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CN120059234A - 测试颗粒、试剂、试剂盒、检测方法和颗粒的生产方法 - Google Patents

测试颗粒、试剂、试剂盒、检测方法和颗粒的生产方法 Download PDF

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CN120059234A
CN120059234A CN202411721223.7A CN202411721223A CN120059234A CN 120059234 A CN120059234 A CN 120059234A CN 202411721223 A CN202411721223 A CN 202411721223A CN 120059234 A CN120059234 A CN 120059234A
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名取良
川边雄大
加藤佑希
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Abstract

本发明涉及测试颗粒、试剂、试剂盒、检测方法和颗粒的生产方法。提供一种可用作测试颗粒的胶乳凝集法用颗粒，其具有用于与配体化学结合的反应性官能团，具有小的非特异性吸附，静置贮存后的分散稳定性优异，即静态贮存稳定性优异。所述测试颗粒具有配体和与配体化学结合的颗粒，其中颗粒具有包含由式(1)表示的结构单元A和由式(2)表示的结构单元B的聚合物(参照说明书)，比重在1.00以上且1.10以下的范围内，并且具有通过XPS测量定量的元素C与元素O的组成比在2.1以上且3.3以下的范围内。

Description

测试颗粒、试剂、试剂盒、检测方法和颗粒的生产方法
技术领域
本发明涉及测试颗粒、试剂、试剂盒、检测方法以及颗粒的生产方法。
背景技术
简单和快速的免疫学测试方法的实例包括胶乳凝集法。在该方法中，将包括结合至与目标物质具有亲和性的配体的胶乳颗粒的测试颗粒的分散液与可能包含目标物质的试样混合。此时，在试样中包含目标物质的情况下，测试颗粒引起凝集反应，其光学地检测为散射光强度、透射光强度、吸光度等的变化，从而能够实现疾病诊断。
临床测试中的许多免疫学测试项目在目标物质以低浓度存在的区域具有重要的诊断点。因此，要求即使在低浓度下也能够判定目标物质的有无。作为改善测试灵敏度的已知手段，使用大粒径的胶乳颗粒。由此，被检测的吸光度等的变化变大，从而能够改善低浓度区域的测量灵敏度。
用于胶乳凝集法中的颗粒和在颗粒表面具有目标物质的配体的测试颗粒要求对目标物质以外的物质具有弱的微弱吸附，即具有小的非特异性吸附。作为具有微弱非特异性吸附的颗粒，已知表面配置有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的颗粒。由于一部分缩水甘油基开环形成二醇，因此推测配置在颗粒表面的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯具有微弱的非特异性吸附。在日本专利申请特开No.2000-351814中公开的情况中，苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的共聚颗粒(其设置有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的表面通过聚乙二醇链化学结合至配体)被应用于生物分离。
甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油酯基团也可以用作反应性官能团以将配体化学结合至颗粒表面。使用化学键以将配体固定至颗粒表面，使得担心在试剂长期贮存的情况下如配体从颗粒表面脱附等问题。日本专利申请特开No.2006-71297公开了其中缩水甘油基被羧基化，使得赋予与配体化学结合的颗粒表面羧基的情况。
发明内容
本发明人在研究改善低浓度区域的检测灵敏度之后发现，如日本专利申请特开No.2000-351814所述，随着由共聚的苯乙烯和(甲基)丙烯酸缩水甘油酯制成的测试颗粒的粒径的进一步增大，在静态贮存期间，颗粒沉降速率加速。推测该加速主要是由于比重大于1的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的配合量和粒径的组合引起。
由于测试颗粒的分散液可以根据测试机构而静置贮存数周，因此保持测试颗粒在分散液中的分散的计划在技术上是重要的。贮存期间颗粒沉降的发生导致测试期间的分配精度下降，从而导致精确测量困难。
颗粒的比重对于维持测试颗粒的分散是重要的。通常，用于体外诊断的试剂的分散介质是水。因此，水的比重、即1.0和颗粒比重之间的差异对沉降水平有很大影响。在比重为1.1的颗粒和比重为1.2的颗粒之间的比较中，沉降速率的差异是两倍。为了在减少沉降的情况下维持分散稳定性，也可以添加提高分散介质的比重或粘度的组分。然而，在某些情况下，添加可能会影响检测灵敏度，因此需要技术来保持性质的平衡。
虽然使用(甲基)丙烯酸缩水甘油酯作为颗粒组分以减少非特异性吸附并且形成配体与颗粒表面的化学键是优选的，但认为需要降低(甲基)丙烯酸缩水甘油酯在颗粒中的共混比以保持在减少沉降情况下的分散稳定性。然而，共混比的简单变化也导致共聚颗粒表面上的量比的变化，这可能导致由于可结合配体的量的减少而引起的检测灵敏度的限制，或者由于表面上羟基的减少而引起的非特异性吸附性的显著恶化。
本发明是根据这些背景技术和问题做出的。本发明的目的是提供一种胶乳凝集法用测试颗粒，其具有与配体化学结合的反应性官能团，非特异性吸附小，静置贮存后的分散稳定性优异，即静态贮存稳定性优异。本发明的另一个目的是提供一种生产该颗粒的方法。本发明的另一个目的是提供试剂、试剂盒和检测方法。
为了解决上述问题，本发明提供一种测试颗粒，其具有：
配体，和
与配体化学结合的颗粒，
其中颗粒具有包含由下式(1)表示的结构单元A和由下式(2)表示的结构单元B的聚合物，
颗粒的比重在1.00以上且1.10以下的范围内，并且
颗粒的通过XPS测量定量的元素C与元素O的组成比在2.1以上且3.3以下的范围内：
其中，在式(1)中，R1表示甲基或氢原子，L1表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，和R2为包含硫醚基(sulfide group)或仲胺和羟基的基团；并且其中，在式(2)中，R3表示甲基或氢原子，L4表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，并且R4为包含硫醚基或仲胺和羧基的基团。
本发明还提供一种颗粒的生产方法，其包括以下步骤：
步骤1：将由下式(7)表示的化合物、由下式(8)表示的化合物、水和自由基聚合引发剂混合以引发聚合；
步骤2：在步骤1之后，向反应体系中进一步添加由式(7)表示的化合物；
其中相对于在步骤1中混合的由式(7)表示的化合物的质量和由式(8)表示的化合物的质量之和，在步骤2中添加的由式(7)表示的化合物的质量的比率为0.16以上且0.30以下：
其中，在式(7)中，R9表示甲基或氢原子，L6表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基；和其中，在式(8)中，R10表示甲基或氢原子，和R11表示碳原子数为1以上且9以下的直链或支链烷基或氢原子。
本发明还提供一种包括与配体化学结合的上述颗粒的测试颗粒。
本发明还提供一种用于通过体外诊断检测试样中的目标物质并且包含上述测试颗粒的试剂。
本发明还提供一种用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒，其至少包含上述试剂。
本发明还提供一种通过凝集反应检测试样中的目标物质的方法，其包括将上述测试颗粒与可能包含目标物质的试样混合。
参照附图，从下面对示例性实施方案的描述中，本发明的其它特征将变得显而易见。
附图说明
图1示出了在本发明的颗粒的差示扫描量热法(DSC)中第二次升温的DSC曲线。
具体实施方式
现在将根据附图详细描述本发明的优选实施方案。
如下更详细地描述本发明的实施方案，尽管本发明的技术范围不限于这些实施方案。
[第一实施方案]
第一实施方案涉及一种测试颗粒。
本发明的测试颗粒具有
配体，和
与配体化学结合的颗粒，
其中颗粒具有包含由下式(1)表示的结构单元A和由下式(2)表示的结构单元B的聚合物，并且比重在1.00以上且1.10以下的范围内，并且通过XPS测量定量的元素C与元素O的组成比在2.1以上且3.3以下的范围内：
其中，在式(1)中，R1表示甲基或氢原子，L1表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，和R2表示包含硫醚基或仲胺和羟基的基团；并且其中，在式(2)中，R3表示甲基或氢原子，L4表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，并且R4为包含硫醚基或仲胺和羧基的基团。
式(1)中的L1和式(2)中的L4优选为如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、和亚异丁基等直链或支链的亚烷基，并且从亲水性与疏水性之间的平衡的观点出发，更优选为亚甲基。因此，更优选使用(甲基)丙烯酸缩水甘油酯作为用于在生产本发明的颗粒的预备阶段形成母颗粒的含环氧基单体。
在如(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等含缩水甘油基单体用于形成母颗粒的情况下，使特定化合物与母颗粒表层中存在的缩水甘油基反应。由此，能够将式(1)中的R2和式(2)中的R4作为侧链添加到颗粒表层，从而能够得到具有包含结构单元A和B的聚合物的颗粒。
特别是，由于结构单元A的侧链具有包括末端羟基的总共3个以上的羟基和包含在R2中的2个以上的羟基，因此提高了减少颗粒的非特异性吸附的效果。
在本发明的测试颗粒中，优选的是，结构单元A包含由下式(5)表示的结构：
其中，R1表示甲基或氢原子，L1表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，L2和L3各自独立地表示单键和碳原子数为1以上且3以下的亚烷基中的任一种，和X表示S或NH。
式(5)中的L1优选为如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、和亚异丁基等直链或支链的亚烷基。式(5)中的L2和L3优选为单键或如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、和亚异丙基等直链或支链的亚烷基。式(5)中的L1、L2和L3更优选分别为亚甲基。在各自为亚甲基的情况下，亲水性和疏水性之间的平衡良好，并且进一步结构单元A的侧链不长于结构单元B的侧链，因此阻碍结构单元B的羧基的反应性的可能性可以进一步得到降低。
式(5)中的X可以为硫原子或氮原子。从改善灵敏度的观点出发，更优选硫原子，从抑制非特异性吸附的观点出发，更优选氮原子。由于硫醚键(sulfide bond)具有表现出弱的疏水性倾向的结构，因此可以预期，高亲水性侧链的水结合力适度地减弱，以抑制通过在高浓度下与试样混合可能引起的渗透絮凝，从而硫醚键可有助于提高灵敏度。另一方面，氨基具有表现出亲水性倾向的结构，并且可以有助于非特异性吸附的减少。
在源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与3-巯基-1,2-丙二醇反应的情况下，在式(5)中，形成其中L1、L2和L3各自表示亚甲基并且X表示硫原子的结构单元A，从改善如上所述的灵敏度的观点出发，这是进一步更优选的。
另外，在源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与3-氨基-1,2-丙二醇反应的情况下，在式(5)中，形成其中L1、L2和L3各自表示亚甲基并且X表示硫原子的结构单元A，从减少如上所述的非特异性吸附的观点出发，这是进一步更优选的。
结构单元B的侧链具有用于与配体化学结合的羧基。特别是，在具有两个以上的羧基的情况下，与配体的反应效率得到改善。
在本发明的测试颗粒中，优选的是，结构单元B包含由下式(6)表示的结构：
其中，R3表示甲基或氢原子，L4表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，L5表示单键和碳原子数为1以上且3以下的亚烷基中的任一种，和X表示S或NH。
在羧基如式(6)那样彼此非常接近地存在的情况下，它们之间的相互作用抑制彼此的解离，使得颗粒的分散性适度地不稳定。因此，在免疫胶乳凝集测量方法中使用该颗粒有利于以高灵敏度检测目标物质。
式(6)中的L4优选为如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、和亚异丁基等直链或支链的亚烷基。式(6)中的L5优选为单键或如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、和亚异丙基等直链或支链的亚烷基。式(6)中的L4和L5更优选为亚甲基。对于具有太多碳原子的基团，这具有由于疏水性增加而促进对颗粒的非特异性吸附的风险。
式(6)中的X可以是硫原子或氮原子中的任一种，更优选为硫原子。由于硫醚键具有表现出弱的疏水性倾向的结构，因此期望侧链的水结合力适度减弱，从而抑制通过在高浓度下与试样混合可能引起的渗透絮凝。
在源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与巯基琥珀酸反应的情况下，形成其中式(6)中的L4和L5各自为亚甲基并且X为硫原子的结构单元B，如上所述这是更优选的。
优选的是，[结构单元A]/[结构单元B]为0.2以上且20以下(摩尔分数)。在摩尔分数小于0.2的情况下，结构单元B中包含的羧基的比例过多，这可能损害颗粒的分散稳定性，并且在与配体化学结合的情况下，未反应的羧基可能与配体相互作用以使配体变性。或者，在摩尔分数大于20的情况下，由于羧基的比例小，与配体化学结合的反应效率可能降低，或者有时有助于颗粒的分散稳定性的静电斥力可能降低。
从颗粒的机械强度的观点出发，优选的是，本发明的颗粒具有由下式(3)或下式(4)表示的结构单元C，并且在结构单元A、结构单元B和结构单元C的总量中，结构单元A和结构单元B的总量优选为43mol％以下，且更优选为5mol％以上且43mol％以下：
其中，在式(3)中，R5表示甲基或氢原子，R6表示碳原子数为1以上且9以下的直链或支链的烷基或氢原子，和n表示1以上且5以下的整数；并且其中，在式(4)中，R7表示甲基或氢原子，和R8表示碳原子数为1以上且12以下的直链或支链的烷基。
由于包含结构单元C，本发明的颗粒物理强化，从而即使当颗粒的精制过程中反复进行如离心分离等操作时，也能够抑制如裂纹、碎屑等对颗粒的损伤。另外，从颗粒的比重降低的观点出发，优选包含结构单元C。
由式(3)表示的组分所源于的化合物的实例包括苯乙烯类，如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、对正丁基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯、对正己基苯乙烯、对正辛基苯乙烯、和对正壬基苯乙烯。
由式(4)表示的组分所源于的化合物的实例包括(甲基)丙烯酸酯类，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸正辛酯、和甲基丙烯酸正壬酯。
在任何情况下，只要能够实现本发明的目的，化合物就不限于此。或者，可以组合使用两种以上的组分。
结构单元C所源于的化合物，优选为由式(3)表示的苯乙烯类，更优选为苯乙烯。另外，本发明的颗粒的结构单元C优选为选自由苯乙烯类组成的组中的至少一种，更优选为苯乙烯。苯乙烯类的单体具有小的比重和优异的折射率，从降低颗粒的比重的观点和从改善颗粒的折射率以改善灵敏度的观点来看是优选的。
在本发明的颗粒中，在结构单元A、结构单元B和结构单元C的总量中，结构单元C的量优选为57mol％以上且95mol％以下，进一步优选为68mol％以上且93mol％以下。(换言之，如上所述，在结构单元A、结构单元B和结构单元C的总量中，结构单元A和结构单元B的总量优选为5mol％以上且43mol％以下。)
＜本发明的颗粒的比重＞
本发明的颗粒的比重在1.00以上且1.10以下的范围内。在比重为1.10以下的情况下，即使在作为测试试剂的测试颗粒的分散液静置贮存的情况下，也能够维持优异的分散稳定性。由于减少了颗粒的沉降，因此可以延长测试试剂的使用期。具体而言，即使在贮存特定时间后也能够维持分配精度，由此能够防止检测灵敏度的降低。
确定颗粒比重的主要因素包括颗粒的构成组分。此外，在具有交联性质的颗粒的情况下，高于一定水平的交联度也影响比重。
本发明的颗粒的构成组分主要是源自用于形成上述母颗粒的反应性单体的组分。具体而言，由于主要组分为结构单元A、B所源于的含缩水甘油基的单体(在本发明中，更优选为(甲基)丙烯酸缩水甘油酯)和结构单元C所源于的单体(在本发明中，更优选为苯乙烯)，因此，本发明的颗粒的比重大致由用于形成母颗粒的这些单体的含量比而确定。
换句话说，在形成母颗粒后添加到表面的侧链组分和配体仅存在于颗粒表面附近，其中在颗粒的构成组分中以非常小的比例存在，使得对本发明的颗粒的比重的贡献非常小。
颗粒的比重与用于形成母颗粒的单体中比重大于1的含缩水甘油基的单体(本发明中，更优选(甲基)丙烯酸缩水甘油酯)的含量成比例地增加。因此，为了在沉降减少的情况下维持分散稳定性，优选的是，在母颗粒的形成中减少含环氧基单体的含量。具体而言，在结构单元A、结构单元B和结构单元C的总量中，结构单元A和结构单元B的总量优选为43mol％以下，进一步优选为32mol％以下。
另一方面，结构单元A和B的结构对于优异的非特异性吸附和配体与颗粒表面的化学结合是必要的，并且在量太少的情况下，则可能导致恶化的非特异性吸附性和与不足量的配体结合。因此，在结构单元A、结构单元B和结构单元C的总量中，结构单元A和结构单元B的总量优选为20mol％以上。
＜通过本发明的颗粒的XPS测量定量的组成比＞
如上所述，虽然优选使用(甲基)丙烯酸缩水甘油酯作为颗粒的组分以减少非特异性吸附和使配体化学结合至颗粒表面，但推测在颗粒形成中需要减少(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的含量以维持在沉降减少的情况下的分散稳定性。然而，简单地减少共混量不仅减少了颗粒的整个区域上的量，而且减少了颗粒的“表层”中的量。在这种情况下，由于在后处理中赋予的羧基和羟基的量减少，可结合配体的量可能减少，或者非特异性吸附性可能显著恶化。
优选的是，本发明的颗粒为即使改变颗粒的整个区域中组分的量比、即配制比，在颗粒的“表层”中的量比也被适当控制的颗粒。(如下描述具有适当控制的颗粒的生产方法。)
本发明的颗粒是将通过XPS测量定量的元素C与元素O的组成比控制在2.1以上且3.3以下的范围内的颗粒。在XPS测量中，检测在从最外表面至约10nm的区域中产生的光电子，从而可以分析颗粒的“表层”中的组分。在组成比小于2.1的情况下，颗粒的“表层”中的元素O过量，因此添加足量的羟基和羧基。另一方面，由于非常高的亲水性，难以发生颗粒的凝集，因此基于胶乳凝集法的原理的检测灵敏度可能降低。相反，在组成比大于3.3的情况下，颗粒的“表层”中的元素O太少，因此亲水性不足，不仅导致在长期贮存期间颗粒的分散稳定性差，而且导致恶化的非特异性吸附性。如上所述，通过优化颗粒“表层”中组分的量，可以提供检测灵敏度和非特异性吸附性都优异的颗粒。
＜本发明的颗粒的DSC曲线＞
在本发明的颗粒的差示扫描量热法(DSC)测量中第二次升温时获得的DSC曲线上，绘制经过DSC曲线上温度为80℃的点和DSC曲线上温度为100℃的点的直线。将在105℃以上且140℃以下的温度区域中该直线与DSC曲线之间的交点定义为交点A。优选的是，DSC曲线在交点A的温度At和100℃之间的温度区域中具有吸热峰。
吸热峰源自苯乙烯类(本发明的结构单元C)的性质。如此观察到的吸热峰表示聚苯乙烯在颗粒中以高浓度聚集，并且结构单元A和B与聚苯乙烯(结构单元C)在颗粒中组成性分离。在本发明的颗粒中，由于结构单元A和结构单元B主要配置于表层以控制“表层”，因此另一方面推测聚苯乙烯(结构单元C)被限制在颗粒内部。由于作为疏水材料的聚苯乙烯在颗粒的表层中的存在可以是使非特异性吸附性恶化的主要因素，因此通过将聚苯乙烯牢固地限制在颗粒内部，可以提供非特异性吸附性优异的颗粒。
在本发明的结构单元C包含由式(4)表示的聚(甲基)丙烯酸甲酯系结构的情况下，在DSC测量中第二次升温时得到的DSC曲线上，画出经过温度为80℃的点和温度为100℃的点的直线。优选的是，该直线和DSC曲线在95℃以上且140℃以下的区域中具有交点A，其中在交点A的温度At与90℃之间的温度区域中具有吸热峰。
＜本发明的颗粒的ζ电位(Zeta potential)＞
优选的是，本发明的颗粒的ζ电位为-50mV以上且-10mV以下。小于-50mV的ζ电位表明颗粒的表层具有许多羧基。在颗粒与配体结合而制成测试颗粒的情况下，配体的反应性可能因配体与颗粒表面之间的静电相互作用而降低，或因配体与颗粒表面之间的ζ电位差而引起的测试颗粒表面的电荷偏移可能导致异种凝集。为了降低可能性，ζ电位优选为-50mV以上。ζ电位大于-10mV表明颗粒的表层具有少量羧基。为了使足够量的配体与颗粒结合以实现优异的检测灵敏度，ζ电位优选为-10mV以下。
＜本发明的颗粒的粒径＞
本发明的颗粒在水分散液中的体积平均粒径优选为50nm以上且500nm以下，更优选为280nm以上且400nm以下，进一步更优选为280nm以上且350nm以下。
在粒径为280nm以上的情况下，通过胶乳凝集法检测的吸光度等的变化增大，使得特别是在目标物质以低浓度存在的情况下，检测灵敏度得到改善。通常，在使用尺寸为280nm以上且包含源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的组分的颗粒作为测试试剂的情况下，由于由颗粒的尺寸和(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的比重导致的颗粒沉降，在测试试剂的长期贮存中容易出现实际使用中的问题。即使在颗粒尺寸为280nm以上的情况下，使用控制了比重的本发明的颗粒，也能够改善测试试剂的分散稳定性和长期贮存时的颗粒沉降。从同样的观点出发，粒径更优选为400nm以下，进一步更优选为350nm以下。
[第二实施方案]
第二实施方案涉及一种颗粒的生产方法。
如上所述，虽然使用(甲基)丙烯酸缩水甘油酯作为颗粒的组分是优选的，但推测在颗粒形成时需要降低(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的含量。然而，简单地减少共混量不仅导致颗粒的整个区域中的量减少，而且导致颗粒的“表层”中的量减少。
优选的是，本发明的颗粒为即使当改变颗粒的整个区域中组分的量比、即配制比时，“表层”中的量比也适当控制的颗粒。为了实现上述要求，本发明的颗粒的生产方法包括以下步骤。
步骤1：将由下式(7)表示的化合物、由下式(8)表示的化合物、水和自由基聚合引发剂混合以引发聚合；
步骤2：在步骤1之后，向反应体系中进一步添加由式(7)表示的化合物；
其中相对于在步骤1中混合的由式(7)表示的化合物的质量和由式(8)表示的化合物的质量之和，在步骤2中添加的由式(7)表示的化合物的质量的比率为0.16以上且0.30以下：
其中，在式(7)中，R9表示甲基或氢原子，和L6表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基；并且其中，在式(8)中，R10表示甲基或氢原子，和R11表示碳原子数为1以上且9以下的直链或支链的烷基或氢原子。
式(7)中的L6优选为如亚甲基、亚乙基、亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、和亚异丁基等直链或支链的亚烷基。式(8)中的R11优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、和正壬基。
在步骤2中添加的由式(7)表示的化合物，即含缩水甘油基的单体，在添加到用于聚合反应的反应体系的水中后立即溶解并附着至颗粒的表层。
在将步骤2中添加的由式(7)表示的化合物、即含缩水甘油基单体的量控制为16质量％以上的情况下，即使在用于形成母颗粒的含缩水甘油基单体的总量减少的情况下，也能够在母颗粒的“表层”中存在足够量的缩水甘油基。因此，可以在后处理中将足量的羟基和羧基添加至颗粒的表层。元素C与元素O的组成比变为3.3以下，使得能够提供亲水性高并且非特异性吸附性优异的颗粒。此外，在将步骤2中添加的含缩水甘油基单体的量控制为30质量％以下，母颗粒的表层中的缩水甘油基不过多地增加，从而可以防止过量的羟基和羧基添加至颗粒的表层。通过颗粒的XPS测量定量的元素C与元素O的组成比变为2.1以上，以提供适当的疏水性，从而能够确保胶乳凝集法所需的凝集性，并且能够提供检测灵敏度优异的颗粒。
在本发明的颗粒的生产方法中，优选的是，在步骤2中分几批进行由式(7)表示的化合物、即含缩水甘油基的单体的添加。为了更精确地控制母颗粒的表层中缩水甘油基的量，需要考虑在步骤2中的添加中残留在反应体系中的单体的量。在步骤2中分几批进行单体的添加的情况下，能够使残留在反应体系中的单体(特别是，在水中溶解度小的苯乙烯类)高效地溶解于水中，从而在第一次添加时促进聚合反应。因此，在步骤2中的添加中，可以减少残留在反应体系中的单体的量，从而减少在最后添加时残留单体的溶解。因此，可以有效地增加最终存在于颗粒的“表层”中的缩水甘油基的比率。“分几批进行单体的添加”是指第一次添加和最后一次添加间隔1分钟以上的时间。作为具体方法，可以间隔地多次批量添加，或者可以没有间隔地进行连续滴加。
本发明的颗粒的生产方法优选在步骤2之后包括下述步骤3。
步骤3：将得到的粒状共聚物的水分散液、3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸混合以制备混合液，由此使源自由式(7)表示的化合物的环氧基与源自3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸的硫醇基(thiol group)反应。
通过所得粒状共聚物(母颗粒)的环氧基与3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸的反应，可以赋予颗粒的表层由式(5)表示的结构单元A和由式(6)表示的结构单元B表示的侧链。更优选3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸的理由如上所述。
在本发明的颗粒的生产方法中，其它典型的生产方法如下所述。然而，本发明的颗粒的生产方法在能够实现本发明的目的的范围内不限于此。
步骤1中的自由基聚合引发剂优选为水溶性聚合引发剂。
尽管水溶性聚合引发剂没有特别限定，但是优选使用水溶性偶氮化合物和水溶性过氧化物。
水溶性偶氮化合物优选为4,4′-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]、2,2′-偶氮双[N-(2-羧乙基)-2-甲基丙脒]四水合物、2,2′-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]和2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物中的任一种。
水溶性过氧化物优选为过硫酸钾、过硫酸铵、过硫酸钠、叔丁基氢过氧化物、枯基氢过氧化物、对孟烷氢过氧化物和二异丙基苯氢过氧化物中的任一种。
在步骤1中，也可以进一步使用具有交联性的自由基聚合性单体。具有交联性的自由基聚合性单体的实例包括，二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、四乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、2,2′-双(4-(丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基聚乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙烯基萘、和二乙烯基醚，尽管在能够实现本发明的目的的范围内不限于此。另外，也可以组合使用两种以上的具有交联性的自由基聚合性单体。
具有交联性的自由基聚合性单体的量优选为聚合中使用的单体总量的0.1质量％～5质量％。在大于5质量％的量的情况下，颗粒密度增加，使得颗粒的比重可能增加。
在通过自由基聚合形成粒状共聚物(母颗粒)的情况下，优选使用乳化聚合、无皂乳化聚合、和悬浮聚合，更优选使用乳化聚合或无皂乳化聚合。还更优选地，使用无皂乳化聚合。通常，通过乳化聚合或无皂乳化聚合获得的粒状聚合物与通过悬浮聚合获得的粒状聚合物相比具有更窄的粒度分布。在使用与配体结合的颗粒作为测试颗粒的情况下，担心的是作为残留物存在的乳化聚合中通常使用的阴离子性表面活性剂或阳离子性表面活性剂可能使配体变性。因此，在通过乳化聚合形成粒状聚合物(母颗粒)的情况下，优选使用非离子性表面活性剂。
步骤3包括用不含伯胺的有机碱将pH调节至碱性区域。在步骤3中，使用3-巯基-1,2-丙二醇和源自巯基琥珀酸的硫醇基，从粒状共聚物(母颗粒)的表面在深度方向上引起粒状共聚物(母颗粒)具有的环氧基的反应。
为了在深度方向上引起充分的反应，优选的是，选择对粒状共聚物(母颗粒)具有渗透性的三乙胺作为有机碱。
优选的是，本发明的颗粒的生产方法在步骤2之后包括下述步骤3′。
步骤3′：将所得粒状共聚物的水分散液、3-氨基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸混合以制备混合液，从而使源自由式(7)表示的化合物的环氧基与源自3-氨基-1,2-丙二醇的氨基和源自巯基琥珀酸的硫醇基反应。
[应用例]
本发明的应用例的实例包括，测试颗粒、试剂、试剂盒、和检测方法。每个项目描述如下。
＜测试颗粒＞
本发明的测试颗粒优选包括与配体化学结合的上述颗粒，更优选包括结合至与目标物质具有亲和性的配体的上述颗粒。优选的是，本发明的测试颗粒用于通过凝集法检测试样中的目标物质。
配体是指与特定目标物质的受体特异性结合的化合物。配体与目标物质结合的区域是特异性的，并且具有选择性或特异性的高亲和性。配体的实例包括抗原和抗体、酶蛋白及其底物、以激素和神经递质及其受体为代表的信号物质、核酸、抗生物素蛋白和生物素等，尽管在可以实现本发明目的的范围内不限于此。配体的具体实例包括抗原、抗体、与抗原结合的片段(例如Fab、F(ab′)2、F(ab′)、Fv和scFv等)、天然来源的核酸、人工核酸、适体、肽适体、寡肽、酶和辅酶等。本发明的测试颗粒的配体优选为抗体或抗原。
在本发明中，作为使源自结构单元B的羧基或羧酸盐与配体结合的化学反应方法，在能够实现本发明的目的的范围内，可以应用常规已知的方法。化学反应的优选实例包括例如碳二亚胺介导的反应和NHS酯活化反应。或者，与抗生物素蛋白结合的羧基可以与用生物素修饰的配体结合。然而，用于使源自结构单元B的羧基或羧酸与配体结合的化学反应方法在能够实现本发明的目的的范围内不限于此。
如上所述，关于本发明的颗粒，可以确定在与配体结合之前的颗粒和具有化学结合的配体的测试颗粒之间的保持比重相同。这是因为配体相对于颗粒的比例足够小。
<试剂>
优选的是，本发明的试剂为用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂，其包含上述测试颗粒和分散介质。
在本发明中，使用抗体(抗原)作为配体并使用抗原(抗体)作为目标物质的情况作为体外诊断中检测试样中的目标物质的方法，可以极其优选地应用于如临床测试和生化研究等领域中广泛使用的免疫学测试中的胶乳凝集法。在使用通常使用的颗粒作为胶乳凝集法的颗粒的情况下，担心作为目标物质的抗原(抗体)和血清或血浆中的异物非特异性地吸附至颗粒表面，从而引起颗粒之间的无意凝集，这损害了免疫学测试的精度。
优选的是，本发明的试剂用于通过凝集法检测试样中的目标物质，并且包含用于胶乳凝集法的颗粒。本发明的试剂中包含的胶乳凝集法用颗粒的量优选在0.001质量％～20质量％的范围内，更优选在0.01质量％～10质量％的范围内。本发明的试剂在能够实现本发明的目的的范围内，可以包含除胶乳凝集法用颗粒以外的第三物质，如溶剂和封闭剂。本发明中使用的溶剂的实例包括各种水系缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、古德氏缓冲溶液、Tris缓冲溶液、HEPES缓冲溶液、MES缓冲溶液和氨缓冲溶液，尽管本发明的试剂中包含的溶剂不限于此。
<试剂盒>
本发明的试剂盒是用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒，优选至少包含上述试剂。本发明的试剂盒除了本发明的试剂(以下称为试剂1)以外，优选还包括包含白蛋白的反应缓冲溶液(以下称为试剂2)。白蛋白的实例包括血清白蛋白等，并且可以包括用蛋白酶处理的白蛋白。试剂2中包含的白蛋白的估计量在0.001质量％至5质量％的范围内，尽管本发明的试剂盒不限于此。用于胶乳凝集测量的敏化剂可以包含在试剂1和试剂2两者中，或者其任何一者中。用于胶乳凝集测量的敏化剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇和海藻酸，尽管本发明的试剂盒不限于此。另外，本发明的试剂盒除了试剂1和试剂2以外，还可以包含阳性对照、阴性对照、血清稀释剂等。用于阳性对照或阴性对照的培养基除了不含可测量的目标物质的血清和生理盐水之外，还可以包括溶剂。本发明的试剂盒可以以与通过通常的体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒同样的方式，用于本发明的目标物质的检测方法中。此外，该试剂盒还可以用于通过常规已知的方法测量目标物质的浓度，特别适合通过胶乳凝集法检测试样中的目标物质。
<检测方法>
通过体外诊断检测试样中的目标物质的方法优选包括，将上述的测试颗粒与可能包含目标物质的试样混合，更优选为通过凝集反应检测试样中的目标物质的方法。另外，优选的是，本发明的测试颗粒与试样的混合在pH3.0～pH 11.0的范围内进行。混合温度在20℃～50℃的范围内，并且混合时间在1分钟～20分钟的范围内。在本检测方法中，优选的是，使用溶剂。在本发明的检测方法中，本发明的测试颗粒的浓度在反应体系中优选为0.001质量％～5质量％，优选为0.01质量％～1质量％。本发明的检测方法的特征在于，通过光学地检测由本发明的测试颗粒与试样混合而产生的颗粒之间的凝集。通过光学检测颗粒之间的凝集，检测试样中的目标物质，此外，还可以测量目标物质的浓度。为了光学地检测凝集反应，可以用能够检测它们的光学设备来测量散射光强度、透射光强度、吸光度等的变化。
[颗粒的比重的测量方法]
对本发明的颗粒的比重的测量方法进行说明。将颗粒以0.5质量％分散于离子交换水中，在规定的离心力下测量颗粒的沉降速率。根据测量的沉降值、分散介质的比重和粘度以及颗粒的体积平均粒径计算颗粒的比重。使用的离子交换水的电导率为10μS/cm以下。具体而言，使用LUMISizer(由MS Scientific Co.,Ltd.制造)来测量向颗粒的分散液施加4000rpm的离心力时由透射光的变化所测定的沉降速率。使用作为分散介质的离子交换水的比重和粘度，以及通过如下所述的方法测量的颗粒的体积平均粒径，从如下所示的斯托克斯公式计算颗粒的比重。进行测量三次，将三次测量值的平均值作为比重。
(斯托克斯公式)
沉降速率Vs＝Dρ 2(ρp-ρf)g/18η
其中Vs表示沉降速率(m/s)，Dρ表示粒度(m)，ρp表示颗粒的比重(kg/m3)，ρf表示分散介质的比重(kg/m3)，g表示重力加速度(m/s2)，并且η表示分散介质的粘度(Pa·s)。
[颗粒的C/O比的测量方法]
描述通过本发明的颗粒的XPS测量的组成比的定量方法。在本发明的颗粒的组成比的XPS测量中，将冷冻干燥状态的颗粒固定于铟箔。测量设备和测量条件如下。
·测量设备：X射线光电子能谱Quantum 2000(商品名，由ULVAC-PHI Inc.制造)
·X射线源：单色AlKα
·X射线设置：100μmφ(25W(15KV))
·光电子射出角：45度
·中和条件：中和枪与离子枪组合使用
·分析区域：300μm×200μm
·通能：58.70eV
·步长：0.125eV
·分析软件：MultiPak(PHI，Inc.)
在测量中，累积数C1s和O1s为15，和N1s为30。从得到的元素的定量值(相对于三种元素的总量，元素C的组成比(原子％)和元素O的组成比(原子％))，求出元素C相对于元素O的组成比。
[颗粒的DSC曲线的获取方法]
描述本发明的颗粒的DSC曲线的获取方法。使用差示扫描量热仪(DSC)(商品名“Discovery DSC2500”，优TAinstruments制造)进行冷冻干燥颗粒的样品的测量。使用如下所述的温度程序测量密封在铝盘中的样品。根据温度程序，最初，在以10℃/分钟的加热速率从20℃到180℃的第一次升温之后，将温度在180℃保持10分钟，然后以10℃/分钟的冷却速率冷却到10℃，然后在10℃保持10分钟，并且随后以10℃/分钟的加热速率再次执行第二次升温至180℃。获得第二次升温期间的DSC曲线。
[颗粒的ζ电位的测量方法]
描述本发明中颗粒的ζ电位的测量方法。在本发明中，在将颗粒以0.001质量％分散于pH 7.8的0.01N钾水溶液中的状态下测量ζ电位。使用的pH为7.8的0.01N钾水溶液通过将使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水制备的0.01N氯化钾水溶液、0.01N氢氧化钾水溶液和0.01N盐酸水溶液适当混合而得到。使用的测量设备是Zetasizer(Nano-ZS，优Spectris制造)，在25℃下进行测量。分析参数的选择包括胶乳作为颗粒的折射率，纯化水作为分散介质。进行测量10次，将10次测量的平均值作为ζ电位。
[水分散液中的颗粒的体积平均粒径的测量方法]
描述本发明的水分散液中颗粒的体积平均粒径的测量方法。在本发明中，水分散液中颗粒的体积平均粒径在将颗粒以0.001质量％分散在电导率为10μS/cm以下的离子交换水中的条件下测量。对于水中粒径的测量，使用动态光散射法。具体而言，使用Zetasizer(Nano-ZS，由Spectris制造)，在25℃下进行测量。分析参数的选择包括胶乳作为颗粒的折射率，纯化水作为分散介质。进行测量10次，将10次测量的平均值作为水中的粒径。
[测试颗粒的抗体致敏率的测量方法]
描述由本发明的颗粒制备的测试颗粒的抗体致敏率的测量方法。通过蛋白质定量来测定测试颗粒的抗体致敏率(％)。抗体致敏率(％)是指与颗粒结合的抗体的量相对于用于反应的抗体的量(抗体的制备量)的比例。
首先，将蛋白质测定BCA试剂盒(由Wako Pure Chemical制造)的A液7mL和B液140μL混合，以制备AB液。接着，向25μL(颗粒量：25μg)测试颗粒的分散液(0.1％溶液)中添加200μL AB液，并在60℃下温育混合物30分钟。将溶液在4℃和15000rpm(20400g)下进行离心5分钟，用移液管将200μL上清液放入96孔微孔中。用酶标仪进行试样和标准样品(在10mMHEPES中0至200μg/mL范围内的抗体的几个样品)在562nm处的吸光度测量，从而从标准曲线计算抗体的量。抗体对颗粒的致敏量(每质量颗粒结合的抗体量(μg/mg))通过将计算出的抗体量除以颗粒质量(在这种情况下为0.025mg)来求得。最后，计算致敏率。在抗体的制备量为25μg/1mg颗粒、抗体的致敏量为12.5μg/mg的情况下，致敏率为50％。
[实施例]
下面参照实施例更详细地描述本发明，尽管本发明不限于这些实施例。
[实施例1-1]
(粒状共聚物(母颗粒)1的合成)
向2L四颈可分离烧瓶中，称出27.8g苯乙烯(St，由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)、17.3g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)、0.70g二乙烯基苯(DVB，由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)、和1305.5g离子交换水，以制成混合液。在70℃下以200rpm搅拌混合液的同时，氮气以200ml/分钟的流速流动以吹扫四颈可分离烧瓶中的氧气。接着，向混合液中添加包含溶解于18g离子交换水中的0.68g V-50(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)的单独制备的溶液，从而引发无皂乳化聚合。
在引发聚合2小时后，作为追加GMA的步骤，将5.2g GMA添加到四颈可分离烧瓶中，并且在30分钟后，进一步添加5.2g GMA(追加5.2g GMA，两次)。在以200rpm搅拌22小时的同时，将温度保持在70℃，从而获得包含粒状共聚物1的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以利用质子NMR和气相色谱法评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，粒状共聚物1中相对于St和GMA的总量，GMA的摩尔比为42.2mol％。另外，相对于聚合开始时的单体的量，追加的GMA的量的质量比为0.23。粒状共聚物1的体积平均粒径为240nm。在4℃的遮光条件下贮存粒状共聚物1。
[实施例1-2]
(粒状共聚物(母颗粒)2的合成)
除了将实施例1-1中的St的量从27.8g改变为35.0g，将GMA的量从17.3g改变为9.7g，将追加的GMA的量从2次5.2g改变为2次6.2g以外，与实施例1-1同样的方式得到粒状共聚物2的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，粒状共聚物2中相对于St和GMA的总量，GMA的摩尔比为32.7mol％。另外，相对于聚合开始时的单体的量，追加的GMA的量的质量比为0.27。粒状共聚物2的体积平均粒径为245nm。
[实施例1-3]
(粒状共聚物(母颗粒)3的合成)
除了将实施例1-1中的GMA的量从17.3g改变为19.3g，将追加的GMA的量从2次5.2g改变为2次4.1g以外，以与实施例1-1同样的方式得到粒状共聚物3的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。
换言之，粒状共聚物3中相对于St和GMA的总量，GMA的摩尔比为41.9mol％。另外，相对于聚合开始时的单体的量，追加的GMA的量的质量比为0.17。粒状共聚物3的体积平均粒径为234nm。
[实施例1-4]
(粒状共聚物(母颗粒)4的合成)
除了将实施例1-1中的离子交换水的量从1305.5g改变为1958.3g，将V-50的量从0.68g改变为1.02g以外，以与实施例1-1同样的方式得到粒状共聚物4的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。
换言之，与实施例1-1同样，粒状共聚物4中相对于St和GMA的总量GMA的摩尔比、和相对于聚合开始时的单体量追加的GMA的量的质量比分别为42.2mol％和0.23。粒状共聚物4的体积平均粒径为212nm。
[实施例1-5]
(粒状共聚物(母颗粒)5的合成)
除了将实施例1-1中的St改变为甲基丙烯酸甲酯(MMA，由Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.制造)以外，以与实施例1-1同样的方式得到粒状共聚物5的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，在粒状共聚物5中，相对于甲基丙烯酸甲酯和GMA的总量，GMA的摩尔比为41.2mol％。相对于聚合开始时的单体的量，追加的GMA的质量比为0.23。粒状共聚物5的体积平均粒径为262nm。
[实施例1-6]
(粒状共聚物(母颗粒)6的合成)
除了将实施例1-1中的GMA的量改变为6.0g，将追加的GMA的量从2次5.2g改变为2次4.2g，并且从聚合开始6小时后添加追加的GMA以外，以与实施例1-1同样的方式得到粒状共聚物6的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，在粒状共聚物6中，相对于St和GMA的总量，GMA的摩尔比为27.5mol％。相对于聚合开始时的单体的量，追加的GMA的质量比为0.27。粒状共聚物2的体积平均粒径为232nm。
[实施例2-1]
(颗粒1的合成)
在100mL圆底烧瓶中，称出粒状共聚物1为24g的2.5wt％水分散液、3.3g离子交换水、80mg(0.53mmol)巯基琥珀酸(MSA，由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)、以及230mg(2.12mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(MPD，由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)，并且向其中添加三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)，将pH调节至11.3。在以200rpm搅拌圆底烧瓶中的混合物的同时，将温度升高至70℃，然后保持该状态18小时。由此，获得颗粒1的分散液。用离心机从分散液中分离颗粒1。进一步，将颗粒1再分散于离子交换水中的操作重复8次，从而纯化颗粒1。最后，制备包含1.0wt％颗粒1的水分散液并贮存。
在4℃下在遮光条件下进行贮存。在表1-1中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-2]
(颗粒2的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为粒状共聚物2以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒2的水分散液。在表1-1中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-3]
(颗粒3的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为粒状共聚物3以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒3的水分散液。在表1-1中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-4]
(颗粒4的合成)
除了将实施例2-1中的pH＝11.3改变为10.0以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒4的水分散液。在表1-1中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-5]
(颗粒5的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为粒状共聚物4以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒5的水分散液。在表1-1中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-6]
(颗粒6的合成)
除了将实施例2-1中的80mg(0.53mmol)巯基琥珀酸改变为78mg 2-氨基戊二酸(APA：L-谷氨酸，由FUJIFILM Wako Pure Chemical制造)以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒6的水分散液。在表1-2中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-7]
(颗粒7的合成)
除了将实施例2-1中的230mg(2.12mmol)3-巯基-1,2-丙二醇改变为193mg(2.12mmol)2-氨基-1,3-丙二醇(2APD，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒7的水分散液。在表1-2中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-8]
(颗粒8的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为粒状共聚物5以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒8的水分散液。在表1-2中，示出了该颗粒的物理性质。
[实施例2-9]
(颗粒9的合成)
除了将实施例2-1中的80mg(0.53mmol)巯基琥珀酸改变为20mg(0.13mmol)，并且将230mg(2.12mmol)3-巯基-1,2-丙二醇改变为273mg(2.52mmol)以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒9的水分散液。在表1-2中，示出了物理性质。
[实施例2-10]
(颗粒10的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为粒状共聚物6，将80mg(0.53mmol)巯基琥珀酸改变为480mg(3.18mmol)，并且将230mg(2.12mmol)3-巯基-1,2-丙二醇改变为345mg(3.18mmol)3-氨基-1,2-丙二醇(3APD，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)以外，以与实施例2-1同样的方式得到颗粒10的水分散液。在表1-2中，示出了物理性质。
[比较例1-1]
(比较粒状共聚物(母颗粒)1的合成)
除了将实施例1-1中的St的量从27.8g改变为22.0g，将GMA的量从17.3g改变为28.0g，并且将追加的GMA的量改变为5.8g且仅在聚合开始2小时后追加一次以外，以与实施例1-1同样的方式得到比较粒状共聚物1的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，相对于比较粒状共聚物1中的St和GMA的总量，GMA的摩尔比为53.0mol％。另外，相对于聚合开始时的单体的量，追加的GMA的量的质量比为0.11。比较粒状共聚物1的体积平均粒径为238nm。
[比较例1-2]
(比较粒状共聚物(母颗粒)2的合成)
除了将实施例1-1中的GMA的量从17.3g改变为21.8g，并且将追加的GMA的量改变为5.8g，且追加时机改变为仅在聚合开始2小时后追加一次以外，以与实施例1-1同样的方式得到比较粒状共聚物2的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，尽管比较粒状共聚物2中相对于St和GMA的总量，GMA的摩尔比如实施例1-1那样为42.2mol％，但相对于聚合开始时的单体量，追加的GMA的量的质量比为0.12。比较粒状共聚物2的体积平均粒径为239nm。
[比较例1-3]
(比较粒状共聚物(母颗粒)3的合成)
除了将实施例1-1中的GMA的量从17.3g改变为13.4g，将追加的GMA的量改变为每一次4.8g，并且将追加时机改变为三次，即，聚合开始2小时后、第1次追加后30分钟、和第2次追加后30分钟以外，以与实施例1-1同样的方式得到比较粒状共聚物3的水分散液。将分散液缓慢冷却至室温后，收集一部分分散液，以与实施例1-1同样的方式评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率为大致100％。换言之，尽管比较粒状共聚物3中相对于St和GMA的总量，GMA的摩尔比如实施例1-1那样为42.2mol％，但相对于聚合开始时的单体量，追加的GMA的量的质量比为0.34。比较粒状共聚物3的体积平均粒径为243nm。
[比较例2-1]
(比较颗粒1的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为比较粒状共聚物1以外，以与实施例2-1同样的方式得到比较颗粒1的水分散液。该颗粒的物理性质示于表2中。
[比较例2-2]
(比较颗粒2的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为比较粒状共聚物2以外，以与实施例2-1同样的方式得到比较颗粒2的水分散液。该颗粒的物理性质示于表2中。
[比较例2-3]
(比较颗粒3的合成)
除了将比较例2-2中的80mg(0.53mmol)巯基琥珀酸改变为20mg(0.13mmol)，并且将230mg(2.12mmol)3-巯基-1,2-丙二醇改变为273mg(2.52mmol)以外，与比较例2-2同样的方式得到比较颗粒3的水分散液。该颗粒的物理性质示于表2中。
[比较例2-4]
(比较颗粒4的合成)
除了将实施例2-1中的粒状共聚物1改变为比较粒状共聚物3以外，以与实施例2-1同样的方式得到比较颗粒4的水分散液。该颗粒的物理性质示于表2中。
[评价1]对颗粒的非特异性吸附性的评价
在磷酸盐缓冲溶液(包含0.01％的Tween20)中，将颗粒1～10和比较颗粒1～4各自分散至0.1wt％的含量，从而制备分散液(液体P)。接着，向各自50μL的分散液中添加55μL包含正常人类试样(血清试样，5μL)和磷酸盐缓冲液(50μL)的试样稀释液(液体Q)并搅拌，以制备混合液，立即进行572nm波长处的吸光度测量。在吸光度的测量中，使用由EppendorfSE制造的分光光度计“Biospectrometer”。然后，将各混合液在37℃下静置5分钟，然后再次进行在572nm波长处的吸光度测量，以计算吸光度变化值ΔABS×10000。结果汇总在表1-1、表1-2和表2中。推测非特异性吸附的发生与该值成比例地增加。在试样试验中使用胶乳凝集法用颗粒的情况下，担心将正常的试样判定为假阳性。另外，考虑到通过胶乳凝集法检测低浓度的目标物质时的噪声风险，基于以下基准对得到的变化值ΔABS×10000评级。
A：小于±50
B：50以上且小于100
C：100以上且小于500
D：500以上
由表1-1和表1-2可看出，颗粒表层中的元素C与元素O的组成比为2.1以上且3.3以下的颗粒1～10，在抑制非特异性吸附的能力方面优异。
另一方面，可以看出，元素C与元素O的组成比大于3.3的比较颗粒2和3的非特异性吸附大。尽管如实施例那样，为了实现长期贮存，比较颗粒2和3在母颗粒中的GMA比率低于一定水平，但在比较颗粒2和3中使用GMA追加量的比率小于16质量％合成的母颗粒。结果，与本发明的颗粒相比，不能补偿母颗粒的表层中较少量的GMA，从而期望母颗粒的表层中的苯乙烯比率高。即使在添加羟基和羧基后的颗粒中，母颗粒的表层中的苯乙烯也不变地存在于表层中。结果，颗粒表层中的元素C与元素O的组成比高，使得预期比较颗粒2和3具有更大的非特异性吸附。
另外，根据在DSC曲线中未检测到特定的吸热峰(源自聚苯乙烯)，预期，与本发明的颗粒相比，比较颗粒2和3在颗粒中不具有聚苯乙烯的高浓度区域，并且聚苯乙烯没有牢固地封闭在颗粒中。
另一方面，比较颗粒1在DSC曲线中也没有检测到特定的吸热峰，具有良好的非特异性吸附性。推测，由于比较颗粒1具有高于本发明范围的GMA比率，在原始颗粒组成中聚苯乙烯的量较少的情况下，几乎观察不到源自聚苯乙烯的行为。
[评价2]通过对颗粒的抗体致敏来制备测试颗粒，以及抗体致敏率的评价。
(测试颗粒的制备)
对于颗粒1至10和比较颗粒1至4中的每一个，将180μL的1.7wt％的水悬浮液提供于1.5mL的微量管中，并向其中添加90μL的5.0wt％的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液和90μL的5.0wt％的N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠水溶液以制备混合液。在室温下搅拌该混合液30分钟，从而得到具有活化羧基的颗粒的分散液(活化颗粒分散液)。
离心洗涤后，添加270μL的pH为7.2的磷酸盐缓冲液-生理盐水溶液(以下，称为PBS)，并且通过超声波使羧基活化的颗粒分散。
向其中添加单克隆小鼠抗人类C反应蛋白(以下，称为CRP抗体)的克隆C5(由Funakoshi Co.,Ltd.制造)的5μL的15.0mg/mL的分散液，并在室温下搅拌3小时，从而通过对该颗粒的抗体致敏而得到测试颗粒。对各测试颗粒进行离心洗涤，然后，向其中添加1mLPBS以制成混合物，并且以分散状态贮存混合物。
作为颗粒1的测试颗粒的比重的评价结果，颗粒比重为1.079，而抗体致敏前的颗粒比重为1.082。根据以上，可以确定作为测试试剂组分的测试颗粒的实际颗粒比重与敏化前的颗粒比重相当。
(测试颗粒的抗体致敏率的评价)
接着，根据上述测试颗粒的抗体致敏率的测量方法，求出抗体致敏率(％)。
结果汇总在表1-1、表1-2和表2中。
由表1-1和表1-2可以看出，颗粒表层中的元素C与元素O的组成比为2.1以上且3.3以下的颗粒1～10中的任一种均表现出充分的抗体致敏率。推测，特别是在ζ电位低于-10mV(绝对值大)的情况下，预期颗粒表层具有许多羧基，导致特别高的抗体致敏率。
特别是，在比较颗粒当中，元素C与元素O的组成比大于3.3并且ζ电位大于-10mV(绝对值小)的比较颗粒3具有差的抗体致敏率。比较颗粒3是由如[评价1]中所述的以低于16质量％的追加GMA的量的比率合成的母颗粒制成的颗粒，并且母颗粒的表层中的GMA的量少，使得赋予足够量的羧基固有地困难。此外，比较颗粒3使用较少量的巯基琥珀酸，如从小的ζ电位的绝对值预测的那样具有较少量的羧基，从而推测没有实现与足够量的抗体的结合。
[评价3]测试颗粒的胶乳凝集灵敏度的评价和非特异性吸附性的评价
(标准血清的评价)
将CRP的标准血清用PBS稀释至0.15mg/dL的浓度以制成CRP试样溶液。将1μL量的CRP试样溶液和50μL量的缓冲液(包含0.01％Tween20的PBS)混合，以制备混合液(以下称为R1+)，在37℃保温。作为对照，将1μL量的生理盐水溶液和50μL量的缓冲液(包含0.01％Tween20的PBS)混合以制备混合液(下文中，称为R1-)，其同样在37℃保温。
接着，将使用前再次通过超声波充分分散的测试颗粒的分散液(颗粒浓度0.1wt％，记作R2)各自50μL与R1+或R1-混合。将搅拌后即刻的混合液(体积：101μL)在572nm波长处进行吸光度测量。吸光度的测量使用由Eppendorf SE制造的分光光度计“Biospectrometer”。将混合液在37℃静置5分钟，然后再次进行572nm波长处的吸光度测量，以计算吸光度的变化值ΔABS×10000。结果汇总在表1-1、表1-2和表2中。
R-(与生理盐水溶液的反应性)的值大意味着在测试颗粒中发生了由非特异性吸附或渗透絮凝引起的凝集。在这种情况下，在试样试验中使用胶乳凝集用颗粒引起正常试样因噪声而产生假阳性的担忧。然而，已经确认在本实施例中评价的所有颗粒中没有发生这种凝集。
在试样试验中使用胶乳凝集法用颗粒的测试颗粒的R+值(与0.15mg/dl人类CRP的反应性)越大，预期目标物质的检测越灵敏。
根据以下标准对所得R+值评级。
A：1500以上
B：1200以上且小于1500
C：1000以上且小于1200
D：小于1000
由表1-1和表1-2可看出，元素C与元素O的组成比为2.1以上且3.3以下的颗粒1～10的测试颗粒能够通过胶乳凝集法以高灵敏度检测低于标准值的浓度(0.15mg/dl)的人类CRP。特别是在体积平均粒径大于280nm的情况下、在具有足够抗体致敏率的ζ电位低于-10mV(大绝对值)的情况下、以及在使用苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的粒状共聚物作为母颗粒的情况下，检测灵敏度优异。
另一方面，元素C与元素O的组成比小于2.1的比较颗粒4在胶乳凝集法中具有差的灵敏度。比较颗粒4是由以大于30质量％的追加GMA的量的比例合成的母颗粒制成的颗粒。结果，母颗粒表层中的GMA的量多，使得以高的抗体致敏率获得了足够的羟基和羧基。另一方面，由于极高的亲水性，几乎不发生颗粒的凝集，导致基于胶乳凝集法原理的降低的检测灵敏度。还预期[评价2]中记载的比较颗粒3的抗体致敏量低，导致不足的检测灵敏度。
[评价4]
(测试颗粒分散液静置贮存后的胶乳凝集灵敏度的评价)
将在[评价2]中制备的测试颗粒各自以0.1wt％的颗粒浓度分散在具有pH7.9的10mM HEPES溶液中，使用0.01％Tween20。将1mL量的分散液各自分到1.5mL微管中。将分散液在4℃下静置贮存1周，然后颗粒的沉降进行目视测试。此时，从距分散液的液面3mm深度的位置小心地收集50μL分散液。使用该液体，以与[评价3]同样方式进行对人类CRP的胶乳凝集灵敏度的评价(R+的测量)。结果汇总在表1-1、表1-2和表2中。
通过从[评价4]中得到的值ΔABS×10000(Δ(2))减去[评价3]中得到的值ΔABS×10000(Δ(1))，然后除以(Δ(1))来计算R+值的变化率(％)。根据以下基准对得到的R+值的变化率评级。
A：-5％以上
B：-10％以上且小于-5％
C：-15％以上且小于-10％
D：小于-15％
如表1-1和表1-2所示，颗粒比重为1.10以下并且颗粒表面的元素C与元素O的组成比为2.1以上且3.3以下的颗粒1～10的测试颗粒，即使静置1周后，也没有发生通过目视测试确定的颗粒沉降。另外，静态贮存后从分散液的上部收集的分散液，在作为超声波分散后即刻的评价的[评价3]中，没有引起胶乳凝集灵敏度大的差异。特别地，推测体积平均粒径为350nm以下的颗粒在分散稳定性方面特别优异，因为由于粒径的原因，自然沉降速率与尺寸为350nm以上的颗粒相比较慢。
另一方面，颗粒比重大于1.10的比较颗粒1的分散液具有在液面附近识别出的透明液相，因此预期颗粒沉降的进展。此外，在静态贮存后从分散液的上部收集的分散液具有明显降低的胶乳凝集灵敏度。另外，在颗粒比重小于1.10的比较颗粒中，元素C与元素O的组成比为3.3以上的比较颗粒2和3具有少量的通过目视测试识别出的透明液相。由于颗粒表层不充分的亲水性，推测在一定程度上加速了沉降。因此，在静态贮存后收集的分散液的胶乳凝集灵敏度大大降低。
[表1-1]
[表1-2]
[表2]
根据本发明，可以提供具有与配体化学结合的反应性官能团、非特异性吸附小、静态贮存期间稳定性优异的胶乳凝集法中使用的颗粒及其生产方法。此外，可以提供包含化学结合的配体的测试颗粒、包含该颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、以及检测目标物质的方法。
虽然已经参考示例性实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于所公开的示例性实施方案。所附权利要求的范围应被赋予最宽泛的解释，以便涵盖所有此类的修改以及等同的结构和功能。

Claims (19)

1.一种测试颗粒，其包含：
配体，和
与所述配体化学结合的颗粒，其中所述颗粒具有包含由下式(1)表示的结构单元A和由下式(2)表示的结构单元B的聚合物，
所述颗粒的比重在1.00以上且1.10以下的范围内，并且
所述颗粒的通过XPS测量定量的元素C与元素O的组成比在2.1以上且3.3以下的范围内：
其中，在所述式(1)中，R1表示甲基或氢原子，L1表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，和R2为包含硫醚基或仲胺和羟基的基团；并且其中，在所述式(2)中，R3表示甲基或氢原子，L4表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，并且R4为包含硫醚基或仲胺和羧基的基团。
2.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中，所述颗粒还包含由下式(3)或下式(4)表示的结构单元C，
其中，在所述结构单元A、所述结构单元B和所述结构单元C的总量中，所述结构单元A和所述结构单元B的总量为5mol％以上且43mol％以下：
其中，在所述式(3)中，R5表示甲基或氢原子，R6表示碳原子数为1以上且9以下的直链或支链的烷基或氢原子，和n表示1以上且5以下的整数；并且其中，在所述式(4)中，R7表示甲基或氢原子，R8表示碳原子数为1以上且12以下的直链或支链的烷基。
3.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中所述颗粒的ζ电位为-50mV以上且-10mV以下。
4.根据权利要求2所述的测试颗粒，其中所述结构单元C为选自由苯乙烯类组成的组中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的测试颗粒，其中在所述结构单元A、所述结构单元B和所述结构单元C的总量中，所述结构单元C的量为57mol％以上且95mol％以下。
6.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中当在所述颗粒的差示扫描量热法DSC测量的第二次升温中得到的DSC曲线上，画出经过所述DSC曲线上温度为80℃的点和所述DSC曲线上温度为100℃的点的直线，并且将105℃以上且140℃以下的温度区域中所述直线与所述DSC曲线之间的交点定义为交点A时，所述DSC曲线在所述交点A的温度At与100℃之间的温度区域中具有吸热峰。
7.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中所述结构单元A包含由下式(5)表示的结构：
其中，R1表示甲基或氢原子，L1表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，L2和L3各自独立地表示单键和碳原子数为1～3的亚烷基中的任一种，和X表示S或NH。
8.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中所述结构单元B包含由下式(6)表示的结构：
其中，R3表示甲基或氢原子，L4表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基，L5表示单键和碳原子数为1以上且3以下的亚烷基中的任一种，和X表示S或NH。
9.根据权利要求2所述的测试颗粒，其中所述结构单元C为苯乙烯。
10.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中所述颗粒在水分散液中的体积平均粒径为280nm以上且400nm以下。
11.根据权利要求1所述的测试颗粒，其中所述配体为抗体或抗原。
12.一种试剂，其用于通过体外诊断检测试样中的目标物质，所述试剂包含根据权利要求1至11中任一项所述的测试颗粒和分散介质。
13.根据权利要求12所述的试剂，其用于通过凝集法检测试样中的目标物质。
14.一种试剂盒，其用于通过体外诊断检测试样中的目标物质，所述试剂盒至少包含根据权利要求12或13所述的试剂。
15.一种通过凝集反应检测试样中的目标物质的方法，其包括：将根据权利要求1至11中任一项所述的测试颗粒与可能包含目标物质的试样混合。
16.一种颗粒的生产方法，其包括以下步骤：
步骤1：将由下式(7)表示的化合物、由下式(8)表示的化合物、水和自由基聚合引发剂混合以引发聚合；
步骤2：在所述步骤1之后，向反应体系中进一步添加由所述式(7)表示的化合物；
其中，相对于在所述步骤1中混合的由所述式(7)表示的化合物的质量和由所述式(8)表示的化合物的质量之和，在所述步骤2中添加的由所述式(7)表示的化合物的质量的比率为0.16以上且0.30以下：
其中，在所述式(7)中，R9表示甲基或氢原子，和L6表示碳原子数为1以上且4以下的亚烷基；并且其中，在所述式(8)中，R10表示甲基或氢原子，和R11表示碳原子数为1以上且9以下的直链或支链的烷基或氢原子。
17.根据权利要求16所述的颗粒的生产方法，其在所述步骤2之后包括以下步骤3：
步骤3：将所得粒状共聚物的水分散液、3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸混合以制备混合液，从而使源自由所述式(7)表示的化合物的环氧基与源自3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸的硫醇基反应。
18.根据权利要求16所述的颗粒的生产方法，其在所述步骤2之后包括以下步骤3'：
步骤3'：将所得粒状共聚物的水分散液、3-氨基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸混合以制备混合液，从而使源自由所述式(7)表示的化合物的环氧基与源自3-氨基-1,2-丙二醇的氨基和源自巯基琥珀酸的硫醇基反应。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的颗粒的生产方法，其中，在所述步骤2中，由所述式(7)表示的化合物的添加分几批进行。
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