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CN120098009A - 咔唑衍生物修饰的d-a-d分子及应用 - Google Patents

咔唑衍生物修饰的d-a-d分子及应用 Download PDF

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CN120098009A CN202510119024.7A CN202510119024A CN120098009A CN 120098009 A CN120098009 A CN 120098009A CN 202510119024 A CN202510119024 A CN 202510119024A CN 120098009 A CN120098009 A CN 120098009A
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Abstract

本发明提供咔唑衍生物修饰的D‑A‑D分子及应用，该咔唑衍生物修饰的D‑A‑D分子具有式(I)所示通式：该D‑A‑D分子具有高亮度特点，与现有的具有烷基取代芴结构的S‑D‑A‑D‑S分子相比，在近红外二区窗口中具有更好的成像效果，可用于体内各种病灶显影，尤其是微小病灶显影。

Description

咔唑衍生物修饰的D-A-D分子及应用
技术领域
本发明涉及有机合成及成像技术领域，具体涉及咔唑衍生物修饰的D-A-D分子及应用。
背景技术
供体-受体-供体小分子(D-A-D分子)是众所周知的具有高荧光量子产率和强光稳定性的有机NIR-II发射体。2016年，Dai等以三苯胺为供体，BBTD为受体，构建了具有NIR-II成像特征的第一个D-A-D结构小分子染料CH1055。随后研究人员围绕D-A-D结构进行不同策略的改进以获得性能更加优异的近红外二区荧光探针。为了获得更长的发射波长，有很多报道对供体和受体进行了设计。Hong等用2-氨基9,9-二烷基取代芴作为供体，设计了NIR-II生物成像分子H1。[1]修饰后的芴单元扭曲了BBTD主链，从而减少了分子间相互作用，增加了分子间距离，在一定程度上提高了荧光QY。聚乙二醇化H1具有良好的生物相容性和清除效率，注射后数小时内可达到90％的肾脏清除率。Jiang等分别使用氨基、叔丁基碳基和苯唑功能化三苯胺作为电子供体部分设计并合成了D-A-D结构荧光团TPB-AM、TPB-BAM和TPBAZO。[2]TPB-AZO在909nm处出现了蓝移发射峰，但QY值较高，为21.59％。TPB-AM和TPB-BAM的红移发射和弱QY归因于供体部分的氨基，增强了ICT效应。Ma等以BSBT为受体设计分子FM1210，并与BBTD作为受体的分子CF1065进行比较，FM1210表现出145nm的显著红移，同时Se的引入对QY和亮度几乎没有影响。[3]CF1065在二氯甲烷溶液中的最大吸收和发射波长分别为855nm和1065nm，而FM1210的最大吸收和发射波长分别为980nm和1210nm。
此外，在分子末端引入屏蔽单元以提高量子产率也成为领域里通用的方法，如烷基取代芴。2017年，Dai等设计了首个S-D-A-D-S结构的NIR-II荧光团IR-FE，其中BBTD为受体，3,4-乙烯二氧基噻吩(EDOT)为给体，二烷基芴为屏蔽单元，IR-FE在甲苯溶液中表现出的QY高达31％。[4]此外，聚乙二醇化的IR-FEP在水中表现出增强的荧光特性，QY为2.0％。Dai等在IR-FE的基础上，以辛基噻吩为第一供体，噻吩为第二供体，进一步合成了具有S-D2-D1-A-D1-D2-S结构的荧光团IR-FTA。多供体增加了共轭物的长度，而辛基噻吩增加了供体和受体的二面角和整体疏水性提高了QY。聚乙二醇化的IR-FTAP在808nm的激光激发下，发射峰在1048nm处，在水中的QY提高到了5.3％。[5]
然而，前述技术获得的这些D-A-D分子大多需要采用两亲性聚合物进一步包裹修饰以获得所需的水溶性，进而满足体内应用的要求，但同时也带来了一系列的问题，例如聚集引起的猝灭效应和吸收发射的蓝移都可能会影响荧光染料的NIR-II发光性能。因此，为了获得更好的实际成像效果，需要进一步优化D-A-D分子结构，以提高包裹成纳米颗粒后的光物理参数。
参考文献如下：
[1]Y.Sun,M.Ding,X.Zeng,Y.Xiao,H.Wu,H.Zhou,B.Ding,C.Qu,W.Hou,A.Er-Bu,Y.Zhang,Z.Cheng,X.Hong,Chem.Sci.2017,8,3489–3493.
[2]L.Zhang,C.Liu,S.Zhou,R.Wang,Q.Fan,D.Liu,W.Wu,X.Jiang,Adv.Healthc.Mater.2020,9,1901470.
[3]Y.Fang,J.Shang,D.Liu,W.Shi,X.Li,H.Ma,J.Am.Chem.Soc.2020,142,15271–15275.
[4]Q.Yang,Z.Ma,H.Wang,B.Zhou,S.Zhu,Y.Zhong,J.Wang,H.Wan,A.Antaris,R.Ma,X.Zhang,J.Yang,X.Zhang,H.Sun,W.Liu,Y.Liang,H.Dai,Adv.Mater.2017,29,1605497.
[5]Q.Yang,Z.Hu,S.Zhu,R.Ma,H.Ma,Z.Ma,H.Wan,T.Zhu,Z.Jiang,W.Liu,L.Jiao,H.Sun,Y.Liang,H.Dai,J.Am.Chem.Soc.2018,140,1715–1724.
发明内容
有鉴于此，针对背景技术中指出的问题，本发明提供咔唑衍生物修饰的D-A-D分子及应用，该D-A-D分子具有高亮度特点，在近红外二区窗口中具有较好成像效果。
为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子具有式(I)所示通式：
其中：
R2和R3之间的虚线表示R2和R3之间无化学键，或者R2和R3之间的化学键为单键或双键；
R1选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；
当R2和R3之间无化学键，R2，R3分别独立选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；R4不表示任何基团；
当R2和R3之间具有化学键，R2，R3和与其相连的C原子一起组成5-7元杂环基、芳环基或者杂芳基；R2，R3分别独立选自：H，CH，N，NH，CR5，NR6，CHR7，C(R8)2；R4选自：H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；R5，R6，R7，R8分别独立选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基。
优选地，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子具有式(II)所示通式：
其中：
R1、R2分别独立选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基。
优选地，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子具有式(III)所示通式：其中：
R1选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；
R4选自：H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基。
优选地，R4选自：H。
优选地，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子选自如下化合物：
第二方面，本发明提供第一方面所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子在制备功能纳米颗粒上的应用。
第三方面，本发明提供一种功能纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将第一方面所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子分散在溶剂中，加入DSPE-PEG2000混合，将混合物加入至超纯水中超声分散；
步骤2，除去超声分散后的体系中的溶剂，并分离出其中的固体，得到所述功能纳米颗粒。
优选地，所述步骤1中，咔唑衍生物修饰的D-A-D分子和DSPE-PEG2000的质量比为1：1～10；和/或，所述溶剂为极性有机溶剂，更优选为烷基醚、低级羧酸酯、烷基醇、含有苯环的芳香烃；和/或，所述步骤2中，采用0.22μm PES过滤器分离出其中的固体。
第四方面，本发明提供第三方面所述的制备方法获得的功能纳米颗粒。
第五方面，本发明提供第四方面所述的功能纳米颗粒在制备发光材料上的应用。
在本发明中，所述发光材料主要应用是血管成像，肿瘤显影，肿瘤微转移灶显影，荧光导航手术等。
本发明的有益效果为：
本发明设计合成了咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，该D-A-D分子具有高亮度特点，与现有报道的具有烷基取代芴结构的S-D-A-D-S分子(TBTF，文献[5]报道)相比，在近红外二区窗口中具有更好的成像效果，可用于体内各种病灶显影，尤其是微小病灶显影。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物5的氢核磁结果。
图2为本发明实施例1中化合物5的碳核磁结果。
图3为本发明实施例1中化合物2的氢核磁结果。
图4为本发明实施例1中化合物2的碳核磁结果。
图5为本发明实施例1中化合物I的氢核磁结果。
图6为本发明实施例1中化合物I的碳核磁结果。
图7为本发明实施例2中化合物6的氢核磁结果。
图8为本发明实施例2中化合物6的碳核磁结果。
图9为本发明实施例2中化合物3的氢核磁结果。
图10为本发明实施例2中化合物3的碳核磁结果。
图11为本发明实施例2中化合物II的氢核磁结果。
图12为本发明实施例2中化合物II的碳核磁结果。
图13为本发明实施例3中化合物7的氢核磁结果。
图14为本发明实施例3中化合物7的碳核磁结果。
图15为本发明实施例3中化合物4的氢核磁结果。
图16为本发明实施例3中化合物4的碳核磁结果。
图17为本发明实施例3中化合物III的氢核磁结果。
图18为本发明实施例3中化合物III的碳核磁结果。
图19为本发明实施例4中化合物TBTF的氢核磁结果。
图20为本发明实施例4中化合物TBTF的碳核磁结果。
图21为本发明实施例5中动态光散射仪测定测定纳米颗粒粒径及其TEM图，其中，A.TBTF；B.TBTC-1；C.TBTC-2；D.TBTC-3比例尺为100nm。
图22为本发明实施例6中不同浓度纳米颗粒孵育48h后4T1细胞活力的变化，其中，A.TBTF；B.TBTC-1；C.TBTC-2；D.TBTC-3纳米颗粒。
图23为本发明实施例6中不同浓度纳米颗粒孵育48h后MCF-7细胞活力的变化，其中，A.TBTF；B.TBTC-1；C.TBTC-2；D.TBTC-3纳米颗粒。
图24为本发明实施例9中不同小分子和纳米颗粒的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，其中，A.不同小分子(填充白色)和纳米颗粒(填充不同透明色)的紫外可见吸收光谱；B.不同小分子(填充白色)和纳米颗粒(填充不同透明色)的荧光发射光谱。
图25为本发明实施例10中不同波长滤光片条件下静脉注射不同纳米颗粒对裸鼠后肢血管的成像。不同波长滤光片:1000lp、1100lp、1300lp(比例尺为1cm)，纳米颗粒注射量(200μg/mL、50μL)。
图26为图25中感兴趣线性区域的NIR-II荧光强度图。图中左侧列出了不同波长滤光片条件下的SBR。A.TBTF；B.TBTC-1；C.TBTC-2；D.TBTC-3。
图27为本发明实施例11中FA功能化TBTC-3纳米颗粒靶向肿瘤成像。A.用1100lp滤光片静脉注射FA功能化TBTC-3纳米颗粒(200μg/mL，50μL)后，4T1荷瘤BALB/c小鼠不同时间点的NIR-II图像；B.用1100lp和1000lp滤光片静脉注射FA功能化TBTC-3纳米颗粒(200μg/mL，50μL)后24小时同一小鼠的NIR-II图像；C.感兴趣线性区域对应的荧光强度图。
图28为本发明实施例11中4T1荷瘤BALB/c小鼠解剖器官明场图(A图)和NIR-II荧光图(B图)。
图29为本发明实施例11中静脉注射TBTC-3纳米颗粒后不同时间点的4T1荷瘤BALB/c小鼠图像。TBTC-3纳米颗粒注射量(200μg/mL，50μL)。
图30为本发明实施例11中FA功能化TBTC-3纳米颗粒对肿瘤远端转移灶成像的结果。A.静脉注射FA功能化TBTC-3纳米颗粒(200μg/mL，50μL)后不同时间点的4T1肿瘤转移BALB/c小鼠图像；B.NIR-II信号切除1-6小组织前后的小鼠图像；C.切除组织的亮场视图(上)和NIR-II图像(下)及其石蜡包埋组织切片的H&E染色图像(比例尺为500μm)，以及癌细胞区域的放大图片(比例尺为50μm)。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，也不是对本发明的技术方案的一种限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例中，本发明提供化合物1～10所示的D-A-D分子的制备方法作为示例，而非将本发明的保护范围只限定于这10种化合物，隶属于通式(I)范围内的化合物都可以参照以下制备过程得出。化合物1～10的具体反应通式如下：
(1)化合物1～6是通过反应方程式一制备得到：
反应方程式一：
其中，R1选自：H，甲基，乙基，甲氧基，乙氧基；R2选自：H，甲基。
(1)化合物7～10是通过反应方程式二制备得到：
反应方程式二：
其中，R1选自：H，甲基；R4选自：H，甲基，甲氧基。
反应方程式一～二中，优选地，反应温度为110±2℃；和/或，采用TLC确定反应终点；和/或，主催化剂一为Pd(Ph3)4，辅助催化剂一为K2CO3；和/或，反应溶剂为Dioxane和H2O按照体积比60～75：1混合。
进一步地，在反应方程式一中，中间体是通过反应方程式三制备得到：
反应方程式三：
在反应方程式二中，中间体是通过反应方程式四制备得到：
反应方程式四：
反应方程式三～四中，优选地，反应温度为100±2℃；和/或，反应时间为11～13h；和/或，主催化剂二为Pd(dppf)2Cl2，辅助催化剂二为KOAc；和/或，反应溶剂为Dioxane。
进一步地，在反应方程式三中，中间体是通过反应方程式五制备得到：
反应方程式五：
进一步地，在反应方程式四中，中间体是通过反应方程式六制备得到：
反应方程式六：
反应方程式五～六中，优选地，反应温度为60±2℃；和/或，反应时间为3～5h；和/或，催化剂为NaH；和/或，反应溶剂为DMF。
下面以化合物1、化合物5、化合物7为例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
化合物1所示结构咔唑衍生物修饰的D-A-D分子的制备，具体如下：
第一步在50mL圆底烧瓶中，加入2-溴咔唑(492mg，2.0mmol)、氢化钠(60％，120mg，3.0mmol)和无水N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)，置于氮气环境下60℃搅拌20min，随后用无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)溶解1-溴-2-己基癸烷(672mg，2.2mmol)，在60℃下继续反应4h，然后用二氯甲烷(30mL)稀释。加入蒸馏水，分离有机层，用水(30mL)洗涤三次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，石油醚/二氯甲烷，10/1，v/v)。所得产物为无色油状物质(866mg，得率92％，化合物1’)。氢核磁和碳核磁结果分别如图1和图2所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝7.6,1H),7.83(d,J＝8.2,1H),7.42(d,J＝1.6,1H),7.40-7.36(m,1H),7.28(d,J＝8.2 1H),7.23(dd,J＝8.2,1.6,1H),7.16-7.13(m,1H),3.99(d,J＝7.5,2H),2.06-1.96(m,1H),1.29-1.12(m,24H),0.81-0.75(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ141.8,141.0,126.0,122.3,121.9,121.7,121.4,120.3,119.3,119.2,112.0,109.2,47.8,37.8,31.9,31.8,31.8,30.0,29.6,29.5,29.3,26.5,26.5,22.7,22.7,14.2,14.1.HR-ESIMS(m/z)[M]+calcd for C28H40BrN 469.2339,found 469.2341。
第二步在50mL舒伦克管中，加入化合物5’(592mg，1.26mmol)、催化剂[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(51.2mg，0.07mmol)、联硼酸频那醇酯(384mg，1.51mmol)和乙酸钾(371mg，3.78mmol.)，5mL1,4-二氧六环。将反应物在氮气环境下回流搅拌12h。加水(20mL)终止反应，用二氯甲烷提取3次(20mL×3)，提取液用无水硫酸钠干燥过滤，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，20/1，v/v)。所得产物为无色油状物质(515mg，得率79％，化合物1”)。氢核磁和碳核磁结果分别如图3和图4所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06-7.99(m,2H),7.79(s,1H),7.60(dd,J＝7.8,0.6,1H),7.41-7.35(m,1H),7.32-7.28(m,1H),7.16-7.10(m,1H),4.12(d,J＝7.5,2H),2.13-2.03(m,1H),1.31(s,12H),1.27-1.12(m,24H),0.81-0.76(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ140.3,139.5,133.7,125.0,124.2,123.8,121.6,119.7,118.5,117.6,114.4,108.1,82.7,46.5,36.8,30.8,30.8,30.7,30.7,28.9,28.6,28.5,28.2,25.5,25.4,23.9,23.8,21.6,21.6,13.1,13.1.HR-ESI MS(m/z)[M+H]+calcd for C34H53BNO2 518.4164,found 518.4168.
第三步将溶剂1,4-二氧六环(3mL)和1滴水用液氮冷冻，然后真空环境下加热至液体。将4,8-双(5-溴-3己基2-噻吩基)-2λ4δ2-苯并[1,2-c:4,5-c']双[1,2,5]噻唑(53.0mg，0.077mmol)、化合物2’(80.2mg，0.155mmol)、四(三苯基膦)钯(8.90mg，0.0077mmol)和碳酸钾(42.8mg，0.31mmol)加入10mL舒伦克管中，置换三次氮气。然后将溶剂加入管中，置换三次氮气。将反应混合物加热至110℃，搅拌过夜。经薄层色谱法判断反应完成后，将产物溶解于二氯甲烷中，用饱和食盐水(50mL)和水(30mL×2)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，100/1，v/v)。所得产物为深绿色固体(63.4mg，得率63％，化合物1)。氢核磁和碳核磁结果分别如图5和图6所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06-8.00(m,4H),7.64-7.61(m,2H),7.55(dd,J＝8.2,1.4,2H),7.48(s,2H),7.42-7.36(m,2H),7.32(d,J＝8.2,2H),7.18-7.13(m,2H),4.13(d,J＝7.4,4H),2.62-2.53(m,4H),2.15-2.04(m,2H),1.65-1.59(m,4H),1.31-1.24(m,12H),1.19-1.08(m,40H),0.78-0.68(m,18H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ152.3,147.4,144.7,140.6,140.3,130.7,127.6,124.8,124.5,121.6,121.6,119.6,119.3,118.0,116.5,115.2,108.0,105.3,52.4,46.7,37.0,31.0,30.8,30.6,30.5,29.5,29.3,28.9,28.6,28.5,28.2,28.2,25.6,21.6,21.6,21.5,13.1,13.0,13.0,10.4.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcd forC82H109N6S4 1305.7591,found1305.7582.
实施例2
化合物5所示结构咔唑衍生物修饰的D-A-D分子的制备，具体如下：
第一步在50mL圆底烧瓶中，加入2-溴-7-甲氧基-9H-咔唑(552mg，2.0mmol)、氢化钠(60％，120mg，3.0mmol)和无水N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)，置于氮气环境下60℃搅拌20分钟，随后用无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)溶解1-溴-2-己基癸烷(672mg，2.2mmol)，在60℃下继续反应4h，然后用二氯甲烷(30mL)稀释。加入蒸馏水，分离有机层，用水(30mL)洗涤三次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，石油醚/二氯甲烷，10/1，v/v)。所得产物为无色油状物质(911mg，得率91％，化合物5’)。氢核磁和碳核磁结果分别如图7和图8所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝8.5,1H),7.73(d,J＝8.2,1H),7.36(d,J＝1.6,1H),7.20(dd,J＝8.2,1.6,1H),6.77(dd,J＝8.5,2.2,1H),6.74(d,J＝2.2,1H),3.94(d,J＝7.5,2H),3.84(s,3H),2.05-1.95(m,1H),1.28-1.11(m,24H),0.82-0.75(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.2,141.4,140.9,120.9,120.9,120.0,119.4,116.8,115.2,110.8,106.5,92.7,54.6,46.7,36.6,30.8,30.8,30.8,30.7,28.9,28.6,28.5,28.2,25.5,25.5,21.6,21.6,13.1,13.1.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcd for C29H43BrNO500.2523,found 500.2519.
第二步在50mL舒伦克管中，加入化合物6’(796mg，1.59mmol)、催化剂[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(58.5mg，0.08mmol)、联硼酸频那醇酯(485mg，1.91mmol)和乙酸钾(468mg，4.77mmol)，5mL1,4-二氧六环。将反应物在氮气环境下回流搅拌12h。加水(20mL)终止反应，用二氯甲烷提取3次(20mL×3)，提取液用无水硫酸钠干燥过滤，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，20/1，v/v)。所得产物为无色油状物质(714mg，得率82％，化合物5”)。氢核磁和碳核磁结果分别如图9和图10所示，具体解析如下：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(d,J＝7.8,1H),7.87-7.84(m,1H),7.73(s,1H),7.57(dd,J＝7.8,0.8,1H),6.74-6.71(m,2H),4.03(d,J＝7.4,2H),3.80(s,3H),1.29(s,12H),1.24-1.11(m,24H),0.80-0.73(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.3,141.7,139.7,133.7,124.5,124.1,120.4,117.6,115.6,114.1,106.1,92.4,82.6,54.5,46.4,36.6,30.8,30.8,30.7,28.9,28.7,28.6,28.5,28.2,25.5,25.4,23.9,23.8,21.6,21.6,13.1,13.1.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcd for C35H55BNO3 548.4270,found 548.4269.
第三步将溶剂1,4-二氧六环(3mL)和1滴水用液氮冷冻，然后真空环境下加热至液体。将4,8-双(5-溴-3己基2-噻吩基)-2λ4δ2-苯并[1,2-c:4,5-c']双[1,2,5]噻唑(53.0mg，0.077mmol)、化合物3’(84.9mg，0.155mmol)、四(三苯基膦)钯(8.90mg，0.0077mmol)和碳酸钾(42.8mg，0.31mmol)加入10mL舒伦克管中，置换三次氮气。然后将溶剂加入管中，置换三次氮气。将反应混合物加热至110℃，搅拌过夜。经薄层色谱法判断反应完成后，将产物溶解于二氯甲烷中，用饱和食盐水(50mL)和水(30mL×2)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，100/1，v/v)。所得产物为深绿色固体(63mg，得率60％，化合物5)。氢核磁和碳核磁结果分别如图11和图12所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝8.0,2H),7.88(d,J＝9.1,2H),7.58(d,J＝1.5,2H),7.52(dd,J＝8.0,1.5,2H),7.45(s,2H),6.81-6.76(m,4H),4.08(d,J＝7.3,4H),3.87(s,6H),2.61-2.52(m,4H),2.08(d,J＝8.0,2H),1.65-1.57(m,4H),1.32-1.27(m,12H),1.17-1.08(m,40H),0.78-0.68(m,18H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.1,152.3,147.6,144.7,142.0,140.5,129.6,127.4,124.3,121.9,120.0,118.7,116.6,115.6,115.2,106.3,105.2,92.6,54.6,46.7,36.8,31.0,30.8,30.5,29.5,29.3,28.9,28.7,28.6,28.6,28.5,28.2,28.2,25.7,23.9,21.6,21.6,21.5,13.1,13.0,13.0.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcdfor C84H113N6O2S4 1365.7802,found 1365.7843.
实施例3
化合物7所示结构咔唑衍生物修饰的D-A-D分子的制备，具体如下：
第一步在50mL圆底烧瓶中，加入9-溴-7H-苯并[c]咔唑(592mg，2.0mmol)、氢化钠(60％，120mg，3.0mmol)和无水N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)，置于氮气环境下60℃搅拌20min，随后用无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)溶解1-溴-2-己基癸烷(672mg，2.2mmol)，在60℃下继续反应4h，然后用二氯甲烷(30mL)稀释。加入蒸馏水，分离有机层，用水(30mL)洗涤三次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，石油醚/二氯甲烷，10/1，v/v)。所得产物为无色油状物质(875mg，得率84％，化合物7’)。氢核磁和碳核磁结果分别如图13和图14所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(d,J＝8.2,1H),8.22(d,J＝8.5,1H),7.86(d,J＝8.2,1H),7.72(d,J＝8.5,1H),7.60-7.54(m,1H),7.44(d,J＝1.7,1H),7.36(d,J＝8.6,2H),7.34-7.29(m,1H),3.92(d,J＝7.5,2H),1.99-1.87(m,1H),1.21-1.03(m,24H),0.79-0.71(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ139.4,137.5,128.6,128.1,127.9,126.4,125.9,122.0,121.9,121.6,121.1,116.5,113.3,111.4,109.9,46.5,37.0,30.8,30.7,30.7,30.6,28.8,28.5,28.4,28.2,25.4,21.6,21.6,13.1,13.0.HR-ESIMS(m/z)[M]+calcd for C32H42BrN 519.2495,found 519.2498.
第二步在50mL舒伦克管中，加入化合物3-3(828mg，1.59mmol)、催化剂[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(58.5mg，0.08mmol)、联硼酸频那醇酯(485mg，1.91mmol)和乙酸钾(468mg，4.77mmol)，5mL1,4-二氧六环。将反应物在氮气环境下回流搅拌12h。加水(20mL)终止反应，用二氯甲烷提取3次(20mL×3)，提取液用无水硫酸钠干燥过滤，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，20/1，v/v)。所得产物为无色油状物质(695mg，得率77％，化合物7”)。氢核磁和碳核磁结果分别如图15和图16所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝8.4,1H),8.50(d,J＝8.0,1H),7.95(s,1H),7.92(d,J＝8.4,1H),7.82(d,J＝8.9,1H),7.74(d,J＝8.0,1H),7.66-7.60(m,1H),7.56(d,J＝8.9,1H),7.41-7.36(m,1H),4.28(d,J＝7.5,2H),2.16-2.05(m,1H),1.34(s,12H),1.27-1.10(m,24H),0.79-0.76(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ138.3,138.0,133.7,129.1,128.1,127.7,126.6,125.9,124.7,124.6,122.2,121.8,120.2,115.2,113.6,110.2,82.7,46.5,37.2,30.8,30.8,30.7,28.9,28.6,28.5,28.2,25.5,25.4,23.9,21.6,21.6,13.1,13.1,13.0.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcd for C38H55BNO2 568.4320,found 568.4319.
第三步将溶剂1,4-二氧六环(3mL)和1滴水用液氮冷冻，然后真空环境下加热至液体。将4,8-双(5-溴-3己基2-噻吩基)-2λ4δ2-苯并[1,2-c:4,5-c']双[1,2,5]噻唑(53.0mg，0.077mmol)、化合物3-6(88.0mg，0.155mmol)、四(三苯基膦)钯(8.90mg，0.0077mmol)和碳酸钾(42.8mg，0.31mmol)加入10mL舒伦克管中，置换三次氮气。然后将溶剂加入管中，置换三次氮气。将反应混合物加热至110℃，搅拌过夜。经薄层色谱法判断反应完成后，将产物溶解于二氯甲烷中，用饱和食盐水(50mL)和水(30mL×2)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，100/1，v/v)。所得产物为深绿色固体(75.8mg，得率70％，化合物7)。氢核磁和碳核磁结果分别如图17和图18所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.80(d,J＝8.2,2H),8.60(d,J＝8.4,2H),8.02(dd,J＝8.2,1.3,2H),7.91(d,J＝9.0,2H),7.85(d,J＝1.6,2H),7.77(dd,J＝8.2,1.6,2H),7.75-7.70(m,2H),7.65(d,J＝8.9,2H),7.60(s,2H),7.52-7.46(m,2H),4.36(d,J＝7.4,4H),2.72-2.64(m,4H),2.24-2.17(m,2H),1.76-1.67(m,4H),1.42-1.32(m,12H),1.24-1.16(m,40H),0.83-0.75(m,18H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ153.5,148.6,145.9,140.3,139.4,130.3,130.0,129.4,129.1,128.7,127.5,127.1,125.6,123.4,123.3,123.1,122.4,118.6,116.4,115.0,111.2,107.0,47.9,38.6,32.1,31.9,31.7,30.7,30.5,30.0,29.8,29.8,29.6,29.4,26.8,22.8,22.7,22.7,14.2,14.2.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcd for C90H113N6S41405.7904,found 1405.7920.
实施例4
烷基芴修饰的D-A-D分子TBTF的制备，具体如下：
将溶剂1,4-二氧六环(3mL)和1滴水用液氮冷冻，然后真空环境下加热至液体。将4,8-双(5-溴-3己基2-噻吩基)-2λ4δ2-苯并[1,2-c:4,5-c']双[1,2,5]噻唑(53.0mg,0.077mmol)、化合物2-(9,9-二辛基-9H-芴-2-基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二硼烷(80.1mg，0.155mmol)、四(三苯基膦)钯(8.90mg，0.0077mmol)和碳酸钾(42.8mg，0.31mmol)加入10mL舒伦克管中，置换三次氮气。然后将溶剂加入管中，置换三次氮气。将反应混合物加热至110℃，搅拌过夜。经薄层色谱法判断反应完成后，将产物溶解于二氯甲烷中，用饱和食盐水(50mL)和水(30mL×2)洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，旋干过柱(200-300目硅胶柱，二氯甲烷/甲醇，100/1，v/v)。所得产物为深绿色固体(60.2mg，得率60％)。氢核磁和碳核磁结果分别如图19和图20所示，具体解析如下：1H NMR(400MHz,CDCl3).δ7.66-7.62(m,6H),7.59-7.57(m,2H),7.45(s,2H),7.29-7.23(m,6H),2.58-2.52(m,4H),1.97-1.90(m,8H),1.64-1.57(m,4H),1.12-0.97(m,52H),0.73(t,J＝7.1,12H),0.70-0.66(m,6H),0.62-0.52(m,8H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ152.3,150.4,149.9,146.8,144.8,140.1,139.6,132.0,127.4,126.2,125.8,124.4,123.8,121.8,119.2,119.0,118.7,115.2,54.2,39.5,30.8,30.5,29.5,29.3,29.0,28.2,28.2,22.8,21.6,21.5,13.0,13.0.HR-ESIMS(m/z)[M+H]+calcd for C84H110N4S41303.7686,found 1303.7692.
实施例5
纳米颗粒的制备
将无水THF中的上述咔唑及其衍生物修饰的小分子(1mg/mL，300μL)和DSPE-PEG2000(2mg/mL，300μL)混合，超声条件下倒入10mL超纯水中，再超声2min。将溶液在氮气下浓缩，用0.22μm PES过滤器过滤，4℃保存备用。
将叶酸(FA)功能纳米颗粒分子(1mg/mL，300μL)、DSPE-PEG2000(2mg/mL，200μL)和DSPE-PEG2000-FA(2mg/mL，100μL)在无水THF中混合，超声条件下倒入10mL超纯水中，再超声2min。将溶液在氮气下浓缩，用0.22μm PES过滤器过滤，4℃保存备用。
利用纳米再沉淀法，小分子通过疏水相互作用折叠和扭曲主链从而形成纳米颗粒，通过控制小分子和两亲性脂质体的浓度比例可以调节最终纳米颗粒的尺寸。通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)对这些纳米颗粒的粒径和形貌进行了表征，如图21所示。所有纳米颗粒的尺寸约为20～30nm，透射电子显微镜(TEM)测定直径约为10nm。
实施例6
细胞培养及毒性分析
所有细胞系均由American Type Culture Collection(ATCC，Manassas，VA，USA)提供，培养MCF-7细胞的培养基为Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM)，添加10％热灭活胎牛血清(FBS)；4T1细胞的培养基为RPMI 1640，添加10％热失活胎牛血清。培养条件为5％CO2，37℃。待细胞长到90％汇合度，用胰酶将细胞消化下来，用于后期的实验。
用CCK8法评估纳米颗粒对MCF-7细胞以及4T1细胞代谢活性的影响。具体如下：取100μL(2×104细胞/mL)的细胞悬液，接种到96孔板的各个孔上，培养过夜。用含有不同纳米颗粒浓度(10，5，2.5，0.1μg/mL)的DMEM/RMPI 1640培养基替换旧培养基，对照组不加纳米颗粒，在37℃孵育24h。吸弃旧培养基，细胞用pH＝7.2磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。随后将新鲜的DMEM/RMPI 1640培养基(90μL)和10μLCCK8溶液(试剂盒原液)加入各个孔中，在37℃静置4h，活细胞中的酶脱氢酶被本试剂盒氧化为橙色，随后用酶标仪(TECAN，Infinite M200，Germany)测定各孔在波长450nm的吸收值。用下式计算细胞生长活力：
生存活力(％)＝实验组的平均吸光度/对照组的平均吸光度(1-1)。
如图22、图23所示，48h后TBTF、TBTC-1(化合物1)、TBTC-2(化合物5)、TBTC-3(化合物7)均无毒性，细胞活力未受影响。
实施例7
摩尔消光系数计算
根据Lambert-Beer定律，对溶液的吸光度与摩尔浓度进行线性拟合，计算摩尔消光系数如下:
A＝εcl(1-2)；
式(1-2)中，A为最大吸收波长或808nm处的吸光度，ε为与化合物固有性质有关的摩尔消光系数，l为光路吸收厚度，c为溶液浓度。小分子和纳米颗粒的摩尔浓度是由相应化合物的摩尔浓度除以溶液的体积来计算的，用不同浓度的溶液测量吸光度。
然后评价了所有小分子在四氢呋喃中及其通过小分子制备的纳米颗粒在水中的摩尔消光系数。可以清楚地看出，咔唑的引入增加了D-A-D分子的摩尔消光系数(见表1)，TBTC-1和TBTC-2的峰值波长处的摩尔消光系数(ε1)均高于TBTF，即使共轭度较大的分子TBTC-3也具有与TBTF相似的系数。被纳米颗粒包裹后，所有分子的摩尔消光系数都不可避免地降低，但除TBTC-2外，其余分子的摩尔消光系数均保持在104cm-1M-1以上。虽然甲氧基的引入增强了咔唑的给体能力，引起了吸收和发射光谱的红移，但自由旋转的甲氧基可能会破坏整个分子在聚集状态下的平面性，这是TBTC-2纳米颗粒摩尔消光系数低的原因。
表1小分子和纳米颗粒光学性能参数
注：表1中，ε1为吸收光谱峰值波长处的摩尔消光系数；ε2为808nm波长处的摩尔消光系数；QY1和QY2分别为在荧光波长范围850-1500nm和1000-1500nm处的量子产率。
实施例8
量子产率计算
在本实施例中，我们使用了相对策略来测量量子产率(QY)。使用标准染料IR-26作为参考来测量QY。计算公式为
其中ΦX为纳米颗粒在水中的QY或小分子在四氢呋喃中的QY，ΦST为IR-26的量子产率(在二氯乙烷中近似为0.5％)，GradX为纳米颗粒(850～1500nm或1000～1500nm)或小分子(850～1500nm或1000～1500nm)的发射光谱面积与808nm处吸光度的线性拟合斜率，ΦST为IR-26(1000～1500nm)的发射光谱面积与808nm吸光度的线性拟合斜率，ηX和ηST为各自溶剂(水:1.333，四氢呋喃:1.465，二氯乙烷:1.4167)的折射率。
以IR26(在二氯乙烷中为0.5％)为参比，计算了分子的量子产率。如表1所示，虽然TBTC-1在有机溶剂中的QY与TBTF相似，但TBTC-1形成纳米颗粒在水溶液中量子产率明显高于TBTF纳米颗粒，证明TBTC-1纳米颗粒中的荧光猝灭程度比TBTF纳米颗粒低，引入咔唑基团相比经典的芴结构具有明显的优势。小分子TBTC-2和TBTC-3的QY由于更长的共轭结构而量子效率较低，但TBTC-3纳米颗粒在水中的QY是可以接受的，因为TBTC-3在聚集状态下的荧光猝灭程度是这几种纳米颗粒中最小的，并且发射光谱的红移使得1000nm后范围内的QY相对较高。
实施例9
亮度计算
整体亮度由消光系数和量子产率决定，在这里，使用量子效率(QE)定义为它们的乘法。考虑到实际成像中通常使用的激发波长为808nm，为了获得更好的成像效果，最好收集NIR-II范围内的发射荧光，因此讨论中QE采用ε2×QY2获得(表1)。在四种纳米颗粒中，TBTC-3纳米颗粒亮度最高(在图24TBTC-3的面积最大)，可能是最有希望用于体内NIR-II成像的材料。
实施例10
血管成像
血管成像采用BALB/c裸鼠，通过尾静脉注射50μL各种纳米颗粒水溶液(200μg/mL)，立即置于小动物活体成像仪中采集图像。所有图像均分别在808nm激发及不同滤光片的组合下采集。小动物活体成像仪所用相机为InGaAs检测器。成像系统为VanGogh IGS1000近红外二区成像系统，激发光源为808nm波长光纤耦合激光器，激光输出功率密度＝0.2Wcm-2，通量＝40mW cm-2。
对小鼠进行了血管成像，以确认这些纳米颗粒在体内的NIR-II成像性能。裸鼠经静脉注射后，在小动物NIR-II成像系统下观察后肢血管。如图25所示，虽然这四个纳米颗粒在1000nm波长后的发射信号相似，但在1300nm长波通滤光片下，性能有显著差异。在此范围内，TBTF和TBTC-1纳米颗粒的荧光强度较低，信号无法与背景清晰区分。如图26所示，TBTC-2和TBTC-3纳米颗粒由于光谱红移，在1300nm以上具有较强的NIR-II荧光发射，且信噪比(SBR)更高，说明在较长波长的体内成像具有优势。尤其是亮度最高的TBTC-3纳米颗粒，在SBR大于2的情况下，对后肢血管成像效果最好。
实施例11
靶向肿瘤及转移灶成像
荷瘤小鼠模型建立实验用雌性BLAB/c，取消化完的4T1细胞制成细胞悬液，浓度为1×107个细胞/mL。将100uL 4T1细胞注射到BALB/c雌性小鼠乳腺脂肪垫，作为乳腺癌的原位位置，一周后建立细胞来源的异植瘤，同时由于4T1细胞的高度侵袭性，出现远处转移。肿瘤成像选取注射癌细胞注射一周后的小鼠，通过尾静脉注射50μL叶酸功能化的TBTC-3纳米颗粒水溶液(200μg/mL)，于相应时间点采集图像。小动物活体成像仪所用相机为InGaAs检测器。成像系统为VanGogh IGS1000近红外二区成像系统，激发光源为808nm波长光纤耦合激光器，激光输出功率密度＝0.2W cm-2，通量＝40mW cm-2。考虑到荧光强度和分辨率之间的平衡，使用1100lp滤光片进行成像。
基于TBTC-3纳米颗粒在血管成像中优异的NIR-II荧光性能，探讨其在肿瘤及转移灶成像中的应用。将FA功能化的TBTC-3纳米颗粒静脉注射到小鼠体内，并在注射后不同时间点拍摄NIR-II图像。结果如图27A所示，注射后2h可在肿瘤处清晰检测到信号，注射后12hSBR达到最大值。同时对小鼠进行解剖，以研究纳米颗粒的分布。如图28所示，纳米颗粒主要分布在肝脏、脾脏和肿瘤，心、肾、肺均未见信号，提示其经过肝胆清除代谢途径。相比之下，如图29所示，在未修饰FA靶向单元的情况下，TBTC-3纳米颗粒在小鼠乳腺肿瘤中的富集较差，说明FA在靶向乳腺癌成像中的重要性。经24h静脉注射后，小鼠体内NIR-II荧光强度下降。NIR-II信号在肿瘤内分布不均匀，使用1100lp滤波器比使用1000lp滤波器信号更清晰(图27B)。从这两幅图像画线标注读取的信号强度(图27C)表明在1100nm后的范围内采集信号可以更准确地了解细节，促使我们进一步在此荧光范围内进行转移灶的成像。
为了建立肿瘤转移模型，我们将4T1细胞静脉注射到BALB/c雌性小鼠体内。一周后，由于4T1细胞的高度侵袭性，出现远处转移。将FA功能化的TBTC-3纳米颗粒静脉注射到小鼠体内，然后在NIR-II成像系统下对小鼠进行成像。8h后，在部分部位观察到NIR-II信号(如图30A所示)，说明在这些组织中出现了纳米颗粒的富集，可能存在着癌细胞转移。在这种情况下，小鼠被处死并褪去皮肤，通过NIR-II成像可以更清楚地看到其分布。如图30B所示，除了明亮的肝脏和脾脏外，还有几个小的组织有着NIR-II发射信号，包括一个腋窝组织(标记为1)，两个小鼠胸腔组织(2和3)，两个腹膜组织(4和6)和一个肠道组织(5)。需要注意的是，由于并不是在实时的荧光导航系统下进行手术，切除的组织中包括一些健康组织。切除这些组织并用10％福尔马林固定，然后制作石蜡包埋组织切片，进行H&E染色分析。正如预期的那样，所有组织中都可以发现癌细胞，癌细胞侵袭区域的放大图片如图30C右侧所示。事实上，由于这些转移灶直径小于2mm，且部分癌细胞分布于深部组织，传统手术方法难以发现。然而，通过明亮的TBTC-3纳米颗粒的NIR-II成像，可以清晰准确地观察到这些转移灶，这说明了高亮度材料在NIR-II窗口中的优势。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，其特征在于，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子具有式(I)所示通式：
其中：
R2和R3之间的虚线表示R2和R3之间无化学键，或者R2和R3之间的化学键为单键或双键；
R1选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；
当R2和R3之间无化学键，R2，R3分别独立选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；R4不表示任何基团；
当R2和R3之间具有化学键，R2，R3和与其相连的C原子一起组成5-7元杂环基、芳环基或者杂芳基；R2，R3分别独立选自：H，CH，N，NH，CR5，NR6，CHR7，C(R8)2；R4选自：H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；R5，R6，R7，R8分别独立选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基。
2.根据权利要求1所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，其特征在于，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子具有式(II)所示通式：
其中：
R1、R2分别独立选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基。
3.根据权利要求1所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，其特征在于，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子具有式(III)所示通式：
其中：
R1选自：H，卤素，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基；
R4选自：H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基。
4.根据权利要求3所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，其特征在于，R4选自：H。
5.根据权利要求1所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子，其特征在于，所述咔唑衍生物修饰的D-A-D分子选自如下化合物：
6.权利要求1～5任一项所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子在制备功能纳米颗粒上的应用。
7.一种功能纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将权利要求1～5任一项所述的咔唑衍生物修饰的D-A-D分子分散在溶剂中，加入DSPE-PEG2000混合，将混合物加入至超纯水中超声分散；
步骤2，除去超声分散后的体系中的溶剂，并分离出其中的固体，得到所述功能纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，咔唑衍生物修饰的D-A-D分子和DSPE-PEG2000的质量比为1：1～10；和/或，所述溶剂为极性有机溶剂，优选为烷基醚、低级羧酸酯、烷基醇、含有苯环的芳香烃；和/或，所述步骤2中，采用0.22μm PES过滤器分离出其中的固体。
9.权利要求7或8所述的制备方法获得的功能纳米颗粒。
10.权利要求9所述的功能纳米颗粒在制备发光材料上的应用。
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