CN120051207A - 包含胶原蛋白水解物的冷冻保存制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冷冻保存制剂，其包含胶原蛋白水解物并且优选地包含二甲基亚砜。本发明还涉及用于冷冻保存一种或更多种生物物质的方法，所述方法包括在包含胶原蛋白水解物和优选的二甲基亚砜的冷冻保存制剂中提供一种或更多种生物物质的步骤。本发明还涉及包含胶原蛋白水解物和优选的二甲基亚砜的冷冻保存制剂用于冷冻保存一种或更多种生物物质的用途，所述生物物质选自真核细胞、原核细胞、细胞器、胞外囊泡、类器官、组织和器官。本发明还涉及胶原蛋白水解物，优选与二甲基亚砜组合的胶原蛋白水解物，在制备冷冻保存制剂中的用途。

Description

包含胶原蛋白水解物的冷冻保存制剂

技术领域

本发明涉及包含细胞和组织的生物物质的冷冻保存，以及用于其中的冷冻保护剂。

背景技术

冷冻保存

冷冻保存是其中通过冷冻保存生物物质(最常见的是单细胞悬液，但也包括细胞组织等)的过程。通过使生物物质达到冷冻状态，使细胞的酶活性和化学活性中止。在任何期望的时刻，生物物质可解冻并且细胞活性可恢复。冷冻保存使得生物物质具有无限的寿命，而在冷冻状态下，生物物质也可以容易地在不同的(遥远的)实验室之间运输。特别是细胞的冷冻保存为医学治疗开辟了多种新的可能性，其中细胞可以大规模扩增和保存，直到其需要使用时。冷冻保存的相对容易和灵活性使其成为细胞培养实验室不可或缺的工作，无论是用于研究目的还是用于治疗应用。

冷冻保存中的细胞应激和毒性

冷冻保存最常见的是在冷冻温度下，例如大约在-80℃下或更低。冷冻保存的重要限制是冷冻过程对细胞的固有毒性，例如导致细胞损失、细胞应激和/或细胞响应的变化。冷冻保存中的细胞毒性在很大一部分上与胞内冰的形成和细胞中的渗透失衡有关(Bissoyi et al.Biopreserv Biobank.2014Feb；12(1):23-34)。考虑到这一点，冷冻保存之后回收细胞的成功可以至少部分地受冷冻保存的实现方法影响。冷冻保存细胞的优选方法是通过所谓的“缓慢冷冻”。缓慢冷冻涵盖以受控的速率冷却细胞，直到达到所期望的冷冻温度。例如，对于许多哺乳动物细胞来说，认为约1℃/分钟的典型冷却速率是合适的。缓慢冷冻背后的原理是其影响外部溶质浓度，并从而使细胞在一定程度上脱水，并且胞内冰晶的形成减少。

冷冻保护剂(CPA)

缓慢冷冻通常与一种或更多种冷冻保护剂(即冷冻保护剂(cryoprotectiveagent)，CPA)相结合而进行。CPA通常通过提高细胞中的溶质浓度来发挥作用，从而帮助降低冷冻损伤。亚砜、乙二醇和糖形成最常见的CPA，并且通常分为渗透性CPA或非渗透性CPA。渗透性CPA包括二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、乙二醇、丙二醇和甘油。渗透性CPA可穿透细胞膜。在细胞中，该结构与水形成氢键的能力有助于降低机械和渗透损伤。非渗透性CPA通常是大分子，并且在细胞外发挥其保护作用。非渗透性CPA包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和糖(例如蔗糖、右旋糖和海藻糖)(Whaley et al.Cryopreservation:An Overview of Principles and Cell-Specific Considerations.CellTransplantation.2021年1月)。

CPA的不期望的特征

CPA也有公知的不期望的特征。这些作用已针对二甲基亚砜(DMSO)进行了最好的表征，二甲基亚砜也被认为是最常规的CPA(例如，也被称为“金标准CPA”)，但这些不期望的特征通常可以在所有CPA中看到。一些最相关的不期望的特征总结如下：

1)CPA对细胞有毒性，其显示出主要与由于质膜孔形成引起的凋亡有关(Notmanet al.J.Am.Chem.Soc.128,13982–13983)。

2)CPA干扰多种细胞过程，并因此可改变冷冻保存之后的细胞功能。例如，在使用CPA之后，已经报道了基因表达、细胞增殖和分化的变化(et al.ScientificReports第8卷，文章号：14828,2018)。

3)CPA可阻碍冷冻之后细胞的治疗潜力。例如，已经发现用CPA冷冻保存的干细胞在患者中移植之后显示出植入减少(Mitrus et al.Randomized Controlled Trial BoneMarrow Transplant.2018Mar；53(3):274-280)。

4)CPA可调节细胞中的炎症应答。改变的炎症应答可导致不可靠的测试结果和/或阻碍其治疗潜力(Li et al.Front Immunol.2021Nov29；12:765667)。

5)CPA的使用提高了劳动强度。洗涤步骤理想地确保从细胞悬液中除去所有CPA。这提高了细胞培养实验室所需的资源。

6)尽管进行了大量的洗涤步骤，但CPA例如DMSO显示出在细胞悬液中持续存在。DMSO污染物在临床环境中对接受者造成直接的副作用(例如，引起高血压、恶心和呕吐)。这限制了在细胞和组织移植以及先进治疗药品(advanced therapy medicinal product，ATMP)中的使用。

通常认为，作为经验法则，细胞存活应高于80％(即细胞死亡低于20％)。特别是对于ATMP，还期望冷冻保存制剂是GMP级的，并且优选不含DMSO和/或血清。目前可用的冷冻保存制剂不符合该标准，例如因为它们通常需要血清和/或DMSO。

CPA不适合于数种细胞类型

常规CPA(例如DMSO、乙二醇、糖)的另一个重要限制是它们不与所有细胞类型兼容。在全世界科学家中，一致认为对于如何预测特定细胞类型/细胞系是容易或难冷冻的没有普遍共识。可以说，细胞类型在冷冻保存之后可以表现出以下行为：

1.细胞冷冻良好，并且冻融之后细胞死亡有限(低于20％)，同时细胞保持其功能；

2.细胞冷冻良好，并且冻融之后细胞死亡有限(低于20％)，但细胞已丧失其特定功能(品质)；

3.细胞被冷冻，但解冻之后细胞死亡超过20％以及/或者丧失其特定功能(品质)。

为简单起见，在第1点下的细胞称为“易冷冻”，并且在第2点和第3点下的细胞分别称为“难冷冻”或“不可冷冻”细胞。

为了显示细胞的成熟度与其在冷冻保存中的行为之间的差异，给出了一些实例。

一方面，一些已分化和/或更成熟的细胞如肌细胞和免疫细胞，很容易冷冻。而其他类型的已分化细胞如神经细胞难以冷冻，因为这些细胞在冷冻之后失去了它们的功能。另一方面，一些多能的和分化程度较低以及较不成熟的细胞表型(例如成纤维细胞、祖细胞、间充质干细胞、高度增殖细胞)易于冷冻，而胚胎干细胞(embryotic stem cell，ESC)更难以冷冻(Li et al.Front.Cell Dev.Biol.,14December 2021)。

由于在现有技术中缺乏对细胞的明确功能描述，描述这些细胞在冷冻保存中的表现的唯一方式是描述为“易冷冻”、“难冷冻”或“不可冷冻”的细胞。例如，(人)神经元细胞被通常分类为使用CPA中“不可冷冻的”，意味着神经元细胞的冷冻导致细胞的极差回收。另外，回收的细胞在其细胞功能方面受到影响。基于上述，分离的神经元细胞因此必须在分离之后立即用于实验，这是不实际的。永生化的神经元细胞系也可用于研究目的(Tremblayet al.J.Neurosci.Methods,186,2010,60-67页)，然而，这些细胞系没有显示出与原代神经元细胞相同的行为。因此，认为神经元细胞系不适合用于研究神经元细胞的特定功能，例如突触形成、活动和可塑性(Ishizuka et al.Journal of Neuroscience Methods.第333卷，2020年3月1日)。

难冷冻的细胞的另一些实例包括许多原代(分离的细胞)和/或心肌细胞、骨骼肌细胞、终末分化的肝细胞、终末分化的成纤维细胞、单核细胞、树突细胞、β细胞、心肌细胞、胰岛、原代人单核细胞、骨细胞和脂肪细胞。这些细胞类型只能从机体获得有限的量，并且由于其不(或几乎不)增殖而一直数量稀少。因此，这些细胞在冷冻保存期间的进一步损失是非常不期望的。

降低CPA的毒性

实践中，蛋白质通常用于降低CPA的毒性。人或其他动物来源的血清或血清蛋白是偏好的蛋白质来源的实例。它们可作为支持细胞生长和分化的通用生长补充剂。在冷冻保存领域中，认为血清或血清蛋白通过稳定和保护细胞膜抵抗剪切应力来降低CPA的毒性。然而，即使使用大量的血清或血清蛋白也不足以抵消CPA的不期望的特征。例如，10％ DMSO与50％至90％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的组合是在现有技术中使用的优选冷冻组成。然而，该优选组成仍然导致至少20％的细胞死亡，即使对于被认为相对易冷冻的细胞也是如此(Yong et al.Scientific Reports第5卷，文章号：9596,2015)。其他限制包括以下：

-一般来说，认为血清补充剂不适合或不期望用于治疗应用；

-在血清补充剂中存在批次间差异，导致细胞中的响应不一致；

-内毒素(脂多糖(lipopolysaccharide)，LPS)水平不受控制，并且其可阻碍结果重现；

-对冷冻保存中使用FBS的伦理反对增长(Jochems et al.Altern Lab Anim.2002年三月至四月；30(2):219-27)。屠宰时，FBS从怀孕的牛取出的胎儿获得，并因此被认为对动物不友好。

总之，可以得出结论，使用血清或其他蛋白质来源不能解决与CPA最典型相关的问题。

解冻以及与解冻相关的细胞应激和毒性

然而，即使在冷冻过程之前和冷冻过程期间通过添加冷冻保护剂可使毒性最小化，随着解冻和与之相关的温度升高，毒性作用可能重新开始。解冻后的毒性可能在冷冻保存周期的所有液体阶段中具有相同的破坏潜力，但通常被忽视。细胞在解冻期间对毒性的敏感性可至少与其在降温时一样，如果不是更高的话，这是由于这样的事实：它们已经受到了冷冻/解冻循环的应激影响。

尽管在用于研究和治疗应用的生物物质的冷冻保存领域中有所发展，但常规CPA具有数个不期望的特征。对于降低对常规CPA(最重要的是DMSO或其他渗透性CPA)的依赖的方法存在未满足的需求。具体地，需要这样的冷冻保存方法：

-降低冷冻保存期间所需的常规CPA的量，从而降低CPA的负面作用，例如细胞毒性、细胞功能的变化和炎症应答的变化；

-完全取代常规CPA，从而消除CPA的负面作用，并且进一步使冷冻保存的细胞在治疗应用中，特别是细胞和组织移植(ATMP)中更安全和更有效；

-允许冷冻保存常规CPA认为不成功的细胞类型。这些通常包括缓慢增殖的、终末分化的细胞、“难冷冻”的细胞或“不可冷冻”的细胞，例如神经元细胞、心肌细胞和/或其他细胞类型；

-即使目前使用的CPA在冷冻期间是有益的，但是由于温度升高，它们在解冻期间可能是有毒的。需要方法或冷冻保存制剂，其允许将冷冻细胞带到室温从代谢不活跃状态至活跃状态而不引起很多损伤。

本发明的目的之一是提供与生物物质的冷冻保存和/或解冻相关的一个或更多个问题的解决方法。

发明内容

出乎意料地，发明人发现使用相对高浓度的胶原蛋白水解物(优选20至50重量％)允许降低冷冻保存中冷冻保护剂二甲基亚砜(即DMSO)的浓度。该策略允许降低二甲基亚砜的量，或者甚至根本不再使用二甲基亚砜，因此其可消除二甲基亚砜的数个已知缺点。

合适的冷冻保存剂通常包含10％(v/v)或更多的二甲基亚砜，并且通常被认为是冷冻保存制剂中的“金标准”。本发明人发现，相对高浓度的胶原蛋白水解物(优选20至50重量％)与相对低浓度的二甲基亚砜(优选0.5至8.5重量％)的组合可导致最高的细胞回收。与在其他冷冻保存制剂中冷冻相比，通过该组合冷冻保存的细胞也显示出改善的活力(例如更高的增殖能力和功能)。因此，与其他冷冻保存制剂相比，本发明的冷冻保存制剂不仅提供了更高的细胞回收，而且还提供了回收的细胞更高的活力。

本发明的胶原蛋白水解物，特别是在所述的高浓度下，允许将冷冻细胞带到室温从代谢非活跃状态至活跃状态而明显不引起损伤。因此，胶原蛋白水解物可对细胞施加有益作用以及/或者降低例如二甲基亚砜在解冻过程中的不期望的作用。

在优选的高浓度下，胶原蛋白水解物具有强的冷冻保护作用。例如，胶原蛋白水解物可充当冷冻保护剂。作为补充或替代，胶原蛋白水解物还可提高二甲基亚砜的冷冻保护作用，降低二甲基亚砜的毒性作用，和/或维持细胞的基因型和表型。胶原蛋白水解物可消除对血清和血清来源的蛋白质的需要，血清和血清来源的蛋白质通常被包含以降低二甲基亚砜的毒性。本发明的冷冻保存制剂特别适合于保存旨在用于人移植的生物物质，例如先进治疗药品(ATMP)。本发明的冷冻保存制剂特别适合于通常不能单独用二甲基亚砜冷冻保存的并因此可认为是难冷冻或不可冷冻的细胞的冷冻保存细胞。

总之，当胶原蛋白水解物的量超过20重量％时，特别是当其为30重量％或40重量％时，获得最佳结果。

本发明人的当前发现是出乎意料的，因为其与在冷冻保存中应避免大量胶原蛋白水解物的现有的观点相矛盾。例如，现有技术指向使用不超过15重量％的胶原蛋白水解物，特别是与二甲基亚砜或其他渗透性冷冻保护剂组合，以不损害冷冻保存之后的细胞的存活率。

在一个方面中，本发明涉及冷冻保存制剂，其包含基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的胶原蛋白水解物。

在一个方面中，本发明涉及如本文中公开的冷冻保存制剂用于冷冻保存一种或更多种生物物质的用途，该生物物质选自真核细胞、原核细胞、细胞器、胞外囊泡、类器官、组织和器官。

在一个方面中，本发明涉及胶原蛋白水解物在冷冻保存制剂中的用途，其中胶原蛋白水解物的以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量使用。

在一个方面中，本发明涉及用于生物物质的冷冻保存的方法，该方法包括以下步骤：在如本文中公开的冷冻保存制剂中提供生物物质，并将冷冻保存制剂的温度降低至低于冷冻保存制剂的凝固点。

在一个方面中，本发明涉及胶原蛋白水解物用于降低冷冻保存制剂中二甲基亚砜的量的用途，其中胶原蛋白水解物以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量提供。

在一个方面中，本发明涉及胶原蛋白水解物用于在冷冻保存之后的解冻期间降低毒性和/或提高细胞生存力的用途，其中胶原蛋白水解物在冷冻保存制剂中以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量提供。

具体实施方式

本发明的冷冻保存制剂涉及组合物，其包含胶原蛋白水解物，优选以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量。

本发明还涉及在本公开内容中描述的冷冻保存制剂的多个实施方案中的一种或更多种的用途。

本发明还涉及利用在本公开内容中描述的冷冻保存制剂的多个实施方案中的一种或更多种来冷冻保存生物物质的方法。

在本发明的上下文中，术语“胶原蛋白”意指包含重复(Gly-X-Y)序列的氨基酸序列，优选包含至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、300或400个含有序列Gly-X-Y的序列，其中X和Y是彼此独立选择的氨基酸残基，但X和/或Y更优选是脯氨酸。“胶原蛋白”优选具有存在于一种或更多种动物物种中的天然胶原蛋白的序列。作为补充或替代，“胶原蛋白”可意指(天然)胶原蛋白的全长序列或者其片段或亚基，所述(天然)胶原蛋白优选I型至XXVII型胶原蛋白中的一种或更多种，更优选I型、II型、III型、V型或X型胶原蛋白中的一种或甚至更多种，甚至更优选I型、II型或III型胶原蛋白中的一种或更多种。例如，术语“胶原蛋白”可指α-1(I)、α-2(I)、α-1(II)或α-1(III)链，或者其片段。术语“胶原蛋白”涵盖如由天然胶原蛋白中存在的三个亚基形成的三螺旋结构。

在本发明的上下文中，术语“胶原蛋白水解物”意指来源于从天然(全长)胶原蛋白的(部分)水解(例如通过酶促水解)的氨基酸短链(二肽、三肽、寡肽、多肽)的混合物。水解程度对最终产物的平均分子量(以道尔顿(Dalton)，Da表示)具有影响。术语“胶原蛋白水解物”可与术语“水解的胶原蛋白”或“胶原蛋白肽”互换使用并且同义。在本发明的上下文中，“胶原蛋白水解物”涵盖经受水解或部分水解的胶原蛋白。

在一个实施方案中，水解是碱水解。在一个实施方案中，水解是酸水解。在一个实施方案中，水解是酶促水解。胶原蛋白水解物可以是酶水解、碱水解和酸水解的胶原蛋白水解物中的一种或更多种。作为补充或替代，胶原蛋白水解物可通过以下方法之一或其组合获得：碱水解、酸水解和酶水解。

在本发明的上下文中，“胶原蛋白水解物”可以以一步法或经由中间明胶阶段(即因此获得“水解明胶”)从含有胶原蛋白的物质产生。因此，术语“胶原蛋白水解物”涵盖水解明胶(即经水解明胶)。本文中使用的术语“明胶”意指如通过胶原蛋白的部分水解获得的胶原蛋白的(不可逆)形式。根据所使用的方法，通常获得两种类型的明胶，即A型(酸水解)和B型(碱水解)。在本发明的上下文中，“明胶”可指A型或B型明胶、或者其组合。根据部分水解的物理和化学方法，肽的分子量可落入广泛的范围内(例如10至95kDa)。部分水解为明胶提供了保水能力及其胶凝化能力，通常将其与“胶原蛋白肽”或“水解的胶原蛋白”(即通过胶原蛋白完全水解获得的产物)区分开。在本发明的上下文中，术语“水解明胶”意指通过明胶的水解获得的产物，并且其导致明胶的较低分子量。至于获得经水解明胶的水解反应包括在添加1分子水的情况下使一个或更多个肽连接断裂。就胶凝化能力而言，经水解明胶有别于其他明胶，即经水解明胶具有降低的/无胶凝化能力，而明胶具有胶凝化能力。明胶可被酸(氢离子)水解，即以获得“酸水解明胶”。明胶可被碱(氢氧根离子)水解，即以获得“碱水解明胶”。明胶可被一种或更多种酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶)水解，即以获得“酶水解明胶”。在本发明的上下文中，术语“水解的(hydrolyzed)”和“水解的(hydrolysed)”可互换使用。

在一个优选实施方案中，胶原蛋白水解物是水解明胶。

在本发明的上下文中，胶原蛋白或胶原蛋白水解物可包括人工合成(例如重组或通过化学合成)的蛋白质或肽。重组合成涵盖蛋白质或肽由在表达系统中表达的重组DNA编码。用于重组肽的表达系统可以是细胞，例如细菌细胞(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种)、酵母细胞[例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)或Ogataea angusta(多形汉逊酵母(HansenuLa polymorpha))、博迪尼假丝酵母(Candida bodini)]、真菌细胞(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichodermareesei))、哺乳动物细胞(例如CHO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、NS0、Sp2/0)、昆虫细胞和植物细胞(例如烟草、谷类、豆类、水果、蔬菜)。

在本发明的多个实施方案中，胶原蛋白水解物可通过胶原蛋白的酶促水解或部分酶促水解产生，其中出于该目的使用的酶可以是选自以下中的一种或更多种：丝氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、巯基蛋白酶、菠萝蛋白酶(bromelain)、金属蛋白酶、蛋白酶、羧肽酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。

在一个实施方案中，水解(优选酶促水解)在pH 5至8、优选pH 6至7下进行。在一个实施方案中，水解(优选酶促水解)在55至70℃，优选60至65℃的温度下进行。在一个实施方案中，水解(优选酶促水解)进行3至8小时，优选4至7小时，更优选5至6小时。

在本发明的上下文中，胶原蛋白水解物可来源于选自I型至XXVII型胶原蛋白中的一种或更多种类型的胶原蛋白，优选I型、II型、III型、V型或X型胶原蛋白中的一种或更多种，更优选I型、II型或III型胶原蛋白中的一种或更多种。作为补充或替代，如本文中公开的胶原蛋白水解物可以是两种或更多种类型的胶原蛋白，优选I型、II型和III型胶原蛋白中的两种或更多种的混合物。

如本文中公开的胶原蛋白可来源于任一种或更多种动物或者动物物种，例如牛(物种)、猪(物种)、鸡和鱼(物种)。在一个实施方案中，胶原蛋白来源于牛(cow)。在一个实施方案中，胶原蛋白来源于猪。在一个实施方案中，胶原蛋白来源于鱼。在一个实施方案中，胶原蛋白来源于鸡。在多个实施方案中，胶原蛋白是来自不同来源的胶原蛋白(例如源自多种动物物种的胶原蛋白和/或源自不同组织的胶原蛋白)的混合物。例如，如本文中公开的胶原蛋白可以是选自以下中的两种或更多种胶原蛋白的混合物：鱼胶原蛋白、猪胶原蛋白、鸡胶原蛋白和牛胶原蛋白。

在本发明的上下文中，胶原蛋白可来源于选自以下的一种或更多种组织：皮肤、鳞、鹿角、突出物(例如驼峰)、角、头、脑、颈、耳、眼、鼻、舌、唇、口、食管、气管、胸骨、喉、支气管、肢、足、趾、掌、爪、骨、软骨、骨髓、关节、膜、后腿(hind)、韧带、腱、肋骨、隔膜、肌肉、骨骼肌、平滑肌、肠、血管、膀胱、胃、主动脉、心脏、肝、肾、胸部、肺、脾、胰腺、卵子、精子、睾丸、卵巢、神经、胆囊和腹部。如本文中公开的术语“皮肤”涵盖“兽皮(hide)”，即意指大型动物的外部覆盖物例如来自牛(物种)或任何其他大型动物。术语“皮肤”和“兽皮”可在本文中互换使用，并且可指动物的外部覆盖物，而与尺寸无关。

在一个优选实施方案中，如本文中教导的胶原蛋白来源于皮肤和/或皮肤结缔组织。在一个优选实施方案中，如本文中教导的胶原蛋白来源于软骨。在一个优选实施方案中，如本文中教导的胶原蛋白来源于骨。在一个优选实施方案中，如本文中教导的胶原蛋白来源于胸骨。如本文中公开的胶原蛋白可以是来源于两种或更多种组织和/或者两种或更多种动物的胶原蛋白的混合物。在一个实施方案中，如本文中公开的胶原蛋白是选自包含以下的组的两种或更多种胶原蛋白的混合物：皮肤胶原蛋白、软骨胶原蛋白、胸骨软骨胶原蛋白和骨胶原蛋白。

本发明的上下文中，术语“冷冻保存制剂”意指适合用于和/或旨在用于细胞冷冻保存的制剂。制剂优选地是液体制剂，或至少是其中可悬浮生物物质(包括细胞)的制剂。本文中使用的术语“冷冻保存”意指冷却、优选冷冻生物物质，优选目的是允许储存生物物质和/或保存生物物质用于将来使用。在本发明的上下文中，最通常地并且优选地，冷冻保存达到约-10至-30℃，更优选地达到约-70至-90℃(例如使用固体二氧化碳)或约-180至-220℃(例如使用液氮)的温度。在本发明的上下文中，术语“冷冻保存”可与术语“冷冻保护”或“冷冻库”互换使用。本文中使用的术语“冷冻保存”涵盖将物质冷却至冰点以上，例如以避免冰晶的形成。术语“冷冻保存”涵盖缓慢冷冻。“缓慢冷冻”意指温度逐渐降低，最通常地是平均每分钟降低0.2至5℃(例如0.5至2℃)，直到达到最终储存温度。这意指生物物质在数个小时的过程中被冷却(例如以达到约-196℃的温度)。在本发明的上下文中，“缓慢冷冻”可与术语“控制速率冷冻”或“缓慢程序化冷冻(slow programmable freezing，SPF)”互换使用。本文中使用的术语“冷冻保存”涵盖“玻璃化”(也称为快速冷冻)，其涉及快速冷却，目的是防止冰晶的形成，并从而有助于防止冷冻保存损伤。“缓慢冷冻”和“玻璃化”的过程在本领域中是公知的，例如如在Son et al.的综述文章中所述(Expert Rev Med Devices2009Jan；6(1):1-7)。

在本发明的上下文中，术语“冷冻保存”优选地涵盖以下步骤：将生物物质并入冷冻保存制剂中、冷冻以及冷冻之后对细胞进行解冻。在本发明的上下文中，认为在解冻期间导致细胞改善的制剂通常改善冷冻保存。本发明还进一步涉及冷冻之后生物物质的解冻。特别地，本发明人发现适当浓度的胶原蛋白水解物允许将冷冻细胞带到室温从代谢非活跃状态至活跃状态而明显不引起损伤。因此，胶原蛋白水解物可在解冻期间发挥有益作用和/或在解冻期间降低二甲基亚砜的负面(毒性)作用。

在一个实施方案中，如本文中公开的胶原蛋白水解物和/或冷冻保存制剂的用途涉及在冷冻保存之后解冻期间降低毒性和/或提高细胞生存力的用途，其中胶原蛋白水解物优选地以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量在冷冻保存制剂中提供。在一个优选实施方案中，通过在解冻期间降低非渗透性和/或渗透性冷冻保护剂在细胞中的一种或更多种毒性作用来降低细胞毒性和/或提高细胞生存力。在一个优选实施方案中，通过在解冻期间降低渗透性冷冻保护剂在细胞中的一种或更多种毒性作用来降低细胞毒性和/或提高细胞生存力，其中渗透性冷冻保护剂是二甲基亚砜。

本发明的方法涉及在如本文中公开的冷冻保存制剂中提供生物物质，并将冷冻保存制剂的温度降低至低于冷冻保存制剂的凝固点。凝固点可取决于液体冷冻保存制剂的组成，并且定义为液体冷冻保存制剂在正常大气压下变成固体的温度。作为补充或替代，考虑到冷冻保存制剂可以是水性的，凝固点优选为0℃或接近0℃(例如-10、-9、-8、7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃)。

在一个实施方案中，含有生物物质的冷冻保存制剂是直接冷冻的，这意味着冷冻速率不受控制，因此排除了程序化和/或缓慢冷冻的用途。

冷冻保存制剂可包含基于冷冻保存制剂的重量计算的至少5重量％、或10重量％、或15重量％、或20重量％、或22.5重量％、或25重量％、或27.5重量％、或30重量％、或32.5重量％、或35重量％、或37.5重量％、或40重量％、或45重量％、或50重量％的胶原蛋白水解物。作为补充或替代，冷冻保存制剂可包含基于冷冻保存制剂的重量计算的不超过80重量％、或75重量％、或70重量％、或65重量％、或50重量％、或45重量％、或40重量％、或37.5重量％、或35重量％、或32.5重量％、或30重量％、或27.5重量％、或25重量％、或22.5重量％、或20重量％的胶原蛋白水解物。在一个优选实施方案中，冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％，优选20至50重量％的胶原蛋白水解物，更优选25至40重量％，甚至更优选27.5至35重量％的胶原蛋白水解物。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂还包含二甲基亚砜。

冷冻保存制剂可包含基于冷冻保存制剂的重量计算的至少0.01重量％、或0.05重量％、或0.1重量％、或0.2重量％、或0.5重量％、或0.6重量％、或0.7重量％、或0.8重量％、或0.9重量％、或1重量％、或1.25重量％、或1.5重量％、或1.75重量％、或2重量％、或2.25重量％、或2.5重量％、或2.75重量％、或3重量％、或3.25重量％、或4重量％、或4.25重量％、或4.5重量％、或4.75重量％、或5重量％、或5.25重量％、或5.25重量％、或5.5重量％、或5.75重量％、或6.0重量％、或6.25重量％、或6.5重量％、或7重量％、或7.5重量％、或8重量％、或8.5重量％、或9重量％、或9.5重量％、或10重量％、或11重量％、或12重量％、或13重量％、或14重量％、或15重量％的二甲基亚砜。作为补充或替代，冷冻保存制剂可包含基于冷冻保存制剂的重量计算的不超过20％、或17.5％、或15％、或12.5、或12％、或11％、或10.9％、或10.8％、或10.7％、或10.6％、或10.5％、或10.4％、或10.3％、或10.2％、或10.1％、或10％、或9.5％、或9％、或8.5％、或8％、或7.5％、或7％、或6.5％、或6.25％、或6％、或5.75％、或5.5％、或5.25％、或5％、或4.75％、或4.5％、或4.25％、或4％、或3.75％、或3.5％、或3.25％、或3％、或2.75％、或2.5％的二甲基亚砜。

例如用于如本文中所述的用途的冷冻保存制剂可包含基于冷冻保存制剂的总体积计算的至少0.01％v/v、或0.05％v/v、或0.1％v/v、或0.2％v/v、或0.5％v/v、或0.6％v/v、或0.7％v/v、或0.8％v/v、或0.9％v/v、或1％v/v、或1.25％v/v、或1.5％v/v、或1.75％v/v、或2％v/v、或2.25％v/v、或2.5％v/v、或2.75％v/v、或3％v/v、或3.25％v/v、或4％v/v、或4.25％v/v、或4.5％v/v、或4.75％v/v、或5％v/v、或5.25％v/v、或5.25％v/v、或5.5％v/v、或5.75％v/v、或6.0％v/v、或6.25％v/v、或6.5％v/v、或7％v/v、或7.5％v/v、或8％v/v、或8.5％v/v、或9％v/v、或9.5％v/v、或10％v/v、或11％v/v、或12％v/v、或13％v/v、或14％v/v、或15％v/v的二甲基亚砜。作为补充或替代，冷冻保存制剂可包含基于冷冻保存制剂的总体积计算的不超过20％v/v、或17.5％v/v、或15％v/v、或12.5v/v、或12％v/v、或11％v/v、或10.9％v/v、或10.8％v/v、或10.7％v/v、或10.6％v/v、或10.5％v/v、或10.4％v/v、或10.3％v/v、或10.2％v/v、或10.1％v/v、或10％v/v、或9.5％v/v、或9％v/v、或8.5％v/v、或8％v/v、或7.5％v/v、或7％v/v、或6.5％v/v、或6.25％v/v、或6％v/v、或5.75％v/v、或5.5％v/v、或5.25％v/v、或5％v/v、或4.75％v/v、或4.5％v/v、或4.25％v/v、或4％v/v、或3.75％v/v、或3.5％v/v、或3.25％v/v、或3％v/v、或2.75％v/v、或2.5％v/v的二甲基亚砜。

在一个优选实施方案中，例如用于如本文中所述的用途的冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的重量计算的超过20重量％，优选超过22.5重量％，甚至更优选超过25重量％的胶原蛋白水解物。在一个优选实施方案中，例如用于如本文中所述的用途的冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的重量计算的小于50重量％，优选小于45重量％，甚至更优选小于40重量％的胶原蛋白水解物。在一个优选实施方案中，例如用于如本文中所述的用途的冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的总体积计算的小于10％v/v，优选小于9.5％v/v，甚至更优选小于9.0％v/v的二甲基亚砜。

在一个优选实施方案中，冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的重量计算的至少0.1重量％的二甲基亚砜。在一个优选实施方案中，冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的重量计算的小于10.9重量％的二甲基亚砜。

在一个优选实施方案中，冷冻保存制剂包含基于冷冻保存制剂的重量计算的0.2至10.5重量％，优选0.5至8.5重量％，更优选1至7重量％，甚至更优选2至6重量％，最优选3至5％的二甲基亚砜。

技术人员知晓如何基于DMSO的已知密度(1.1g/cm³)和DMSO存在于其中的水性介质的密度(通常密度约1.0g/cm³)在DMSO的重量％和体积％量之间转换。例如，基于水性制剂的体积计算的10％(v/v)DMSO浓度等于基于制剂的总重量计算的10.9重量％的DMSO。相同的转化适合于例如DMSO浓度为0.5％v/v(即0.55重量％)、1.0％v/v(即1.10重量％)、1.5％v/v(即1.65重量％)、2.0％v/v(即2.2重量％)、2.5％v/v(即2.74重量％)、3.0％v/v(即3.29重量％)、3.5％v/v(即3.84重量％)、4.0％v/v(即4.38重量％)、4.5v/v(即4.93重量％)、5.0％v/v(即5.24重量％)、5.5％v/v(即6.02重量％)、6.0％v/v(即6.56重量％)、6.5％v/v(即7.10重量％)、7.0％v/v(即7.65重量％)、7.5％v/v(即8.16重量％)、8.0％v/v(即8.73重量％)、8.5％v/v(即9.27重量％)、9.0％v/v(即9.81重量％)、9.5％v/v(即10.35重量％)、10％v/v(即10.90重量％)、12.5％v/v(即13.58重量％)、15％v/v(即16.26重量％)。

在一个实施方案中，本发明涉及本文中公开的胶原蛋白水解物在生物物质的冷冻保存中的用途，其中生物物质优选地选自真核细胞、原核细胞、细胞器、胞外囊泡、类器官、组织和器官。在一个优选实施方案中，本文中所述的用途中的胶原蛋白水解物以基于冷冻保存制剂的总重量计算的10至70重量％，优选20至60重量％，更优选超过20重量％的量存在。在一个优选实施方案中，本文中所述的用途中的二甲基亚砜水解物以基于冷冻保存制剂的总体积计算的小于10％(v/v)，优选小于9.5％(v/v)，更优选小于9％(v/v)的量存在。在一个优选实施方案中，本文中所述的用途中的冷冻保存制剂(基本上)不含二甲基亚砜，或包含基于冷冻保存制剂的总体积计算的不超过0.1％(v/v)、或不超过0.01％(v/v)、或不超过0.001％(v/v)、或不超过0.0001％(v/v)的二甲基亚砜。在一个优选实施方案中，本文中所述的用途中的胶原蛋白水解物(基本上)不含以下中的一种或更多种：另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白，更优选不含另外的渗透性冷冻保护剂。

在一个实施方案中，本发明的方法利用冷冻保存制剂，该冷冻保存制剂含有基于冷冻保存制剂的总重量计算的10至70重量％、优选20至60重量％、更优选超过20重量％的胶原蛋白水解物的量。在一个优选实施方案中，本发明的方法利用冷冻保存制剂，该冷冻保存制剂含有基于冷冻保存制剂的总体积计算的小于10％(v/v)，优选小于9.5％(v/v)，更优选小于9％(v/v)的二甲基亚砜的量。在一个优选实施方案中，本发明的方法利用冷冻保存制剂，该冷冻保存制剂(基本上)不含二甲基亚砜，或包含基于冷冻保存制剂的总体积计算的不超过0.1％(v/v)、或不超过0.01％(v/v)、或不超过0.001％(v/v)、或不超过0.0001％(v/v)的二甲基亚砜。在一个优选实施方案中，本发明的方法利用冷冻保存制剂，该冷冻保存制剂(基本上)不含以下中的一种或更多种：另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白，更优选不含另外的渗透性冷冻保护剂。

在一个实施方案中，在不存在另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白中的一种或更多种，更优选在不存在DMSO的情况下，本发明的方法和/或用途利用胶原蛋白水解物作为冷冻保护剂。

在其中胶原蛋白水解物用于不存在另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白中的一种或更多种的情况下的实施方案中，胶原蛋白水解物优选为水解明胶，因为这显示出在冷冻保存之后导致最高的活力，但其他形式的胶原蛋白水解物也可适合于本发明。

在其中胶原蛋白水解物用于不存在另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白中的一种或更多种的情况下的实施方案中，胶原蛋白水解物优选分子量为3500至7500Da，优选4000至6000Da，更优选4500至5500Da，因为这显示出在冷冻保存之后导致最高的活力，尽管其他形式的胶原蛋白水解物也可适合于本发明。

在其中胶原蛋白水解物用于不存在另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白中的一种或更多种的情况下的实施方案中，胶原蛋白水解物的量基于制剂的总重量计算优选超过20至50重量％，优选22.5至45重量％，更优选25至40重量％，甚至更优选27.5至35重量％，因为这显示出在冷冻保存之后导致最高的活力，但其他形式的胶原蛋白水解物也可适合于本发明。

在一个实施方案中，本发明的用途涉及胶原蛋白水解物用于降低冷冻保存制剂中二甲基亚砜的量的用途，其中胶原蛋白水解物优选以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量提供。例如，二甲基亚砜的量可由于胶原蛋白水解物而降低，同时仍然实现至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少99％的细胞回收。

在一个实施方案中，在本发明的冷冻保存制剂中，生物物质(优选细胞)的冷冻保存导致与相同但不含胶原蛋白水解物的冷冻保存制剂相比的相似或更高的细胞回收(和/或更低的细胞死亡)以及/或者细胞生存力。例如，25重量％的胶原蛋白水解物和5重量％的DMSO的组合可导致与不含胶原蛋白水解物的5重量％的DMSO相比的相似或更高的细胞回收(和/或更低的细胞死亡)以及/或者细胞生存力。

在一个实施方案中，在生物物质(优选细胞)的冷冻保存中使用胶原蛋白水解物，允许使用较低量的DMSO，同时产生相似或更高的细胞回收(和/或更低的细胞死亡)以及/或者细胞生存力。例如，25重量％的胶原蛋白水解物和5重量％的DMSO的组合可导致与使用不含胶原蛋白水解物的10重量％的DMSO相比的相似或更高的细胞回收(和/或更低的细胞死亡)以及/或者细胞生存力。例如，“较低量的DMSO”可以是DMSO的量降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％以及/或者降低至如本文中公开的任何优选的DMSO浓度。

在本发明的上下文中，“细胞回收”和/或“细胞死亡”优选在细胞缓慢冷冻之后确定，并在解冻之后确定活细胞和死细胞的百分比。技术人员知晓缓慢冷冻和解冻可取决于细胞的类型，并且可相应地调整方案。解冻之后的细胞回收可通过对活细胞计数并将其与冷冻细胞的数量进行比较来确定，例如使用选择性染色死细胞的染色剂，例如台盼蓝来进行。细胞死亡％可通过比较活细胞和冷冻细胞的数量来确定。作为补充或替代，活细胞和死细胞可使用商业测定来确定，例如活死测定(Live Dead assay)，其使用差异标记活细胞和死细胞的两种荧光染料的混合物，并使用流式细胞术或荧光显微术测量活细胞和死细胞。

在本发明的上下文中，术语“活细胞”意指具有完整细胞膜的细胞，例如通过显示(DNA结合)细胞膜不可渗透的染料不能进入细胞来限定。在本发明的上下文中，术语“死细胞”意指不是活细胞的细胞。

在本发明的上下文中，“细胞生存力”优选地根据细胞代谢活性、细胞增殖和(三磷酸腺苷)ATP浓度中的一种或更多种来确定，即较高的细胞代谢活性、较高的细胞增殖和/或较高的ATP浓度可以是较高细胞生存力的指标。

例如，细胞代谢活性可用基于四唑盐(例如MTT、XTT)或Alamar Blue的测定来测量。例如，细胞增殖可用针对细胞增殖标志物或细胞周期调节标志物(例如Ki-67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、拓扑异构酶IIB或磷酸化的组蛋白H3)的测定来测量。例如，可使用生物发光萤光素酶及其底物(萤光素)来检测ATP。

在一个实施方案中，本发明的用途涉及胶原蛋白水解物用于降低冷冻保存制剂中二甲基亚砜的量的用途，其中胶原蛋白水解物优选以基于冷冻保存制剂的重量计算的20至70重量％的量提供。

胶原蛋白水解物的平均分子量可在500Da至25,000Da的范围内，例如1000Da至15000Da或者2000Da至10000Da。胶原蛋白水解物的平均分子量可为至少500Da、或600Da、或700Da或800Da、或900Da、或1000Da或1100Da、或1200Da、或1300Da、或1400Da、或1500Da、或1750Da、或2000Da、或2250Da、或2500Da、或2750Da、或3000Da、或3250Da、或3500Da、或4000Da、或4500Da、或5000Da、或5500Da。作为补充或替代，胶原蛋白水解物的平均分子量可不超过10000Da、或9500Da、或9000Da、或8750Da、或8500Da、或8250Da、或8000Da、或7750Da、或7500Da、或7250Da、或7000Da、或6750Da、或6500Da、或6250Da、或6000Da、或5750Da、或5500Da、或5250Da、或5000Da、或4500Da、或4000Da。在一个优选实施方案中，胶原蛋白水解物的平均分子量为500至10000Da，优选1000至8000Da，更优选2000至7000Da，甚至更优选3000至6000Da。

在本发明的上下文中，平均分子量优选为重均分子量。测量胶原蛋白水解物或明胶的(平均)分子量和/或分子量分布的优选方法是通过高效尺寸排阻色谱(highperformance size exclusion chromatography，HPSEC)。以下方案是优选的HPSEC方案：

使用具有TSKgel SWXL预柱和G2000SWXL柱(Tosoh Bioscience)的Agilent HPLC，1260Infinity系列(G1316A、G1329B、G1311C、G1315D)。使用WinGPC软件(PSS)进行分析。洗脱剂是pH 5.3的100mM磷酸盐缓冲剂。将样品从柱上洗脱(例如0.5mL/分钟，等度)并用UV检测器监测(例如214nm，分析时间：40分钟/次注射+180分钟平衡)。使用窄校准标准物(低FILK)进行校准。

本发明人发现，在本发明的上下文中，如果不存在LPS(内毒素)或存在最少量的LPS(内毒素)将是有益的，特别是当进行离心洗涤步骤时。不具有LPS或具有低LPS可使离心洗涤步骤更多余。此外，发现在冷冻保存期间LPS的存在可在细胞中诱导不期望的毒性和/或促炎症应答。作为补充或替代，胶原蛋白水解物的使用也可针对冷冻保存制剂中LPS的不期望的作用提供保护。

胶原蛋白水解物的内毒素水平优选不超过10000EU(即内毒素单位)/g胶原蛋白水解物或/mL冷冻保存制剂，优选不超过1000EU(例如不超过500、400、300或200EU)，更优选不超过100EU(例如不超过90、80、70、60、50、40或30或20EU)，甚至更优选不超过10EU(例如不超过9、8、7、6、5、4、3、2、1EU)，最优选不超过1EU，均为/g胶原蛋白水解物或/mL冷冻保存制剂。作为补充或替代，胶原蛋白水解物的内毒素水平可以是至少1EU/g胶原蛋白水解物或/mL冷冻保存制剂，优选至少10EU，例如至少20EU(例如至少30、40、50、60、70、80、90、100或150EU)，更优选至少100EU(例如至少200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500EU)，甚至更优选至少1000EU(例如，至少3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或1000EU)，最优选至少10000EU，均为/g胶原蛋白水解物或/mL冷冻保存制剂。

在一个优选实施方案中，胶原蛋白水解物的内毒素水平基于胶原蛋白水解物的重量计算不超过10000EU/g，优选不超过1000EU/g，更优选不超过100EU/g，最优选不超过10EU/g。

在一个优选实施方案中，冷冻保存制剂的内毒素水平基于冷冻保存制剂的体积计算小于2500EU/ml，优选小于250EU/ml，更优选小于25EU/ml，甚至更优选小于2.5EU/ml，最优选小于1EU/ml。例如，冷冻保存制剂的内毒素水平基于冷冻保存制剂的体积计算可以为0.5至2500EU/ml，或1至1000EU/ml，或5至500EU/ml或10至250EU/ml。

在一个实施方案中，胶原蛋白水解物是无内毒素的。在一个实施方案中，冷冻保存制剂是无内毒素的。术语“无内毒素”可意指不存在内毒素和/或可意指“基本上不含内毒素”。

术语“不含”可与“基本上不含”含义相同。术语“基本上不含”涵盖物质或化合物的量根据本领域的标准技术是不可测量的和/或是低于某些阈值的，优选低于0.1重量％，更优选低于0.01重量％，甚至更优选低于0.001重量％，最优选低于0.0001重量％。在本发明的上下文中，“基本上不含”可意指内毒素水平低于10，优选低于1，更优选低于0.1，甚至更优选低于0.01，最优选低于0.001(均以EU/g或EU/ml计)。措辞“不含”或“基本上不含”涵盖物质或化合物是完全不存在的(例如0重量％)。在本发明的上下文中，术语“不存在”、“不含”和“基本上不含”可互换使用。

在本发明的上下文中，用于测量内毒素水平(例如用于确定EU/g或EU/ml)的广泛使用且优选的方法是技术人员熟悉的鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)测试或重组因子C(recombinant Factor C，rFC)测试。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂不含以下中的一种或更多种：另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白。

在本发明的上下文中，术语“冷冻保护剂”意指用于生物物质冷冻保存的任何物质或化合物，并且其例如通过减少冰晶形成来防止(即至少减少)生物物质中的冷冻损伤。在本发明的上下文中，术语“冷冻保护剂”、“冷冻保存剂”及其变化形式以及“抗冻剂”可互换使用。当应用于低温生物学之外时，冷冻保护剂通常称为“抗冻剂”。在本发明的上下文中，如果包含物质或化合物的溶液在冷却(例如在-80℃或在液氮中)之后玻璃化，则认为该物质或化合物是冷冻保护剂。在本发明的上下文中，“玻璃化”意指形成具有不规则、无定形结构的固态水。玻璃化优选地通过以下来确定：制备包含物质或溶液的溶液并在-80℃下或在液氮中冷却30分钟。如果冷却的溶液变得透明(而不是乳状的)，例如如果透明度等于或高于参考(公知的)冷冻保护剂(例如如本文中公开的渗透性或非渗透性冷冻保护剂)所观察到的透明度，则认为该冷却的溶液是玻璃化的。例如，包含20％(w/v)胶原蛋白水解物的溶液的透明度可与作为参考的二甲基亚砜(10％v/v)、乙二醇(1M)、丙二醇(1M)或甘油(20％v/v)进行比较。可获得剂量-响应曲线来确定最佳玻璃化(对于胶原蛋白水解物)。

在本发明的上下文中，冷冻保护剂涵盖渗透性和非渗透性冷冻保护剂二者。术语“渗透性冷冻保护剂”意指具有渗透到细胞中的能力并由此可提供针对冷冻损伤的胞内保护的冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂能够穿过生物膜。术语“非渗透性冷冻保护剂”意指(很大程度上)不具有渗透到细胞中的能力和/或(很大程度上)不需要渗透到细胞中来介导冷冻保护作用的冷冻保护剂。非渗透性冷冻保护剂通常通过与渗透性冷冻保护剂相同的机制诱导玻璃化，但是在胞外。在本发明的上下文中，化合物或物质的细胞渗透性优选地通过将细胞暴露于包含该化合物或物质的溶液之后细胞体积的增大来限定。因此，物质或化合物可例如分类为渗透性或非渗透性冷冻保护剂或冷冻保存剂。渗透到细胞中的速度可通过在细胞暴露于溶液之后以特定时间间隔测量细胞体积来确定。优选的方案如由Eto et al(Cryobiology.2014Feb；68(1):147-51)所述。接下来，提供了实例以确定胶原蛋白水解物的可能的细胞渗透性：

在25±0.5℃下将细胞(例如3T3成纤维细胞系)暴露于含有20％w/v的胶原蛋白水解物的溶液中。将包含渗透性二甲基亚砜(10％v/v)、乙二醇(1M)、丙二醇(1M)或甘油(20％v/v)的溶液用作参考，并在30、60、120、180、240和300秒之后测量细胞直径(对照)。体积用式V＝S^3/2计算(S：相对横截面积；V：相对体积，S＝πab；a：长轴半径；b：短轴半径)并且用对照体积计算每个时间点的体积比。如果胶原蛋白水解物溶液的平均相对体积至少与参考的平均体积匹配(对于一个或更多个测量的时间点)，则认为胶原蛋白水解物渗透细胞。

暴露于胶原蛋白水解物溶液的细胞最初可收缩，并此后恢复(一旦胶原蛋白水解物进入细胞)。因此，优选从最低的V值开始计算体积变化。

发现胶原蛋白水解物还可提高二甲基亚砜的冷冻保护作用，降低二甲基亚砜的毒性作用，和/或维持细胞的基因型和表型(例如，通过DNA测序、甲基化、细胞表面标志物表达、细胞分化测定或其他功能测试)。

在一个实施方案中，胶原蛋白水解物是冷冻保护剂。在一个实施方案中，胶原蛋白水解物是渗透性冷冻保护剂。在一个实施方案中，胶原蛋白水解物是非渗透性冷冻保护剂。在一个实施方案中，胶原蛋白水解物不是冷冻保护剂。在一个实施方案中，胶原蛋白水解物提高(另外的)冷冻保护剂的作用和/或降低其毒性，所述冷冻保护剂优选渗透性冷冻保护剂，更优选二甲基亚砜。

不受理论的束缚，本发明人发现胶原蛋白水解物可具有改善冷冻保存之后的细胞回收和活力的一种或更多种机制(与DMSO组合)，例如提供细胞结合位点、水结合/吸收、影响渗透压、影响胞内水含量和冰晶形成。因此，在本发明的上下文中，胶原蛋白水解物可提供多种作用机制中的一种或更多种。

在一个优选实施方案中，冷冻保存制剂包含以下中的一种或更多种：另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白。

在一个实施方案中，渗透性冷冻保护剂是选自以下中的一种或更多种：二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和甘油。

如果制剂中存在二甲基亚砜，则术语“另外的冷冻保护剂”是指除二甲基亚砜之外的任何冷冻保护剂。如果二甲基亚砜不存在于制剂中，则术语“另外的冷冻保护剂”可指任何冷冻保护剂，包括二甲基亚砜。

在一个实施方案中，非渗透性冷冻保护剂是选自以下中的一种或更多种：聚乙二醇、糖(例如蔗糖、右旋糖、棉子糖、海藻糖、乳糖)、聚乙烯吡咯烷酮和甲基纤维素。

发现添加胶原蛋白水解物可消除本领域中通常使用以降低冷冻保护剂毒性的血清和血清来源的蛋白的需要。不受理论的束缚，胶原蛋白水解物可保护细胞膜免受剪切应力和/或抵消二甲基亚砜或其他冷冻保护剂的不期望的特征。另外地或替代地，替代血清和血清来源的蛋白可降低批次间差异、细胞响应不一致以及就伦理或治疗考虑而言的使用限制。

本文中公开的术语“血清”涵盖人和动物血清，包括但不限于胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)或新生牛血清(newborn bovineserum，NBS)、新生牛血清(newborn calf serum)。本文中公开的术语“血清”涵盖热灭活的血清。在本发明的上下文中，术语“血清蛋白”涵盖人血清蛋白和动物血清蛋白，优选人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)或牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。

在本发明中，盐可存在或不可存在于冷冻保存制剂中。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂(基本上)不含盐。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂(基本上)不含加成盐。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂是非动物来源的，意指其不包含动物来源的成分，例如当胶原蛋白(水解物)或明胶(水解物)是重组或合成获得时。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂包含渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂中的一种或更多种，其量为基于冷冻保存制剂的重量计算的0.1至50重量％，优选0.2至25重量％，更优选0.5至10重量％，甚至更优选1至5重量％，最优选2至4重量％。作为补充或替代，在一个实施方案中，冷冻保存制剂包含渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂中的一种或更多种，其量为基于冷冻保存制剂的重量计算的0.1至50重量％，优选0.2至25重量％，更优选0.5至10重量％，甚至更优选1至5重量％，最优选2至4重量％。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂包含一种或更多种渗透性二醇，其量为基于冷冻保存制剂的重量计算的0.1至20重量％，优选0.2至10重量％，更优选0.5至5重量％，甚至更优选1至2.5重量％。本文中使用的“渗透性二醇”优选为乙二醇和/或丙二醇。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂包含一种或更多种糖，其量为基于冷冻保存制剂的重量计算的0.1至20重量％，优选0.2至10重量％，更优选0.5至5重量％，甚至更优选1至2.5重量％。

在本发明的上下文中，“糖”是优选地选自以下中的一种或更多种：蔗糖、右旋糖、棉子糖、海藻糖和乳糖。

在本发明的上下文中，冷冻保存制剂适合于一种或更多种生物物质的冷冻保存，例如选自以下中的一种或更多种：细胞(真核或原核)、多细胞真核生物(例如(线虫)蠕虫)、类器官(例如肠类器官、肺类器官、胚胎类器官、肾类器官、上皮类器官)、微生物培养物(例如真菌、细菌)、血液(例如脐带血)、精液、thrombosome、组织(例如活组织或非活组织，如肿瘤和组织学横截面)、卵巢组织、皮肤组织、肌肉骨骼组织(例如骨、软骨、腱)、睾丸组织、精子、卵母细胞、胚胎、器官(例如肝、心脏、肾、皮肤、肺、胰腺、肠)、细胞囊泡(例如胞外囊泡，包括外泌体)、类器官、植物物质(例如植物种子、芽尖、休眠芽、苔藓植物)。

生物物质优选是哺乳动物的，更优选是人的。

在一个优选实施方案中，本发明的用途涉及选自以下的一种或更多种生物物质的冷冻保存：真核细胞、原核细胞、细胞器、胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)、类器官、组织和器官。

3D类器官密切模拟体内情况，其包含增殖性干细胞和祖细胞以及分化的细胞类型，包括吸收性肠上皮细胞、分泌性黏液产生细胞、帕内特(paneth)细胞或肠内分泌细胞。细胞类型位于整个类器官结构中不同的增殖(隐窝)或分化(绒毛)区。3D类器官代表结构封闭的系统，其特征在于形成具有类似体内特征的连续上皮。另外，与原生组织相当的分子特征将原代3D类器官培养物分级为重要的体外模型，用于未来制药工业中更精确的药物筛选。

技术人员知晓不同类型的类器官和获得它们的方法(例如，至少如Kim etal.Nature Reviews Molecular Cell Biology第21卷，第571至584页(2020)的综述文章中所述的类器官)。

如果生物物质是细胞，则细胞可例如以基于冷冻保存制剂的体积计算的以下的浓度冷冻保存：1×10³至1×10⁹个细胞/ml，优选1×10⁴至1×10⁸个细胞/ml，更优选1×10⁵至1×10⁷个细胞/ml。如果生物物质是胞外囊泡(即EV)，则EV可例如以基于冷冻保存制剂的体积计算的以下的浓度冷冻保存：1×10⁵至1×10¹¹个EV/ml，优选1×10⁶至1×10¹⁰个EV/ml，更优选1×10⁷至1×10⁹个EV/ml。如果生物物质是类器官，则类器官可例如以基于冷冻保存制剂的体积计算的以下的浓度冷冻保存：10至10,000个类器官/ml，优选50至1000个类器官/ml，更优选100至500个类器官/ml。

在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是用于先进药品(ATMP)的细胞和/或是选自以下的一种或更多种：造血细胞(例如红系细胞、造血干细胞)、髓样细胞(例如粒细胞、巨核细胞、巨噬细胞)、免疫细胞(例如中性粒细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞)、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、干细胞(例如造血干细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、胚胎干细胞)、羊膜上皮细胞、肝细胞和肝星状细胞。

在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)T淋巴细胞。在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是CD3+和/或CD45+T淋巴细胞。在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是CD45+和/或CD34+干细胞。

本发明的冷冻保存制剂特别适合于冷冻保存“难冷冻的细胞”、“不可冷冻的细胞”、终末分化的细胞和缓慢生长的细胞中的一种或更多种，其使用10％(v/v)(10.9重量％)DMSO通常不能实现期望的低细胞死亡和/或高细胞生存力，但其通常可通过胶原蛋白水解物和DMSO的组合实现。

在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是“易冷冻的细胞”。本文中使用的“易冷冻的细胞”意指这样的细胞类型：在基于如本文中公开的渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂而非胶原蛋白水解物的制剂中冷冻保存之后，显示出低于20％的细胞死亡(在最佳条件下)并保持活力(例如活力降低不超过20％)。优选地，本文中使用的“易冷冻的细胞”意指这样的细胞类型：在10％(v/v)DMSO中冷冻保存之后显示出低于20％的细胞死亡并保持活力(例如活力降低不超过20％)。

在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是“难冷冻的细胞”。本文中使用的“难冷冻的细胞”意指这样的细胞类型：在基于如本文中公开的渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂而非胶原蛋白水解物的制剂中冷冻保存之后，显示出低于20％的细胞死亡(在最佳条件下)但显示出活力降低(例如活力降低至少20％)。优选地，本文中使用的“难冷冻的细胞”意指这样的细胞类型：在10％(v/v)DMSO中冷冻保存之后显示出低于20％的细胞死亡但显示出活力降低(例如活力降低至少20％)。

在一个实施方案中，在本发明的上下文中，细胞是“不可冷冻的细胞”。本文中使用的“不可冷冻的细胞”意指这样的细胞类型：在基于如本文中公开的渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂而非胶原蛋白水解物的制剂中冷冻保存之后，显示出至少20％的细胞死亡(在最佳条件下)。优选地，本文中使用的“不可冷冻的细胞”意指这样的细胞类型：在10％(v/v)DMSO中冷冻保存之后显示出至少20％的细胞死亡。

在一个实施方案中，细胞是原代细胞，意指从活组织(优选人组织)中(新鲜)分离的细胞。

在一个实施方案中，细胞是终末分化的细胞，优选地选自以下中的一种或更多种：神经元细胞、神经毡(neuropil)、心肌细胞、骨骼肌细胞、终末分化的成纤维细胞、终末分化的肝细胞、单核细胞、树突细胞、β细胞、胰岛、人原代肝细胞、原代人单核细胞、软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞。本文中使用的术语“终末分化的细胞”意指几乎不(即每48小时不超过一次，优选每7天不超过一次)增殖或根本不增殖的细胞，尤其是在体外。本文中使用的术语“终末分化的细胞”优选地意指已经经历细胞周期阻滞的细胞。在本发明的上下文中，增殖能力优选地涉及体外增殖的能力。通常来说，终末分化的细胞不转化为其他类型的细胞，并且已经分化以执行特定的功能。

在一个实施方案中，如本文中公开的生物物质(旨在)用于移植到宿主中，优选移植到人中。在一个实施方案中，生物物质是先进药品(ATMP)，例如基因治疗药物产品、体细胞治疗药物产品和组织工程化产品中的一种或更多种。对于ATMP产品，通常认为，作为经验法则，细胞存活应高于80％(即细胞死亡低于20％)，并且此外，冷冻保存制剂应该是GMP级，并且优选不含DMSO和/或(动物)血清。目前可用的冷冻保存制剂不符合该标准，例如因为它们通常需要血清(蛋白质)和/或DMSO。然而，本发明的冷冻保存制剂可符合该标准。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂是GMP(良好生产规范)级和/或可在GMP条件下制造。

在一个实施方案中，冷冻保存制剂可另外用作细胞载体，例如本领域已知的支架和/或水凝胶，包括适合于3D打印的生物墨水。用于该目的的冷冻保存制剂包含允许形成水凝胶的另外的可交联的聚合物(例如由Chaudhary et al.Beni-Suef Univ J Basic ApplSci 11,3 2022讨论的)。例如，冷冻保存制剂可包含光引发剂，以促进冷冻保存之前和/或之后的交联，例如以获得3D构建体(Tan et al.Micromachines(Basel).2022Jul；13(7):1038)。

在一个实施方案中，本发明的冷冻保存制剂适合于生物物质的长期保存，例如细胞，更优选哺乳动物细胞，甚至更优选人细胞。在一个实施方案中，本发明的冷冻保存制剂用于冷冻保存至少1年(例如1年至20年)，优选至少5年，更优选至少10年。

在使用本发明的冷冻保存制剂的情况下，出乎意料地显示，如果在解冻之后不包括离心洗涤步骤，则可以改善细胞回收、活力和/或功能性。在一个实施方案中，生物物质在冷冻保存之后和/或冻融之后不经受离心洗涤步骤，而是直接用于例如体外培养和/或体内植入，而不排除冷冻保存制剂在选择的另外的(液体)制剂中稀释的可能性。在本发明的上下文中，术语“冷冻保存之后”和/或“冻融之后”优选地意指解冻细胞之后15分钟、优选30分钟、更优选60分钟、甚至更优选1天、最优选1周的时间段。在本发明的上下文中，术语“离心洗涤”可以是通过施加离心力使至少部分生物物质(例如细胞)聚集和/或沉淀的任何方法。离心洗涤允许去除上清液冷冻保存制剂)，然后可将生物物质重悬于不同的水性介质或另一种载体物质中。术语“离心洗涤”涵盖用商业(实验室)离心机的离心，例如在50至10,000×g、或100至5000×g、或200至1000×g，或300至500×g下使用。

在本发明的上下文中，术语“包含/包括”或“以包含/包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，以表示包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。

除非上下文明确需要存在一个且仅一个要素，否则通过没有数量词修饰的名词对要素的提及不排除存在多于一个要素的可能性。因此没有数量词修饰的名词通常意指“至少一个/种”。

在本发明的上下文中，当水平比对照或参考中的相应水平分别高或低至少1％(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％)时，水平是“提高的”或“降低的”。作为补充或替代，当样品中的水平与对照或参考(包括较早的时间点)中的水平相比分别在统计学上显著更高或更低时，无论变化的大小如何，可认为样品中的水平提高或降低。在本发明的上下文中，术语“以减少”可与术语“以降低”互换使用。

附图说明

图1.用基于25％(w/v)胶原蛋白水解物(含有1250EU/g LPS(“低LPS”，P5000)或13350EU/g LPS(“高LPS”，P2000))与6.7％(v/v)DMSO的组合的冷冻保存制剂冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。

图2.在含有8％(v/v)DMSO，以及含有或不含20000EU/ml LPS(“LPS”组)的冷冻保存制剂中的成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。在不存在离心洗涤步骤或存在离心洗涤步骤(以300×g力持续3分钟)(“旋转”组)的情况下，确定细胞死亡。

图3.在10％(v/v)DMSO(“对照”)或补充有30％(w/v)胶原蛋白水解物的6.7％(v/v)DMSO(“+CH”)中冷冻之后，神经毡细胞中的细胞死亡(％)。

图4.在多种冷冻保存制剂中冷冻保存之后的神经元细胞死亡。30％HC＝30w/v的平均分子量约为5000Da的胶原蛋白水解物(“P5000”)。

图5.新鲜的神经毡细胞(左图)和冷冻的神经毡细胞(中图和右图)中神经胶质标志物和神经元标志物的染色。将神经毡细胞在10％(v/v)DMSO(中图)或6.7％(v/v)DMSO与30％(w/v)胶原蛋白水解物(CH，“P5000”)的组合中冷冻。染色示出了GFAP(神经胶质细胞标志物)和MAP2(神经元标志物)的组合染色。

图6.通过染色确定细胞生存力。将成纤维细胞3T3细胞在不含(上图)或含有(下图)水解明胶(“HG”，20％w/v)和0至13.3％(v/v)DMSO的冷冻培养基中冷冻保存。将细胞解冻并培养3天。然后对活细胞进行染色。

图7.通过计数确定细胞生存力。将成纤维细胞3T3细胞在不含(上图)或含有(下图)水解明胶(“HG”，20％w/v)和0至20％(v/v)DMSO的冷冻培养基中冷冻保存。将细胞解冻并培养3天。3天之后对活细胞的数目进行计数。

图8.解冻之后1小时用WST-1测定确定的3D类器官的细胞生存力(相对于对照的％)。

实施例

实施例1

方法

表1提供了实施例中使用的起始物质的概述(全部来自Rousselot B.V.,Belgium)。

表1.所用起始物质的概述。MW＝分子量；LPS＝脂多糖，EU＝内毒素单位；IEP＝等电点。

实验中使用3T3细胞系(成纤维细胞培养物)。通过使用-1℃/分钟的冷却速率缓慢冷冻将细胞冷冻在冷冻瓶中。然后将细胞在-80℃下储存至少18小时过夜。通过用DMSO(在0至13％v/v之间变化)和/或胶原蛋白水解物(在0至40％w/v之间变化)补充DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)培养基来制备冷冻溶液。

对于解冻，将冷冻瓶中的细胞在37℃下在水浴中解冻，直到仅留下一小片冰，并且之后将冷冻瓶保持在冰上。将细胞悬液转移至管中并小心地添加过量的培养基(达到室温)并混合悬液。将细胞以300×g离心3分钟，之后弃去上清液，并将细胞以期望的浓度重悬于温热(约37℃)细胞培养基中。

通过计数活细胞并将其与冷冻细胞的数目进行比较来确定解冻之后细胞死亡的％。

结果

表2.示出了用基于0至40％(w/v)胶原蛋白水解物(“P5000”)和6.7％(v/v)DMSO的冷冻保存制剂冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。发现相对高浓度的胶原蛋白水解物(例如30％或40％w/v)与6.7％(v/v)DMSO的组合将细胞死亡降低至低于10％。这低于用20％(w/v)胶原蛋白水解物和6.7％(v/v)DMSO所实现的细胞死亡。

表2.用基于不同浓度胶原蛋白水解物(CH，“P5000”)和6.7％(v/v)DMSO的冷冻保存制剂冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。

CH浓度(w/v)	DMSO浓度(v/v)	细胞死亡
			0％	6.7％	>20％
20％	6.7％	2.3％
			30％	6.7％	2.9％
40％	6.7％	6％
			20％	10％	56％

表3示出了用不同浓度的DMSO(0％、0.8％、1.7％、3.3％、6.7％v/v)、单独或与20％(w/v)胶原蛋白水解物(“P5000”)组合冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡(％)。发现20％胶原蛋白水解物在用作独立的冷冻保存剂时可降低细胞死亡。此外，发现对于胶原蛋白水解物和DMSO的组合，即使DMSO浓度低至0.8％，细胞死亡也降低至低于20％。与10％ DMSO(通常认为是“金标准”)相比，添加胶原蛋白水解物允许所需的DMSO浓度的量降低>90％。还发现，当胶原蛋白水解物与0.8％至6.7％ DMSO组合使用时，细胞死亡可降低至2％至5％。当单独使用DMSO时，不能实现这样低的毒性。

表3.在不同浓度DMSO(0％、0.8％、1.7％、3.3％、6.7％v/v)单独或与20％(w/v)胶原蛋白水解物(CH，“P5000”)组合中冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡(％)。

DMSO浓度	仅DMSO中的细胞死亡	DMSO+20％CH中的细胞死亡
			0％	75.8％	48％
0.8％	65.2％	18.8％
			1.7％	48.2％	4.1％
3.3％	23.1％	3.3％
			6.7％	>20％	2.3％
10％	20％	无数据

表4示出了用基于分子量为约2000Da(“P2000”)或约5000Da(“P5000”)的胶原蛋白水解物与6.7％ DMSO组合的冷冻保存制剂冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。发现分子量为2000Da或5000Da的胶原蛋白水解物二者在20％、30％或40％(均为w/v)胶原蛋白水解物存在下均导致低细胞死亡。

表4.用基于分子量为约2000Da(“P2000”或约5000Da(“P5000”)的胶原蛋白水解物(CH)与6.7％ DMSO组合的冷冻保存制剂冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。

CH浓度(w/v)	CH约2000Da	CH约5000Da
			0％	15.5％	15.5％
20％	8.2％	2.3％
			30％	2.3％	2.9％
40％	6.0％	6.0％

为了研究离心洗涤步骤的作用，将细胞离心(在300×g力下持续3分钟)或不离心，并在冻融之后重悬于新鲜的DMEM培养基中。然后如上所述确定细胞死亡％。

表5示出了在含有不同浓度胶原蛋白水解物(“P5000”)和DMSO的冷冻保存制剂中成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。在不存在离心洗涤步骤或存在离心洗涤步骤(在300×g力下持续3分钟)的情况下确定细胞死亡。发现在24％(w/v)胶原蛋白水解物和低于8％的DMSO存在下，细胞死亡最低。

表5.在含有不同浓度胶原蛋白水解物(CH，“P5000”)和DMSO的冷冻保存制剂中成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。在不存在离心洗涤步骤或存在离心洗涤步骤的情况下确定细胞死亡。

冷冻保存剂组合物	未离心洗涤的细胞死亡	离心洗涤的细胞死亡
			0％CH+8％DMSO	15.5％	20％
24％CH+0％DMSO	1％	19％
			24％CH+2.7％DMSO	1％	4％
24％CH+5.3％DMSO	2％	4％

总的来说，发现20％或更多的胶原蛋白水解物与无DMSO或低DMSO(例如<10％)的组合最适合于冷冻保存。平均分子量为约2000Da和约5000Da的胶原蛋白水解物表现相似。

当在不存在DMSO的情况下以0％、10％、20％、30％或40％(w/v)测试“P5000”和“H5000”时，在胶原蛋白水解物的量和细胞死亡％之间发现逆浓度依赖性关系。使用30％或40％(w/v)的胶原蛋白水解物时，细胞死亡％最低。在不存在DMSO的情况下，细胞还显示出更有益的基因型和表型(通过DNA测序、甲基化、细胞表面标志物表达、细胞分化测定或其他功能测试)。

发现DMSO量的降低导致细胞基因型和表型的变化较小，因此认为胶原蛋白水解物可降低DMSO的负面作用(et al.Scientific Reports第8卷，文章号：14828,2018)。

总的来说，当胶原蛋白水解物的量超过20％时，特别是当其为30％或40％时，获得最佳结果。

实施例2

方法

在“P5000”(1250EU/g LPS)和“P2000”(13350EU/g LPS)水解明胶之间进行了比较，它们的LPS含量不同。根据实施例1中的方法冷冻和解冻细胞，并确定细胞死亡％。

为了进一步研究LPS在洗涤离心期间的作用，比较了掺有或不掺有20000EU/mlLPS的冷冻溶液。冷冻溶液基于根据实施例1的DMEM，并且含有24％(w/v)水解明胶(“P5000”)和8％(v/v)DMSO。根据实施例1进行冷冻和解冻。

在冷冻和解冻之后，将细胞离心或不离心并重悬于新鲜的DMEM培养基中。然后如上所述确定细胞死亡％。

用Endozyme重组因子-C方法确定LPS水平。(参考：供应商Hygloss；FDA批准的方法)。

结果

图1.用基于25％(w/v)胶原蛋白水解物(含有1250EU/g LPS(“低LPS”，P5000)或13350EU/g LPS(“高LPS”，P2000))与6.7％(v/v)DMSO的组合的冷冻保存制剂冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。发现与高LPS条件相比，使用低LPS含量的胶原蛋白水解物使细胞死亡降低了75％。

图2示出了在含有8％(v/v)DMSO，以及掺有或不掺有20000EU/ml LPS(“LPS”组)的冷冻保存制剂中的成纤维细胞3T3细胞中的细胞死亡。在不存在离心洗涤步骤或存在离心洗涤步骤(“旋转”组)的情况下确定细胞死亡。发现在存在8％ DMSO的情况下，离心洗涤不提高细胞死亡。然而，在存在20000EU/ml的情况下，离心洗涤提高了细胞死亡。

类似地，发现对于包含24％(w/v)胶原蛋白水解物(“P5000”)、掺有或不掺有20000EU/ml LPS的冷冻保存制剂，离心洗涤步骤导致更高的细胞死亡，特别是存在LPS的情况下。对于包含24％(w/v)胶原蛋白水解物(“P5000”)以及含有或不含8％(v/v)DMSO二者的冷冻保存制剂，观察到离心和LPS对提高细胞死亡的影响。

此外，发现在冷冻保存期间LPS的存在可诱导不期望的毒性和/或促炎症应答。

总的来说，发现当不存在LPS或存在最少量的LPS时，特别是当进行离心洗涤时，冷冻保存得到进一步改善。不含有LPS或低LPS可使离心洗涤冗余。

总的来说，当胶原蛋白水解物的量为约20％(w/v)或超过20％(w/v)时，特别是当其为30％(w/v)或40％(w/v)时，获得最佳结果。

实施例3

方法

按照如实施例1中所述的方法，用神经毡细胞群(含有神经元细胞)进行实验。使用从供应商获得的神经毡细胞。使用的神经毡细胞为约1:3星形胶质细胞:神经元。将细胞用GFAP(神经胶质细胞标志物)和MAP2(神经元标志物)染色。

结果

图3示出了在10％(v/v)DMSO(“对照”)或补充有30％(w/v)胶原蛋白水解物的6.7％(v/v)DMSO(“+CH”)中冷冻之后，神经毡细胞中的细胞死亡(％)。发现DMSO和胶原蛋白水解物的组合导致细胞死亡强烈降低，然而当仅使用10％(v/v)DMSO时未观察到。

图4示出了在多种冷冻保存制剂中冷冻保存之后神经毡细胞中的细胞死亡。与单独的DMSO相比，30％(w/v)胶原蛋白水解物(“P5000”)和DMSO的组合降低了细胞死亡。值得注意的是，在神经毡细胞中，在6.7％(v/v)DMSO中细胞死亡几乎为70％，这表明通过添加胶原蛋白水解物实现的大的改善。

图5示出了新鲜的神经毡细胞(即未冷冻保存的，左图)以及经冷冻和解冻的神经毡细胞(中图和右图)中神经胶质标志物和神经元标志物的染色。

如图所示，左图和右图示出了具有预期密度的树突的神经元和星形胶质细胞的混合物。在中间图中，该密度较低，并因此预期没有活性。当分析细胞时，研究了树突的密度和形成(突起/向外生长)。发现与在10％(v/v)DMSO制剂中冷冻的细胞相比，在包含6.7％(v/v)DMSO与30％(w/v)胶原蛋白水解物(“P5000”)的组合的制剂中冷冻的神经毡细胞表现出改善的表型。

还发现20％至40％(w/v)胶原蛋白水解物是最佳浓度范围(有或没有另外的DMSO)。

总的来说，发现对于在10％(v/v)DMSO中显示出高细胞死亡和/或低活力的细胞(并因此认为是“难冷冻的”或“不可冷冻的”细胞)，例如神经元细胞，基于超过20％(w/v)胶原蛋白水解物的冷冻培养基比仅基于(10％v/v)DMSO的冷冻培养基更有效。如果超过20重量％的胶原蛋白水解物与5％(v/v)或其他低量的DMSO组合，则观察到最低的细胞死亡和最高的活力。

对于未分化的细胞，例如ESC，获得了与神经元细胞相似的结果。仅用10％(v/v)DMSO，ESC显示出不期望的高细胞死亡，然而，与30％(w/v)胶原蛋白水解物组合时细胞死亡改善至低于5％。

还在3T3成纤维细胞、HEK293细胞、CaLu-3细胞、间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ESC)和神经元细胞之间进行了比较。发现10％(v/v)或更多的DMSO不导致ESC和神经元细胞中令人满意的细胞回收和活力。然而，使用超过20％(w/v)的胶原蛋白水解物可实现至少80％的细胞回收或对于特定细胞更好，特别是使用低浓度的DMSO(例如5％或其他低浓度)的情况下。

测试的其他细胞包括人原代心肌细胞、胰岛、人原代肝细胞和人原代单核细胞。对于这些细胞类型，在10％(v/v)DMSO中冷冻的细胞回收低于20％或甚至低于10％。与超过20重量％(特别是30或40重量％)的胶原蛋白水解物以及与1％至5％(v/v)DMSO组合时，细胞回收和活力得到改善。

总的来说，当胶原蛋白水解物的量超过20％(v/v)时，特别是当其为30％(v/v)或40％(v/v)时，与低浓度(例如1％至5％v/v)的DMSO组合获得最佳结果。

实施例4

方法

根据实施例1冷冻保存成纤维细胞。在解冻之后，在组织培养板中培养细胞。3天之后，通过对活细胞进行染色并随后对其进行计数来确定细胞生存力。

结果

图6和7示出了在不同冷冻培养基组合物中冷冻保存并培养三天的成纤维细胞3T3细胞的活力。然后对活细胞进行染色。

随着时间的推移，与在单独DMSO中冷冻保存的细胞相比，对于已经在与DMSO组合的水解明胶中冷冻保存的细胞观察到相对更高的细胞扩增。这表明胶原蛋白水解物不仅降低了细胞死亡，而且增强了回收的细胞的细胞生存力。此外，发现当DMSO浓度低于10％(v/v)时，细胞生存力最高，并且对于3.3％和6.7％(v/v)的DMSO组，细胞生存力特别高。还在一天或两天之后确定了活力，并且当DMSO浓度低于10％(v/v)时也显示出最高的细胞生存力。

实施例5

方法

根据实施例1，将3T3细胞系(成纤维细胞培养物)在包含2.5％或10％(v/v)DMSO、含有或不含30重量％的水解明胶的冷冻培养基中冷冻保存。

对于细胞代谢活性，在96小时时进行比色MTT测定。MTT测定基于MTT(3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物，一种具有黄色的物质)通过线粒体脱氢酶代谢还原为蓝色的甲产物。只有活细胞能够催化该反应。

结果

表6示出了在不同冷冻介质中冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞的代谢活性。当细胞在水解明胶和与相对低浓度DMSO的组合中冷冻保存时，观察到最高的代谢活性。

表6.在具有不同浓度DMSO以及含有或不含30重量％的水解明胶(胶原蛋白水解物，CH)的冷冻保存制剂中冷冻保存之后成纤维细胞3T3细胞中的代谢活性。

冷冻保存剂组合物	代谢活性
		10％DMSO	平均
2.5％DMSO	低
		10％DMSO+30％CH	高
2.5％DMSO+30％CH	非常高

总的来说，发现使用相对较低量的DMSO是有益的。对于其他浓度的胶原蛋白水解物，观察到DMSO浓度的类似作用。

实施例6

方法

将小鼠原代皮层细胞(E18)根据实施例1中所述的冷冻方法进行冷冻保存，但冷冻周期提高至4周。如在表7中所述比较不同的冷冻培养基(每组n＝2)。

1.对于细胞代谢活性，进行比色MTT测定。MTT测定基于MTT(3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物，一种黄色的物质)通过线粒体脱氢酶代谢还原为蓝色的甲产物。只有活细胞能够催化该反应。

2.使用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)测定在原代皮层神经元的上清液中评估细胞毒性。LDH是稳定的胞质酶，存在于所有细胞中，并且当质膜受损时迅速释放到细胞培养上清液中。通过偶联的酶促反应确定细胞培养上清液中的LDH活性，在反应中四唑盐INT被还原成甲。

3.为了评估神经元活性，在DIV2用Neuroburst^TM慢病毒转导原代皮层神经元，并使用IncuCyteTM装置上的活细胞成像来监测神经元活性的评估，持续72小时(例如DIV10至12)，每次读取120秒的RFP振荡。使用该装置自动评价活跃细胞的数目、平均爆发速率和平均相关性。

表7.测试了基于DMSO和/或水解明胶(胶原蛋白水解物，CH)的不同冷冻保存制剂对冷冻保存之后小鼠原代皮层细胞的活力和代谢活性的作用。

结果

发现单独的10％(v/v)DMSO导致较差的活力和代谢活性。当DMSO与胶原蛋白水解物组合时，观察到总体上高的活力和代谢活性，并且DMSO的浓度优选低于10％(v/v)。

对皮层大鼠细胞(神经毡)进行了类似的实验，其中也如在实施例3中所述进行了GFAP/MAP2染色。

实施例7

实施例7示出了与基于FCS和10％ DMSO的冷冻培养基相比，在水解明胶X-PureHGP LS(Rousselot B.V.,Belgium)或Peptan P5000 LD(Rousselot B.V.,Belgium)中冷冻的肠类器官的活力。

图8示出了解冻之后1小时用WST-1测定确定的3D肠类器官的细胞生存力(相对于对照的％)。

发现与基于FCS+10％ DMSO的冷冻培养基相比，在X-Pure HGP LS和PeptanP5000LD中冷冻的类器官的活力在解冻后的1小时之后更高。

Claims (22)

1.冷冻保存制剂，其包含胶原蛋白水解物和二甲基亚砜，

其中胶原蛋白水解物的量为基于所述冷冻保存制剂的重量计算的10至70重量％，

其中二甲基亚砜的量为基于所述冷冻保存制剂的体积计算的小于10％(v/v)。

2.根据权利要求1所述的冷冻保存制剂，其包含不超过8.5％，优选不超过7％(v/v)的二甲基亚砜。

3.根据权利要求1或2所述的冷冻保存制剂，其包含至少1％(v/v)，优选至少2％(v/v)的二甲基亚砜。

4.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存制剂，其包含20至50重量％的胶原蛋白水解物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存制剂，其包含大于20重量％并且小于45重量％的胶原蛋白水解物。

6.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存制剂，其中所述胶原蛋白水解物为水解明胶。

7.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存制剂，其中所述胶原蛋白水解物的平均分子量为500至10000Da。

8.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存制剂，其中所述胶原蛋白水解物的内毒素水平为基于所述胶原蛋白水解物的重量计算的小于10000EU/g，优选小于1000EU/g，更优选小于100EU/g。

9.根据权利要求8所述的冷冻保存制剂，其中所述胶原蛋白水解物是无内毒素的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的冷冻保存制剂，其中所述冷冻保存制剂的内毒素水平为基于所述冷冻保存制剂的体积计算的小于2500EU/ml，优选小于250EU/ml，更优选小于25EU/ml。

11.根据权利要求10所述的冷冻保存制剂，其中所述冷冻保存制剂是无内毒素的。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的冷冻保存制剂，其中所述冷冻保存制剂不含以下中的一种或更多种：另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的冷冻保存制剂，其包含以下中的一种或更多种：另外的冷冻保护剂、血清和血清蛋白。

14.根据权利要求12或13所述的冷冻保存制剂，其中所述另外的冷冻保护剂是渗透性和/或非渗透性冷冻保护剂。

15.根据权利要求14所述的冷冻保存制剂，其中所述渗透性冷冻保护剂是渗透性二醇，优选乙二醇、丙二醇、或其组合。

16.根据权利要求14所述的冷冻保存制剂，其中所述非渗透性冷冻保护剂是选自以下中的一种或更多种：聚乙二醇、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、糖、或其组合。

17.用于冷冻保存生物物质的方法，所述方法包括以下步骤：在根据权利要求1至16中任一项所限定的冷冻保存制剂中提供所述生物物质，并将冷冻保存制剂的温度降低至低于所述冷冻保存制剂的凝固点。

18.用于冷冻保存生物物质的方法，所述方法包括以下步骤：在包含胶原蛋白水解物的冷冻保存制剂中提供所述生物物质，并将冷冻保存制剂的温度降低至低于所述冷冻保存制剂的凝固点，

其中胶原蛋白水解物的量为基于所述冷冻保存制剂的重量计算的10至70重量％，

其中二甲基亚砜的量为基于所述冷冻保存制剂的体积计算的小于10％(v/v)。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述生物物质选自真核细胞、原核细胞、细胞器、胞外囊泡、类器官、组织和器官。

20.胶原蛋白水解物在生物物质的冷冻保存中的用途，其中所述胶原蛋白水解物在根据权利要求1至16中任一项所限定的冷冻保存制剂中提供。

21.胶原蛋白水解物在生物物质的冷冻保存中的用途，

其中所述胶原蛋白水解物在冷冻保存制剂中提供，

其中胶原蛋白水解物的量为基于所述冷冻保存制剂的重量计算的10至70重量％，

其中二甲基亚砜的量为基于所述冷冻保存制剂的体积计算的小于10％(v/v)。

22.根据权利要求20或21所述的用途，其中所述生物物质选自真核细胞、原核细胞、细胞器、胞外囊泡、类器官、组织和器官。