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CN120137035A - 一种抗犬pd-1抗体及其用途 - Google Patents

一种抗犬pd-1抗体及其用途 Download PDF

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CN120137035A
CN120137035A CN202410076193.2A CN202410076193A CN120137035A CN 120137035 A CN120137035 A CN 120137035A CN 202410076193 A CN202410076193 A CN 202410076193A CN 120137035 A CN120137035 A CN 120137035A
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heavy chain
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谭泽民
杨友桥
段军叶
吴冰春
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Zhejiang Weijiexin Biotechnology Co ltd
Beijing Weijiexin Biotechnology Co ltd
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Zhejiang Weijiexin Biotechnology Co ltd
Beijing Weijiexin Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及抗体领域，公开了一种抗犬PD‑1的抗体及其在哺乳动物肿瘤预防和治疗方面的用途，尤其是预防和治疗犬类肿瘤方面的用途。该高亲和力、高活性的犬PD‑1抗体能够通过阻断犬PD‑1与其配体的结合，从而达到治疗犬肿瘤疾病的目的。

Description

一种抗犬PD-1抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体为一种抗犬PD-1抗体及其用途。
背景技术
肿瘤是人类和动物的一种常见病、多发病，其中犬恶性肿瘤已经成为导致犬死亡的主要原因。相关研究数据显示，每4只犬中就有一只被诊断为肿瘤，10岁以上犬患肿瘤的比例更是高达50％以上。目前犬肿瘤的临床治疗手段主要包括手术、化学治疗和放射性治疗。常见的化疗药物包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等，这些均存在肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。免疫治疗是一种新兴的治疗手段，对化疗反应不佳的患者使用免疫治疗可能有效且副作用小，免疫治疗的研究和应用已在人类肿瘤中取得了重大突破，而将免疫治疗推广至动物肿瘤具有重要意义。
程序性细胞死亡受体1(PD-1)，是一个大小约55kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于CD28超家族受体，主要在T细胞、B淋巴细胞和活化的巨噬细胞表面表达。PD-1蛋白有两个配体：PD-L1和PD-L2。在正常生理条件下，PD-1与PD-L1/PD-L2的结合会抑制T细胞的活化，进而保护机体免受自身免疫系统的攻击；但是，多种实体瘤以及一些血液瘤，包括黑色素瘤、乳腺癌、各种消化系统肿瘤、淋巴瘤、白血病等癌细胞也大量表达PD-L1。肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞的活化，从而成功逃避机体免疫系统的识别和攻击，实现肿瘤细胞的免疫逃逸。同时研究发现，肿瘤细胞上PD-L1的表达与多个肿瘤类型的不良预后相关。因此，阻断PD-1和PD-L1结合是一种肿瘤免疫治疗的思路。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种高亲和力、高活性的犬PD-1抗体，通过阻断犬PD-1与其配体的结合，从而达到治疗犬肿瘤疾病的目的。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的第一个方面，是提供了一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的CDR序列。
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR1、2、3和/或轻链可变区的CDR1、2、3。
根据本发明的实施例，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列：重链可变区的CDR序列选自SEQ ID NO:2-4、8-11、14所示，轻链可变区的CDR序列选自SEQ ID NO:5-7、12-13、15所示。
值得注意的是，上述记载中，其保护范围为可变区限定的上述序列范围内所有可能得到的CDR序列：上述重链和轻链可变区的CDR1-3，可以为现有技术中不同编码体系所得到的，包括但不限于Kabat、Chothia、IMGT、North、AbM、Contact等编码体系，采用其他已知或未知的编码系统确定的CDR也在本申请的保护范围内。此外，在不同数据库(例如不同的商业、非商业、科研等用于预测CDR位置的数据库，包括但不限于abYsis数据库、IMGT数据库、TABS数据库、智慧芽BIO数据库等)，采用的包括但不限于Kabat、Chothia、IMGT、North、AbM、Contact等编码体系，其预测得到的的CDR序列也在本申请的保护范围内。因不同的数据库对于同一抗体可变区序列使用同一编码体系进行预测得到的CDR如有一定差异，也在本发明的保护范围内。
进一步的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，序列为：SEQ ID NO:16所示的重链可变区、SEQ ID NO:17所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区、SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区、SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区、SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区、SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区、SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区、SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区、SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区、SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区、SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或与以上具有至少85％同一性的氨基酸序列。
进一步的，本发明提出了一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含：选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列：重链可变区的CDR序列选自SEQ ID NO:2-4、8-11、14所示，轻链可变区的CDR序列选自SEQ ID NO:5-7、12-13、15所示，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。
进一步的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列：
选自如SEQ ID NO:2、8、14任一项所示的重链可变区CDR1，选自如SEQ ID NO:3、9、10任一项所示的重链可变区CDR2，选自如SEQ ID NO:4、11、任一项所示的重链可变区CDR3；选自SEQ ID NO:5、12任一项所示的轻链可变区CDR1，选自SEQ ID NO:6、13、15任一项所示的轻链可变区CDR2，选自SEQ ID NO:7所示的轻链可变区CDR3，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区CDR以及能够达到85％以上同一性的氨基酸序列：分别如SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据Kabat编码体系获得)；分别如SEQ ID NO:8、9和4的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据Chothia编码体系获得)；分别如SEQ ID NO:14、10和11的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据IMGT编码体系获得)。
根据本发明的实施例，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区CDR以及能够达到85％以上同一性的氨基酸序列：分别如SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据Kabat或Chothia编码体系获得)；分别如SEQ ID NO:12、13和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，分别如SEQ ID NO:12、15和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据IMGT编码体系获得，但采用不同的数据库分析得到)。
具体的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包括：
分别如SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，并且分别如SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据Kabat编码体系获得)；或，分别如SEQ ID NO:8、9和4的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，并且分别如SEQ ID NO:5、6和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列(上述序列依据Chothia编码体系获得)；或，分别如SEQ ID NO:14、10和11的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，并且分别如SEQ ID NO:12、13和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或，分别如SEQ ID NO:14、10和11的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，并且分别如SEQ ID NO:12、15和7的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
上述序列均包含能够达到85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或其以上的同一性的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的可变区序列。
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区选自SEQ ID NO:16、18-20所示，所述轻链可变区选自SEQ ID NO:17、21-23所示；
进一步地，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以是：
SEQ ID NO:16所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区，并且如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或与以上具有至少85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或其以上的同一性的氨基酸序列。
本发明的第三方面是提供了一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的恒定区。
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段使用的重链恒定区可以为犬IgG A、IgG B、IgG C、IgG D或保证相同功能的突变体序列，进一步的，优选IgG B突变体序列，具体的重链恒定区结构域氨基酸序列可以为SEQ IDNO：24所示；所述抗体使用的轻链恒定区可以为犬kappa链、lambda链结构域恒定区序列，进一步的，优选犬kappa链，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：25所示。
但本发明的发明构思并不仅限于上述示例序列所示的恒定区，只要能够达到本发明的基于PD-1靶点的预防、治疗、检测等效果的恒定区设计均在本发明的保护范围内。
本发明的第四方面提供了一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的全长序列。
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包含重链全长和/或轻链全长，使用的重链全长序列选自SEQ ID NO:26、28-30任一项所示，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或抗原结合片段使用的轻链全长选自SEQ ID NO:27、31-33任一项所示；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段与犬PD-1的亲和常数KD范围为8.76E-10～3.83E-09M；
进一步的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或抗原结合片段的重链全长如SEQID NO:26所示，轻链全长如SEQ ID NO:27所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:28所示，轻链全长如SEQ ID NO:31所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:28所示，轻链全长如SEQ ID NO:32所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:28所示，轻链全长如SEQ ID NO:33所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:29所示，轻链全长如SEQ ID NO:31所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:29所示，轻链全长如SEQ ID NO:32所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:29所示，轻链全长如SEQ ID NO:33所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:30所示，轻链全长如SEQ ID NO:31所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:30所示，轻链全长如SEQ ID NO:32所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:30所示，轻链全长如SEQ ID NO:33所示，
或与以上具有至少85％、87％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
本发明的第五方面提供了一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的类型。
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段包括选自单克隆抗体、多克隆抗体、多聚体抗体和CDR移植抗体中的至少之一；
任选地，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或抗原结合片段包括选自单链抗体、Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一；当作为抗原结合片段时，所述CDR序列并不限定于6个，可以为少于或多于6个，限于能够亲和性结合目的抗原即可。
任选地，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或抗原结合片段包括Fab片段、(Fab)2片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白、Fv片段以及最小识别单位的至少之一。
本发明的第六方面提供了一种核酸元件。
所述元件可以为核酸分子，所述核酸分子编码前述的一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段。所述核酸分子包括但不限于DNA、RNA；优选的，所述核酸分子为DNA。但本发明保护范围包含能够表达前述氨基酸序列的所有核酸、核苷酸序列，包含各种不同密码子偏好性所推得的核酸序列，本领域技术人员采用本领域常规技术能够推知其他能够表达前述氨基酸序列的核苷酸序列，以下序列仅为示例：
具体的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列可以为SEQ ID NO:49、51-53所示的DNA编码序列，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区序列可以为SEQ ID NO:50、54-56所示的DNA编码序列。
进一步的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQ ID NO:49所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:51所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:51所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:51所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:52所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:54所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:52所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:52所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:56所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:53所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区如SEQ ID NO:54所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:53所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区如SEQ ID NO:55所示的DNA编码序列；
所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为重链可变区如SEQID NO:53所示的DNA编码序列，并且，轻链可变区如SEQ ID NO:56所示的DNA编码序列。
具体的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的重链恒定区犬IgG B突变体可以为SEQ ID NO:57所示的DNA编码序列，轻链恒定区犬kappa链可以为SEQID NO:58所示的DNA编码序列。
具体的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段重链全长DNA序列可以为SEQ ID NO:59、61-63任一项所示，抗体轻链全长DNA序列可以为SEQ ID NO:60、64-66任一项所示。
具体的，所述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段可以为：重链全长DNA序列如SEQ ID NO:59所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:60所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:61所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:64所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:61所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:65所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:61所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:66所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:62所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:64所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:62所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:65所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:62所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:66所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:63所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:64所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:63所示，并且，轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:65所示；
或，重链全长DNA序列如SEQ ID NO:63所示，并且轻链全长DNA序列如SEQ ID NO:66所示。
具体地，SEQ ID NO：2-15所示的CDR氨基酸序列，按顺序对应的DNA编码序列可以为，SEQ ID NO：35-48所示。
所述元件可以为重组载体，包括但不限于克隆载体、表达载体、穿梭载体、病毒载体(例如慢病毒载体、腺相关病毒载体，痘病毒相关载体等)，携带上述核酸分子，优选表达载体为真核表达载体或原核表达载体。所述表达载体为质粒表达载体，例如pcDNA3.1、pcDNA3.4。
所述元件可以为重组细胞，所述重组细胞携带上述核酸分子，或可以表达前述一种能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段的重组载体；所述重组细胞是通过将前述表达载体引入至宿主细胞中而获得的；所述重组细胞优选真核细胞，所述重组细胞优选哺乳动物细胞。包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1)、HEK293细胞等。
本发明的第七方面涉及一种药物组合物以及用途。
所述药物组合物包含前述的能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段、或前述的核酸分子、或前述的表达载体、或者前述的重组细胞。
任选地，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料和赋形剂。
所述药物组合物可以制备成一种联合药物或药盒，其包含前述的能够与犬PD-1结合的抗体或其抗原结合片段或药物组合物作为第一活性成分；以及可选的，用于组合使用的第二活性成分，第一活性成分和第二活性成分可相同或不同，所述第二活性成分可以，包括但不限于帕拉定、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等。
所述抗犬PD-1抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、联合药物或药盒在预防和/或治疗肿瘤中的用途，或者用于制备药物中的用途，或者用于制备检测生物基质中PD-1蛋白检测试剂盒的用途；所述肿瘤为哺乳动物的肿瘤，包括人、猴、鼠(大鼠、小鼠)、马、牛、羊、猪、犬、猫等，进一步优选犬类的肿瘤。
所述肿瘤种类包括但不限于“肿瘤”，而是指一类以异常细胞的发展为特征的疾病，这些异常细胞不受控制地增殖并具有浸润和破坏正常身体组织的能力。示例性肿瘤包括但不限于鳞状上皮癌(SCC)；乳头状瘤；纤维乳头瘤；骨内癌；浸润性鼻癌；恶性黑色素瘤(MM)；纤维肉瘤(FSA)；纤维瘤；横纹肌肉瘤；血管肉瘤(HAS)；颗粒细胞瘤；混合性间叶肉瘤；神经纤维肉瘤；未分化肉瘤；黏液肉瘤；软骨肉瘤(CSA)；叶状骨软骨肉瘤(MLO)；骨肉瘤(OSA)；传染性性病肿瘤(TVT)；肥大细胞瘤(MCT)；淋巴瘤(LSA)；成釉细胞瘤；成釉细胞腺瘤；牙源性上皮钙化瘤；牙瘤；纤维素黏液瘤；牙骨质瘤；牙源性纤维瘤；棘状牙龈瘤；骨化牙龈瘤；纤维牙龈瘤；基底细胞瘤；耵聍腺瘤；病毒性乳头状瘤,唾液腺肿瘤，鼻腔淋巴瘤；耵聍腺癌(CGC)；良性嗜酸粒性细胞腺瘤(横纹肌瘤)；软骨瘤；骨瘤；骨软骨瘤；气管癌；平滑肌瘤；良性喉肿瘤(例如横纹肌瘤或嗜酸性粒细胞腺瘤)；纵膈肿瘤(例如胸腺瘤和纵膈淋巴瘤)；恶性胸壁肿瘤(肉瘤)；良性胸壁肿瘤(骨瘤和软骨瘤)；原发性肺肿瘤；继发性(转移性肺肿瘤)；心脏肿瘤(例如血管肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；异位甲状腺癌)；食道癌；胃肿瘤(例如胃腺癌和淋巴瘤)；胃平滑肌肉瘤；胃平滑肌瘤；胃部髓外浆细胞瘤；胃肠道肥大细胞瘤；非淋巴性肠道肿瘤；肠道淋巴瘤；肠道腺癌；髓外浆细胞瘤；类癌；腺癌性息肉；大肠腺癌；结肠直肠平滑肌瘤和平滑肌肉瘤；肛周腺瘤；肛周腺癌；肛囊腺癌；肝脏肿瘤(例如肝脏肉瘤，肝癌或类癌)；肝细胞癌(HCC)；肝细胞腺瘤；肝母细胞瘤；胆道癌；胆管腺癌；胆囊肿瘤；胰腺腺癌；乳腺肿瘤；恶性乳腺肿瘤(乳腺癌)；恶性混合肿瘤；乳腺肉瘤；乳腺骨骼外骨肉瘤；子宫肿瘤；阴道和外阴肿瘤；卵巢肿瘤(例如腺囊瘤、粒层细胞瘤)；生殖索基质肿瘤(例如卵泡膜细胞瘤和黄体瘤)；生殖细胞瘤(无性细胞瘤、畸胎瘤或畸胎癌)；睾丸肿瘤(例如支持细胞瘤、精原细胞瘤和间质细胞瘤)；组织细胞性网状内皮细胞瘤、移行细胞癌(TCC)；前列腺肿瘤；肾脏肿瘤(例如肾癌、纤维肉瘤和血管肉瘤)；输尿管肿瘤；膀胱肿瘤；尿道肿瘤；皮肤血管瘤；甲下鳞状上皮癌；基底细胞瘤(包括基底细胞癌、基底细胞上皮窟和墓底细胞样肿瘤)；耵聍腺肿瘤；皮内角化上皮瘤(角化棘皮瘤)；毛囊肿瘤(毛母细胞瘤、毛发上皮瘤和甲床细胞瘤)；皮肤浆细胞肿瘤；皮肤淋巴瘤；皮脂腺腺瘤；汗腺肿瘤；趋上皮性淋巴瘤(ELSA)；皮肤组织细胞瘤；皮肤神经内分泌(梅克尔细胞)瘤；皮肤平滑肌肿瘤；软组织或梭行细胞肉瘤(STS)；淋巴管肉瘤；滑膜细胞肉瘤；组织细胞肉瘤(HS)；四肢骨肉瘤；中轴骨骨肉瘤；骨外骨肉瘤；表层骨肉瘤；多小叶骨软骨肉瘤(MLO)；多发性软骨外生性骨疣(MCE)；淋巴细胞性白血病(CLL)；非淋巴细胞性白血病(粒细胞性白血病)；慢性髓细胞性白血病(CML)；急性髓细胞性白血病(AML)；脾脏血管肉瘤(HSA)；脾脏肉瘤(非淋巴性、非血管性)；神经胶质瘤；脑膜瘤；神经节细胞瘤(嗜铬细胞瘤及非嗜铬性副神经节瘤)；神经节神经胶质细胞瘤；脊髓肿瘤(OSA、CSA、FSA、HSA、血管内皮瘤、骨髓瘤)；周围神经鞘瘤(PNSTs)；神经上皮瘤(室管膜瘤、髓上皮瘤、肾胚细胞瘤及脊髓胚细胞瘤)；髓内脊柱肿瘤；硬膜外肉瘤；硬膜外肉瘤；神经鞘肿瘤；外周神经系统肿瘤(例如成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤、视网膜成神经细胞瘤)；眼险肿瘤；睑板腺瘤；成肌细胞瘤；第三眼险瘤；结膜肿瘤；球外(角膜和巩膜)肿瘤；眼眶(包围眼球的腔隙)及球后肿瘤；甲状腺肿瘤；甲状旁腺肿瘤；APUD细胞瘤(胶前体摄取脱羧细胞瘤)；胰岛素瘤；胰高血糖素瘤；胃泌素瘤；肾上腺皮质肿瘤；嗜铬细胞瘤；垂体肿瘤。优选黑色素瘤、肥大细胞瘤、结肠癌。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明所述的抗PD-1嵌合抗体及犬源化抗体亲和性良好，其中，嵌合抗体亲和常数KD为8.76E-10M，多种犬源化抗体亲和常数KD低于3.83E-09M。
2、本发明所述的抗PD-1嵌合抗体及犬源化抗体在体外可有效阻断犬T细胞活化抑制通路(cPD-1/cPD-L1)，从而增强T细胞激活，具有生物学活性。
3、本发明所述的抗PD-1嵌合抗体及犬源化抗体能够在体内水平抑制小鼠MC38肿瘤生长，并且对于犬肿瘤也具有较好的抗肿瘤疗效，这对于开发高效的癌症治疗药物具有重要意义。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为流式细胞术检测3334嵌合抗体与犬PD-1/PD-L1的竞争结合结果图(A为流式结果图；B为APC阳性细胞率定量图)。
图2为3334嵌合抗体和犬源化抗体体外活性检测-荧光素酶报告基因法结果图(A为3334嵌合抗体和3334-H1K1/H1K2/H1K3-canIgG B犬源化抗体组；B为3334嵌合抗体和3334-H2K1/H2K2/H2K3-canIgG B犬源化抗体组；C为3334嵌合抗体和3334-H3K1/H3K2/H3K3-canIgG B犬源化抗体组)。
图3为3334嵌合抗体和犬源化抗体体外活性检测-T细胞激活实验结果图。
图4为3334嵌合抗体、3334-H1K2-canIgG B犬源化抗体对于小鼠体重影响结果图。
图5为3334嵌合抗体、3334-H1K2-canIgG B犬源化抗体对于小鼠体重变化率影响结果图。
图6为3334嵌合抗体、3334-H1K2-canIgG B犬源化抗体对于小鼠肿瘤体积影响结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例说明。
为了可更清楚地了解本公开，首先定义一些术语。术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体，包括但不限于单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体，是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariableregion，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR。
在本文中，术语“Fab抗体”通常是指仅含Fab分子的抗体，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”可互换使用，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,HamersR.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中，术语“单链抗体”通常是指由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过连接肽连接而成的抗体。
在本文中，术语“最小识别单位”和“MRU”均是指仅由一个CDR组成的抗体，其分子量十分小仅占完全抗体的1％左右。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似相”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“至少85％同一性”指与各参考序列至少为85％，可为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性。
如本文中使用的，“结合PD-1”，“特异性结合PD-1”的抗体或“抗PD-1抗体”指以KD值为1.0×10-8mol/L或更低。结合亲和力是用标准结合测定法，诸如生物膜干涉(Gator)使用PD-1胞外域测定的。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。所述表达载体携带前述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的抗体或抗原结合片段的表达，进而实现抗体或抗原结合片段在体外的大量获得。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入治疗对象。本发明的抗体或抗原结合片段或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射等等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。所述治疗对象可以为哺乳动物，优选犬类。
在本文中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是犬的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
实施例1小鼠抗犬PD-1抗体的制备和鉴定
1、抗原制备
在UniProt库和GenBank库中搜索犬PD-1蛋白(UniProtKB：A0A024FCJ9)，氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，人工合成对应的带有His标签的核苷酸序列，并构建于pcDNA3.4载体中，瞬转至HEK293细胞中，转染5天后收集细胞上清液，通过Ni柱对上清进行亲和层析，洗脱得到纯化的犬PD-1重组蛋白。
2、小鼠免疫
以7-8mg犬PD-1重组蛋白作为抗原，对Balb/c小鼠或C57小鼠进行免疫。四次免疫后收集血清，并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析抗体效价。
3、脾脏RNA提取及反转录
利用Trizol法提取小鼠脾脏组织的RNA，通过变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，使用超微量分光光度计测定RNA的浓度及OD260/OD280。选择质量合格的RNA按照反转录酶Superscript II reverse transcriptase(Thermo Scientific)的说明书进行RNA反转录，获得cDNA。
4、抗体库构建与噬菌体展示
从cDNA中扩增抗体重链和轻链，分别构建scFv抗体库和Fab抗体库，库容均达到1×108CFU/mL。将抗体库电转至TG1大肠杆菌中，再加入辅助噬菌体M13KO7侵染TG1大肠杆菌，经过夜培养后，使用PEG/NaCl沉析噬菌体，制备噬菌体展示抗体库。
5、噬菌体展示抗体库筛选
采用免疫管和磁珠筛选仪，分别对噬菌体展示抗体库进行固相筛选、固相与液相交叉筛选。其中固相筛选使用犬PD-1重组蛋白包被免疫管，液相筛选使用生物素化的犬PD-1重组蛋白包被Dynabeads磁珠。经过三轮筛选后，使用Phage ELISA鉴定富集的噬菌体集合以及从集合中分离的单克隆。
6、抗体的构建与表达纯化
对Phage ELISA阳性单克隆的噬菌粒进行DNA测序，从测序结果中选取具有正确读码框的鼠源抗体可变区进行基因合成，获得有活性的鼠源抗体。分别使用Kabat、Chothia、IMGT(分别在abYsis和IMGT数据库编码)编码得到鼠源抗体重链和轻链可变区互补决定区(CDR)1、2、3的氨基酸序列。
然后将鼠源抗体重链可变区(SEQ ID NO：16)与来自犬IgG B突变体的重链恒定区(包括CH1、CH2、CH3)融合，轻链可变区(SEQ ID NO：17)与犬kappa链恒定区(CL)融合，插入pcDNA3.4载体，构建全长嵌合抗体表达质粒。在HEK293细胞中瞬时转染表达嵌合抗体，培养上清经重组蛋白质A亲和层析，获得纯化的嵌合抗体，编号为3334，所述嵌合抗体重链全长为SEQ ID NO：26所示，轻链全长为SEQ ID NO：27所示。
实施例2阻断犬PD-1与其配体结合的抗体筛选
构建犬PD-L1全长(UniProtKB：E2RKZ5)，并转染CHO-K1细胞，通过筛选得到高表达量的单克隆细胞株(以下简称犬PD-L1/CHO-K1细胞)，通过流式细胞技术检测犬PD-1抗体阻断犬PD-1与犬PD-L1/CHO-K1细胞结合的能力。
将生物素标记的犬PD-1重组蛋白与不同浓度的抗体孵育5分钟，然后加入至PD-L1/CHO-K1细胞中，于4℃孵育60分钟，用冷的含1％FBS的PBS漂洗两次后，加入链霉亲和素-APC荧光二抗，于4℃孵育30分钟，再用冷的含1％FBS的PBS漂洗两次，并重悬浮于200mL含1％FBS的PBS中，利用流式细胞仪(Beckman Coulter，CytoFLEX)分析被APC标记的细胞比例。APC阳性细胞率反映生物素标记犬PD-1重组蛋白与PD-L1/CHO-K1细胞的结合能力，APC阳性细胞率越低，说明抗体阻断生物素标记犬PD-1重组蛋白与其配体结合的能力越强。
如图1结果显示，随着3334嵌合抗体浓度增加，APC阳性细胞率逐渐下降，说明3334嵌合抗体能够阻断犬PD-1与PD-L1的结合。
实施例3构建犬源化抗体
基于框架区同源性的CDR移植和回复突变，对3334嵌合抗体进行犬源化。首先，构建了犬源化重链可变区变体(SEQ ID NO：18-20)和犬源化轻链可变区变体(SEQ ID NO：21-23)。犬源化抗体的可变区由同一抗体的犬源化可变区重链和犬源化可变区轻链自由组合，如重链3334-H1(SEQ ID NO：18)可与轻链3334-K1(SEQ ID NO：21)、3334-K2(SEQ ID NO：22)或3334-K3(SEQ ID NO：23)组合，分别标记为3334-H1K1，3334-H1K2和3334-H1K3。犬源化抗体的恒定区由犬IgG B突变体的恒定结构域和犬kappa恒定区结构域组成，如3334-H1K1-canIgG B是具有犬源化可变区重链H1、犬源化可变区轻链K1和犬IgG B突变体恒定区、犬kappa恒定区，具体序列组合名称详见表1，所示抗体的恒定区分别为，犬IgG B突变体重链的恒定区结构域，氨基酸序列为SEQ ID NO：24所示，犬kappa链恒定区结构域，氨基酸序列为SEQ ID NO：25所示。
表1 3334嵌合和犬源化抗体的序列编号表
实施例4嵌合抗体和犬源化抗体所构建的亲和力测定
使用基于生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)技术的Gator仪器测定3334嵌合抗体和9个3334犬源化抗体的亲和力。首先对抗体进行生物素标记(ThermoFisher，21343)，将生物素化的检测抗体稀释至100nM加入黑色96孔板中，作为固定相；然后将分析物(犬PD-1-His)梯度稀释(200、100、50、25、12.5、6.25、3.13nM)后加入黑色96孔板中；最后使用链霉亲和素探针(GatorTMStreptavidin Probes)按照平衡、固定相、平衡、分析物、平衡的移动程序，测定抗体与犬PD-1的亲和力。
结果如表2所示，3334嵌合抗体的亲和力为8.76E-10，3334犬源化抗体稍稍弱于3334嵌合抗体，但变化不明显。
表2 3334嵌合抗体和3334犬源化抗体的亲和力数据
注：E为科学计数法，为×10，E后面的数值为10的幂。
实施例5嵌合抗体和犬源化抗体的体外活性测定
1、利用犬PD-1/PD-L1荧光素酶报告基因细胞系检测新抗体的体外生物学活性
分别构建基于犬PD-1/PD-L1信号通路的Canine_PD-L1 aAPC CHO-K1和Canine_PD-1Reporter Jurkat的犬PD-1/PD-L1荧光素酶报告基因单克隆细胞系细胞系，用于评价抗体影响PD-1/PD-L1信号通路的能力，检测抗体为3334嵌合抗体和9个犬源化抗体。
首先，将靶细胞Canine_PD-L1 aAPC CHO-K1 Cell Line以1E4 cells/孔的密度提前16-24h铺于96孔细胞板中。然后，分别将50μL 2E6 cells/mL效应细胞Canine_PD-1Reporter Jurkat Cell Line与50μL系列浓度3334嵌合抗体和犬源化抗体共同孵育1h。之后，去除96孔细胞板内靶细胞的培养基，加入上述效应细胞和抗体的混合液，继续孵育16h。最后取上清中的悬浮细胞，加入50μL one-glo酶反应底物(Promega，E6120)，室温避光孵育15min后，上机检测荧光信号。利用Prism软件计算EC50。
结果如表3和图2所示，3334嵌合抗体和9个犬源化抗体均可有效地阻断PD-1/PD-L1信号通路，EC50值在0.36～1.23μg/mL。
表3 3334嵌合抗体和犬源化抗体体外细胞生物学活性数据
抗犬PD-1抗体 EC50(μg/mL)
3334-canIgG B 0.36
3334-H1K1-canIgG B 0.72
3334-H1K2-canIgG B 0.37
3334-H1K3-canIgG B 0.59
3334-H2K1-canIgG B 1.07
3334-H2K2-canIgG B 0.42
3334-H2K3-canIgG B 1.06
3334-H3K1-canIgG B 1.23
3334-H3K2-canIgG B 0.55
3334-H3K3-canIgG B 0.75
2、利用T细胞激活实验进一步检测3334嵌合抗体和犬源化抗体的体外生物学活性
选择健康成年比格犬，采集全血，使用Ficoll(GE Healthcare，17-1440-02)密度梯度离心法提取犬PBMC。将犬PBMC以4E5 cells/孔的密度加入96孔细胞板中，加入10ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB，Toxin Technology，BT202)，作为超级抗原进行刺激，同时分别加入阴性对照(canIgG B)、3334嵌合抗体和犬源化抗体，于37℃二氧化碳培养箱中培养72h，离心收集细胞上清液。使用ELISA检测试剂盒分别检测上清液中cIFN-γ(R&D，DY781B)和cIL-2(R&D，DY1815)的含量。
结果如图3所示，在体外水平，3334嵌合抗体和9个犬源化抗体均能增加T细胞cIFN-γ和cIL-2的分泌，且与阴性对照比差异显著。说明3334抗体在体外可有效阻断犬T细胞活化抑制通路(cPD-1/cPD-L1)，从而增强T细胞激活，具有生物学活性。
实施例6 3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B抗体的体内药效评价
前期验证显示犬PD-1可与人PD-L1(hPD-L1)交叉结合。因此，利用结肠癌MC38/hPD-L1重组细胞株皮下移植雌性犬PD-1C57BL/6转基因小鼠动物模型检测，进一步评价3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B的抗肿瘤作用。
收集指数生长期的MC38/hPD-L1细胞，使用PBS缓冲液重悬至1E7/mL，分别在犬PD-1C57BL/6转基因小鼠右侧背部皮下接种0.1mL MC38/hPD-L1细胞。对所有动物称重，并用游标卡尺测量肿瘤体积，待肿瘤生长至平均体积为102.10mm3时，根据肿瘤大小随机分组并给药。实验组分别为阴性对照组(溶媒对照)、3334嵌合抗体组和3334-H1K2-canIgG B抗体组，每组6只小鼠。分组当天(第0天)开始给药，对抗体组小鼠尾静脉注射3mg/kg的相应抗体，对阴性对照组小鼠尾静脉注射等体积溶媒，给药频率为每周3次，共给药3周。给药后，每天观察实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加和降低情况，眼睛、被毛及其他异常情况，每周测量三次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(a×b2)(其中a表示长径，b表示短径)。给药9次后结束实验。
使用绝对肿瘤增值率(T/C％)和绝对肿瘤抑制率(TGI％)评价3334抗体的抗肿瘤作用。T/C％＝Ti/Ci×100％，TGI％＝(Ci-Ti)/Ci×100％，其中Ti表示第i天给药组的平均肿瘤体积，Ci表示第i天阴性对照组的平均肿瘤体积。
结果如图4-6所示，图4和图5表示各组的小鼠体重在给药期间均增加，且各组间的体重变化无显著差异，同时在治疗过程中也未出现小鼠意外死亡的现象，说明各给药组均耐受性良好，无显著的毒性反应；图6显示了各组的肿瘤生长情况，其中与阴性对照组相比，3334抗体组和3334-H1K2-canIgG B抗体组小鼠的肿瘤生长速度显著减缓。
最后一次给药后的T/C％和TGI％统计结果如表4所示，3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B抗体组小鼠在第19天均存活，平均肿瘤体积分别为1333.08mm3和1044.91mm3，TGI分别为55.54％和65.15％。在统计学上与阴性对照组相比，分别有显著和极显著的差异。
表4 3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B抗体抑制小鼠MC38肿瘤生长数据
实施例7 3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B抗体的靶动物体内药效评价
本实施例用于说明3334和3334-H1K2-canIgG B对犬恶性肿瘤的治疗效果。
采用单臂试验设计，从北京某宠物医院筛选40只就诊的肿瘤患犬(包括黑色素瘤20只、肥大细胞瘤20只)，分别进行3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B抗体治疗恶性肿瘤患犬的疗效研究。实验犬品种包括：雪纳瑞、拉布拉多犬、吉娃娃、金毛猎犬等，平均年龄为12岁(10-15岁)，均为晚期恶性肿瘤患犬。
将所有患病犬分两组，分别为3334嵌合抗体组和3334-H1K2-canIgG B组，每组均包括黑色素瘤患犬10只、肥大细胞瘤患犬10只。对所有患犬，按照5mg/kg体重的剂量静脉滴注相应的3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B抗体(注射用生理盐水稀释)，每两周给药一次，连续给药8次，末次给药一周后结束试验。通过大体检查和计算机断层扫描评估肿瘤负荷，每两周测量一次肿瘤大小评估疗效，比较客观缓解率(ORR)、完全缓解率(CR)和部分缓解率(PR)。其中ORR＝完全缓解和部分缓解的患病犬/总患病犬×100％；CR＝所有可检测肿瘤消失的患病犬/总患病犬×100％；PR＝靶病灶最大径之和至少减少30％的患病犬/总患病犬×100％。
初步临床治疗效果如下表5所示：3334嵌合抗体和3334-H1K2-canIgG B均有较好的抗肿瘤疗效；且3334-H1K2-canIgG B的治疗效果优于3334嵌合抗体。
表5 3334和3334-H1K2-canIgG B的临床抗肿瘤疗效数据
通过以上结果可以看出，采用本发明筛选得到的抗体具有高亲和力和高活性，通过阻断犬PD-1及其配体结合，从而达到治疗犬肿瘤疾病的目的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种抗PD-1抗体或抗原结合片段，其特征在于，能够与犬PD-1结合，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区的CDR1、2、3，和/或轻链可变区的CDR1、2、3；所述重链可变区选自SEQ ID NO:16、18-20所示，所述轻链可变区选自SEQ ID NO:17、21-23所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区：SEQ ID NO:16所示的重链可变区、SEQ ID NO:17所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区、SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区、SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:18所示的重链可变区、SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区、SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区、SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:19所示的重链可变区、SEQ ID NO:23所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区、SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区、SEQ ID NO:22所示的轻链可变区；
或，SEQ ID NO:20所示的重链可变区、SEQ ID NO:23所示的轻链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列：重链可变区的CDR序列选自SEQ ID NO:2-4、8-11、14所示，轻链可变区的CDR序列选自SEQ ID NO:5-7、12-13、15所示。
4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区为犬IgG B突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；所述抗体或抗原结合片段的轻链恒定区为犬kappa链结构域恒定区，氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括重链全长和/或轻链全长，所述抗体或抗原结合片段使用的重链全长序列选自SEQ IDNO:26、28-30任一项所示，所述抗体或抗原结合片段使用的轻链全长选自SEQ ID NO:27、31-33任一项所示；
进一步的，所述抗体或抗原结合片段的重链全长如SEQ ID NO:26所示，轻链全长如SEQID NO:27所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:28所示，轻链全长如SEQ ID NO:31所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:28所示，轻链全长如SEQ ID NO:32所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:28所示，轻链全长如SEQ ID NO:33所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:29所示，轻链全长如SEQ ID NO:31所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:29所示，轻链全长如SEQ ID NO:32所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:29所示，轻链全长如SEQ ID NO:33所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:30所示，轻链全长如SEQ ID NO:31所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:30所示，轻链全长如SEQ ID NO:32所示；
或，重链全长如SEQ ID NO:30所示，轻链全长如SEQ ID NO:33所示。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述核酸分子为DNA或RNA。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求7所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求6所述的核酸分子，或权利要求7所述的表达载体，或权利要求8所述的重组细胞。
10.权利要求1～5任一项所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求6所述的核酸分子，或权利要求7所述的表达载体，或权利要求8所述的重组细胞，或权利要求9所述的药物组合物，在预防和/或治疗哺乳动物肿瘤中的用途；或用于制备预防和/或治疗哺乳动物肿瘤药物中的用途；或用于检测PD-1蛋白中的用途。
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