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CN120118196A - 融合蛋白及其应用 - Google Patents

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CN120118196A
CN120118196A CN202411803011.3A CN202411803011A CN120118196A CN 120118196 A CN120118196 A CN 120118196A CN 202411803011 A CN202411803011 A CN 202411803011A CN 120118196 A CN120118196 A CN 120118196A
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CN
China
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seq
amino acid
acid sequence
sequence shown
antibody
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Application number
CN202411803011.3A
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刘国胜
李闯
陈彩燕
陈奕藩
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Bio Thera Solutions Ltd
Original Assignee
Bio Thera Solutions Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供了融合蛋白及其应用，所述融合蛋白包含抗PD‑L1抗体或抗原结合片段、IL‑15或其片段和IL‑15Rα或其sushi结构域。本发明的融合蛋白可用于疾病的预防、治疗或改善。

Description

融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及融合蛋白及其应用。
背景技术
程序性死亡受体-1(PD-1)为一种I型跨膜糖蛋白，分子量约为55kDa。PD-1是表达在活化的T细胞、B细胞和髓样细胞上表达的免疫抑制性受体，属于CD28免疫球蛋白超家族成员。作为PD-1的配体，PD-L1也是一种I型跨膜糖蛋白，其分布广泛：表达在B细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞的表面，以及肿瘤组织中。
PD-1与PD-L1相互作用会负调节抗原受体信号转导，减弱T细胞应答。迄今为止，大量研究显示PD-1和PD-L1之间的相互作用会导致渗入肿瘤的淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞的免疫逃避。阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用可增加T细胞增殖和细胞因子产生，提高肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫性，有助于免疫系统清除肿瘤细胞。
IL-15是一种具有114个氨基酸的14-15kDa的糖蛋白，并且属于共有的细胞因子受体γ链家族，该家族还包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-21。IL-15由巨噬细胞、树突细胞和单核细胞分泌。IL-15可以刺激中枢记忆CD8+细胞发挥免疫，而对其他T细胞无调节作用。此外，IL-15可以激活NK细胞以及效应和记忆CD8+T细胞并且可以拯救T细胞免于调节性T细胞(Treg)诱导的细胞凋亡。IL-15受体由以下三个亚基构成：IL-15Rα、IL-15Rβ和IL-15Rγ。在与T细胞和NK细胞上的功能性IL-15Rβ和γ单元结合前，IL-15典型地与APC上表达的IL-15受体α形成复合物。IL-15Rα的sushi结构域(7.5kDa)在IL-15与IL-15Rα的复合物形成中起关键作用。
发明内容
本发明提供了融合蛋白及其应用，所述融合蛋白包含抗PD-L1抗体或抗原结合片段、IL-15或其片段和IL-15Rα或其sushi结构域。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段特异性结合PD-L1，并且包含：
(a)HCDR1，其包含DSWIH；和/或
(b)HCDR2，其包含WISPYGGSTYYADX1X2X3X4(SEQ ID NO:86)，X1为S、D、H、G、P或Y，X2为V、F、L、M或Y，X3为K、R、G、S、V或H，X4为G、H、D、Q、S或A；和/或
(c)HCDR3，其包含RHWPGGX5X6X7(SEQ ID NO:87)，X5为F或L，X6为D或L，X7为Y或P。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段特异性结合PD-L1，并且包含：
(a)HCDR1，其包含DSWIH；
(b)HCDR2，其包含WISPYGGSTYYADX1X2X3X4(SEQ ID NO:86)，X1为S、D、H、G、P或Y，X2为V、F、L、M或Y，X3为K、R、G、S、V或H，X4为G、H、D、Q、S或A；和
(c)HCDR3，其包含RHWPGGX5X6X7(SEQ ID NO:87)，X5为F或L，X6为D或L，X7为Y或P。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段特异性结合PD-L1，并且包含：
(a)HCDR1，其包含DSWIH；和/或
(b)HCDR2，其包含WISPYGGSTYYADX1X2X3X4(SEQ ID NO:86)，X1为S、D、H、G、P或Y，X2为V、F、L、M或Y，X3为K、R、G、S、V或H，X4为G、H、D、Q、S或A；和/或
(c)HCDR3，其包含RHWPGGX5X6X7(SEQ ID NO:87)，X5为F或L，X6为D或L，X7为Y或P；和/或
(d)LCDR1，其包含X8ASQX9IX10X11X12LX13(SEQ ID NO:88)，X8为L、Q或R，X9为D、T或G，X10为G或S，X11为K、T、或S，X12为H、W、F或Y，X13为N或A；和/或
(e)LCDR2，其包含X14ASX15LX16X17(SEQ ID NO:89)，X14为A或G，X15为T、N、S或R，X16为Q或K，X17为S或T；和/或
(f)LCDR3，其包含QQX18X19X20TPX21T(SEQ ID NO:90)，X18为Y或S，X19为Y或F，X20为S或T，X21为R或Y。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段特异性结合PD-L1，并且包含：
(a)HCDR1，其包含DSWIH；
(b)HCDR2，其包含WISPYGGSTYYADX1X2X3X4(SEQ ID NO:86)，X1为S、D、H、G、P或Y，X2为V、F、L、M或Y，X3为K、R、G、S、V或H，X4为G、H、D、Q、S或A；
(c)HCDR3，其包含RHWPGGX5X6X7(SEQ ID NO:87)，X5为F或L，X6为D或L，X7为Y或P；
(d)LCDR1，其包含X8ASQX9IX10X11X12LX13(SEQ ID NO:88)，X8为L、Q或R，X9为D、T或G，X10为G或S，X11为K、T、或S，X12为H、W、F或Y，X13为N或A；
(e)LCDR2，其包含X14ASX15LX16X17(SEQ ID NO:89)，X14为A或G，X15为T、N、S或R，X16为Q或K，X17为S或T；和
(f)LCDR3，其包含QQX18X19X20TPX21T(SEQ ID NO:90)，X18为Y或S，X19为Y或F，X20为S或T，X21为R或Y。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2-11中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ IDNO:12或13所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，所述取代变体为保守氨基酸取代变体。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91-95任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2-11中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:12或13所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，所述取代变体为保守氨基酸取代变体。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:3所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:5所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:7所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:8所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:10所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:11所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:14-18中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:19-22中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:23-26中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。在一些实施方案中，所述取代变体为保守氨基酸取代变体。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:19所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:22所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段特异性结合PD-L1，并且包含：(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO:2-11中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO:12或13所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(d)LCDR1，其包含SEQ ID NO:14-18中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(e)LCDR2，其包含SEQID NO:19-22中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(f)LCDR3，其包含SEQ ID NO:23-26中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段至少包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2-11中任一项所示的HCDR2、SEQ ID NO:12或13所示的HCDR3、SEQ IDNO:14-18中任一项所示的LCDR1、SEQ ID NO:19-22中任一项所示的LCDR2、SEQ ID NO:23-26中任一项所示的LCDR3中的一个、二个、三个、四个、五个或全部。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2-11中任一项所示的HCDR2、SEQ ID NO:12或13所示的HCDR3、SEQ IDNO:14-18中任一项所示的LCDR1、SEQ ID NO:19-22中任一项所示的LCDR2和SEQ ID NO:23-26中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段特异性结合PD-L1，并且包含：(a)HCDR1，其包含SEQ ID NO:91-95任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(b)HCDR2，其包含SEQ ID NO:2-11中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(c)HCDR3，其包含SEQ ID NO:12或13所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(d)LCDR1，其包含SEQ ID NO:14-18中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(e)LCDR2，其包含SEQ ID NO:19-22中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体；和/或(f)LCDR3，其包含SEQ ID NO:23-26中任一项所示的氨基酸序列或其有单一位点取代、缺失或插入的变体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段至少包含SEQ ID NO:91-95任一项所示的HCDR1、SEQ ID NO:2-11中任一项所示的HCDR2、SEQ ID NO:12或13所示的HCDR3、SEQ ID NO:14-18中任一项所示的LCDR1、SEQ ID NO:19-22中任一项所示的LCDR2、SEQ ID NO:23-26中任一项所示的LCDR3中的一个、二个、三个、四个、五个或全部。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91-95任一项所示的HCDR1、SEQ ID NO:2-11中任一项所示的HCDR2、SEQ ID NO:12或13所示的HCDR3、SEQ ID NO:14-18中任一项所示的LCDR1、SEQ ID NO:19-22中任一项所示的LCDR2和SEQ IDNO:23-26中任一项所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:15所示的LCDR1、SEQ ID NO:20所示的LCDR2和SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:16所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:17所示的LCDR1、SEQ ID NO:22所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:18所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:3所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:5所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:6所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:7所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:15所示的LCDR1、SEQ ID NO:20所示的LCDR2和SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:16所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:17所示的LCDR1、SEQ ID NO:22所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:18所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:3所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:5所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:6所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:7所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，所述重链可变区包含结构：重链FR1-HCDR1-重链FR2-HCDR2-重链FR3-HCDR3-重链FR4。
在一些实施方案中，所述轻链可变区包含结构：轻链FR1-LCDR1-轻链FR2-LCDR2-轻链FR3-LCDR3-轻链FR4。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27-41中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27-41中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27-41中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ IDNO:42-47中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42-47中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42-47中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27-41中任一项所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42-47中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:29所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链可变区包含SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。
在一些实施方案中，Fc是变体Fc区。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，变体Fc区具有一个或多个氨基酸修饰，如取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区活性，Fc区的氨基酸修饰改变了效应功能活性。在一些实施方案中，变体Fc区可以具有改变的(即，增加的或降低的)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CDC)、吞噬作用、调理作用或细胞结合。在一些实施方案中，相对于亲本Fc区，Fc区氨基酸修饰可以改变变体Fc区对FcγR(Fcγ受体)的亲和力。在一些实施方案中，所述Fc区来源于IgG1或IgG4。在一些实施方案中，Fc区突变是N297A。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为分离的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scFv、Fab、F(ab)2或IgG。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗原结合片段为Fab、Fv或scFv抗体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含SEQ IDNO:48或49所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48或49所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48或49所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含SEQ IDNO:48所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的重链恒定区包含SEQ IDNO:49所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段的轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区a(CHa)、重链恒定区b(CHb)和轻链恒定区(CL)。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a和重链恒定区b形成“杵入臼(Knobs-into-Holes)”的稳定缔合。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a和/或重链恒定区b包含选自Y349C、S354C、T366W、T366S、L368A和Y407V的氨基酸突变，其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a和/或重链恒定区b包含如下氨基酸突变：K447A，其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含选自S354C、T366W的氨基酸突变；和/或所述重链恒定区b包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V的氨基酸突变；其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含如下氨基酸突变：S354C和T366W；和/或所述重链恒定区b包含如下氨基酸突变：Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含如下氨基酸突变：S354C和T366W；所述重链恒定区b包含如下氨基酸突变：Y349C、T366S、L368A和Y407V；其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含如下氨基酸突变：S354C、T366W和K447A；和/或所述重链恒定区b包含如下氨基酸突变：Y349C、T366S、L368A、Y407V和K447A；其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含如下氨基酸突变：S354C、T366W和K447A；所述重链恒定区b包含如下氨基酸突变：Y349C、T366S、L368A、Y407V和K447A；其中氨基酸位置为Eu编号。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:77所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:77所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述重链恒定区b包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:78所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:78所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:77所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:77所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述重链恒定区b包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:78所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQID NO:78所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链恒定区a包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述重链恒定区b包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体包含重链和轻链。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51-65中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:51-65中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:51-65中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66-71中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66-71中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66-71中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的重链包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述抗PD-L1抗体的轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体或多特异性抗体或抗原结合片段(例如双特异性抗体或抗原结合片段)。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体包含重链a、重链b和轻链。
在一些实施方案中，所述重链a包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:79所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:79所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述重链b包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:80所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:80所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链a包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列，所述重链b包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-15包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:82所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:82所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-15Rα或其sushi结构域包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段通过连接子与IL-15或其片段以及IL-15Rα或其sushi结构域连接。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体的一条重链的C端通过连接子与IL-15或其片段连接，所述抗PD-L1抗体的另一条重链的C端通过连接子与IL-15Rα或其sushi结构域连接。
在一些实施方案中，所述连接子为GS接头。在一些实施方案中，所述连接子独立选自GS，GGS，GGGS，GGGGS，SGGGS，GGSS，(GGGGS)2，(GGGGS)3，或其任意组合。在一些实施方案中，所述连接子为(GmS)n，其中，每个m独立为1、2、3、4、5或6，n为1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含第一多肽、第二多肽和第三多肽；其中
所述第一多肽包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:83所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:83所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述第二多肽包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:84所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:84所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述第三多肽包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，所述第三多肽包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述融合蛋白为分离的融合蛋白。本发明还提供编码所述融合蛋白或其一部分的多聚核苷酸。在一些实施方案中，所述多聚核苷酸为分离的多聚核苷酸。
本发明还提供包含所述的多聚核苷酸的载体。在一些实施方案中，所述载体为分离的载体。在一些实施方案中，所述载体为核酸片段、质粒、噬菌体或病毒。
本发明还提供包含所述多聚核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为分离的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞、HEK细胞(如HEK293F细胞)、BHK细胞、Cos1细胞、Cos7细胞、CV1细胞或鼠L细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的融合蛋白。在一些实施方案中，所述的药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于预防、治疗或改善疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本文所述的融合蛋白或药物组合物。在一些实施方案中，提供了本文所述的融合蛋白或药物组合物在预防、治疗或改善疾病中的应用。在一些实施方案中，提供了本文所述的融合蛋白或药物组合物在制备用于预防、治疗或改善疾病的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述疾病包括但不限于感染(如细菌、病毒、真菌或原生动物导致的感染)、自身免疫性疾病、癌症、肿瘤。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于斑秃、自身免疫性肝炎、乳糜泻、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本病、溶血性贫血、炎性肠病、炎性肌病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮、白癜风、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性血小板减少性紫癜、克罗恩病、I型糖尿病、嗜酸细胞性筋膜炎、嗜酸细胞性胃肠炎、古德帕斯丘综合征、重症肌无力、银屑病关节炎、风湿热、溃疡性结肠炎、血管炎、韦氏肉芽肿病。在一些实施方案中，所述癌症和肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、唾液腺癌、胃癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头癌、颈癌、胰腺癌。
本发明的融合蛋白的抗PD-L1抗体为完整抗体形式，可以很好的解除肿瘤细胞导致的免疫抑制，同时IL-15活性减弱，可以避免全身性的免疫激活，抗PD-L1抗体端又会将IL-15富集在肿瘤微环境中，产生局部免疫激活，既可以提高抗肿瘤效果也可以增加安全性。与抗PD-L1抗体相比，本发明的融合蛋白能够明显激活CTLL-2细胞增殖活力，能够明显促进CD8+T、NK和NKT细胞扩增，抑制肿瘤效果更好。
附图说明
图1为融合蛋白A的结构示意图。
图2为融合蛋白A结合CTLL-2细胞实验。
图3为融合蛋白A刺激CTLL-2细胞活性实验。
图4为融合蛋白A结合HH细胞实验。
图5为融合蛋白A激活HH细胞实验。
图6为融合蛋白A结合CHO-K1-CD122-CD132细胞实验。
图7为融合蛋白A体外激活PBMC实验；其中图7a为总细胞数，图7b为CD8+T细胞占比，图7c为NKT细胞占比，图7d为NK细胞占比。
图8为固相状态下激活PBMC释放细胞因子实验；其中图8a-8e分别显示IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α的浓度；图中，供体1、供体2、供体3和供体4为来自不同人的PBMC细胞。
图9为液相状态下激活PBMC释放细胞因子实验；其中图9a-9e分别显示IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α的浓度；图中，供体1、供体2、供体3和供体4为来自不同人的PBMC细胞。
图10为融合蛋白A小鼠体内抑制黑色素瘤生长实验。
具体实施方式
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
定义
应当注意的是，术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体，因此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中互换使用。
本文所用的术语“包含”或“包括”意味着抗体、组合物或方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由……组成”意味着抗体、组合物或方法等排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对抗体、组合物或方法等无本质上影响的元素。“由……组成”意味着排除未特别列举的元素。
本文所用术语“抗体”指免疫球蛋白(Ig)分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。抗体包括但不限于单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体(scFv)、Fab、Fab'和F(ab')2片段、Fv和Fab表达库。
本发明公开的抗体、抗原结合单元或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体(scFv)、表位结合片段(例如Fab、Fab'和F(ab')2)。
术语“单克隆抗体”(mAb)是指一群这样的抗体分子：其只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子中的一种分子种类。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。MAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸的接头(linker)连接而成的抗体。接头可以富含甘氨酸以增加柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以增加溶解性，并且可以连接VH的N端和VL的C端，反之亦然。尽管该蛋白质被除去了恒定区和引入了接头，但其保留了原始免疫球蛋白的特异性。ScFv分子通常是本领域中已知的，例如在美国专利5,892,019中有相关描述。
本领域技术人员将会理解，重链的类别包括gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等已被充分表征并且赋予的功能特异性也已知。所有的免疫球蛋白种类都在本发明公开的保护范围内。在一个或多个实施方式中，免疫球蛋白分子的种类为IgG。两条重链和两条轻链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”口开始并延续通过可变区包围重链。轻链可以分为kappa(κ)或lambda(λ)。每个重链可以与κ或λ轻链结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生产免疫球蛋白时，其轻链和重链通过共价键结合，两条重链的“尾巴”部分通过共价二硫键或非共价键结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。免疫球蛋白κ轻链可变区为Vκ；免疫球蛋白λ轻链可变区为Vλ。
抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)决定了抗原识别和特异性。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N端部分是可变区，C端部分是恒定区；如IgG1抗体的CH3和CL结构域分别包含重链和轻链的羧基端。
在天然存在的抗体中，假设抗体在含水环境中呈现其三维构型时，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是形成抗原结合结构域的短的、非连续的与抗原特异性结合的氨基酸序列。抗原结合结构域中被称为“框架”(“FR”)区域的剩余其它氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，CDR形成与之连接的环状结构，或在某些情况下形成β折叠结构的一部分。因此，框架区通过形成支架从而通过链间非共价相互作用使CDR定位在正确的方位上。具有特定位置的CDR的抗原结合域形成了与抗原上的表位互补的表面，该互补表面促进抗体和其抗原表位的非共价结合。通常在抗体分子中，每条重链和轻链有三个CDR，分别被称为HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2以及LCDR3。按照位置顺序，通常重链可变区包含VH FR1、HCDR1、VH FR2、HCDR2、VH FR3、HCDR3以及VHFR4，轻链可变区包含VL FR1、LCDR1、VL FR2、LCDR2、LFR3、LCDR3以及VL FR4。对于给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员都可以通过已知方法鉴定出包含CDR和框架区的氨基酸(参见Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(1983)和Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)等)。
人源化抗体的框架区及CDR区不必准确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR或共有框架可通过至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失而突变诱发，使得该位点的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。通常，至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR及CDR序列的那些残基。如本文使用的，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes to Clones[从基因到克隆](Verlagsgesellschaft,Weinheim,德国1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的各位置由该家族中最频繁出现于该位置的氨基酸占据。若两个氨基酸同等频繁地出现，则共有序列中可包括任一个。
在本领域中使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，除非明确地对立指出，否则本文使用的术语的定义包括所有这些含义。一个具体的例子是使用“互补决定区”(“CDR”)一词来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。这一特定区域在Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest(1983)和Chothia等在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)有相关描述，其通过引用全部并入本文。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以不依赖于序列本身以外的其他实验数据将该“Kabat编号”系统应用到任何可变区序列。“Kabat编号”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services在“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。抗体还可以用EU或Chothia、AbM、Contact、IMGT等编号系统。
本发明公开的抗体可以来源于任何动物，包括但不限于鱼类、鸟类和哺乳动物。较佳地，抗体是人源、鼠源、驴源、兔源、山羊源、骆驼源、美洲驼源、马源或鸡源抗体。在另一实施方案中，可变区可以是软骨鱼纲(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。
“重链恒定区”包括CH1结构域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或变体或片段中的至少一种。抗体的重链恒定区可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，抗体的重链恒定区可以包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，重链恒定区可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实施方案中，部分重链可以包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链区。
“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的一部分氨基酸序列。较佳地，轻链恒定区包含恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链-重链对”是指可通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
“二硫键”指两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸的硫醇基团可以与第二个硫醇基团形成二硫键或桥接。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接。
“嵌合抗体”指其可变区从第一个物种中获得或衍生，而其恒定区(可以是完整的、部分的或修饰过的)来源于第二个物种的任何抗体。某些实施方案中，可变区来自非人源(例如小鼠或灵长类动物)，而恒定区来自人源。
本文所用术语“表位”包括任意能够特异性结合免疫球蛋白或其片段或T细胞受体的蛋白决定区。表位决定区通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
如本文所用，术语“特异性结合”或“发生免疫反应”是指在免疫球蛋白分子与其目标抗原的一个或多个抗原决定簇之间发生的非共价相互作用。免疫学结合相互作用的强度或亲和力可以以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中较小的KD代表较大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可使用本领域熟知方法进行定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同等影响该速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)两者可通过计算浓度和实际的缔合和解离速率测定(参见Malmqvist,M.,Nature 361:186-87(1993))。koff/kon比率能够消除所有与亲和力无关的参数，并且等于平衡解离常数KD(参见Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473)。特异性结合可由放射性配体结合测定、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术结合测定、或本领域技术人员已知的类似测定所测。
本发明中关于细胞、核酸、多肽等所使用的术语“分离的”，例如“分离的”DNA、RNA、多肽是指分别于细胞天然环境中的其它组分如DNA或RNA中的一种或多种所分离的分子。本发明使用的术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽意在包括纯化的和重组的多肽。分离的多肽等通常通过至少一个纯化步骤制备。在一个或多个实施方式中，分离的核酸、多肽等的纯度至少为约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。
术语“编码”应用于多聚核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。
术语“重组”涉及多肽或多聚核苷酸，意指天然不存在的多肽或多聚核苷酸的形式，不受限制的实施例可以通过组合产生通常并不存在的多聚核苷酸或多肽。
“氨基酸”是指既含氨基又含羧基的有机化合物，比如α-氨基酸、β-氨基酸，其可直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸由三个核苷酸(所谓的密码子或碱基三联体)组成的核酸编码。每一个氨基酸由至少一个密码子编码。相同氨基酸由不同密码子编码称为“遗传密码的简并性”。氨基酸包括天然氨基酸和非天然氨基酸。
如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren编辑，Sinauer Associates,Sunderland Mass.(1991))。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸(诸如α-、α-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、乳酸及其它非常规氨基酸也可为适用于本公开多肽的组分。非常规氨基酸的示例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酰、σ-N-甲基精氨酸及其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽表示方法中，左手方向为氨基末端方向，并且右手方向为羧基末端方向，与标准用法和惯例一致。常规(或天然)氨基酸包括丙氨酸(三字母代码：Ala，一字母代码：A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)、缬氨酸(Val，V)等。
术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的氨基酸单体形成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何单条链或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，“多肽”的定义中包括肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指两个或多个氨基酸链的任何其他术语，并且术语“多肽”可以用来代替上述任何一个术语，或者与上述任何一个术语交替使用。术语“多肽”也意在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割或非天然发生的氨基酸修饰。多肽可以源自天然生物来源或通过重组技术产生，但其不必从指定的核酸序列翻译所得，它可能以包括化学合成的任何方式产生。
术语“多核苷酸”、“多聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多聚核苷酸是由四个碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，或当多聚核苷酸是RNA时胸腺嘧啶换为尿嘧啶(U)。“多聚核苷酸序列”可以以多聚核苷酸分子的字母表示。该字母表示可以被输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，例如用于功能基因组学和同源性搜索。多聚核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是不受限制的多聚核苷酸的实施例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多聚核苷酸、分支的多聚核苷酸、质粒、载体、DNA、RNA、核酸探针和引物。多聚核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在该修饰，则对核苷酸的结构修饰可以在组装多聚核苷酸之前或之后进行。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多聚核苷酸，例如通过与标记组分缀合。这个术语也指双链和单链分子。除另有说明或要求外，本公开的任何多聚核苷酸的实施例包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种可互补单链形式中的每一种。
多聚核苷酸或多聚核苷酸序列(或多肽或抗体序列)与另一序列有具有一定百分比(例如90％、95％、98％或者99％)的“同一性或序列同一性”是指当序列比对时，所比较的两个序列中该百分比的碱基(或氨基酸)相同。可以使用目测或本领域已知的软件程序来确定该比对和同一性百分比或序列同一性，比如Ausubel et al.eds.(2007)在CurrentProtocols in Molecular Biology中所述的软件程序。优选使用默认参数进行比对。其中一种比对程序是使用默认参数的BLAST，例如BLASTN和BLASTP，两者使用下列默认参数：Geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant；GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swi ssProtein+SPupdate+PIR。生物学上等同的多聚核苷酸是具有上述指定百分比的同一性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的多聚核苷酸。
抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变化都涵盖在本公开之内，条件是氨基酸序列的同一性保持至少90％，如至少92％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，变化为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的取代。基因编码的氨基酸大致分以下类：(1)酸性氨基酸为天冬氨酸盐、谷氨酸盐；(2)碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)无电荷的极性氨基酸为甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。其它家族的氨基酸包括(i)脂肪族-羟基家族的丝氨酸和苏氨酸；(ii)含酰胺家族的天冬酰胺和谷氨酰胺；(iii)脂肪族家族的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及(iv)芳族家族的苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、以及天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，可以合理地预测用异亮氨酸或缬氨酸单独的置换亮氨酸，用谷氨酸盐置换天冬氨酸盐，用丝氨酸置换苏氨酸，或用一个结构相关的氨基酸类似的置换一个氨基酸，且对所得分子的结合或特性不会有重要影响，特别是该置换不涉及结合位点内的氨基酸。氨基酸改变是否产生功能性肽可以容易地通过测定多肽衍生物的比活性来确定。所述测定在本文进行了详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可由本领域普通技术人员容易地制备。
在一些实施方案中，氨基酸取代具有如下效果：(1)降低对蛋白水解作用的敏感性，(2)降低对氧化作用的敏感性，(3)改变用于形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改进此类类似物的其它物理化学或功能特性。类似物可包括序列不同于天然存在的肽序列的各种突变蛋白。例如，可在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分中)中进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应当显著改变亲本序列的结构特性(例如，置换的氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋结构，或破坏表征亲本序列的其它类型二级结构)。人工识别的多肽的二级和三级结构的示例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton编辑，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction toProtein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)。
VL、VH的保守氨基酸取代的氨基酸数目可以为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。重链恒定区、轻链恒定区、重链或轻链的保守氨基酸取代的氨基酸数目可以为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约8个、约9个、约10个、约11个、约13个、约14个、约15个、约18个、约19个、约22个、约24个、约25个、约29个、约31个、约35个、约38个、约41个、约45个保守氨基酸取代，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端值)或其中任何值。
如本文所用，术语“标记”或“经标记的”是指掺入可检测标记，例如，通过掺入放射性标记的氨基酸，或者附着于可由标记的亲和素(例如，含有荧光标记或可由光学方法或量热法检测的酶活性的链霉亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标记物或标记也可为治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记物的示例包括但不限于以下项：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)，荧光标记物(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶标记物(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素酰基，被二级报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减小可能的空间位阻。术语“药剂”或“药物”是指适当施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。
“约”指相关技术领域技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。在一些实施方式中，本文中提到“约”指所描述的数值以及其±10％、±5％或±1％的范围。
“EC50”即半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防、减缓、改善或停止不良的生理改变或紊乱，例如疾病的进程，包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善、缓和、减轻或消失(无论是部分还是全部)、延长与不接受治疗时预期的生存期限等。需要治疗的患者包括已经患有病症或紊乱的患者，容易患有病症或紊乱的患者，或者需要预防该病症或紊乱的患者，可以或预期从施用本发明公开的抗体或药物组合物用于检测、诊断过程和/或治疗中受益的患者。
术语“肿瘤”意指或意在描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是细胞生长失控包括良性肿瘤和恶性肿瘤如癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤或白血病。此类癌症的更具体实例包括但不限于大肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、唾液腺癌、腹膜癌、输卵管癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈鳞形细胞癌、鼻咽癌、喉癌、肺腺癌、肺鳞癌、肝癌、肝细胞癌、胃肠道癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、脑癌、肾癌、肾细胞癌、直肠癌、前列腺癌、外阴癌、睾丸癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、子宫颈癌、膀胱癌、视网膜母细胞瘤、神经胶母细胞瘤、间皮瘤、口腔上皮样癌、绒毛膜癌和头颈癌。
如本文所用，术语“给予”、“给药”和“施用”可互换使用，意指递送物质(例如，抗体或融合蛋白)以实现治疗目的(例如，治疗与PD-L1或IL-15有关的疾病)。给予方式可以是肠胃外、肠内和局部。肠胃外给予通常是通过注射，包括但不限于静脉、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、以及胸骨内注射和输注。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指药物，例如抗体或融合蛋白的量，该量足以降低或改善病症(例如癌症)或其一种或多种症状的严重程度和/或持续时间；预防病症进展；引起病症消退；预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展；检测病症；或增强或改善另一疗法(例如预防剂或治疗剂)的预防或治疗效果的量。例如，抗体或融合蛋白的有效量可以抑制肿瘤生长(例如，抑制肿瘤体积的增加)；减少肿瘤生长(例如，减小肿瘤体积)；减少癌细胞的数量；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。例如，有效量可以改善无病生存(DFS)、改善总体存活(OS)或降低复发的可能性。
术语“患者”是指需要诊断、预后或治疗的任何哺乳动物，包括但不限于人类、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。
如本文所用，术语“有需要”是指已将患者鉴定为需要特定方法或治疗。在一些实施例中，可以通过任何诊断方式进行识别。在本文描述的任何方法和治疗中，患者可能需要。
本文所用术语“治疗肿瘤的药物”是指具有抑制肿瘤在人体中发展或累进的功能特性的试剂，尤其是恶性(癌性)病变，诸如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制转移在很多情况下是抗肿瘤药的特性。
“药物组合物”是指一种或多种化合物、其药学上可接受的盐或前药和其它化学组分形成的混合物，其中，“其它化学组分”是指药学上可接受的辅料和/或一种或多种其它治疗剂。
本文提及出版物的相关描述均通过引用全部并入本文。
抗PD-L1抗体和融合蛋白
本发明提供了对PD-L1蛋白具有高亲和力的抗体或抗原结合片段。抗体表现出有效的结合活性、生物学活性，并可用于治疗和诊断用途。比如，这些抗体或抗原结合片段可以有效阻断抑制性的免疫检查点，激活淋巴细胞释放细胞因子，用于治疗各种类型的癌症、肿瘤或感染等相关疾病。
在一些实施方案中，本发明的抗体使用了“杵入臼”(Knobs-into-Holes)技术(参见，例如，John B.B.Ridgway等人，‘Knobs-into-holes’engineering of antibodyCH3domains for heavy chain heterodimerization,Protein Engineering,9(7):p.617-21(1996)；专利US8216805B2)。该技术可在抗体的不同链之间改造界面，以促进抗体的各条链正确缔合。通常，该技术涉及在一条链的界面引入“凸起”(“杵(knobs)”)，在欲与之配对的另一条链的界面引入相应的“空穴”(“臼(holes)”)，使得凸起可置于空穴中。可通过将来自一条链的重链恒定结构域的CH3结构域的界面的氨基酸侧链替换为较大的侧链(如氨基酸置换T366W(Eu编号))来构建凸起。通过将大氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如氨基酸置换T366S、L368A和Y407V(Eu编号))，在欲配对的另一条链的重链恒定结构域的CH3结构域的界面构建与凸起相同或相似大小的补偿性空穴。
在一些实施方案中，抗体的一条重链的恒定区包含如下氨基酸突变：Y349C，T366S，L368A和Y407V(EU编号)，抗体的另一条重链的恒定区包含如下氨基酸突变：S354C和T366W(EU编号)，形成“杵入臼(Knobs-into-Holes)”的稳定缔合。
本领域普通技术人员还应当理解，本发明所公开抗体或抗原结合片段序列是可以被替换的，替换后其氨基酸序列不同于该抗体的天然存在的氨基酸序列。例如，替换后的氨基酸序列可以是与起始序列相似的，比如与起始序列具有一定比例的同一性，比如它可以与起始序列的同一性是约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％，或这些数值中的任何两个值之间的范围(包括端点)或其中任何值。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含氨基酸序列具有一个或多个修饰基团。例如，本发明公开的抗体或抗原结合片段可以包含有韧性的接头序列，或者可以被修饰以添加功能性基团(例如PEG、药物、毒素或标签)。
本发明公开的抗体、抗原结合片段及其融合蛋白包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体或抗原结合片段或其融合蛋白的共价连接进行修饰，其中共价连接不会阻止抗体或抗原结合片段或其融合蛋白与表位结合。包括但不限制以下实例，抗体或抗原结合片段或其融合蛋白可以被糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。众多化学修饰中的任一种修饰可以通过现有技术进行，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与治疗剂、药物前体、肽、蛋白质、酶、病毒、脂类、生物反应调节剂、药剂或PEG缀合。
抗体或抗原结合片段可通过将其偶联至化学发光化合物来被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光从而确定化学发光标记的抗体或抗原结合片段的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
在一些实施方案中，为了便于抗体在宿主细胞中表达，还可以在抗体的重链和轻链添加信号肽序列，例如重链信号肽：MEFGLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:75)，轻链信号肽：MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:76)。
在一些实施方案中，本发明还提供了融合蛋白，其包含PD-L1结合结构域和刺激NK和T细胞活性的结构域。在一些实施方案中，PD-L1结合结构域为抗PD-L1抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，刺激NK和T细胞活性的结构域包含IL-15或其受体结合片段或其变体和IL-15Rα或其sushi结构域或其变体。sushi结构域以高亲和力结合IL-15，并且IL-15与sushi结构域的复合物对于刺激NK和T细胞增殖具有较高的活性。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段、IL-15或其受体结合片段或其变体和IL-15Rα或其sushi结构域或其变体。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段、IL-15和IL-15Rα的融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段、IL-15和IL-15Rα的sushi结构域的融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段、IL-15受体结合片段和IL-15Rα的sushi结构域的融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段、IL-15或其受体结合片段的变体和IL-15Rα或其sushi结构域的变体的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述IL-15包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:82所示序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:82所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-15Rαsushi结构域包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81所示序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-15或其受体结合片段的变体包含与IL-15或其受体结合片段具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-15或其受体结合片段的变体与IL-15或其受体结合片段相比具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述IL-15Rα或其sushi结构域的变体包含与IL-15Rα或其sushi结构域具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IL-15Rα或其sushi结构域的变体与IL-15Rα或其sushi结构域相比具有一个或多个保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述融合蛋白的抗PD-L1抗体或抗原结合片段通过连接子与IL-15或其受体结合片段或其变体以及IL-15Rα或其sushi结构域或其变体连接。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体的一条重链的C端通过连接子与IL-15或其受体结合片段或其变体连接，抗PD-L1抗体的另一条重链的C端通过连接子与IL-15Rα或其sushi结构域或其变体连接。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体的一条重链的C端通过连接子与IL-15连接，抗PD-L1抗体的另一条重链的C端通过连接子与IL-15Rα的sushi结构域连接。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体的一条重链的恒定区包含如下氨基酸突变：Y349C，T366S，L368A和Y407V(EU编号)，抗PD-L1抗体的另一条重链的恒定区包含如下氨基酸突变：S354C和T366W(EU编号)，形成“杵入臼(Knobs-into-Holes)”的稳定缔合，极大促进了两条重链的正确组装，最大程度减少错配。
在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸(“GS接头”)。在一些实施方案中，所述连接子为(GmS)n，其中，每个m独立为1、2、3、4、5或6，n为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子为GGGGS。在一些实施方案中，所述连接子为(GGGGS)2。在一些实施方案中，所述连接子为(GGGGS)3，如SEQ ID NO:85所示。在一些实施方案中，所述连接子为(GGGGS)4。在一些实施方案中，所述连接子为(GGGGS)5。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白包含第一多肽、第二多肽和第三多肽；第一多肽包含抗PD-L1重链a、连接子和IL-15Rα或其sushi结构域或其变体，第二多肽包含抗PD-L1重链b、连接子和IL-15或其受体结合片段或其变体，第三多肽为抗PD-L1轻链。在一些实施方案中，所述融合蛋白的结构示意图如图1所示，由4条多肽组成，包含一条第一多肽、一条第二多肽和两条序列相同的第三多肽。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:83所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:83所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二多肽包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:84所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:84所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第三多肽包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，或与SEQID NO:66所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，所述第三多肽包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合蛋白为融合蛋白A。
抗体、融合蛋白的制备方法
本发明还公开了编码本发明所述抗体、抗原结合片段、融合蛋白及其衍生物的多聚核苷酸或核酸分子。本发明公开的多聚核苷酸可以编码重链可变区、轻链可变区、Fc区、部分重链可变区、部分轻链可变区、重链、轻链或融合蛋白等。制备抗体、融合蛋白的方法是本领域公知的并且在本发明中有所描述。
在某些实施方案中，制备的抗体不会在待治疗的动物(例如人类)中引起有害的免疫应答。在一些实施方案中，本发明公开的抗体、抗原结合片段、或衍生物使用本领域公认的技术修饰以降低其免疫原性。例如，抗体可以被人源化、灵长类化、去免疫化或者可以制备嵌合抗体。这些类型的抗体来源于非人抗体，通常是鼠类或灵长类抗体，其保留或基本保留亲本抗体的抗原结合特性但在人体中免疫原性较低。其可以通过多种方法来实现，包括(a)将整个非人源的可变区移植到人源的恒定区以产生嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人源的框架和恒定区中，保留或不保留关键的框架残基；或(c)移植整个非人源的可变区，但通过用类人源的部分置换表面残基从而“隐藏”它们。通常人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，比如能够改善抗原结合的残基。这些框架替换可以通过本领域公知的方法鉴定，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用以鉴定对抗原结合起重要作用的框架残基和通过序列对比以鉴定特定位置上异常的框架残基。(参考美国专利5,585,089；其全部内容通过引用并入本文)。可以使用本领域公知的多种技术使抗体人源化，例如CDR移植(WO1991009967；美国专利5,225,539,5,530,101和5,585,089)，修复或者表面重排(EP592,106；EP519,596；以及链的重排(美国专利5,565,332)，其全部内容通过引用并入本文。
去免疫化也可用于降低抗体的免疫原性。在本发明中，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位(参见例如WO2000034317 A2)。例如，分析来自起始抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列，并产生来自每个可变区的人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDRs)和序列内其它关键残基的位置。分析来自T细胞表位图的单个T细胞表位，以鉴定具有较低改变抗体活性风险的可选择的氨基酸取代。设计包含氨基酸取代组合的一系列可选的重链可变区序列和轻链可变区序列，随后将这些序列掺入到一系列结合多肽中。然后将包含修饰过的可变区和人类恒定区的完整重链和轻链的基因克隆到表达载体中，随后将质粒转入细胞系以产生完整的抗体。然后利用合适的生物化学和生物学实验中比较抗体，鉴定出最佳的抗体。
本发明公开的抗体或抗原结合片段的结合特异性可以通过体外实验，例如免疫共沉淀、放射免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)来检测。
scFv的制备可参见生产单链单元的技术(美国专利4,946,778)。通过氨基酸桥接Fv区的重链和轻链片段形成单链单元，产生单链融合肽。也可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.,Science 240:1038-1041(1988))。
可用于生产单链Fv(scFv)和抗体的技术的实例包括如美国专利4,946,778和5,258,498中所述。对于包括在人体内使用抗体和体外检测实验的某些用途，可以使用嵌合抗体、人源化抗体或全人源抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分源自不同动物物种的一类分子，例如具有鼠源单克隆抗体的可变区和人源免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见美国专利5,807,715、4,816,567和4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。
此外，在Newman,Biotechnology 10:1455-1460(1992)中公开了另一种生产重组抗体的高效方法，特别地，该技术能产生含有猴可变区和人恒定区序列的灵长类抗体，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。此外，该技术也在美国专利5,658,570、5,693,780和5,756,096中有所提及，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自免疫球蛋白序列的抗体文库进行的噬菌体展示方法。也可参考美国专利4,444,887和4,716,111，以及PCT公布文本WO 1998050433、WO 1998024893、WO 1998016654、WO 1996034096、WO 1996033735和WO1991010741，每个专利的全部内容通过引用并入本文。
在另一些实施方案中，使用常规方法(例如使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞可以作为此类DNA的来源。一旦分离出来，DNA可以被置于表达载体中，然后被转染到原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中。分离的DNA(如本文所述可以是合成的)也可用于制备抗体的恒定区和可变区的序列，如美国专利5,658,570中所述，其全部内容通过引用并入本文。该方法从所选细胞中提取RNA并转化成cDNA，然后使用Ig特异性引物通过PCR技术进行扩增。适于此目的的合适的探针在美国专利5,658,570中也有所提及。
此外，使用常规重组DNA技术，可将本发明的抗体的一个或多个CDR插入框架区，例如插入到人类框架区以构建人源化非全人源抗体。框架区可以是天然存在的或共有的框架区，优选人类框架区(参见Chothia et al.,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)，其列出一系列人类框架区)。一些多核苷酸可以编码框架区和CDR组合产生的与目标抗原的至少一个表位特异性结合的抗体。在框架区内可以进行一个或多个氨基酸取代，可以选择能够改善抗体与其抗原结合的氨基酸取代。另外，可用此法进行参与链间二硫键形成的一个或多个可变区中半胱氨酸残基的取代或缺失，从而产生缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。本领域技术范围内的对多核苷酸进行的其他改变也涵盖于本发明中。
抗体或融合蛋白可以通过使用常规重组DNA技术制备。使用本领域技术人员公知的技术可以选择、构建和培养生产抗体或融合蛋白的载体及细胞系等。这些技术在各种实验室手册和主要出版物中均有描述，例如Recombinant DNA Technology for Productionof Protein Therapeutics in Cultured Mammalian Cells，D.L.Hacker,F.M.Wurm,Reference Module in Life Sciences,2017，其全部内容包括补充内容通过引用并入全文。
在一些实施方案中，可以按常规方法根据本文所述抗体或融合蛋白氨基酸序列设计合成编码抗体或融合蛋白的DNA，将其置入表达载体中，然后转染宿主细胞，在培养基中培养被转染的宿主细胞产生单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，表达抗体或融合蛋白载体包括至少一个启动子元件，抗体或融合蛋白编码序列，转录终止信号和polyA尾巴。其他元件包括增强子，Kozak序列及插入序列两侧RNA剪接的供体和受体位点。可以通过SV40的前期和后期启动子，来自逆转录病毒的长末端重复序列如RSV、HTLV1、HIVI及巨细胞病毒的早期启动子来获得高效的转录，也可应用其它一些细胞的启动子如肌动蛋白启动子。合适的表达载体可包括pIRES1neo，pRetro-Off，pRetro-On，pLXSN，pLNCX，pcDNA3.1(+/-)，pcDNA/Zeo(+/-)，pcDNA3.1/Hygro(+/-)，pSVL，pMSG，pRSVcat，pSV2dhfr，pBC12MI或pCS2等。常使用的哺乳动物细胞包括HEK293细胞，Cos1细胞，Cos7细胞，CV1细胞，鼠L细胞和CHO细胞等。
在一些实施方案中，插入基因片段需含有筛选标记，常见的筛选标记包括二氢叶酸还原酶，谷氨酰胺合成酶，新霉素抗性，潮霉素抗性等筛选基因，以便于转染成功的细胞的筛选分离。将构建好的质粒转染到无上述基因的宿主细胞，经过选择性培养基培养，转染成功的细胞大量生长，产生想要获得的目的蛋白。
此外，可以使用本领域技术人员已知的标准技术在编码本发明所述抗体或融合蛋白的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于导致氨基酸取代的定点突变和PCR介导的突变。变体(包括衍生物)编码相对于原目标蛋白来说少于50个氨基酸的取代、少于40个氨基酸的取代、少于30个氨基酸的取代、少于25个氨基酸的取代、少于20个氨基酸的取代、少于15个氨基酸的取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代或少于2个氨基酸的取代。或者可以沿着全部或部分编码序列时随机引入突变，例如通过饱和突变，以及可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。
治疗方法
本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，提供了用于预防、治疗或改善各种类型的自身免疫学疾病、癌症、肿瘤或感染等相关疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的抗PD-L1抗体或抗原结合片段或融合蛋白。在一些实施方案中，提供了抗PD-L1抗体或抗原结合片段或融合蛋白在用于预防、治疗或改善自身免疫学疾病、癌症、肿瘤或感染等相关疾病中的应用。在一些实施方案中，提供了所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段或融合蛋白在制备用于预防、治疗或改善自身免疫学疾病、癌症、肿瘤或感染等相关疾病的药物中的应用。
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包括所使用的特定抗体或融合蛋白或衍生物、患者的年龄和体重、一般健康状况、性别和饮食，以及给药时间、排泄频率、药物组合，以及所治疗的特定疾病的严重程度。由包括在本领域普通技术人员范围内的医疗护理人员对这些因素进行判断。所述剂量还将取决于待治疗的个体患者、给药途径、制剂类型、所用化合物的特性、疾病的严重程度以及所需的效果。所用剂量可以通过本领域熟知的药理学和药代动力学原理确定。
抗体或融合蛋白或衍生物的施用方法包括但不限于通过真皮内、肌肉、腹腔、静脉、皮下、鼻腔、硬脊膜外和口服施用。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂共同施用。因此，含有本发明抗体或抗原结合片段或融合蛋白的药物组合物可以口服给药、直肠给药、肠胃外给药、膀胱内给药(如膀胱内灌注)、脑池内给药、阴道内给药、腹腔内给药、外敷(如通过粉末，软膏，滴剂或透皮贴剂)、口腔给药或通过口服或鼻腔喷雾给药。
本发明使用的术语“肠胃外”是指包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。
施用方式可以是全身施用或局部施用。此外，可能需要通过任何合适的途径将本发明的抗体或融合蛋白引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可以通过脑室内导管连接到如贮液囊(可以是Ommaya贮液囊)来辅助注射。也可以通过肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及使用雾化的制剂。
本发明抗体或融合蛋白可以局部施用于需要治疗的区域；可以通过但不限于以下方式：手术期间局部输注，例如与手术后伤口敷料联合的局部应用，通过注射，通过导管，借助栓剂或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(例如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体或融合蛋白)时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
在一些实施方案中，本发明提供包含编码抗体或融合蛋白的核酸或多聚核苷酸，可以通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分来体内施用所述核酸或多聚核苷酸以促进其编码的蛋白质的表达，然后通过下述方式施用上述核酸或多聚核苷酸或载体使其变为胞内部分，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被，或者通过与已知进入细胞核的同源异型盒类肽连接施用(参见例如Joliot etal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868)等等。可选地，核酸可以通过同源重组在引入细胞内并整合至宿主细胞DNA中用于表达。
在一些实施方案中，本发明抗体或融合蛋白施用于患者的剂量为0.01mg/kg至100mg/kg患者体重，或0.1mg/kg至20mg/kg患者体重。在初始剂量之后可随后给予第二剂或多剂该抗体或抗原结合片段或融合蛋白，其剂量与初始剂量大致相同或较少，其中该随后的剂量可相隔至少1天至3天；或至少一星期。也可以用一个较低的起始剂量增加耐受性，后续提高剂量给药。可以通过例如脂质化等修饰来增强抗体或融合蛋白的摄取和组织穿透能力(例如进入脑内)，从而减少本发明抗体或融合蛋白的施用的剂量和频率。
各种已知输送系统可用于施用本发明抗体或融合蛋白或衍生物或编码其的多核苷酸，例如包封于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。
联合疗法
在一些实施方案中，本发明抗PD-L1抗体或抗原结合片段或融合蛋白可以结合其它治疗或预防方案，包括施用一种或多种本发明抗体或抗原结合片段或融合蛋白以及一种或多种其它治疗剂或方法一起使用或组合使用。在一些实施方案中，其他治疗方案包括但不限于放射疗法、化学疗法、激素疗法等。对于组合治疗，抗体或融合蛋白可以与其它治疗剂可同时或分开施用。当分开施用时，可以在施用另一种其它治疗剂之前或之后施用本发明抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明抗体或融合蛋白与化疗剂组合施用。在一些实施方案中，可与本发明抗体或融合蛋白一起施用的化疗剂包括但不限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、柔红霉素和放线菌素D)、抗雌激素药(如他莫昔芬)、抗代谢物(如氟尿嘧啶、5-FU、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光神霉素、巯基嘌呤和6-硫基鸟嘌呤)、细胞毒性剂(如卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)、激素(如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲睾酮、己烯雌酚二磷酸、氯烯雌醚和睾内酯)、氮芥衍生物(例美法仑、苯丁酸氮芥、二氯甲基二乙铵(氮芥)和噻替哌)、类固醇及其组合(如倍他米松磷酸钠)，以及其它化合物(如氮烯唑胺、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。
在一些实施方案中，本发明抗PD-L1抗体或融合蛋白与化疗剂联合施用。化疗剂的实例包括免疫治疗剂，包括但不限于适用于治疗患者的治疗性抗体。治疗性抗体的一些实例包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿来组单抗、依帕珠单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗和贝伦妥单抗等。
药物组合物
本发明还提供了药物组合物。这样的组合物包含抗PD-L1抗体或抗原结合片段或融合蛋白以及药学上可接受的辅料。在一些实施方案中，药物组合物包含0.1％-99％的抗PD-L1抗体或抗原结合片段或融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂)。
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由政府的监管机构批准的或公认药典中列出的用于动物，特别是用于人类的物质。此外，“药学上可接受的辅料”通常指是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂等。
术语“辅料”是指可以与活性成分一起施用于患者的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸、螯合剂，以及调节张力的试剂如或右旋葡萄糖也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。此类组合物将含有临床有效剂量的抗体或抗原结合片段或融合蛋白，优选以纯化后的形式，连同合适数量的辅料，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药模式。亲本制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一些实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分以单位剂量形式单独供给或混在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在表示活性成分含量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水在施用之前混合活性成分。
本发明的抗体或抗原结合片段或融合蛋白可以为中性的或盐的形式。药学上可接受的盐包括衍生自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的与阴离子形成的盐，以及衍生自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的与阳离子形成的盐。
实施例
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：抗PD-L1抗体和融合蛋白A的制备
1)抗PD-L1抗体的制备
示例抗体的组成及相关序列见表1-10；其中抗体的重链、轻链组成见表1，抗体重链和轻链CDR区见表2，抗体重链CDR区的组成见表3和表4，抗体轻链CDR区的组成见表5。
将编码抗体重链和轻链的DNA序列分别克隆至表达载体中，然后分别抽提质粒，重链和轻链按质粒摩尔比1:1瞬时转染HEK293F细胞。经细胞培养和纯化后获得抗PD-L1抗体，测序结果与预计的序列相同。
表1抗体的重链和轻链组成
表2抗体重链和轻链CDR区
表3抗体重链CDR区的组成
表4抗体重链CDR区的组成
表5抗体轻链CDR区的组成
表6抗体重链可变区
表7抗体轻链可变区
表8抗体恒定区
表9抗体重链序列
表10抗体轻链序列
2)融合蛋白A的制备
融合蛋白A的结构示意图如图1所示，由4条多肽组成：第一多肽(如SEQ ID NO:83所示)、第二多肽(如SEQ ID NO:84所示)以及两条序列相同的第三多肽(如SEQ ID NO:66所示)；其中，第一多肽从N-末端到C-末端包含：抗PD-L1重链a(如SEQ ID NO:79所示)、连接子(如SEQ ID NO:85所示)和IL-15Rαsushi结构域(如SEQ ID NO:81所示)，第二多肽从N-末端到C-末端包含：抗PD-L1重链b(如SEQ ID NO:80所示)、连接子(如SEQ ID NO:85所示)和IL-15(如SEQ ID NO:82所示)，第三多肽为抗PD-L1轻链；其中第一多肽的核酸序列如SEQ IDNO:72所示，第二多肽的核酸序列如SEQ ID NO:73所示，第三多肽的核酸序列如SEQ ID NO:74所示。融合蛋白A相关氨基酸序列见表11，相关核酸序列见表12。
将编码融合蛋白A的第一多肽、第二多肽和第三多肽的DNA序列分别克隆至表达载体中，然后瞬时转染HEK293F细胞，经细胞培养和纯化获得融合蛋白A。
表11融合蛋白A相关氨基酸序列
表12融合蛋白A相关核酸序列
实施例2：融合蛋白A与CTLL-2细胞结合判定和活性检测
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定法来评估融合蛋白A对内源性表达IL-15Rα，IL-2Rβ，IL-2Rγ的CTLL-2细胞(小鼠细胞毒性T淋巴细胞细胞系)的结合。将CTLL-2细胞用PBS缓冲液重悬为单细胞悬液，并与100μL不同浓度的融合蛋白A样品(从100nM开始，2倍连续稀释，具有10种浓度)等体积混合(均在96孔板中)，细胞50万/孔。将混合物在4℃平衡60分钟(min)，用PBS缓冲液洗涤。然后添加用作二抗的藻红蛋白(PE)缀合的羊抗人IgGFc抗体(Invitrogen,货号：12-4998-82)，并在4℃避光平衡30分钟。用PBS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用GraphPad PRISM 8(GraphPadSoftware，San Diego，CA)分析数据。如图2中所示，FACS结合测定展示出融合蛋白A能够明显与CTLL-2细胞结合。
使用CTLL-2细胞在细胞增殖分析中评估融合蛋白A的活性。在37℃5％CO2条件下，将CTLL-2细胞在RPMI-1640培养基中维持，该培养基补充有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清(FBS)以及10ng/mL IL-2。将细胞悬浮培养直到它们在分瓶之前达到每毫升5×105个细胞的细胞密度。对于活性分析，最后分瓶之后的2-3天，将细胞用RPMI-1640培养基洗涤，用含15％ FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，按照2万/孔(50μL)密度将细胞铺于96孔白板，边孔补PBS。将融合蛋白A按照如下方式稀释：稀释液为含15％ FBS的RPMI-1640培养基，抗体L1-R2-4-71和融合蛋白A样品从200nM开始，1：3稀释，50μL/孔加入上述铺好细胞的白板中。将板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时(h)。检测时提前将CellCounting-Lite2.0Luminescent Cell Viability Assay试剂从-20℃冰箱取出，平衡至室温。将细胞培养板从培养箱中取出，室温(25±3℃)平衡5～10min，每孔加入50μL CellCounting-Lite2.0Luminescent Cell Viability Assay试剂(诺唯赞，货号：DD1101-02)，室温避光孵育5～30min。用SpectraMax多功能酶标仪上的Luminescence检测模块，读取相对光单位(relative light units，RLU)。使用非线性回归，利用GraphPad PRISM 8
(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据。如图3中所示，CTLL-2细胞增殖分析展示出融合蛋白A能够明显激活CTLL-2细胞增殖活力，EC50值为0.417nM。
实施例3：融合蛋白A与HH细胞结合判定和活性检测
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定法来评估融合蛋白A对内源性表达IL-2Rβ，IL-2Rγ的HH细胞(人皮肤T淋巴细胞瘤细胞；ATCC CRL-2105)的结合。将HH细胞用PBS缓冲液重悬为单细胞悬液，并与100μL不同浓度的抗体L1-R2-4-71或融合蛋白A样品(起始浓度为100nM，2倍稀释，11个浓度梯度)等体积混合(均在96孔板中)，细胞50万/孔。将混合物在4℃平衡60分钟，用PBS缓冲液洗涤。然后添加用作二抗的藻红蛋白(PE)缀合的羊抗人IgG Fc抗体(Invitrogen，货号：12-4998-82)，并在4℃避光平衡30分钟。用PBS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用GraphPad PRISM 8(GraphPadSoftware，San Diego，CA)分析数据。如图4中所示，FACS结合测定展示出融合蛋白A能够明显与HH细胞结合。
IL-15结合IL-15Rα后，会反式作用结合IL-2Rβ和IL-2Rγ，激活下游信号通路，导致STAT5磷酸化。采用不同浓度融合蛋白A样品与HH细胞共孵育后观察STAT5磷酸化情况，评价融合蛋白A激活HH细胞活性的能力。收集对数期的HH细胞，PBS清洗后用预热的RPMI-1640培养基重悬，200万/100μL，置于37℃温育30min。期间用含10％FBS的RPMI-1640培养基稀释抗体L1-R2-4-71或融合蛋白A样品，200nM开始，2倍稀释，具有11种浓度，各100μL。分别将100μL上述稀释好的融合蛋白A样品与等体积的细胞混匀，置于37℃温育15min。然后立即置于冰上，加入等体积的4％多聚甲醛(Paraformaldehyde,FPA)溶液(终浓度2％)，固定细胞，冰上放置30min。随后用预冷的PBS缓冲液洗涤。弃去上清，加入1mL预冷的90％甲醇，冰上放置30min后用预冷的PBS缓冲液洗涤，用PBS缓冲液重悬后加入PE anti-STAT5 Phospho(Tyr694)Antibody(BioLegend，货号：936904)，室温避光孵育40min，洗涤后上机检测(Beckman CytoFlex)，统计平均荧光强度(Mean Fluorescent Intensity,MFI)值来评价STAT5的磷酸化水平。使用非线性回归，利用GraphPad PRISM 8(GraphPad Software，SanDiego，CA)分析数据。如图5中所示，STAT5磷酸化水平分析展示出融合蛋白A能够明显激活HH细胞活性，EC50值为1.609nM。
实施例4：融合蛋白A与CHO-K1-CD122-CD132细胞结合判定
使用基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定法来评估融合蛋白A对外源性表达IL-2Rβ(CD122)，IL-2Rγ(CD132)的CHO-K1细胞(即CHO-K1-CD122-CD132细胞)的结合。将CHO-K1-CD122-CD132细胞用PBS缓冲液重悬为单细胞悬液，并与100μL不同浓度的融合蛋白A或抗体L1-R2-4-71样品(从100nM开始，2倍连续稀释)等体积混合(均在96孔板中)，细胞50万/孔。将混合物在4℃平衡60分钟，用PBS缓冲液洗涤。然后添加用作二抗的藻红蛋白(PE)缀合的羊抗人IgG Fc抗体(Invitrogen,货号：12-4998-82)，并在4℃避光平衡30分钟。用PBS缓冲液再次洗涤细胞，并通过流式细胞术分析。使用非线性回归，利用GraphPad PRISM 8(GraphPad Software，San Diego，CA)分析数据。如图6中所示，FACS结合测定展示出融合蛋白A能够明显与CHO-K1-CD122-CD132细胞结合。
CHO-K1-CD122-CD132细胞的构建方法：将连接有CD122基因序列(NCBI ReferenceSequence:NM_000878.5)的载体线性化后电转CHO-K1，培养后筛选得到CHO-CD122稳定细胞株；在CHO-CD122细胞株的基础上，用含有CD132基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_000206.3)的慢病毒进一步感染，培养后筛选得到CHO-K1-CD122-CD132稳定细胞株。
实施例5：融合蛋白A体外激活PBMC实验
本实施例概述了采用融合蛋白A样品诱导人外周血中效应淋巴细胞的选择性激活和扩增的效果。提前一晚采用500μL、200ng/mL抗CD3抗体(近岸生物，GMP-A018)包被6孔细胞培养板；第二天上午弃去上清后加入用含有15％ FBS的RPMI-1640培养基重悬的PBMC，每孔1×106细胞，每孔总体积为3mL，并分别加入融合蛋白A或抗体L1-R2-4-71，终浓度分别为0.5nM和20nM。37℃，5％ CO2下培养7天，将PBMC转移到新的6孔细胞培养板(去除抗CD3抗体)，补加融合蛋白A或抗体L1-R2-4-71，再培养5天；流式检测CD8+T、NK和NKT细胞增殖。其中CD8+T为CD3CD8双阳性T细胞(即CD3+CD8+T细胞)，NK细胞为CD16或CD56阳性细胞，NKT细胞为CD3阳性CD4CD8双阴性T细胞(即CD3+CD4-CD8-T细胞)，检测用的抗体来源如下：CD3抗体(elabscience，货号：FW2689)，CD4抗体(elabscience，货号：FW0218)，CD8抗体(elabscience，货号：FW0931)，CD16抗体(BioLegend，货号：302038)，CD56抗体(BioLegend，货号：302630)。结果如图7a-d所示，融合蛋白A相比抗体L1-R2-4-71，能够明显促进CD8+T、NK和NKT细胞扩增。
实施例6：融合蛋白A细胞因子释放实验
本实施例采用液相和固相孵育系统评价了不同测试品引起的细胞因子释放。干包法，即固相孵育系统，将25μg/mL融合蛋白A样品包被96孔细胞培养板，40μL体积/孔，于超净工作台中吹干过夜后每孔加入1×105个PBMC细胞(雷德生物，广州)，体积为200μL。湿包法，即液相孵育系统，将25μg/mL融合蛋白A样品加入96孔细胞培养板，100μL/孔，每孔加入1×105个PBMC细胞，体积为100μL。同时选用抗CD3抗体(近岸生物，GMP-A018)和TGN1412抗体(cd28激动性抗体；序列来源于专利US8709414B2)作为阳性对照抗体。孵育三天后收集上清检测IL-2，IFN-γ，IL-10,IL-6和TNF-α(MABTECH，ELISABATIC kit)。图8a-8e和图9a-9e所示，TGN1412抗体在液相和固相两种孵育系统均能非常明显的激活PBMC，表现为IL-2，IL-10,IFN-γ和TNF-α释放量远高于其他测试品，抗CD3抗体作为对照抗体，也能不同程度激活PBMC。而融合蛋白A在固相孵育系统中，不能激活PBMC释放IL-2，对于其他细胞因子的释放，和抗体L1-R2-4-71效果相当。
实施例7：融合蛋白A体内抗肿瘤功效
该实施例描述了评估融合蛋白A对PD-L1的功能阻断和IL-15R的功能激活的体内实验。因为PD-L1单抗也与小鼠PD-L1结合，IL-15也能够识别小鼠的受体，因此采用野生型小鼠能够直接体内评估不同测试品在小鼠肿瘤异种移植模型中的功效。
小鼠荷瘤模型通过将肿瘤细胞植入C57BL/6小鼠来制备。在该测定中使用稳定表达人PD-L1的鼠黑色素瘤细胞系B16F10(即B16F10-hPD-L1；南方模式动物中心)。将B16F10-hPD-L1(1×106)皮下注射到8周龄C57BL/6小鼠中。当平均肿瘤体积达到75mm3左右时，根据肿瘤体积随机分组，每组10只。肿瘤植入后第6天为分组当天，分组当天定义为D0天，并于分组当天D0天开始给药，一周给药两次，肿瘤体积测算两次。通过静脉注射向小鼠施用IgG1对照(义翘神州，HG1K)、抗体L1-R2-4-71和融合蛋白A。通过评估肿瘤尺寸的抑制来评估不同测试品的功效。其中肿瘤体积抑瘤率(TGI)计算方式为：
TGI＝[1-(TVt-TVinitial)/(CVt-CVinitial)]×100％，其中，TVt表示治疗组每次测量时的肿瘤体积；TVinitial表示分组给药时治疗组的肿瘤体积；CVt表示对照组每次测量时的肿瘤体积；CVinitial表示分组给药时对照组的肿瘤体积。图10可以看出该模型对PD-L1单抗不敏感，抗体L1-R2-4-71没有明显的药效，而融合蛋白A有比较明显的抑制肿瘤效果。

Claims (23)

1.一种融合蛋白，其包含：
i.抗PD-L1抗体或抗原结合片段；所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1、91-95任一项所示的HCDR1、SEQ ID NO:2-11中任一项所示的HCDR2、SEQ ID NO:12或13所示的HCDR3、SEQ ID NO:14-18中任一项所示的LCDR1、SEQ ID NO:19-22中任一项所示的LCDR2和SEQ ID NO:23-26中任一项所示的LCDR3；
ii.IL-15或其片段；和
iii.IL-15Rα或其sushi结构域。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ IDNO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:15所示的LCDR1、SEQ ID NO:20所示的LCDR2和SEQ ID NO:24所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:16所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:17所示的LCDR1、SEQ ID NO:22所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:18所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:3所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:5所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:6所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:7所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:15所示的LCDR1、SEQ ID NO:20所示的LCDR2和SEQ ID NO:24所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:16所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:17所示的LCDR1、SEQ ID NO:22所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:18所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:25所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:21所示的LCDR2和SEQ ID NO:26所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:3所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:4所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:5所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:6所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3；或
所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:91所示的HCDR1、SEQ ID NO:7所示的HCDR2、SEQ ID NO:12所示的HCDR3、SEQ ID NO:14所示的LCDR1、SEQ ID NO:19所示的LCDR2和SEQ ID NO:23所示的LCDR3。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；其中
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27-41中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27-41中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27-41中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42-47中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42-47中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42-47中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链可变区包含SEQ ID NO:27-41中任一项所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42-47中任一项所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:43所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:44所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列；或
所述重链可变区包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区；其中
所述重链恒定区包含SEQ ID NO:48或49所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48或49所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48或49所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；或
所述重链恒定区包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ IDNO:50所示的氨基酸序列。
7.如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区a、重链恒定区b和轻链恒定区；所述重链恒定区a和/或重链恒定区b包含选自Y349C、S354C、T366W、T366S、L368A和Y407V的氨基酸突变；或者
所述重链恒定区a包含选自S354C、T366W的氨基酸突变；和/或
所述重链恒定区b包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V的氨基酸突变；
其中氨基酸位置为Eu编号。
8.如权利要求1-5、7所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链恒定区包含氨基酸突变：K447A，其中氨基酸位置为Eu编号。
9.如权利要求7或8所述的融合蛋白，其特征在于，
所述重链恒定区a包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:77所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:77所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述重链恒定区b包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:78所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:78所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链恒定区a包含SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述重链恒定区b包含SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
11.如权利要求1-6任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体包含重链和轻链；其中
所述重链包含SEQ ID NO:51-65中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:51-65中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:51-65中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:66-71中任一项所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66-71中任一项所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66-71中任一项所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列；或
所述重链包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
13.如权利要求1-4、7-10任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体包含重链a、重链b和轻链；其中
所述重链a包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:79所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:79所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述重链b包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:80所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:80所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列相比具有一或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
14.如权利要求13所述的融合蛋白，其特征在于，所述重链a包含SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列，所述重链b包含SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
15.如权利要求1-14任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-15包含SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:82所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:82所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
16.如权利要求1-15任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL-15Rα或其sushi结构域包含SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:81所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
17.如权利要求1-16任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段通过连接子与IL-15或其片段以及IL-15Rα或其sushi结构域连接；或者，所述抗PD-L1抗体的一条重链的C端通过连接子与IL-15或其片段连接，所述抗PD-L1抗体的另一条重链的C端通过连接子与IL-15Rα或其sushi结构域连接。
18.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子为GS接头；或者，所述连接子独立选自GS，GGS，GGGS，GGGGS，SGGGS，GGSS，(GGGGS)2，(GGGGS)3，或其任意组合；或者，所述连接子为(GmS)n，其中，每个m独立为1、2、3、4、5或6，n为1、2、3、4或5。
19.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含第一多肽、第二多肽和第三多肽；其中
所述第一多肽包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:83所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:83所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述第二多肽包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:84所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:84所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列；和/或
所述第三多肽包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66所示序列相比具有一个或多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
20.一种融合蛋白，其包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含SEQ IDNO:83所示的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，所述第三多肽包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
21.一种生物材料，为
(1)一种多聚核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1-20任一项所述的融合蛋白或其一部分；
(2)一种载体，其特征在于，其包含编码如权利要求1-20任一项所述的融合蛋白或其一部分的多聚核苷酸；或
(3)一种细胞，其特征在于，其包含编码如权利要求1-20任一项所述的融合蛋白或其一部分的多聚核苷酸。
22.一种药物组合物，其包含权利要求1-20任一项所述的融合蛋白；或者，还包含药学上可接受的辅料。
23.如权利要求1-20任一项所述的融合蛋白或如权利要求22所述的药物组合物在预防、治疗或改善疾病或在制备用于预防、治疗或改善疾病的药物中的应用；或者，所述疾病为感染、自身免疫性疾病、癌症或肿瘤。
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