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CN120035611A - 双特异性多肽及其用途 - Google Patents

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CN120035611A
CN120035611A CN202380065314.7A CN202380065314A CN120035611A CN 120035611 A CN120035611 A CN 120035611A CN 202380065314 A CN202380065314 A CN 202380065314A CN 120035611 A CN120035611 A CN 120035611A
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Kerui Biological Products Private Ltd
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Abstract

本披露内容总体上涉及一种双特异性多肽，包括其部分和用途，所述双特异性多肽包含能够结合抗原呈递细胞(APC)的第一结合结构域和能够结合T细胞的第二结合结构域。在本文披露的第一方面，提供了一种双特异性多肽，其包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白，所述第一抗原结合蛋白特异性结合CD40，并且其中，所述第二抗原结合蛋白特异性结合FLAG标签。在本文披露的第二方面，提供了一种双特异性多肽，其包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白，其中，所述第一抗原结合蛋白特异性结合CD206，并且其中，所述第二抗原结合蛋白特异性结合FLAG标签。

Description

双特异性多肽及其用途
技术领域
本披露内容总体上涉及一种双特异性多肽，包括其部分和用途，该双特异性多肽包含能够结合抗原呈递细胞(APC)的第一结合结构域和能够结合T细胞的第二结合结构域。
相关申请的交叉引用
本申请要求澳大利亚临时申请AU 2022902713的优先权，其全部内容在此并入本文。
背景技术
过继性细胞转移(ACT)正显露出令人兴奋的癌症治疗潜力。在ACT中，体外生成大量自体肿瘤反应性T细胞，然后再输注给患者。肿瘤反应性T细胞可以从血液或肿瘤中分离出，并使用多肽和/或细胞因子的刺激进行体外扩增。
提高T细胞对ACT的反应性的方法包括对患者淋巴细胞进行基因修饰，以生成抗大多数恶性肿瘤(包括实体癌症和血液肿瘤)的肿瘤反应性T细胞。基因修饰的两种主要方法涉及编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因。CAR由抗体源结构域与T细胞信号传导结构域融合组成，其重定向T细胞对肿瘤细胞的效应功能。这两种方法都可以使T细胞产生肿瘤反应性，但CAR方法不受MHC的限制，可更广泛地应用于更多的患者。
CAR可以采取各种形式，但通常由胞外结构域构成，该胞外结构域由对肿瘤相关抗原(TAA)特异的抗体的单链可变片段(scFv)组成。该scFv经由铰链和跨膜结构域连接到由一个或多个信号转导部分构成的胞内区。已开发出对一系列TAA(包括间皮素、Her2、CEA、FBP、CD19和BCMA)具有特异性的CAR。最先进的临床研究已经利用对CD19特异的CAR来治疗B细胞白血病和淋巴瘤。自2017年以来，食品和药物管理局(FDA)已批准了6种CAR T细胞疗法。所有这些疗法都被批准用于治疗血液癌症，包括淋巴瘤、某些形式的白血病以及最近的多发性骨髓瘤。
优化这种疗法的尝试已经让CAR T细胞与旨在克服肿瘤诱导的免疫抑制的其他治疗方法相结合，包括利用α-PD-1单克隆抗体进行的联合治疗、对信号传导通路和细胞因子通路的基因修饰、以及激动性α-4-1BB单克隆抗体(mAB)和双特异性T细胞衔接器(BiTE)等佐剂的使用。虽然这些方法中的一些已被证明成功地使T细胞与癌症细胞之间实现了直接相互作用，这可能使得造血系统癌症细胞中的T细胞扩增，但在实体癌症环境中却很少观察到显著扩增。
由于淋巴细胞计数低并且来自重度治疗患者的细胞状况不佳，体外扩增和制造CART细胞时所面临的困难往往会使得对用于递送CAR T细胞的治疗方法进行优化的问题加剧。此外，即使有足够的供体细胞可用，也需要制造大量的细胞，以便为患者提供有效剂量的此类治疗，虽然有人建议用健康供体的同种异体细胞来解决这个问题，但仍存在一些问题，比如供体与受体之间的人类白细胞抗原(HLA)不匹配，这可能会导致移植物抗宿主病(GvHD)。因此，仍然迫切需要开发新的试剂来提高ACT、特别是CAR T疗法的疗效。
本说明书中对任何现有技术的引用并不是承认或暗示该现有技术在任何司法管辖区内构成公知常识的一部分，或者该现有技术可以被合理地预期为本领域技术人员所理解、视为相关和/或与其他现有技术组合。
发明内容
在本文披露的第一方面，提供了一种双特异性多肽，其包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白，其中，该第一抗原结合蛋白特异性结合CD40，并且其中，该第二抗原结合蛋白特异性结合FLAG标签。
在第一方面的实施方案中，第一抗原结合蛋白结合CD40近膜结构域(D1a)的外部模体A，可选地，其中，所述结合不会阻止、减少或抑制CD40-CD40L的结合。
在第一方面的实施方案中，第一抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4，以及
FR1a–CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各自为骨架区；
CDR1、CDR2和CDR3各自为互补决定区；
FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自为骨架区；
CDR1a、CDR2a和CDR3a各自为互补决定区；
其中，骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如下表1中关于CD40结合蛋白所述。
在第一方面的任何实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3是指来自抗体可变重链(VH)的互补决定区，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自抗体可变轻链(VL)的互补决定区，或者在CDR1、CDR2和CDR3是来自VL的互补决定区的情况下，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VH的互补决定区。在这种示例中，CDR可以根据情况而指CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本文中提及的“结合(binds to)”CD40的蛋白质或抗体为“特异性结合(bindsspecifically to或specifically binds to)”CD40的蛋白质或抗体提供了文字支持。
在第一方面的任何实施方案中，本发明提供了一种用于结合CD40的第一抗原结合蛋白，其中，该第一抗原结合蛋白竞争性抑制抗体或其抗原结合片段与CD40结合，该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1所示序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示序列的VL。
在第一方面的任何实施方案中，本发明提供了一种第一抗原结合蛋白，该第一抗原结合蛋白具有抗原结合结构域的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3，所述抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:1所定义的可变重链结构域。
在第一方面的任何实施方案中，本发明提供了一种第一抗原结合蛋白，该第一抗原结合蛋白具有抗原结合结构域的CDRL1、CDRL2和/或CDRL3，抗原结合结构域具有如SEQID NO:2所定义的可变轻链。
在第一方面的任何实施方案中，本发明提供了一种第一抗原结合蛋白，该第一抗原结合蛋白具有抗原结合结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3，所述抗原结合结构域具有如SEQID NO:1所定义的可变重链和如SEQ ID NO:2所定义的可变轻链。
在第一方面的任何实施方案中，本文所描述的第一抗原结合蛋白包含：
FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4–接头–FR1a–CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中，骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如下表1中所述。
如本文所定义的，接头可以是化学物质、一个或多个氨基酸、或者形成于两个半胱氨酸残基之间的二硫键。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含：
(i)和(ii)：
(i)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:6所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，以及
(ii)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(iii)和(iv)：
(iii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:3所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:10所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(iv)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:12所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:14所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(v)和(vi)：
(v)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:5所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:11所示的序列或由其组成，以及
(vi)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:13所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:15所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(vii)和(viii)：
(vii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:5所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:9所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:11所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列，以及
(viii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:15所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(ix)和(x)：
(ix)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，以及
(x)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(xi)和(xii)：
(xi)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:4所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:7所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:10所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(xii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:12所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:14所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(xiii)和(xiv)：
(xiii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:8所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:10所示的序列或由其组成，以及
(xiv)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(xv)和(xvi)：
(xv)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:4所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:8所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:10所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(xvi)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:12所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:14所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。可选地，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，该第一抗原结合蛋白的重链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合CD40的能力。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。可选地，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，该第一抗原结合蛋白的轻链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合CD40的能力。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。可选地，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，该第一抗原结合蛋白的重链可变结构域和/或轻链可变结构域分别包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合CD40的能力。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的氨基酸序列(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)、基本上由其组成或由其组成。
在第一方面的任何实施方案中，本文所描述的第一抗原结合蛋白可以从N末端到C末端具有VH然后VL，或VL然后VH，或本文定义为VH的任何CDR1、CDR2和CDR3然后本文定义为VL的任何CDR1、CDR2和CDR3，或本文定义为VL的任何CDR1、CDR2和CDR3然后本文定义为VH的任何CDR1、CDR2和CDR3。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以是以下形式：
(i)单结构域抗体(sdAb)；
(ii)单链Fv片段(scFv)；
(iii)二聚体scFv(di-scFv)；或者
(iv)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(ii)或(iii)之一。
进一步地，如本文所描述的，在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以是以下形式：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；
(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体；
(viii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vii)之一。
在第一方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以是免疫球蛋白G(IgG)分子的形式。可选地，根据本发明第一方面的任何实施方案，第一抗原结合蛋白可以是IgG或异质二聚体Fab-Fc的形式，并且第二抗原结合蛋白可以是IgG的抗原结合片段(比如，scFv)的形式。
在本文披露的第二方面，提供了一种双特异性多肽，其包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白，其中，该第一抗原结合蛋白特异性结合CD206，并且其中，该第二抗原结合蛋白特异性结合FLAG标签。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白结合表达于免疫细胞表面的CD206，该免疫细胞优选为抗原呈递细胞、更优选为专职抗原呈递细胞。优选地，该第一抗原结合蛋白结合表达于专职抗原呈递细胞表面的CD206，该专职抗原呈递细胞选自树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、上皮细胞，最优选地选自树突状细胞，甚至更优选地，其中，该专职抗原呈递细胞不是肿瘤细胞。
在第一方面的实施方案中，第一抗原结合蛋白结合人巨噬细胞B11抗原，可选地，其中，B11抗原包含SEQ ID NO:186所示的氨基酸序列。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4，以及
FR1a-CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各自为骨架区；
CDR1、CDR2和CDR3各自为互补决定区；
FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自为骨架区；
CDR1a、CDR2a和CDR3a各自为互补决定区；
其中，骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如下表1中关于CD206结合蛋白所述。
在第二方面的该实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3是指来自抗体可变重链(VH)的互补决定区，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自抗体可变轻链(VL)的互补决定区，或者在CDR1、CDR2和CDR3是来自VL的互补决定区的情况下，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VH的互补决定区。在这种示例中，CDR可以根据情况而指CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本文中提及的“结合(binds to)”CD206的蛋白质或抗体为“特异性结合(bindsspecifically to或specifically binds to)”CD206的蛋白质或抗体提供了文字支持。
在第二方面的任何实施方案中，本发明提供了一种用于结合CD206的第一抗原结合蛋白，其中，该第一抗原结合蛋白竞争性抑制抗体与CD206结合，该抗体包含含有SEQ IDNO:33所示序列的VH和含有SEQ ID NO:34所示序列的VL。
在第二方面的任何实施方案中，本发明提供了一种第一抗原结合蛋白，该第一抗原结合蛋白具有抗原结合结构域的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3，所述抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:33所定义的可变重链结构域。
在第二方面的任何实施方案中，本发明提供了一种第一抗原结合蛋白，该第一抗原结合白蛋具有抗原结合结构域的CDRL1、CDRL2和/或CDRL3，所述抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:34所定义的可变轻链。
在第二方面的任何实施方案中，本发明提供了一种第一抗原结合蛋白，该第一抗原结合蛋白具有抗原结合结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3，所述抗原结合结构域具有如SEQID NO:33所定义的可变重链和如SEQ ID NO:34所定义的可变轻链。
在第二方面的任何实施方案中，本文所描述的第一抗原结合蛋白包含：
FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4–接头-FR1a-CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中，骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如下表1中所述。
如本文所定义的，接头可以是化学物质、一个或多个氨基酸、或者形成于两个半胱氨酸残基之间的二硫键。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(i)和(ii)：
(i)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:35所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(ii)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(iii)和(iv)：
(iii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:35所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:38所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(iv)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(v)和(vi)：
(v)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:41所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:43所示的序列或由其组成，以及
(vi)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:45所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:47所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(vii)和(viii)：
(vii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:37所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:41所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:43所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(viii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:45所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:47所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(ix)和(x)：
(ix)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:39所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(x)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(xi)和(xii)：
(xi)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:36所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:39所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(xii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(xiii)和(xiv)：
(xiii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:40所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(xiv)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(xv)和(xvi)：
(xv)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述互补决定区(CDR)1包含与SEQ ID NO:36所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:40所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(xvi)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。可选地，与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列相比，该第一抗原结合蛋白的重链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合CD206的能力。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。可选地，与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比，该第一抗原结合蛋白的轻链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合CD206的能力。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或者包含与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。可选地，与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比，该第一抗原结合蛋白的重链可变结构域和轻链可变结构域分别包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合CD206的能力。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34的氨基酸序列(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)、基本上由其组成或由其组成。
在第二方面的任何实施方案中，本文所描述的第一抗原结合蛋白可以从N末端到C末端具有VH然后VL，或VL然后VH，或本文定义为VH的任何CDR1、CDR2和CDR3然后本文定义为VL的任何CDR1、CDR2和CDR3，或本文定义为VL的任何CDR1、CDR2和CDR3然后本文定义为VH的任何CDR1、CDR2和CDR3。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以是以下形式：
(i)单结构域抗体(sdAb)；
(ii)单链Fv片段(scFv)；
(iii)二聚体scFv(di-scFv)；或者
(iv)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(ii)或(iii)之一。
进一步地，如本文所描述的，第一抗原结合蛋白可以是以下形式：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；
(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体；
(viii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vii)之一。
在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以是IgG的形式。在第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以是免疫球蛋白G(IgG)分子的形式。可选地，根据本发明第二方面的任何实施方案，第一抗原结合蛋白可以是IgG或异质二聚体Fab-Fc的形式，并且第二抗原结合蛋白可以是IgG的抗原结合片段(比如，scFv)的形式。
在任何方面(包括第一方面和第二方面)，第二抗原结合蛋白用于结合FLAG标签，该第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4，以及
FR1a-CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各自为骨架区；
CDR1、CDR2和CDR3各自为互补决定区；
FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自为骨架区；
CDR1a、CDR2a和CDR3a各自为互补决定区；
其中，骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如下表1中所述。
在任何实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3是指来自抗体可变重链(VH)的互补决定区，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自抗体可变轻链(VL)的互补决定区，或者在CDR1、CDR2和CDR3是来自VL的互补决定区的情况下，CDR1a、CDR2a和CDR3a是来自VH的互补决定区。在这种示例中，CDR可以根据情况而指CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白能够特异性结合FLAG标签或其变体(比如，SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:99所定义的或本文中另外定义的)。本发明的抗原结合蛋白优选地能够特异性结合包含多个FLAG标签序列(例如，2×FLAG、3×FLAG等)的蛋白结构域。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白用于特异性结合肽标签，该肽标签含有序列DYK、优选序列DYKD(SEQ ID NO:80)，或由其组成。除了这些序列外，第二抗原结合蛋白结合的FLAG标签中还可以存在其他氨基酸，优选地，其中，FLAG标签中的额外氨基酸是亲水氨基酸，例如R(Arg)、D(Asp)、E(Glu)和K(Lys)和/或具有芳香族侧链的氨基酸，例如Y(Tyr)、F(Phe)、H(His)和W(Trp)。
在本发明任何方面的优选实施方案中，第二抗原结合蛋白能够特异性结合FLAG标签，该标签含有、包含或由以下序列组成：GDYKDDDDKG(SEQ ID NO:98)、DYKDDDDK(SEQ IDNO:99)、MDYKDDDDK(SEQ ID NO:100)、DFKDDDK(SEQ ID NO:101)、DYKAFDNL(SEQ ID NO:102)、DYKDHDG(SEQ ID NO:103)、MDFKDDDDK(SEQ ID NO:104)、MDYKAFDNL(SEQ ID NO:105)、DYKDHDI(SEQ ID NO:106)、DYKDH(SEQ ID NO:107)、DYKDD(SEQ ID NO:108)、DYKDHD(SEQ ID NO:109)和/或DYKDDD(SEQ ID NO:110)。最优选的序列是DYKDDDDK(SEQ ID NO:99)。
如本文所使用的，术语FLAG标签还囊括了经修饰的FLAG标签，比如通过氨基酸插入、删除或取代源自上述FLAG标签的那些FLAG标签，尤其是源自具有序列DYKDDDDK的标签的那些FLAG标签。
本文中提及的“结合(binds to)”FLAG标签的蛋白质或抗体为“特异性结合(bindsspecifically to或specifically binds to)”FLAG标签的蛋白质或抗体提供了文字支持。
在任何实施方案中，FLAG标签存在于本发明双特异性多肽能够结合、与其结合或特异性结合的蛋白质的N末端、C末端或内部。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白竞争性抑制抗体与FLAG标签的结合，该抗体：
-包含VH，其包含SEQ ID NO:70所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:75所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
-包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；或者
-包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列。
在任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3，抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所定义的可变重链。
在任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域的CDRL1、CDRL2和/或CDRL3，该抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所定义的可变轻链。
在任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3，该抗原结合结构域具有如SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所定义的可变重链和如SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所定义的可变轻链。
在任何方面的任何实施方案中，本文所描述的第二抗原结合蛋白包含：
FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4–接头-FR1a-CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中，骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如下表1中所述。
如本文所定义的，接头可以是化学物质、一个或多个氨基酸、或者形成于两个半胱氨酸残基之间的二硫键。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合结构域包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)和(b)：
(a)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:81所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:82的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:83的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(b)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:90的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:91的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(c)和(d)：
(c)VH，其包含互补决定区CDR1，所述互补决定区CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQID NO:112的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:113的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(d)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(e)和(f)：
(e)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQID NO:113的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(f)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(g)和(h)：
(g)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQID NO:157的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(h)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(i)和(j)：
(i)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQID NO:157的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(j)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(k)和(l)：
(k)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(l)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(m)和(n)：
(m)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(n)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(o)和(p)：
(o)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:132的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(p)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(q)和(r)：
(q)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(r)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成。
在本发明任何方面的实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：
(a)和(b)：
(a)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列或由其组成，以及
(b)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(c)和(d)：
(c)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(d)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(e)和(f)：
(e)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(f)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(g)和(h)：
(g)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(h)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(i)和(j)：
(i)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(j)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(k)和(l)：
(k)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(l)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(m)和(n)：
(m)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(n)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(o)和(p)：
(o)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(p)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(q)和(r)：
(q)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(r)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:92的氨基酸序列或由其组成。
在本发明任何方面的任何实施方案中，FR1、FR2、FR3和FR4可以是指来自抗体可变重链(VH)的骨架区，FR1a、FR2a、FR3a和FR4a可以是指来自抗体可变轻链(VL)的骨架区，或者在FR1、FR2、FR3和FR4是来自VL的骨架区的情况下，FR1a、FR2a、FR3a和FR4a是来自VH的骨架区。在这种示例中，FR可以根据情况而指FR H1、FR H2、FR H3、FR H4、FR L1、FR L2、FR L3和FR L4。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有来自人类种系的FR H1、FR H2、FR H3和/或FR H4，其中，该人类种系为IGHV1-46*01或IGHV7-4-1*02。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有来自人类种系的FR L1、FR L2、FR L3和/或FR L4，其中，该人类种系为IGKV2-30*01或IGKV4-1*01。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有来自人类种系的FR H1、FR H2、FR H3和/或FR H4，其中，该人类种系为IGHV1-46*01或IGHV7-4-1*02，以及具有来自人类种系的FR L1、FR L2、FR L3和/或FRL4，其中，该人类种系是IGKV2-30*01或IGKV4-1*01。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含VH，其与人类的同一性大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％，优选地，与人类的同一性百分比如实施例2中所述进行计算，和/或VL，其与人类的同一性大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％，优选地，与人类的同一性百分比如实施例2中所述进行计算。
在本发明任何方面的实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有：具有如SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所定义的可变重链的抗原结合结构域的FR H1、FR H2、FR H3和/或FR H4。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域具有：具有如SEQ ID NO:76至SEQ ID No：79中任一项所定义的可变轻链的抗原结合结构域的FR L1、FR L2、FR L3和/或FR L4。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含：具有如SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所定义的可变重链的抗原结合结构域的FR1、FR2、FR3和/或FR4，以及具有如SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所定义的可变轻链的抗原结合结构域的FR1、FR2、FR3和/或FR4。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(a)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(b)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
E.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
F.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
G.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
H.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
I.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
J.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
K.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
L.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
M.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
N.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
O.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列，对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
P.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
Q.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示。
在任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(c)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(d)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQ IDNO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQ IDNO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ IDNO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ IDNO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(e)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(f)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(g)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(h)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(i)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(j)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(k)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(l)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
E.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
F.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
G.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
H.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ IDNO:89所示，并且对于VL FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ IDNO:125和SEQ ID NO:97所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含VH，其包含上文(m)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(n)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示；
或者
E.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
F.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示；
或者
G.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
H.VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，该抗原结合结构域包含：
A.VH，其包含如上文(o)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含如上文(p)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:137所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH，其包含如上文(q)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含如上文(r)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且VH和VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，该参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:137所示，并且对于VLFR，该参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含可变重链，该可变重链包含SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。可选地，与SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列相比，该第二抗原结合蛋白的重链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合FLAG标签的能力。
在本发明任何方面的实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含可变轻链，该可变轻链包含SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。可选地，与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列相比，该第二抗原结合蛋白的轻链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合FLAG标签的能力。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含可变重链，该可变重链包含SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所示的氨基酸序列，以及可变轻链，该可变轻链包含SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。可选地，与SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列相比，该第二抗原结合蛋白的重链可变结构域和轻链可变结构域分别包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，氨基酸取代不在CDR中和/或该抗原结合蛋白保留了结合FLAG标签的能力。
如本文所描述的，第二抗原结合蛋白可以是以下形式：
(i)单结构域抗体(sdAb)；
(ii)单链Fv片段(scFv)；
(iii)二聚体scFv(di-scFv)；
(iv)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(ii)或(iii)之一；
(v)与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的(i)至(iv)之一；
(vi)与经修饰的免疫细胞受体(比如，经修饰的T细胞受体)连接的(i)至(iv)之一。
进一步地，如本文所描述的，第二抗原结合蛋白可以是以下形式：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；
(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体；
(viii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vii)之一。
在本发明任何方面的优选实施方案中，第二抗原结合蛋白为scFv的形式，并且第一抗原结合蛋白为免疫球蛋白G(IgG)抗体的形式。在替代实施方案中，第二抗原结合蛋白可以是与第一抗原结合蛋白具有相同的抗体形式或抗体片段。可替代地，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白是不同形式的抗原结合蛋白。
在本发明第一方面或第二方面的任何实施方案中，第二结合结构域可以是抗体或其抗原结合片段的形式。抗原结合蛋白可以是抗体，例如单克隆抗体。抗原结合蛋白可以是重组抗体或修饰抗体的形式(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人源抗体、CDR移植抗体、灵长类化(primatised)抗体、去免疫化抗体、同人源化抗体、半抗体(half-antibody)、双特异性抗体、三特异性抗体或多特异性抗体)。抗体可进一步包括化学修饰，比如与活性剂或放射性标记物或者用于提高溶解度的试剂耦联、或本文所述的其他修饰。如本文所使用的，抗原结合蛋白可以是可变结构域。
在本发明任何方面的任何实施方案中，第二抗原结合结蛋白包含以下氨基酸序列(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)、基本上由其组成或由其组成：
-SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:79；
-SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:78；
-SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:76；
-SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:77；
-SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:76；
-SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:77；
-SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:78；
-SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:79；
-SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:76；
-SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:77；
-SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:78；
-SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:79；
-SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:76；
-SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:77；
-SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:78；或者
-SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:79。
如本文所使用的，本发明抗原结合蛋白的互补决定区(CDR)序列根据IMGT、Chothia或Kabat编号系统或任何其他CDR编号系统来进行定义。
在本发明任何方面的任何实施方案中，双特异性多肽包含以下氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21；
-SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:26；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:28；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:29；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:30；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:31；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:32；
-SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:173；
-SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:175；
-SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:176；
-SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:177；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:52；
-SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:56；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:57；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:58；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:59；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:60；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:61；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:62；或者
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:63。
在上述的任何实施方案中，双特异性多肽包含一条、两条或三条多肽链、基本上由其组成或由其组成，其中，该一条、两条或三条多肽链通过共价接头(例如本文所述的任何接头，包括(多个)氨基酸或二硫键)连接。如本文所述，双特异性多肽可以是异二聚化的。
在第三方面，本发明提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含根据本发明第一方面或第二方面的第一抗原结合蛋白、以及根据本发明第一方面或第二方面所定义的第二抗原结合蛋白。本发明还提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含根据本发明第一方面或第二方面在本文中所定义的双特异性多肽。
在第四方面，本发明提供了一种编码本发明第一方面或第二方面的双特异性多肽或其部分或者第三方面的融合蛋白的核酸。优选地，该核酸具有编码与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:171至SEQ ID NO:177相对应的任何一个或多个氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明第四方面的任何实施方案中，核酸可以是DNA(例如，cDNA)或RNA(例如，mRNA)。
在第五方面，本发明提供了一种包含第四方面的核酸的载体。
在本发明的涉及形成双特异性多肽或抗原结合蛋白的多个多肽链的方面，表达构建体包含与启动子可操作地连接的、编码包含例如VH的多肽的核酸，以及与启动子可操作地连接的、编码包含例如VL的多肽的核酸。
在另一个示例中，表达构建体是双顺反子表达构建体，例如，包含以下按5’到3’的顺序可操作连接的组件：
(i)启动子；
(ii)编码第一多肽的核酸；
(iii)内部核糖体进入位点；以及
(iv)编码第二多肽的核酸，
其中，第一多肽包含VH，而第二多肽包含VL，反之亦然。
本发明还设想了单独的表达构建体，其中一个表达构建体编码包含VH的第一多肽，而另一个表达构建体编码包含VL的第二多肽。例如，本发明还提供了一种组合物，该组合物包含：
(i)第一表达构建体，该第一表达构建体包含与启动子可操作地连接的、编码包含VH的多肽的核酸；以及
(ii)第二表达构建体，该第二表达构建体包含与启动子可操作地连接的、编码包含VL的多肽的核酸。
在第六方面，本发明提供了一种包含第五方面的载体或第四方面的核酸的细胞。优选地，该细胞是分离的、基本纯化的或重组的。在一个示例中，细胞包含本发明的表达构建体，或者：
(i)第一表达构建体，该第一表达构建体包含与启动子可操作地连接的、编码包含VH的多肽的核酸；以及
(ii)第二表达构建体，该第二表达构建体包含与启动子可操作地连接的、编码包含VL的多肽的核酸，
其中，第一多肽和第二多肽缔合形成本文所述的抗原结合蛋白。
本发明的细胞的示例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种包含本文所述细胞的动物或由源自该动物的组织。
在第七方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含第一方面或第二方面的双特异性多肽、第三方面的融合蛋白、第四方面的核酸、第五方面的载体或第六方面的细胞以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
在第八方面，本发明提供了一种用于生成第一方面或第二方面的双特异性多肽或第三方面的融合蛋白的方法，该方法包括在如本文所述的细胞或动物中表达第四方面的核酸。
在第九方面，本发明提供了第一方面或第二方面的双特异性多肽、第三方面的融合蛋白、第四方面的核酸、第五方面的载体或第六方面的细胞在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
在第十方面，本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，该方法包括向受试者施用第一方面或第二方面的双特异性多肽、第三方面的融合蛋白、第四方面的核酸、第五方面的载体或第六方面的细胞，从而治疗或预防癌症。
本文所述的抗原结合蛋白可以是纯化的、基本纯化的、分离的和/或重组的。
本发明的双特异性多肽可以是取自培养基的上清液的一部分，表达本发明双特异性多肽的杂交瘤已在该培养基中生长。
如本文所使用的，除非上下文另有要求，术语“包括(comprise)”及该术语的变体(比如，“包含”、“含有”和“包含的”)并非旨在排除其他附加物、组分、整数或步骤。
本发明的其他方面以及先前段落中描述的方面的其他实施方案将从以下通过示例并参考附图给出的描述中变得显而易见。
附图说明
图1：IgG人源化FLAG标签结合单克隆抗体的ELISA滴度。
图2：人源化单克隆抗体与FLAG标记的CAR结合以诱导CAR T细胞分泌IFN-γ。
图3：来自亲本抗体的VH区和VL区与人源化变体v4和v7的比对。
图4：IgG结构域和scFv结构域的BEAT变化示意图。
图5：在50nM FLAG-BAP存在下，CD40与BEAT 1a4(F7-G8)结合的单参传感图，示出了在50nM FLAG-BAP结合和饱和之后，在50nM FLAG-BAP存在下注入CD40。CD40浓度为50nM、16.7nM、5.6nM、1.9nM、0.62nM、0.21nM、0.069nM、0.023nM、0nM。示出了1∶1结合模型的拟合。
图6：抗CD40(A)和抗CD206(B)BEAT与单核细胞来源DC的结合。
图7：(A)在0.1nM至100nM BEAT 1a4之间，BEAT与人MoDC细胞上CD40的剂量依赖性结合；(B)在0.1nM至100nM BEAT 1a4之间，BEAT与人B细胞上CD40的剂量依赖性结合；(C)在0.1nM至100nM BEAT 1a4之间，BEAT与非人灵长类MoDC细胞上CD40的剂量依赖性结合；(D)在0.1nM至100nM BEAT 1a4之间，BEAT与非人灵长类B细胞上CD40的剂量依赖性结合。
图8：在3nM至30nM(CD86)和1nM至60nM(IL-12)之间，BEAT 1(以及CD40IgG2对照品)使CD86表达(A)和IL-12/IL-23p40释放(B)以剂量反应的方式增加。
图9：(A)BEAT与7B1抗间皮素CD28z CAR上的FLAG标签结合，并使IFN-γ增加。(B)MoDC表达CD40和CD206。(C)经由FACS通过FLAG标签检测由GPF+/AF647+细胞来评估BEAT1a4与CAR T细胞的结合。
图10：以一名供体对BEAT进行细胞因子分析。
图11：在对照化合物/BEAT(30nM)存在下(有或没有MoDc)添加BEAT增殖120小时后，CART细胞的增殖情况。
图12：图11中所述的CD4+、CD8+和CD3+的进一步表型。
图13：BEAT+CAR T细胞在SKOV-3MSLN阳性细胞系中的细胞毒性。
图14：CAR T+BEAT 1a5在用CD40敲除细胞转染的SKOV3-间皮素阳性模型中的体内功效。(A)示意性实验时间线。(B)生存曲线。(C)肿瘤大小。
图15：BEAT 3、BEAT 4、BEAT 5和BEAT 6的示意图。
图16：抗CD40抗FLAG BEAT 3、4、5和6与CD40抗原的ELISA结合测定。
图17：BEAT 1、BEAT 3、BEAT 4、BEAT 5和BEAT 6与7B1抗间皮素CD28z CAR人T细胞(A)和人单核细胞来源DC(B)的结合。
图18：在MoDC上CD86(A)和IL-12/IL-23p40(B)随着BEAT 1、BEAT 3、BEAT 4、BEAT5和BEAT 6的添加而上调。
图19：在对照化合物/BEAT(30nM)(有或没有MoDc)和CAR T细胞存在下添加BEAT1、BEAT 3、BEAT 4、BEAT 5和BEAT 6增殖5天后，CAR T细胞的增殖情况。
图20：图15中所述的CD3+T细胞的进一步表型。
图21：图15中所述的CD4+T细胞的进一步表型。
图22：图15中所述的CD8+T细胞的进一步表型。
图23：BEAT 1、BEAT 3、BEAT 4、BEAT 5和BEAT 6在CAR T细胞或MoDC或CAR+MoDC下的细胞因子活性，包括IFN-γ(A)、IL12-p70(B)、IL-6(C)、IL-2(D)，MCP-1(E)、TNF-α(F)。
图24：在详细描述肿瘤大小的SKOV3间皮素模型中，CAR T细胞单独与CAR T+BEAT2a6(抗CD206 BEAT)比较的体内功效。
序列描述
表1本发明序列
具体实施方式
应理解的是，本说明书中披露和定义的本发明延伸至本文或附图中提及的或根据本文或附图明显的两个或更多个单独特征的全部可替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各个可替代方面。
本发明的其他方面以及先前段落中描述的各个方面的其他实施方案将从以下通过示例的方式并参考附图给出的描述中变得显而易见。
现在将详细参考本发明的特定实施方案。虽然本发明将结合实施方案进行描述，但是应该理解的是，意图并不是将本发明限于这些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可以包括在本发明的如权利要求限定的范围内的所有替代方案、修改和等同物。
本发明人已开发出双特异性多肽，例如抗体，该双特异性多肽结合抗原呈递细胞上的CD40和存在于在免疫细胞(比如，T细胞)上表达的分子上的FLAG标签，或结合抗原呈递细胞上的CD206和存在于在免疫细胞(比如，T细胞)上表达的分子上的FLAG标签。这些双特异性多肽允许表达工程化TCR的免疫细胞(例如，CAR T细胞)与抗原呈递细胞(APC)接合，从而增强免疫细胞在体外和体内的功效，对肿瘤形成具有高度抑制作用而无毒性，同时减少表达工程化TCR的免疫细胞(例如，CAR T细胞)实现治疗效果所需的有效剂量。重要的是，表达工程化TCR的免疫细胞(例如，CAR T细胞)会在远离免疫抑制肿瘤微环境的淋巴组织中接收活化和增殖信号。
双特异性多肽
如本文所使用的，术语“双特异性多肽”意指可以同时特异性结合两种不同靶抗原的多肽。本文所描述的双特异性多肽包含两种在结构上不同的结合蛋白或结构域(即，区)，其中每一个均特异性结合单个靶抗原。双特异性多肽可以用于结合APC上的靶抗原(例如，CD40或CD206)和表达工程化TCR(例如，包含FLAG标签的CAR)的免疫细胞上的不同靶抗原。进一步地，本发明的双特异性多肽可以用于结合APC上的靶抗原和由免疫细胞表达的工程化TCR(例如，CAR)上的不同靶抗原。双特异性多肽可以包括一种或多种抗体或抗体片段(例如，一种或多种scFv或IgG)的多肽序列(即，结构域)。在另一个实施方案中，双特异性多肽可以包括一个或多个配体的多肽序列。
在任何实施方案中，双特异性多肽都是具有第一scFv和第二scFv的串联单链可变片段抗体(taFv)。在替代性实施方案中，双特异性多肽可以是融合蛋白的形式，该融合蛋白包含用于结合第一抗原的免疫球蛋白、以及与免疫球蛋白融合的用于结合第二抗原的一个或多个scFv。如本文进一步描述的，应理解本发明的双特异性多肽可以是各种不同的形式，其中，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，并且其中，蛋白可以是源自抗体的各种形式中的任何一种。
本文所述的双特异性多肽可以被不同地称为“APC和T细胞的双特异性衔接器(Bispecific Engagers ofAPCs and T cells)”或“BEAT”。
“多肽”、“肽”、“蛋白质”和“蛋白质分子”在本文中可以互换使用，以指包含氨基酸残基的聚合物或由其组成的分子、以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适于氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物中的一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，比如对应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所使用的，术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸、以及与天然存在的氨基酸功能相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳。这种类似物可以具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架。氨基酸模拟物是指结构与氨基酸的一般化学结构不同，但功能与天然存在的氨基酸相似的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过其常用全名(例如，半胱氨酸)、其公知的三个字母符号(例如，Cys)或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单个字母符号(例如，C)来指代。同样，核苷酸也可以用其被普遍接受的单字母代码来指代。
如本文所使用的，术语“抗原”是指由“抗体”、“抗体片段”或“双特异性多肽”结合的分子。抗原可以是免疫球蛋白识别的蛋白质，在这种情况下，被免疫球蛋白结合的蛋白质上的位点被称为“表位”。在一个实施方案中，抗原可以是CD40、CD206或FLAG标签。在另一个实施方案中，抗原是免疫细胞表达的工程化TCR(例如，CAR)上的标签。
如本文所使用的，术语“抗原呈递细胞”或“APC”可以是专职抗原呈递细胞(例如，树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、上皮细胞等)或非专职抗原呈递细胞(例如，成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰岛β细胞、血管内皮细胞等)。在一个优选实施方案中，APC是内源性专职抗原结合细胞(优选地，树突状细胞或巨噬细胞)，并且不是肿瘤细胞。
本文所述的APC的示例包括但不限于树突状细胞(DC)、外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞(比如，THP-1)、B淋巴母细胞(比如，C1R.A2、1518B-LCL)和单核细胞来源树突状细胞(moDC)。在任何实施方案中，第一抗原结合蛋白特异性结合表达于APC(比如，DC或moDC)上的抗原，其中，该抗原选自CD40和CD206。在优选实施方案中，由第一抗原结合蛋白特异性结合的抗原(CD40或CD206)不是肿瘤相关抗原。换句话说，应该理解，在使用本发明的双特异性多肽的上下文中，意图是将第一抗原结合多肽用于结合如DC、moDC等非肿瘤内源性专职抗原呈递细胞上的CD40或CD206。
术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原并使其例如作为MHC-I和/或MHC-II偶联物的组分被T细胞识别的过程。
“MHC分子”包括MHC I类和MHC II类两种类型的分子。MHC I类分子向特异性CD8+T细胞呈递抗原，并且MHC II类分子向特异性CD4+ T细胞呈递抗原。外源性递送给APC的抗原主要被加工用于与MHC II类结合。相比之下，内源性递送给APC的抗原主要被加工用于与MHC I类结合。
在任何实施方案中，第二抗原结合蛋白特异性结合表达工程化TCR(例如，CAR)或类似受体的免疫细胞上的抗原。在进一步的实施方案中，本发明双特异性多肽的第二抗原结合蛋白可以结合免疫细胞上的抗原，其中，该抗原不是工程化TCR的一部分，而是存在于免疫细胞的细胞表面上的抗原。
在特定实施方案中，免疫细胞通常是工程化T细胞或NK细胞，通常地，其中，工程化T细胞或NK细胞上的抗原是工程化TCR(例如，CAR)的一部分。根据这些实施方案，本发明双特异性多肽的第二抗原结合蛋白可以结合工程化TCR的细胞外部分。第二抗原结合蛋白可以结合工程化TCR的抗原结合结构域，或者第二抗原结合蛋白可以结合工程化TCR的不参与抗原结合的细胞外区。
在特定实施方案中，存在于免疫细胞上的工程化TCR(例如，CAR)还可以包含用于与第二抗原结合蛋白结合的附加氨基酸或分子。如本领域已知的，工程化TCR(例如，CAR)构建体可以被设计成包含“标签”，该标签通常是被抗体特异性识别的短氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫细胞是经工程化以表达包含标签的工程化TCR(例如，CAR)的T细胞或NK细胞。在这种实施方案的上下文中，双特异性多肽的第二抗原结合蛋白可以结合标签。
在任何实施方案中，标签为FLAG标签。因此，第二抗原结合蛋白能够特异性结合FLAG标签或其变体(比如，SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:99所定义的或本文中另外定义的)。第二抗原结合蛋白优选地能够特异性结合包含多个FLAG标签序列(例如，2×FLAG、3×FLAG等)的蛋白结构域。
在任何实施方案中，第二抗原结合蛋白用于特异性结合肽标签，该肽标签包含序列DYK、优选序列DYKD(SEQ ID NO:80)，或由其组成。除了这些序列外，还可以存在其他氨基酸，优选地亲水氨基酸，例如R(Arg)、D(Asp)、E(Glu)和K(Lys)，和/或具有芳香族侧链的氨基酸，例如Y(Tyr)、F(Phe)、H(His)和W(Trp)。
在一个优选实施方案中，本发明双特异性蛋白的第二抗原结合蛋白能够特异性结合FLAG标签，该标签包含以下序列或由其组成：GDYKDDDDKG(SEQ ID NO:98)、DYKDDDDK(SEQID NO:99)、MDYKDDDDK(SEQ ID NO:100)、DFKDDDK(SEQ ID NO:101)、DYKAFDNL(SEQ ID NO:102)、DYKDHDG(SEQ ID NO:103)、MDFKDDDDK(SEQ ID NO:104)、MDYKAFDNL(SEQ ID NO:105)、DYKDHDI(SEQ ID NO:106)、DYKDH(SEQ ID NO:107)、DYKDD(SEQ ID NO:108)、DYKDHD(SEQ ID NO:109)和/或DYKDDD(SEQ ID NO:110)。最优选的序列是DYKDDDDK(SEQ ID NO:99)。
如本文所使用的，术语FLAG标签还指经修饰的FLAG标签，该经修饰的标签通过氨基酸插入、删除或取代源自上述FLAG标签、尤其是具有序列DYKDDDDK的标签。
本文中提及的“结合(binds to)”FLAG标签的蛋白质或抗体为“特异性结合(bindsspecifically to或specifically binds to)”FLAG标签的蛋白质或抗体提供了文字支持。
在任何实施方案中，FLAG标签存在于N末端、C末端或该标签旨在结合的蛋白质内。
在特定实施方案中，免疫细胞是经工程化以表达工程化TCR(例如，CAR)的T细胞或NK细胞，并且双特异性多肽结合该工程化TCR的细胞外部分。技术人员熟悉工程化TCR(例如，CAR)的一般结构和用途，更具体地说，熟悉CAR T和CARNK细胞。例如并且如本领域已知的，CAR是一种细胞表面受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的组合，该组合在单一蛋白质中并非天然存在的。胞外结构域包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域可以是抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可以是人源抗体或片段、人源化抗体或片段、或非人源抗体或片段。通常，CAR的抗原结合结构域是抗体片段，比如Fab或scFv。最通常的情况下，CAR的抗原结合结构域是scFv。胞外结构域通常还包含将抗原结合结构域连接到跨膜结构域的间隔区(或铰链区)。CAR的间隔区可以源自免疫球蛋白，比如IgG1或IgG4，或者该间隔区可以源自替代性的细胞表面蛋白，包括但不限于CD4、CD8或CD28。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”意指包含抗原结合结构域的重组多肽，该抗原结合结构域与至少一个细胞内信号传导结构域连接。CAR的抗原结合结构域是CAR的功能部分，该功能部分特异性结合(即特异性靶向)至癌细胞上表达的抗原(即“肿瘤相关抗原”)。肿瘤相关抗原的示例是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括间皮素、Her2、CEA、FBP、CD19和BCMA。
如本文所使用的，“肿瘤相关抗原”是指由癌细胞表达的抗原。肿瘤相关抗原可以由非肿瘤细胞表达，也可以不由非肿瘤细胞表达。当肿瘤相关抗原不由非肿瘤细胞表达时(即，当肿瘤相关抗原是肿瘤细胞所特有的时)，肿瘤相关抗原也可以被称为“肿瘤特异性抗原”。当肿瘤相关抗原不是肿瘤细胞所特有的时，在未能诱导出对抗原的免疫耐受状态的条件下，肿瘤相关抗原也会在非肿瘤细胞上表达。在肿瘤上抗原的表达可能在使免疫系统能够对抗原产生应答的条件下发生。肿瘤相关抗原可能是在胎儿发育期间当免疫系统不成熟且不能应答时在非肿瘤细胞上表达的抗原，或者肿瘤相关抗原可能是通常在正常细胞上以低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。与对应的非肿瘤组织相比，临床上最感兴趣的那些肿瘤相关抗原被差异表达，并且允许特异性T细胞或免疫球蛋白优先识别肿瘤细胞。
从本披露内容的其余部分将会清楚，本发明双特异性多肽的第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白通常是抗体或抗体片段的形式。如本文所使用的，术语“抗体”泛指由四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子。本文还设想了包含抗原结合片段、突变体、变体及其衍生物的双特异性多肽，所述双特异性多肽保留了抗体分子的基本表位结合特征。这种突变体、变体和衍生物是本领域技术人员所熟知的，其说明性示例在本文别处进行了描述。
抗体重链通常包含重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区通常由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。轻链通常包含轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区(CL)。VH区和VL区可以进一步细分为超变区，也称为互补决定区(CDR)，该超变区与骨架区(FR)交错。每个VH和VL通常由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CD和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所使用的，术语“抗原结合片段”或“抗体片段”意指抗体的保留了特异性结合靶抗原的能力的一个或多个抗体片段。抗原结合片段的说明性示例包括(i)Fab片段，一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的单链可变片段(scFv)；(v)dAb片段(Ward等，1989，Nature，341：544-6)，其包含单个可变结构域；以及(vi)分离的CDR。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白是不同的抗体或抗体片段。例如，第一抗原结合蛋白可以是寡聚形式，其中，2条多肽链连接或结合，并且第二抗原结合蛋白可以是单条多肽链。例如，第一抗原结合蛋白可以是IgG形式(例如，重链和轻链连接或结合)，并且第二抗原结合蛋白可以是scFv形式(例如，单条连续多肽链)。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，第一抗原结合蛋白可以包含本文定义的VH和VL或由其组成，并且按N末端到C末端的顺序，VH和VL可以排列为VL-VH或VH-VL。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白可以包含本文定义的VH和VL或由其组成，并且按N末端到C末端的顺序，VH和VL可以排列为VL-VH或VH-VL。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白可以连接至第一抗原结合蛋白的N末端或第一抗原结合蛋白的抗原结合结构域的N末端。例如，第二抗原结合蛋白可以连接至第一抗原结合蛋白的VH或VL的N末端。在一个实施方案中，第二抗原结合蛋白经由接头、优选本文所描述的接头连接至第一抗原结合蛋白或第一抗原结合蛋白的抗原结合结构域的N末端。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，第二抗原结合蛋白可以连接至第一抗原结合蛋白的C末端或第一抗原结合蛋白的抗原结合结构域的C末端。例如，第二抗原结合蛋白可以连接至第一抗原结合蛋白的VH或VL的C末端。在一个实施方案中，第二抗原结合蛋白经由接头、优选本文所描述的接头连接至第一抗原结合蛋白或第一抗原结合蛋白的抗原结合结构域的C末端。
如本文所使用的，术语“序列同一性”或“序列同源性”是指两个聚合物分子之间(例如，两个核酸分子之间，比如两个DNA分子或两个RNA分子之间)或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的一个亚基位置被同一单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子各自中的一个位置被腺嘌呤占据，则这两个分子在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置数量的直接函数，例如，如果两个序列中一半位置(例如，长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(即，10个中的9个位置)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
异二聚化
“CH3结构域”包含Fc区中残基C末端至CH2结构域的延伸(即自IgG的约第341位氨基酸残基到约第447位氨基酸残基)。在根据本文所述的本发明的双特异性多肽(例如，抗体)中，可以将一个相应的CH3结构域布置在第三结合位点的VH3结构域和VL3结构域的C末端。本文所述的“CH3结构域”可以是变体CH3结构域，其中，天然CH3结构域的氨基酸序列经过至少一个不同的氨基酸取代(即，对CH3结构域的氨基酸序列的修饰)，以促进多特异性抗体内彼此面对的两个CH3结构域的二聚化。
例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中已经描述了用于CH3修饰的若干方法以支持异二聚化，其披露内容通过引用以其全文并入本文。
通常，在本领域已知的异二聚化方法中，以互补的方式对一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域都进行工程化，使得包含一个工程化CH3结构域的重链不能再与具有相同结构的另一条重链同二聚化。因此，包含一个工程化CH3结构域的重链被迫与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一条重链异二聚化。
本领域已知的一种异二聚化方法是所谓的“knobs-into-holes”技术，以下文献中提供了若干示例对该技术进行详细描述：WO 96/027011；Ridgway J.B.等人，ProteinEng.，9(1996)617-621；Merchant A.M.等人，Nat.Biotechnol.，16(1998)677-681；以及WO98/050431；这些文献的披露内容通过引用以其全文并入本文。在“knobs-into-holes”技术中，在抗体三级结构中两个CH3结构域之间形成的界面内，将每个CH3结构域上的特定氨基酸工程化以分别在一个CH3结构域中产生突起(“knob”)并在另一个CH3结构域中产生空腔(“hole”)。在多特异性抗体的三级结构中，一个CH3结构域中所引入的突起可定位于另一个CH3结构域中所引入的空腔中。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，双特异性多肽可以包含CH3结构域，该CH3结构域包含T366或Y407位的氨基酸取代，例如T366W取代和Y407V取代(根据Kabat编号)。
在第一方面或第二方面的任何实施方案中，双特异性多肽可以包含CH3结构域，该CH3结构域包含T366、L368、Y407、S354和Y349位的一个或多个氨基酸取代。在优选示例中，CH3结构域可以包含以下氨基酸取代：
(a)T336W；
(b)T366S、L368A和Y407V；
(c)Y407T；或者
(d)T336Y。
在上述的任何实施方案中，双特异性多肽可以包含两个CH3结构域，其中：
-第一CH3结构域包含T336W的氨基酸取代，并且第二CH3结构域包含T366S、L368A和Y407V的氨基酸取代；或者
-第一CH3结构域包含Y407T的氨基酸取代，并且第二CH3结构域包含T336Y的氨基酸取代。
除了本文所述的工程化CH3结构域外或作为其替代，CH3结构域可以包含附加的半胱氨酸取代，以提供附加的链间二硫键来稳定异二聚体，例如S354C取代和/或Y349C取代(根据Kabat编号)(Atwell S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35；Merchant A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677至681)。
接头
本发明的双特异性多肽可以包含连接第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白的接头序列。可替代地或附加地，接头序列可以连接第一抗原结合蛋白内的一个或多个抗原结合结构域或第二抗原结合蛋白内的一个或多个抗原结合结构域。接头例如可以起到连接抗原结合蛋白的两个结构域(比如，scFv或双抗体的VH和VL)的作用，或者接头可以起到将两个抗原结合蛋白(比如，两个或更多个Fab或sdAb)连接在一起的作用，或者接头可以起到将抗原结合蛋白连接到支架的作用。在一些实施方案中，双特异性多肽可以包含多个接头(即，两个或更多个)，例如，连接到支架的一个或多个scFv可以包含连接scFv的VH和VL的接头和将scFv连接到支架的接头。适当的接头是本领域已知的，并且可以由技术人员基于接头的预期用途容易地进行选择(例如，见Müller和Kontermann，治疗性抗体手册中的“双特异性抗体”("Bispecific Antibodies"inHandbook ofTherapeutic Antibodies)，Wiley-VCH Verlag有限责任公司，2014年)。
有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸(GlySer)接头，其在本领域中是公知的，并且包含以各种顺序组合的甘氨酸和丝氨酸单元。示例包括但不限于(GS)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:187)、(GGGS)n(SEQ ID NO:188)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:189)，其中，n是至少为1的整数，通常是1到约10之间(例如，1到约8之间、1到约6之间或1到约5之间)的整数。
其他有用的接头包括源自免疫球蛋白铰链序列的序列。接头可以包含来自四种IgG类型中任何一种的铰链序列的全部或部分，并且可以可选地包括附加序列。例如，接头可以包括免疫球蛋白铰链序列的一部分和甘氨酸-丝氨酸序列。非限制性示例是包括IgG1铰链约前15个残基、然后是长度约为10个氨基酸的GlySer接头序列(比如，如上所述的接头序列)的接头。
接头的长度将根据其应用而变化。技术人员可以容易地选择适当的接头长度。例如，当接头连接scFv的VH结构域和VL结构域时，接头的长度通常在约5到约20个氨基酸之间，例如，长度在约10到约20个氨基酸之间、或长度在约15到约20个氨基酸之间。当接头连接双抗体的VH结构域和VL结构域时，接头应足够短，以防止这两个结构域在同一条链内缔合。例如，接头的长度可以在约2到约12个氨基酸之间，例如，长度在约3到约10个氨基酸之间、或长度为约5个氨基酸。
在一些实施方案中，当接头连接两个Fab片段时，可以选择接头，使得其保持F(ab’)片段互补位点的相对空间构象，并能够形成相当于IgG核心铰链中二硫键的共价键。在此上下文中，合适的接头包括IgG铰链区，例如来自IgG1、IgG2或IgG4的铰链区。也可以使用这些示例性接头的修饰型。例如，改善IgG4铰链稳定性的修饰是本领域已知的(见例如Labrijn等人，2009，NatureBiotechnology，27：767至771)。
接头可以包含连接第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白的氨基酸残基序列。可替代地，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白可以经由化学偶联连接(例如，在结构域之间形成双芳基偶联物)。用于化学偶联结合结构域的合适方法的示例是本领域已知的。这种方法包括使用琥珀酰亚胺基化合物修饰存在于赖氨酸残基上的伯胺，如TriLink科技生物偶联剂中所使用的。在一个实施方案中，如果第一抗原结合蛋白和/或第二抗原结合蛋白是scFv，则双特异性多肽包含scFv的VH结构域和VL结构域之间的接头序列。合适的接头序列是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括相对柔性和亲水性的氨基酸残基。在一个实施方案中，接头序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65，或者与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:65具有至少71％、优选地至少72％、优选地至少73％、优选地至少74％、优选地至少75％、优选地至少76％、优选地至少77％、优选地至少78％、优选地至少79％、优选地至少80％、优选地至少81％、优选地至少82％、优选地至少83％、优选地至少84％、优选地至少85％、优选地至少86％、优选地至少87％、优选地至少88％、优选地至少89％、优选地至少90％、优选地至少91％、优选地至少92％、优选地至少93％、优选地至少94％、优选地至少95％、优选地至少96％、优选地至少97％、优选地至少98％、或更优选地至少99％序列同一性的氨基酸序列。
抗体或抗体片段可以包含附加的氨基酸或分子，用于纯化或识别。例如，抗体可以包含表位或亲和标签。这种表位或亲和标签的说明性示例包括肽标签(例如，FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签、eXact标签)和蛋白标签(例如，GST标签、MBP标签、GFP标签)。在一个实施方案中，表位或亲和标签是His标签。
核酸和载体
在本文披露的另一方面，提供了一种编码本文所述的双特异性多肽的核酸。在该实施方案中，核酸可以编码表1中列举的一个或多个氨基酸序列。在又另一方面，提供了一种包含本文所述载体的细胞。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”或“核酸序列”在本文中可互换地使用，以指代mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常是指长度至少为10个碱基的聚合物形式的核苷酸(可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸)，或修饰形式或任一类型的核苷酸。该术语包括单链和双链形式的RNA和DNA。
如本文所使用的，术语“基因”包括能够用于产生mRNA的核酸分子，可选地添加有助于该过程的元件。基因可能能够也可能不能够用来产生功能蛋白。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列以及5’非翻译区和3’非翻译区)。
术语“转基因”在本文中用于描述已经或将要人工引入宿主生物体基因组中并传递给该宿主子代的遗传物质。在一些实施方案中，转基因赋予被引入的T细胞所需的特性，或以其他方式产生所需的治疗结果。
如本文所使用的，术语“编码(encode或encoding)”等指一种核酸提供另一核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列可以被转录和/或翻译以产生多肽，或者如果核酸序列可以被加工成可以被转录和/或翻译以产生多肽的形式，则该核酸序列被称为“编码”多肽。这种核酸序列可以包括编码序列、或包括编码序列和非编码序列两者。因此，术语“编码”等包括由DNA分子转录产生的RNA产物，由RNA分子翻译产生的蛋白质，由DNA分子转录形成RNA产物并随后翻译该RNA产物产生的蛋白质，或由DNA分子转录提供RNA产物、加工该RNA产物以提供经加工的RNA产物(例如，mRNA)并随后翻译该经加工的RNA产物产生的蛋白质。
在任何实施方案中，编码本发明双特异性多肽的核酸序列可以具有一个或多个多核苷酸序列，该一个或多个多核苷酸序列编码或能够编码选自由以下组成的组中的多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:71至SEQ IDNO:74、以及SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79。
在任何实施方案中，编码本发明双特异性多肽的核酸序列可以具有选自由以下组成的组中的一个或多个多核苷酸序列：SEQ ID NO:178至SEQ ID NO:185。
在另一方面，提供了一种载体，其包含与调控序列可操作地连接的本文所述的核酸。
术语“调控元件”或“调控序列”是指在特定细胞中表达可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列(例如，DNA)。适于真核细胞的调控序列包括启动子、多腺苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的前导序列或尾随序列、以及将由转录的多核苷酸编码的产物靶向到细胞内的胞内区室或胞外环境的靶向序列。
通常，调控序列包括但不限于启动子序列、5’非编码区、顺式调控区(比如，转录调控蛋白或翻译调控蛋白的功能性结合位点)、上游开放阅读框、核糖体结合序列、转录起始位点、翻译起始位点、和/或编码前导序列、终止密码子、翻译终止位点和3’非翻译区的核苷酸序列。设想了本领域已知的组成型启动子或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，也可以是结合了一个以上启动子元件的杂合启动子。
所设想的启动子序列可以是哺乳动物细胞的天然序列，也可以源自替代性来源，其中，该区域在所选生物体中具有功能性。启动子的选择会根据预期宿主细胞的不同而不同。例如，可以用于在哺乳动物细胞中表达的启动子包括金属硫蛋白启动子(其可以响应于如镉等重金属而被诱导)、β-肌动蛋白启动子以及病毒启动子，比如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)即刻早期(IE)启动子、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒启动子和HPV启动子、尤其是HPV上游调控区(URR)等。所有这些启动子在本领域中都有很好的描述，并且容易获得。
增强子元件也可以在本文中使用以提高载体构建体中核酸序列的表达水平。示例包括：SV40早期基因增强子，例如Dijkema等人(1985，EMBOJournal，4：761)所述；源自劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子，例如Gorman等人(1982，ProceedingsoftheNationalAcademy ofScience，美国，79：6777)所述；以及源自人CMV的元件，例如Boshart等人(1985，Cell，41：521)所述，比如包含在CMV内含子A序列中的元件。
载体构建体还可以包含3’非翻译序列。3’非翻译序列是指包含DNA片段的基因部分，该DNA片段包含多腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号。多腺苷酸化信号的特征在于影响多腺苷酸束在mRNA前体的3’末端的添加。多腺苷酸化信号通常通过与规范形式5’AATAAA-3’是否存在同源性来识别，然而变异也不少见。3’非翻译调控DNA序列优选地包括约50nt到1000nt，并且除了多腺苷酸化信号和能够影响mRNA加工或基因表达的任何其他调控信号外，还可以包含转录和翻译终止序列。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”或“可操作地连结”是指并置，其中，如此描述的组分处于允许其以预期方式发挥作用的关系中。例如，与编码序列“可操作地连接”的调控序列是指调控序列相对于编码序列定位和/或取向，以允许编码序列在与调控序列相容的条件下表达。
如本文所使用的，术语“开放阅读框”和“ORF”在本文中可互换使用，以指在编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”(例如，ATG)和“终止密码子”(例如，TGA、TAA、TAG)是指编码序列中三个相邻核苷酸(“密码子”)单元，其分别指定了蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止。
如本文所使用的，应用于“核酸分子”、“多核苷酸”等的术语“重组”应理解为意指人工核酸结构(即，非复制型cDNA或RNA、或复制子、自复制cDNA或RNA)，所述人工核酸结构可以在如本文所述的细胞中转录和/或翻译。
重组的核酸分子或多核苷酸可以插入载体中。可以使用如质粒表达载体等非病毒载体或病毒载体。根据本发明的载体种类和插入核酸构建体的技术是本领域已知的，其说明性示例包括粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的质粒)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在任何实施方案中，载体包含编码选自由以下组成的组中的一个或多个多肽序列的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64至SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:71至SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79。
在任何实施方案中，载体包含选自由SEQ ID NO:178至SEQ ID NO:185组成的组中的一个或多个多核苷酸序列。
本文所述的核酸序列、多核苷酸或载体构建体包含自然界中不存在的异源序列。
在又另一方面，提供了一种包含本文所述载体的宿主细胞。合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括细菌细胞(例如，大肠杆菌、奇异变形杆菌)、真菌细胞(例如，酿酒酵母、毕赤酵母、里氏木霉)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF21、Hi-5)或哺乳动物细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括CHO细胞或293T细胞。这些细胞可从商业供应商处广泛获得。
用于产生双特异性多肽的方法
在另一方面，提供了一种用于产生本文所述的双特异性多肽的方法，该方法包括(i)在培养基中并在适于双特异性多肽表达的条件下培养本文所述的细胞；以及(ii)从细胞或培养基中分离所述双特异性多肽。
本文所述的双特异性多肽可以使用本领域技术人员已知的任何数量的表达系统来产生，其说明性示例包括在细菌(例如，大肠杆菌、奇异变形杆菌)、真菌(例如，酿酒酵母、毕赤酵母、里氏木霉)、植物或植物细胞、昆虫或昆虫细胞(例如，SF-9、SF21、Hi-5)或哺乳动物细胞中产生或通过其产生。在一个实施方案中，表达系统是哺乳动物表达系统。合适的哺乳动物表达系统是本领域技术人员已知的，其说明性示例包括CHO表达系统或293表达系统。这些表达系统可从商业供应商处广泛获得。在一个实施方案中，双特异性多肽使用哺乳动物表达系统产生。
在另一方面，提供了一种用于产生本文所述的双特异性多肽的方法，该方法包括在适于形成包含第一抗原结合蛋白和第二结合蛋白的化学偶联的双特异性多肽的条件下结合第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白。
在一个优选实施方案中，化学偶联的双特异性多肽是在对存在于赖氨酸残基上的伯胺进行琥珀酰亚胺基化合物修饰(如本文别处所述)后形成的。
药物组合物
在另一方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的双特异性多肽和药学上可接受的载剂。
本文所述的组合物可以以本领域已知的方式来制备，并且是适合于对哺乳动物、特别是人类胃肠外施用的组合物，该组合物包含治疗有效量的组合物以及一种或多种药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载剂”意指任何合适的载剂、稀释剂或赋形剂。这些包括所有使组合物与预期受体的血液等渗的水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可能含有抗氧化剂、缓冲剂和溶质；水性和非水性无菌混悬剂，其可能包括悬浮剂和增稠剂、分散介质、抗真菌剂和抗菌剂、等渗剂和吸收剂等。应当理解，本发明的组合物还可以包括其他补充的生理活性剂。
载剂通常是药学上“可接受的”，即与组合物中的其他成分相容且对受试者无害。组合物包括适合于肠胃外施用(包括皮下、肌内、静脉和皮内施用)的成分。组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。这种方法包括制备用于与分离的T细胞缔合的载剂。一般来说，组合物是通过将任何活性成分与液体载剂均匀且密切地缔合来制备的。
在一个实施方案中，该组合物适合于肠胃外施用。在另一个实施方案中，该组合物适合于静脉施用。
适合于肠胃外施用的组合物包括使组合物与预期受体的血液等渗的水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可能含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂和溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可能包括悬浮剂和增稠剂。
本披露内容还设想了本文所述的组合物与其他活性剂的组合和/或以及与其他治疗方案或治疗方式(比如放射疗法或手术)的组合。当本文所述的组合物与已知的活性剂联合使用时，该组合可以按顺序(连续或被不治疗的时期中断)施用，也可以并行施用或作为混合物施用。适合的抗癌剂是本领域技术人员已知的。联合治疗还被设想为囊括利用本发明的组合物进行治疗，然后再进行已知的治疗，或者利用已知的制剂进行治疗，然后再利用本发明的组合物进行治疗，例如作为维持治疗。例如，在癌症的治疗中，设想本发明的组合物可以与以下联合施用：烷基化剂(比如氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺联合顺铂(ifosfamidecysplatin)、或含铂烷化剂，比如顺铂、卡铂和奥沙利铂)、抗代谢物(比如嘌呤或嘧啶类似物、或抗叶酸剂，比如咪唑硫嘌呤和巯嘌呤)、蒽环类药物(比如柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌或蒽环类药物类似物)、植物生物碱(比如长春花生物碱、或紫杉烷，比如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇或多烯紫杉醇)、拓扑异构酶抑制剂(比如I型或II型拓扑异构酶抑制剂)、鬼臼毒素(比如依托泊苷或替尼泊苷)、酪氨酸激酶抑制剂(比如甲磺酸伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼)、腺苷受体抑制剂(比如A2aR抑制剂、SCH58261、CPI-444、SYN115、ZM241385、FSPTP、或A2BR抑制剂，比如PSB-1115)、腺苷受体激动剂(比如CCPA、IB-MECA和CI-IB-MECA)、检查点抑制剂(包括PDL-1:PD-1轴、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、阿替珠单抗、BMS-936559、MEDI4736、MPDL33280A或MSB0010718C)、CTLA-4通路抑制剂(比如伊匹木单抗和曲美木单抗)、TIM-3通路抑制剂、或已知的可促进T细胞功能的激动剂单克隆抗体(包括抗OX40，比如MEDI6469；以及抗4-BB，比如PF-05082566)。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒或制品，其包括一种或多种本发明的双特异性多肽、编码所述双特异性多肽的核酸和/或如上所述的药物组合物。
在其他方面，提供了一种用于上述治疗应用的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)容纳有本发明的双特异性多肽、核酸、载体或药物组合物的容器；以及
(b)附有使用说明的标签或药品说明书。
该试剂盒还可以包括一种或多种用于治疗癌症的活性成分或成分。例如，该试剂盒还可以包括表达CAR的免疫细胞。
“试剂盒”或“制品”可以包括容器以及容器上或与容器相关联的标签或药品说明书。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由比如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳对治疗病症有效的治疗组合物，并且可能具有无菌接入口(例如，容器可能是静脉液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的瓶塞的小瓶)。标签或药品说明书指示治疗组合物用于治疗所选病症。在一个实施方案中，标签或药品说明书包括使用说明，并指示治疗性或预防性组合物可以用于治疗本文所述的癌症或其他病症。
试剂盒可以包括(a)治疗性或预防性组合物；以及(b)其中含有第二活性成分或成分的第二容器。根据本发明该实施方案的试剂盒可以进一步包括药品说明书，该药品说明书指示该组合物及其他活性成分可以用于治疗本文所述的癌症或病症。可替代地或附加地，该试剂盒可以进一步包括第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，比如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该试剂盒可以进一步包括从商业和用户的角度来看所期望的其他物料，这些物料是本领域技术人员已知的，其适合的示例包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
治疗方法
在另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者共同施用治疗有效量的以下各项：(i)表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞；和(ii)如本文所述的双特异性多肽或药物组合物，其中，该双特异性多肽在体内同时结合受试者内源性APC上表达的抗原和由免疫细胞表达的工程化TCR(例如，CAR)上的抗原，以刺激免疫细胞活化和扩增来治疗癌症。
在本文所述的任何治疗方法或用途中，或在本发明的向受试者施用双特异性多肽的其他方面，该受试者可能已经接受或正在接受表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞。
在任何治疗方法中，或在本发明的向受试者施用双特异性多肽的其他方面，该方法或其他陈述进一步包括施用表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞的步骤。
表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞和本文所述的双特异性多肽或药物组合物的共同施用可以通过将免疫细胞和双特异性多肽或药物组合物配制在同一组合物(例如，用于同时共同施用)中来实现，或者可以将它们配制成不同的组合物用于顺序施用。所谓“顺序”施用是指免疫细胞的施用与双特异性多肽或药物组合物的施用之间存在间隔。顺序施用之间的间隔可以是几秒、几分钟、几小时或几天。在一个实施方案中，可能需要定期重新施用免疫细胞和双特异性多肽或药物组合物，以达到所需的治疗效果。顺序施用可以是任何顺序。
发明人已出人意料地示出，本文所述的双特异性多肽会刺激免疫细胞在体内的活化和扩增，从而提高免疫细胞疗法(比如，CAR T细胞疗法)的功效。因此，双特异性多肽可以被称为“佐剂”。如本文所使用的，术语“佐剂”是指双特异性多肽，该双特异性多肽可以提高由表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞所引发的免疫应答量级，使其超过表达工程化TCR的免疫细胞单独所能预期的量级。
免疫细胞活化可以通过例如通过T细胞TCR/CD3复合物或经由刺激CD2表面蛋白提供初级刺激信号，并通过辅助分子(例如，CD28或4-1BBL)提供次级共刺激信号来完成。除了通过TCR/CD3复合物或经由CD2提供的初级刺激信号外，诱导T细胞应答还需要第二种共刺激信号。在具体实施方案中，CD28结合剂可以用于提供共刺激信号。适合的共刺激配体包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、4-1BBL、OX40L、诱导性共刺激配体(ICOS-L)、细胞间黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、ILT3、ILT4、结合Toll样受体的激动剂或抗体、以及与B7-H3特异性结合的配体。
术语“扩增的”、“扩增(expansion或expanding)”、“繁殖”等在本文中可互换使用，以指代在向受试者施用细胞或药物组合物制剂之前或施用之后，免疫细胞数量的增加。免疫细胞可以使用本领域已知的任何细胞培养方法来扩增。例如，可以在体外组织培养系统(包括液体培养物、单层等)中扩增免疫细胞。
用于治疗癌症的治疗方案可以由本领域技术人员确定，并且通常取决于多种因素，包括但不限于肿瘤的类型、大小、阶段和受体状态，以及受试者的年龄、体重和总体健康状况。另一个决定性因素可能是发展为复发性疾病的风险。例如，与被视为发展为复发性疾病的风险低或较低的受试者相比，对于被确定为发展为复发性疾病的风险高或较高的受试者，可以开出更积极的治疗方案。类似地，与癌症未及晚期的受试者相比，对于被确定为癌症中晚期(例如，III期或IV期疾病)的受试者，可以开出更积极的治疗方案。
如本文所使用的，术语“癌症”意指与异常细胞增殖相关联的任何病症。这些病症是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，癌症是实体癌。在另一个实施方案中，癌症是间皮素阳性癌。在另一个实施方案中，癌症不表达CD40或CD206，或者相对于同类型的非癌组织，CD40或CD206被下调。在另一个实施方案中，癌症可以表达CD40。在另一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：脑癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌、胸腺癌和子宫内膜癌。
如本文所使用的，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指以任何方式矫正病症或症状，或以其他方式预防、阻碍、延缓、消除或逆转癌症或其他不良症状的发作或进展的任何和所有用途。因此，术语“治疗(treating)”等应在其尽可能广泛的情况下加以考虑。例如，治疗不一定意味着对受试者进行治疗直到完全康复或治愈。在表现出多种症状或以多种症状为特征的病症中，治疗不一定需要矫正、预防、阻碍、延缓、消除或逆转所有所述症状，而是可以矫正、预防、阻碍、延缓、消除或逆转所述症状中的一种或多种。
要治疗癌症的受试者可以是人类、或对人类具有经济意义和/或社会意义的哺乳动物，譬如除人类之外的食肉动物(例如，猫和狗)、猪(例如，家猪、阉猪和野猪)、反刍动物(例如，牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)、马和鸟类，鸟类包括濒危鸟类、动物园饲养的鸟类和禽类，更具体地是驯养的禽类(例如，火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等家禽)，因为它们对人类具有经济意义。术语“受试者”并不表示特定的年龄。因此，旨在涵盖成人、青少年和新生儿受试者。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，以指代本披露内容可适用的任何受试者。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人类。
如本文所使用的，术语“治疗有效量”意指当向需要这种治疗的哺乳动物、特别是人类施用时足以治疗癌症的细胞量。要施用的经修饰细胞的精确量可以由医生考虑到受试者在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及病症方面的个体差异来确定。
通常，免疫细胞(例如，CAR-T细胞)疗法的施用由每千克体重的细胞数量来定义。然而，因为经修饰的细胞在转移后会复制和扩增，所以所施用的细胞剂量不会与最终的稳态细胞数量相似。在一个实施方案中，包含本发明经修饰细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量来施用。在另一个实施方案中，包含本发明经修饰细胞的药物组合物可以以105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量来施用。
包含本文所述双特异性多肽的组合物也可以按这些剂量多次施用。本领域技术人员通过监测患者的疾病迹象并对治疗做相应调整就可以容易地确定特定受试者的最佳剂量和治疗方案。
在一个实施方案中，免疫细胞源自自体细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞源自同种异体细胞。
术语“自体”是指源自同一个体的任何材料，该材料随后将被重新引入该个体。
术语“同种异体”是指源自不同个体的、物种与引入该材料的个体相同的任何材料。当一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体材料可能在遗传上具有足够的差异性，从而在抗原性上相互作用。
细胞制造
为了取得足够治疗剂量的免疫细胞组合物，用于制造免疫细胞的方法通常涉及一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。根据本文披露的方法，可以刺激免疫细胞在体内和体外活化和扩增。
因此，在本文披露的另一方面，提供了一种用于刺激免疫细胞在体内活化和/或扩增的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下各项：(i)表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞；和(ii)如本文所述的双特异性多肽或药物组合物，其中，该双特异性多肽在体内同时结合受试者内源性APC上表达的抗原和由免疫细胞表达的工程化TCR(例如，CAR)上的抗原。
如本文所述的免疫细胞体内活化和扩增有助于减少对每种治疗剂量的免疫细胞所需的免疫细胞数量。
另一方面，提供了一种用于刺激免疫细胞体外活化和扩增的方法，该方法包括在培养基中培养分离的表达工程化TCR(例如，CAR)的免疫细胞，该培养基包括：(i)APC或APC模拟物；和(ii)如本文所述的双特异性多肽，其中，该双特异性多肽同时结合APC或APC模拟物上表达的抗原和由免疫细胞表达的工程化TCR(例如，CAR)上抗原。在一个实施方案中，双特异性多肽可以结合肿瘤细胞上表达的抗原。
本文设想的免疫细胞制造方法具有简单且稳健的培养起始和活化步骤，有助于产生作为优质治疗产品的免疫细胞组合物。在一个实施方案中，培养起始和活化包括将细胞群接种在细胞培养容器(例如，细胞培养袋、GREX生物反应器、WAVE生物反应器等)中，并通过初级和共刺激免疫细胞信号通路活化免疫细胞。细胞组合物可以进一步在一种或多种附加的生长因子或细胞因子(例如，IL-2、IL7和/或IL-15)或其任何适合的组合存在下进行培养。
在另一个实施方案中，免疫细胞的活化和扩增包括利用APC或APC模拟物来培养分离的免疫细胞。在一个实施方案中，APC或APC模拟物选自由以下组成的组：供体来源的APC、合成的人工APC(aAPC)、利用CD3和CD8的活化抗体功能化的微珠(Dynabeads)、自体单核细胞来源树突状细胞(moDC)和模拟APC的支架。
在特定实施方案中，培养起始包括在细胞培养容器中以所需密度(例如，1-5×106个细胞/mL)将包含T细胞(例如，PBMC)的细胞群接种在适合的细胞培养基中，该细胞培养基包含一种或多种细胞因子、初级刺激配体和共刺激配体。在另一个实施方案中，细胞因子、刺激配体和共刺激配体可以随后添加到细胞培养基中的PBMC中。
在一个实施方案中，细胞培养容器为细胞培养袋，包括但不限于GMP细胞扩增袋、GMP细胞分化袋、EXP-PakTM细胞扩增生物容器、VueLifeTM袋、KryoSureTM袋、KryoVueTM袋、袋、PermaLifeTM袋、X-FoldTM袋、Si-CultureTM袋和VectraCellTM袋，如本文其他部分所设想的。
在特定实施方案中，将细胞接种在包含适合细胞培养基的细胞培养容器中。适合的细胞培养基的说明性示例包括但不限于TCGM、X-VIVOTM15(补充2mM GlutaMAXTM-I、10mMHEPES和5％人AB血清)、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(生命技术公司)、CTSTMAIM培养基(生命技术公司)、RPMI 1640、Clicks、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo15(龙沙)、无血清培养基(CellGenix)和X-Vivo 20(龙沙)，其中，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充了适量血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使免疫细胞生长和扩增的足量细胞因子。
本文设想的细胞培养基可以进一步包括一种或多种因子，包括但不限于血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α。
在一个实施方案中，APC或APC模拟物选自由以下组成的组：供体来源APC、合成的人工APC(aAPC)、利用CD3和CD8的活化抗体功能化的微珠(Dynabeads)、自体单核细胞来源树突状细胞(moDC)和模拟APC的支架。
本领域技术人员将会理解，除了那些具体描述的之外，本文描述的本发明易于进行变化和修改。应当理解，本发明包括落入其精神和范围内的所有这种变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
本文实现的各种实施方案通过以下非限制性示例做了进一步描述。
应理解的是，本说明书中披露和定义的本发明延伸至本文或附图中提及的或根据本文或附图明显的两个或更多个单独特征的全部可替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各个可替代方面。
实施例
实施例1——抗CD40抗体的产生
获得人类抗CD40抗体。利用编码抗CD40抗体的载体转染500mL HEK293培养物。在第6天通过离心收获培养物。在第3天完成SDS-PAGE凝胶分析。对丝氨酸进行半胱氨酸突变(C232和C127)以确认表达/聚集。在半胱氨酸突变和非突变IgG2形式中均观察到强表达。
通过蛋白A亲和层析和缓冲液(PBS)交换对IgG2蛋白的澄清上清液进行纯化。将材料渗析到pH为7.0的PBS缓冲液中。最终浓度通过A280测定，而产率、纯度和内毒素水平详见下表：
所有形式的IgG2均被确定具有高表达、低聚集和高纯度，并且适合于BEAT设计。
实施例2——嵌合抗体的人源化
获得小鼠抗FLAG抗体。为了识别互补决定区(CDR)和分析最接近的匹配种系序列，使用了IMGT DomainGapAlign工具(Ehrenmann F.、Kaas Q.和Lefranc M.-P.，NucleicAcidsRes.，2010；38：D301-D307)。
使用内部软件，基于与先前公布的抗体晶体结构的同源性，构建VH结构域和VL结构域的分子模型。可以根据要求提供PDB文件，以便在任何分子可视化软件中查看。图像使用PyMol(PyMol分子图形系统，版本2.0，有限责任公司)来生成。
基于公开的蛋白质基序来分析抗体序列的特定倾向(liability)。通过分析以下基序来进行分析，其中，X表示除脯氨酸以外的任何氨基酸，如下表所述：
在人源化过程开始时，以单链Fv(scFv)形式构建亲本VH和亲本VL的同源模型。建模分4个阶段进行：收集同源序列；折叠库扫描；环建模；侧链放置。所得到的模型用于指导人源化期间“供体”或“受体”氨基酸的选择。
亲本VH和VL序列与一组人类种系序列进行比对。该组已经过筛选，以选择不含不需要的序列倾向、特别是N-连接糖基化位点和游离半胱氨酸的种系序列。从两个不同的VH和VL家族中选择最接近的匹配种系。然后使用人源化算法来选择CDR和骨架氨基酸，以从供体亲本序列移植到人类受体种系序列上。生成四个VH序列和四个VL序列，从而产生可能的16种抗体。使用IMGT DomainGapAlign工具(Ehrenmann F.、Kaas Q.和Lefranc M.-P.，NucleicAcidsRes.，2010；38：D301-D307)来计算与人类的同一性百分比。基于序列基序来测定序列倾向。
通过IMGT DomainGapAlign工具运行VH序列和VL序列，以针对所有已知的抗体种系序列进行分析。使用IMGT定义来分配CDR区。如所预期的，该序列与小鼠最接近，特别是VH的IGHV1-4*01家族和VL的IGK1-117*01家族。与亲本SEQ ID NO:1最接近的匹配种系是IGHV1-46*01、IGHV7-4-1*02、IGKV2-30*01和IGKV4-1*01。
下表总结了原始亲本序列和人源化序列：
4种不同重链和轻链骨架区的组合产生了16种不同的VH/VL组合。
下表中总结了16种抗体的不同VH/VL组合：
所有人源化IgG1形式均表达良好，并成功纯化，通过SDS-PAGE和SEC-HPLC表征，以监测蛋白质质量。下表中描述了滴度、最终纯化抗体的量和单体含量：
实施例3——人源化抗体的表征
使用ELISA对所有16种IgG形式和scFv形式的人源化抗体结合靶标(FLAG标签)的能力进行了评估。结果在图1中示出。
尽管大多数人源化变体都保留了结合靶标的能力，但有3株人源化IgG克隆(v3、v4和v7)具有更强的亲和力。选择这三株IgG克隆和对应的scFV形式进行进一步分析。
人源化抗体能够表现出与亲本小鼠抗体(即在人类恒定区情况下的小鼠VH/VL)相当的高结合亲和力。
下表总结了通过Biacore测得的抗体亲和力和化学计量：
抗体 KD(M) 结合化学计量
V4scFv 2.2E-08 2.8
V3scFv 1.9E-08 5.5
V7scFv 1.5E-08 3.7
V7IgG 1.3E-09 1.1
V3IgG 1.0E-09 1.2
亲本 9.6E-10 1.3
V4IgG 9.1E-10 1.1
通过Biacore将四种IgG抗体(亲本小鼠抗体和3种人源化抗体：v3、v4和v7)与对应人源化scFv进行了结合单一抗原的比较。小鼠scFv无法表达，因此不能用于亲和力比较。与scFv相比，IgG抗体与抗原的结合更紧密，几乎高出10倍。这是所预期的，因为IgG本质上是二价的，与单价表达的scFv相比，其亲合力将产生更紧密的结合。
对抗体v3、v4、v7和v11(以IgG形式，并且在v11的情况下也以scFv形式)进行进一步表征。评估抗体活化抗HER2-FLAG CAR T细胞和诱导IFN-γ的能力。抗体诱导IFN-γ的表达图2所示。抗体v11还以IgG形式和scFv形式被纳入了评估。结果表明，抗体v7和抗体v4分别通过CAR T细胞诱导了最大量的IFN-γ。
基于这些结果，选择抗体变体v4和v7 scFv用于未来研究。
实施例4——抗CD40-抗FLAGBEAT(BEAT1)的设计和亲和力
设计并评估了12个抗CD40-抗FLAG BEAT(统称为BEAT 1)。图4中概述了IgG和scFv结构域的取向。下表中总结了所生成的BEAT 1的12种变体：
VL-VH之间以及scFv和IgG2之间所使用的接头是(G4S)*3。VH-VL之间所使用的接头是21个AA(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGAS)。
使用多循环SPR实验对CD40与11个抗CD40 BEAT抗体、抗CD40 IgG对照品和hCD40-cMyc cBEAT的结合进行表征。对于每个抗CD40抗体与CD40的结合，获得了至少两组可靠的数据。CD40与所有抗CD40 BEAT抗体的结合都拟合良好，亲和力高，并且KD在0.4nM至2nM的范围内。CD40与hCD40-cMyc rBEAT的结合示出KD为0.05nM至0.06nM，而对照抗体抗CD40IgG2示出的KD为0.5nM(表3)。
使用多循环SPR实验对FLAG-BAP与抗CD40 BEAT抗体和3种抗FLAG IgG对照抗体的结合进行表征。针对每个BEAT与FLAG的结合，获得至少两组可靠的数据。FLAG-BAP的结合拟合良好，亲和力高，并且KD在1nM至70nM的范围内。FLAG-BAP与对照抗FLAG抗体的结合示出KD范围为0.4nM至35nM(表4)。
表3BEAT1对CD40抗原的亲和力
表4BEAT 1对FLAG标签的亲和力
接下来，进行了BEAT 1a4(F7-G8)同时与CD40和FLAG-BAP结合的实验。在这些实验中，在蛋白G表面捕获BEAT 1a4之后，注入50nM FLAG-BAP直到达到饱和，然后在50nM FLAG-BAP存在下立即注入CD40，然后再在仅注入50nM FLAG-BAP的情况下监测CD40的解离。这是针对不同浓度的CD40进行的，这允许对CD40与BEAT 1a4的缔合和解离进行测量，BEAT 1a4始终利用FLAG-BAP饱和。类似地，进行反向实验，其中，在捕获BEAT 1a4之后，注入50nMCD40直至饱和，随后在50nM CD40存在下注入FLAG-BAP，然后再在仅注入50nM CD40的情况下监测FLAG-BAP的解离。这些实验表明，BEAT 1a4能够在被FLAG-BAP饱和的情况下结合CD40(图5)。在这些条件下，在存在或不存在结合的FLAG-BAP的情况下，CD40都能以相似的动力学参数、亲和力和Rmax进行结合。同样，FLAG-BAP在BEAT 1a4被结合的CD40达到饱和的情况下与BEAT 1a4结合。FLAG-BAP与BEAT 1a4的结合在存在或不存在结合的CD40的情况下也都显示出相似的动力学参数、亲和力和Rmax。
实施例5——BEAT1与APC的结合
评估BEAT 1在10nM、30nM和100nM时与APC的结合。IgG2同种型对照品未结合，而抗CD40抗体对照品的结合最高(仅100nM)(图6A)。BEAT 1a7、BEAT 1a4和BEAT 1b4的结合最高。
BEAT 1a4在0.1nM至100nM之间与人类MoDC细胞(图7A)和人类B细胞(图7B)上的CD40、以及在0.1nM至100nM之间与非人灵长类MoDC细胞(图7C)和非人灵长类B细胞(图7D)上的CD40表现出剂量依赖性结合。
BEAT 1a4与人类细胞/DC的结合：使用两(2)个供试品(抗体生物制品)进行细胞结合，包括一(1)个感兴趣的供试品(双特异性抗体1(BEAT 1a4))和一(1)个人类IgG2同种型对照抗体。对来自3名健康人类供体的PBMC和MoDC进行评估。对供试品与CD3+、CD20+、CD14+和CD11c+细胞亚群的结合进行评估。针对与所有建议的细胞类型的结合情况(图7A和图7B)，用200nM最高浓度，然后是两倍稀释的系列浓度(共10个点)和未经处理的样本，最后是次级抗体(5μg/mL)，对每个感兴趣的供试品和同种型对照抗体的剂量反应进行一式两份检测。
BEAT 1a4与NHP细胞的结合：使用两(2)个供试品(抗体生物制品)进行细胞结合，包括一(1)个感兴趣的供试品(双特异性抗体1(BEAT 1a4))和一(1)个人类IgG2同种型对照抗体。对来自3名NHP供体的PBMC和MoDC进行评估。对供试品与CD3+、CD20+、CD14+和CD11c+细胞亚群的结合进行评估。针对与所有建议的细胞类型的结合情况(图7C和图7D)，用200nM最高浓度，然后是两倍稀释的系列浓度(共10个点)和未经处理的样本，最后是次级抗体(5μg/mL)，对每个感兴趣的供试品和同种型对照抗体的剂量反应进行一式两份地检测。
实施例6——BEAT1与CAR T细胞的结合
对BEAT 1a4与具有FLAG标签并表达GFP的CAR T细胞的结合进行评估。经由FAC对细胞进行检测，为GFP+/AF647+细胞。在0.1nM至100nM整个剂量范围内对BEAT 1a4的结合进行评估(图9C)。
以10个点的标准曲线对供试品BEAT 1a4与具有FLAG标签的CAR-T靶细胞的结合进行评估，以确认EC50。在活性染料染色并用5％FBS孵育以阻断非特异性结合之后，CAR-T细胞与BEAT 1a4或人类IgG2同种型对照品进行剂量反应孵育。除了未经处理的对照品外，还在以下浓度下一式两份进行了测试：0.01nM、0.03nM、0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM、33nM和100nM。孵育后，洗涤细胞并用5μg/mL荧光标记的次级试剂(AF647-偶联的AffiniPure Fab2片段山羊抗人IgG Fcg特异性)染色，然后洗涤细胞并经由高通量流式细胞术进行采集。将AF647(活性染料-阴性)在活细胞内的几何平均荧光强度(MFI)值绘制在XY图上，从而图表化MFI与浓度的对数，并将数据拟合为非线性回归曲线，由此计算出EC50。还对在活细胞上设门的细胞进行了AF647百分比分析。
BEAT 1a4表现出与CAR T细胞剂量依赖性结合，EC50为0.51nM。
实施例7——BEAT1对APC和CAR T细胞的功能活性
随着将BEAT添加到单核细胞来源DC(MoDC)中，对主要BEAT候选物的CD86上调进行评估。预期CD40的激动作用会上调CD86的表达。在BEAT 1a4为10nM时，随着抗CD40 BEAT(BEAT 1a4和BEAT 1a5)的添加，CD86以剂量依赖性的方式上调(图8A)。对照抗体对CD86的增加无影响。
BEAT 1a4(和抗CD40激动剂对照品)在3nM至30nM(CD86)和1nM至60nM(IL-12/IL-23p40)之间以剂量反应的方式增加了IL-12/IL-23p40的释放(图8B)。
随着BEAT 1a4的添加，对包括FLAG标签和MoDC的CAR T细胞的功能活性进行评估。确认MoDC有CD40表达(图9B)。随着抗CD40 BEAT的添加，看到IFN-γ增加(图9A)。阴性(IgG1和IgG2同种型)对照品对IFN-γ无影响。
实施例8——BEAT1细胞因子分析
以一个供体完成细胞因子分析，从而对BEAT 1a4进行测试。抗CD40 BEAT 1刺激IFN-γ、TNF-α和IL2，具有一定活性，其中，BEAT 1a4和BEAT 1a5以低剂量刺激IL12-p70(图10)。对于BEAT 1a4而言，单独细胞背景以上，IL-6、IL-4、IL-10、IL-8、IP-10、MCP-1和IL-17A的活性有限。
实施例9——添加BEAT1后的T细胞增殖
增殖120h之后，检测7B128z CAR T细胞在存在对照化合物/BEAT 1(30nM)和MoDC的情况下的增殖。
对于抗CD40 BEAT 1a4和1a5，观察到CD3+、CD4+和CD8+细胞的倍数变化相对于对照品显著增加(图11)，特别是在添加抗CD40 BEAT 1a4后，效应性记忆T细胞、特别是CD8+ T细胞的百分比增加(图12)。
实施例10——BEAT1+CAR T的细胞毒性
使用卵巢癌细胞系SKOV-3(亲本、MSLN–ve和MSLN表达)+MoDC+CAR T，通过荧光素酶测定法来测量细胞毒性。
BEAT对MSLN表达的SKOV-3细胞无影响(图13)。
实施例11——CAR T+BEAT的体内功效
使用SKOV3间皮素转染的CD40敲除细胞在NSG小鼠模型中评估BEAT 1a5。首先在NSG小鼠中建立肿瘤(50mm2)。单次给药500万个抗间皮素CAR/500万个MoDC(间皮素高表达)，并且每两周给药一次BEAT，剂量为12.5ug BEAT(5剂)(图14A)。
对存活率和肿瘤大小(图14B和图14C)进行测量，其中，在第21天时，使用CART细胞+MoDC+BEAT的小鼠中有2/4无肿瘤，相较而言单独使用CART细胞的小鼠中只有有1/3无肿瘤。
实施例12——抗CD206抗体的产生
获得抗CD206抗体。利用抗CD206(B11)编码载体来转染500mL HEK293培养物。在第6天通过离心收获培养物。在第3天完成SDS-PAGE凝胶分析。通过蛋白A亲和层析ProtA(琼脂糖树脂)和缓冲液(PBS)交换对IgG1蛋白的澄清上清液进行纯化。将材料渗析到的PBS缓冲液中。在4×上样缓冲液(还原和非还原)中配制15μg样品，并通过SDS-PAGE进行分析。基于大小，还原条件使B11的纯度>95％。
实施例13——抗CD206-抗FLAGBEAT2的设计和特征
如以上实施例2和实施例3中所述对抗FLAG进行设计。如图4所概述的，使用IgG结构域和scFv结构域对12个抗CD206-抗FLAG BEAT(BEAT 2)进行设计和评估。下表中总结了所生成的BEAT 2的12种变体：
VL-VH之间以及scFv和IgG2之间所使用的接头是(G4S)*3。VH-VL之间所使用的接头是21个AA(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGAS)。
使用多循环SPR实验对CD206与12个抗CD206 BEAT抗体以及抗CD206 IgG对照品的结合进行表征。针对每个抗CD206抗体与CD206的结合，获得至少两组可靠的数据。CD206与所有抗CD206 BEAT抗体的结合都拟合良好，亲和力高，并且KD在10nM至80nM的范围内。CD206与对照抗体抗CD206 IgG1的结合示出KD为11nM。所有抗CD206 BEAT抗体与CD206的缔合速率常数(6×103-3×104M-1s-1)与解离速率常数(2-5×10-4s-1)相似(表5)。
使用多循环SPR实验对FLAG-BAP与12个BEAT抗体和3个抗FLAG IgG对照抗体的结合进行表征。除BEAT 2a1外，针对每个BEAT与FLAG的结合，获得至少两组可靠的数据。FLAG-BAP与BEAT抗体的结合拟合良好，亲和力高，并且KD在1nM至70nM的范围内。FLAG-BAP与对照抗FLAG抗体的结合示出KD范围为0.4nM至35nM。所有BEAT抗体与FLAG-BAP的缔合速率常数范围为1×105-5×106M-1s-1，而解离速率常数范围为1×10-3-4×10-2s-1(表6)。
表5BEAT2对CD206抗原的亲和力
表6BEAT2对FLAG标签的亲和力
实施例14—BEAT2与APC的结合
评估BEAT在10nM、30nM和100nM时与APC的结合。IgG2同种型对照品未结合，而B11抗CD206 Mab对照品的结合最高(仅100nM)(图6B)。BEAT 2a6、BEAT 2a8和BEAT 2b3的结合最高。
实施例15—BEAT2对APC和CAR T细胞的功能活性
利用BEAT对CART和MoDC进行评估。确认MoDC有CD206表达(图9B)。经由FLAG标签的结合刺激IFN-γ反应。随着抗CD206 BEAT的添加，看到IFN-γ增加(图9A)。阴性对照品(IgG1和IgG2同种型)对IFN-γ无影响。主要抗CD206 BEAT包括2b3。
实施例16——BEAT2细胞因子分析
以一个供体完成细胞因子分析，从而对主要BEAT 2进行测试。在单独细胞背景上，抗CD206 BEAT 2对IFN-γ、TNF-α和IL-6的刺激高于单独细胞背景(图10)。IL-2、IL-4、IL-10、IL-8、IP-10、MCP-1、IL-12p70和IL-17A的活性有限。
实施例17——7B128z CAR+BEAT2+MoDC的T细胞增殖
增殖120h之后，检测7B128z CAR T细胞在存在对照化合物/BEAT 2(30nM)和MoDC的情况下的增殖。
对于抗CD206 BEAT 2b3和2b4，观察到CD3+、CD4+和CD8+细胞的倍数变化相对于对照品增加(图11)，特别是在将BEAT 2b4添加到CD8+ T细胞后，中枢记忆T细胞的百分比增加(图12)。
实施例18——CAR T+抗CD206BEAT的体内功效
使用SKOV3-间皮素转染的CD40敲除细胞在NSG小鼠模型中评估BEAT 2a6。首先在NSG小鼠中建立肿瘤(50mm2)。单次给药500万个抗间皮素CAR/500万个MoDC(间皮素高表达)，并且每两周给药一次BEAT，剂量为12.5ugBEAT(5剂)(图14A)。
与单独CAR T细胞或无治疗对照品相比，测量CART细胞+MoDC+BEAT 2a6的肿瘤大小(图24)。
实施例19——单臂BEAT表达和纯化
使用两种不同的Knobs-in-Holes突变来设计单臂抗CD40和抗FLAG BEAT，以形成双特异性BEAT 3&4和BEAT 5&6(图15)。
BEAT 3：
·具有KIH突变集#1的单臂抗CD40 IgG2(Fab+Fc)
·单臂抗FLAG scFv+Fc(VL-(GGGGs)3-VH中的hM2V4 scFv)，具有KIH突变集#1中的KIH突变
重链1
·HC-IgG2(抗CD40)KIH1a
轻链1
·LC-IgG2(抗CD40)
重链2
●HC-hM2V4_CurrusLinker-(GGGGS)3-IgG2 Fc-KIH1b
BEAT4：
·具有KIH突变集#2的单臂抗CD40 IgG2(Fab+Fc)
●单臂抗FLAG scFv+Fc(VL-(GGGGs)3-VH中的hM2V4 scFv)，具有KIH突变集#2中的KIH突变
重链1
·HC-IgG2(抗CD40)KIH2a
轻链1
·LC-IgG2(抗CD40)
重链2
·HC-hM2V4_CurrusLinker-(GGGGS)3-IgG2 Fc-KIH2b
BEAT 5：
·单臂二价抗CD40 IgG2，具有连接的抗FLAG scFv(在重链的C末端)和KIH突变集#1
·具有KIH突变集#1的单臂抗CD40 IgG2
重链1
·HC-IgG2(抗CD40)KIH1a
轻链1
·LC-IgG2(抗CD40)
重链2
·HC-IgG2(抗CD40)-(GGGGS)3-hM2V4_CurrusLinker-KIH1b
轻链2
·LC-IgG2(抗CD40)
BEAT 6：
·单臂二价抗CD40 IgG2，具有连接的抗FLAG scFv(在重链的C末端)和KIH突变集#2
·具有KIH突变集#2的单臂抗CD40 IgG2
重链1
·HC IgG2(抗CD40)KIH2a
轻链1
·LC-IgG2(抗CD40)
重链2
·HC-IgG2(抗CD40)-(GGGGS)3-hM2V4_CurrusLinker-KIH2b
轻链2
·LC-IgG2(抗CD40)
合成与全部4种BEAT变体相对应的可变重链(VH)序列和可变轻链(VL)序列的cDNA，并将其亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pTXs1中。
以单臂BEAT(BEAT 3、BEAT 4、BEAT 5、BEAT 6)编码载体转染500mL XtenCHO培养物。转染后14天，通过离心收获培养物。通过蛋白A亲和层析ProtA(琼脂糖树脂)和缓冲液(PBS)交换对蛋白质的澄清上清液进行纯化。将物质渗析到的PBS缓冲液中。在4x上样缓冲液(还原和非还原)中配制15μg样品，并通过SDS-PAGE和SEC-HPLC进行分析。
以超过10mg的抗体对所有BEAT形式进行表达，其中，纯度大于90％，如下表所示：
实施例20——单臂BEAT对CD40和FLAG标签的亲和力
通过ELISA对单臂BEAT与CD40的结合进行评估。所有BEAT与CD40的结合情况均相似(图16)。使用1∶1模型经由SPR来确认单臂BEAT对CD40或FLAG的亲和力。如下表所示，使用1∶1模型，单臂BEAT与抗CD40对照Mab和BEAT 1a4的亲和力相当：
CD40 FLAG
抗CD40对照Mab 0.77nM 不适用
BEAT1a4 0.59nM 2.59nM
BEAT3 0.52nM 0.475nM
BEAT4 0.92nM 0.357nM
BEAT5 0.73nM 1.95nM
BEAT6 0.42nM 1.44nM
实施例21——单臂BEAT与CAR T细胞和AP细胞的结合
单价单臂BEAT 3和BEAT 4与CAR T细胞的结合与二价BEAT 1a4相当，与BEAT 1a4、BEAT 3和BEAT 4相比，BEAT 5和BEAT 6的结合略有降低(图17A)。单价单臂BEAT与MoDC的结合也与二价BEAT 1a4相当(图17B)。
实施例22——单臂BEAT的功能活性
在BEAT存在的情况下评估CD86表达和IL-12/IL-23p40释放，并将其与BEAT 1a4和抗CD40对照抗体进行比较。与BEAT 1a4相比，单臂BEAT的活性低，其中，对于CD86表达和IL-12/IL-23p40释放两者而言，BEAT 3和BEAT 4(单价抗CD40)比BEAT 5和BEAT 6(双价抗CD40)低(图18)。
实施例23——第5天时单臂BEAT的T细胞增殖
当添加CAR T和MoDC两者时，在剂量反应测定中将单臂BEAT的增殖与BEAT 1a4进行比较。将7B1-CD28z CAR与MoDC和各种BEAT及对照品孵育120h，并测量CAR T细胞数量(经由CD4+GFP+)。
在1nM BEAT 1a4时，看到CAR T细胞增殖出现前带效应。各单臂BEAT均看到剂量反应，其中，BEAT 3最强，其次是BEAT 4、BEAT 5和BEAT 6，最高剂量时，在0.1至10nM之间看到等效增殖，并且BEAT 5在1nM以上时看到前带效应(图19)。
在该增殖测定中还评估了细胞的表型，其中，T细胞的TEM增加(图20A、图20C、图20D)并且主要是由CD8+细胞中的增加驱动的(图22A、图22B、图22C、图22D)，CD4+细胞的TEM在100nM剂量的最高剂量时增加(图21D)。单臂BEAT的T细胞(图20)、CD4+细胞(图21)和CD8+细胞(图22)的表型在所有剂量下都相似。
实施例24——单臂BEAT的细胞因子分析
在CAR、CAR+MoDC和MoDC单独存在的情况下分析细胞因子。在CAR单独存在或MoDC单独存在下，BEAT对IFN-γ无影响(图23A)。在CAR T细胞+MoDC和BEAT存在下，IFN-γ以剂量反应的方式增加，其中，所有BEAT的反应相当，并且在1nM时看到最大反应(图23A)。
在CAR单独存在或MoDC单独存在下，BEAT对IL-12p70或IL-6无影响(图23B和图23C)。所有BEAT的IL-12p70在0.1nM和1nM时增加，并在存在CAR和MoDC时，在1nM以上出现前带效应(图23B)。随着将BEAT添加到CAR和MoDC中，IL-6以剂量反应的方式增加，其中，BEAT4的细胞因子水平高于其他BEAT(图23C)。
IL-2在CAR单独存在下增加，并在BEAT+CAR+MoDC存在下以剂量反应的方式增加(图23D)。背景以上，未见MCP-1有变化(图23E)。TNF-α在BEAT+CAR+MoDC存在下增加，而在CAR或MoDC单独存在下无变化(图23F)。

Claims (64)

1.一种双特异性多肽，其包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白，其中，所述第一抗原结合蛋白特异性结合CD40或CD206，并且其中，所述第二抗原结合蛋白特异性结合FLAG标签。
2.根据权利要求1所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4，以及
FR1a–CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
其中：
FR1、FR2、FR3和FR4各自为骨架区；
CDR1、CDR2和CDR3各自为互补决定区；
FR1a、FR2a、FR3a和FR4a各自为骨架区；
CDR1a、CDR2a和CDR3a各自为互补决定区；
其中，所述骨架区和/或互补决定区中任何一个的序列都如本文所述，优选地如本文表1中所述。
3.根据权利要求2所述的双特异性多肽，其中，所述的第一抗原结合蛋白包含：
FR1–CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4–接头–FR1a–CDR1a–FR2a–CDR2a–FR3a–CDR3a–FR4a，
可选地，其中，所述接头是化学物质、一个或多个氨基酸、或者形成于两个半胱氨酸残基之间的二硫键。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白结合或特异性结合CD40。
5.根据权利要求4所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白竞争性抑制抗体或其抗原结合片段与CD40结合，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1所示序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示序列的VL。
6.根据权利要求4或5所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含具有如SEQ ID NO:1所定义的可变重链结构域的抗原结合结构域的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3，和/或具有如SEQ ID NO:2所定义的可变轻链的抗原结合结构域的CDRL1、CDRL2和/或CDRL3。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含：
(i)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:3所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:6所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:10所示的序列或由其组成，以及
(ii)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(iii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:3所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:6所示的序列至少约80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:10所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(iv)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:12所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:14所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(v)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:5所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:9所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:11所示的序列或由其组成，以及
(vi)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:13所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:15所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(vii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:5所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:9所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:11所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列，以及
(viii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:13所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:15所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(ix)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:4所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:7所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:10所示的序列或由其组成，以及
(x)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:12所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:14所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:16所示的序列或由其组成；
或者
(xi)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:4所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:7所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:10所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(xii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:12所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:14所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:16所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(ix)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:40所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(vi)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(vii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:36所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:40所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(viii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与所述氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
9.根据权利要求8所述的双特异性多肽，其中，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，所述第一抗原结合蛋白的重链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，所述氨基酸取代不在CDR中和/或所述抗原结合蛋白保留了结合CD40的能力。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合结构域包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与所述氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
11.根据权利要求10所述的双特异性多肽，其中，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相比，所述第一抗原结合蛋白的轻链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，所述氨基酸取代不在CDR中和/或所述抗原结合蛋白保留了结合CD40的能力。
12.根据权利要求4至11中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)、基本上由其组成或由其组成。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白结合或特异性结合CD206。
14.根据权利要求1至3或13中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白结合表达于免疫细胞表面的CD206，所述免疫细胞优选为抗原呈递细胞、更优选为专职抗原呈递细胞，尤其是内源性专职抗原呈递细胞。
15.根据权利要求14所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白结合表达于所述专职抗原呈递细胞表面的CD206，所述专职抗原呈递细胞选自树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、上皮细胞，最优选地选自树突状细胞，甚至更优选地，其中，所述专职抗原呈递细胞不是肿瘤细胞。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白竞争性抑制抗体与CD206结合，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33所示序列的VH和含有SEQID NO:34所示序列的VL。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含具有如SEQ ID NO:33所定义的可变重链结构域的抗原结合结构域的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3，和/或具有如SEQ ID NO:34所定义的可变轻链的抗原结合结构域的CDRL1、CDRL2和/或CDRL3。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(i)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:35所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:38所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(ii)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(iii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:35所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:38所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(iv)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(v)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:37所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:41所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:43所示的序列或由其组成，以及
(vi)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:45所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:47所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(vii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:37所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:41所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:43所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(viii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:45所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:47所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(ix)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:39所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(x)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(xi)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:36所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:39所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(xii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成；
或者
(ix)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:36所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:40所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:42所示的序列或由其组成，以及
(vi)VL，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含SEQ ID NO:44所示的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:46所示的序列或由其组成，以及CDR3，所述CDR3包含SEQID NO:48所示的序列或由其组成；
或者
(vii)VH，其包含互补决定区(CDR)1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:36所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:40所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:42所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，以及
(viii)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:44所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:46所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:48所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与所述氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
20.根据权利要求19所述的双特异性多肽，其中，与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列相比，所述第一抗原结合蛋白的重链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，所述氨基酸取代不在CDR中和/或所述抗原结合蛋白保留了结合CD206的能力。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合结构域包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由其组成，或者包含与所述氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列或由其组成。
22.根据权利要求21所述的双特异性多肽，其中，与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列相比，所述第一抗原结合蛋白的轻链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，所述氨基酸取代不在CDR中和/或所述抗原结合蛋白保留了结合CD206的能力。
23.根据权利要求13至22中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34的氨基酸序列(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)、基本上由其组成或由其组成。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白从N末端到C末端包含VH然后VL，或VL然后VH，或本文定义为VH的任何CDR1、CDR2和CDR3然后本文定义为VL的任何CDR1、CDR2和CDR3，或本文定义为VL的任何CDR1、CDR2和CDR3然后本文定义为VH的任何CDR1、CDR2和CDR3。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白是以下形式：
(i)单结构域抗体(sdAb)；
(ii)单链Fv片段(scFv)；
(iii)二聚体scFv(di-scFv)；或者
(iv)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(ii)或(iii)之一。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白是以下形式：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；
(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体；
(viii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vii)之一。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第一抗原结合蛋白是免疫球蛋白G(IgG)分子的形式。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白能够特异性结合FLAG标签或其变体或修饰形式。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合结构域用于结合SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:99所定义的FLAG标签或其变体，比如其中，所述FLAG标签含有、包含或由以下序列组成：GDYKDDDDKG(SEQ ID NO:98)、DYKDDDDK(SEQ IDNO:99)、MDYKDDDDK(SEQ ID NO:100)、DFKDDDK(SEQ ID NO:101)、DYKAFDNL(SEQ ID NO:102)、DYKDHDG(SEQ ID NO:103)、MDFKDDDDK(SEQ ID NO:104)、MDYKAFDNL(SEQ ID NO:105)、DYKDHDI(SEQ ID NO:106)、DYKDH(SEQ ID NO:107)、DYKDD(SEQ ID NO:108)、DYKDHD(SEQ ID NO:109)和/或DYKDDD(SEQ ID NO:110)。
30.根据权利要求1到29中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述FLAG标签存在于所述双特异性多肽能够结合、与其结合或特异性结合的蛋白质的N末端、C末端或内部。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白竞争性抑制抗体与FLAG标签的结合，所述抗体：
(e)包含VH，其包含SEQ ID NO:70所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:75所示的序列；
(f)包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
(g)包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
(h)包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；
(i)包含VH，其包含SEQ ID NO:71所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列；
(j)包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
(k)包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
(l)包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；
(m)包含VH，其包含SEQ ID NO:72所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列；
(n)包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
(o)包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
(p)包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；
(q)包含VH，其包含SEQ ID NO:73所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列；
(r)包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:76所示的序列；
(s)包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:77所示的序列；
(t)包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:78所示的序列；或者
(u)包含VH，其包含SEQ ID NO:74所示的序列，以及VL，其包含SEQ ID NO:79所示的序列。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含具有如SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所定义的可变重链的抗原结合结构域的CDRH1、CDRH2和/或CDRH3，和/或具有如SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所定义的可变轻链的抗原结合结构域的CDRL1、CDRL2和/或CDRL3。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合结构域包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(a)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:81所示的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:82的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:83的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(b)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:90的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:91的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ IDNO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(c)VH，其包含互补决定区CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:113的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，以及
(d)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(e)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ IDNO:113的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(f)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ IDNO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(g)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ IDNO:157的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(h)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(i)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ IDNO:157的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQ ID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(j)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(k)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(l)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(m)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(n)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(o)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:111的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:132的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(p)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；
或者
(q)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:126的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:127的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:114的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成；以及
(r)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含与SEQ ID NO:133的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含与SEQ ID NO:121的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含与SEQID NO:92的序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列或由其组成。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合结构域包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：
(a)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列或由其组成，以及
(b)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(c)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(d)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(e)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:112的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(f)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(g)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(h)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(i)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:156的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(j)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(k)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(l)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(m)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(n)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(o)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(p)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成；
或者
(q)VH，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或由其组成，以及
(r)VL，其包含CDR1，所述CDR1包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或由其组成，CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或由其组成，CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列或由其组成。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含具有来自人类种系的FR H1、FR H2、FR H3和/或FR H4的抗原结合结构域，其中，所述人类种系为IGHV1-46*01或IGHV7-4-1*02；和/或其中，所述第二抗原结合蛋白包含具有来自人类种系的FR L1、FR L2、FR L3和/或FR L4的抗原结合结构域，其中，所述人类种系是IGKV2-30*01或IGKV4-1*01。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域有具有如SEQ ID NO:71至SEQ ID No：74中任一项所定义的可变重链的抗原结合结构域的FR H1、FR H2、FR H3和/或FR H4。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域有具有如SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任何一项所定义的可变轻链的抗原结合结构域的FR L1、FR L2、FR L3和/或FR L4。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含VH，其包含上文(a)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(b)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
E.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
F.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
G.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
H.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
I.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
J.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
K.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
L.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列，对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
M.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
N.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:97所示；
或者
O.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:97所示；
或者
P.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示；
或者
Q.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97所示。
39.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含VH，其包含上文(c)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(d)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQID NO:125和SEQ ID NO:127所示。
40.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含VH，其包含上文(e)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(f)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示。
41.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含VH，其包含上文(g)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(h)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:127所示。
42.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含VH，其包含如上文(i)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(j)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:97所示。
43.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含VH，其包含如上文(k)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(l)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
E.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
F.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
G.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:97所示；
或者
H.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQID NO:125和SEQ ID NO:97所示。
44.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含VH，其包含上文(m)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含上文(n)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且：
A.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示；
或者
C.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
D.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:89所示，并且对于VLFR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示；
或者
E.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
F.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示；
或者
G.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
H.所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167和SEQ ID NO:89所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:97所示。
45.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，其中，所述抗原结合结构域包含：
A.VH，其包含如上文(o)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含如上文(p)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:137所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示；
或者
B.VH，其包含如上文(q)中任一项所定义的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，以及VL，其包含如上文(r)中任一项所定义的CDR1、CDR2和CDR3，并且所述VH和所述VL各自包含骨架区(FR)1、2、3和4，所述骨架区(FR)1、2、3和4包含与参考序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同或100％相同的序列；对于VH FR，所述参考序列分别如SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:137所示，并且对于VL FR，所述参考序列分别如SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:97所示。
46.根据权利要求1至37中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含可变重链，所述可变重链包含SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74中任一项所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。
47.根据权利要求46所述的双特异性多肽，其中，与SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列相比，所述第二抗原结合蛋白的重链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，所述氨基酸取代不在CDR中和/或所述抗原结合蛋白保留了结合FLAG标签的能力。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含可变轻链，所述可变轻链包含SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79中任一项所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列至少约80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的序列。
49.根据权利要求48所述的双特异性多肽，其中，与SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列相比，所述第二抗原结合蛋白的轻链可变结构域包含不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个、不超过11个、不超过12个、不超过13个、不超过14个、不超过15个、不超过16个、不超过17个、不超过18个、不超过19个或不超过20个氨基酸残基取代；可选地，其中，所述氨基酸取代不在CDR中和/或所述抗原结合蛋白保留了结合FLAG标签的能力。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白是以下形式：
(i)单结构域抗体(sdAb)；
(ii)单链Fv片段(scFv)；
(iii)二聚体scFv(di-scFv)；
(iv)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(ii)或(iii)之一。
51.根据权利要求1至49中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白是以下形式：
(i)双链抗体；
(ii)三链抗体；
(iii)四链抗体；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；
(vii)双特异性抗体或其他形式的多特异性抗体；
(viii)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的(i)至(vii)之一。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白为scFv的形式，并且所述第一抗原结合蛋白为免疫球蛋白G(IgG)抗体的形式。
53.根据权利要求1至51中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合蛋白和所述第一抗原结合蛋白都是抗体或其抗原结合片段；可选地，其中，所述第一抗原结合蛋白及所述第二抗原结合蛋白具有相同的抗体形式或其片段。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述第二抗原结合结构域包含以下的氨基酸序列(按N末端至C末端或C末端至N末端的顺序)、基本上由其组成或由其组成：
(v)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:79；
(w)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:78；
(x)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:76；
(y)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:77；
(z)SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:76；
(aa)SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:77；
(bb)SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:78；
(cc)SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:79；
(dd)SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:76；
(ee)SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:77；
(ff)SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:78；
(gg)SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:79；
(hh)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:76；
(ii)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:77；
(jj)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:78；或者
(kk)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:79。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述双特异性多肽包含以下的氨基酸序列：
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21；
-SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:26；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:28；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:29；
-SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:30；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:31；
-SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:32；
-SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:173；
-SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:175；
-SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:176；
-SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174和SEQ ID NO:177；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:52；
-SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:56；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:57；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:58；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:59；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:60；
-SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:61；
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:62；或者
-SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:63。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的双特异性多肽，其中，所述多肽是包含所述第一抗原结合蛋白和所述第二抗原结合蛋白的融合蛋白。
57.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含如权利要求1至56中任一项所述的双特异性多肽。
58.一种核酸，所述核酸编码权利要求1至56中任一项所述的双特异性多肽或权利要求57所述的融合蛋白。
59.一种载体或表达构建体，所述载体或表达构建体包含权利要求58所述的核酸。
60.一种细胞，所述细胞包含权利要求59所述的载体或表达构建体、或权利要求58所述的核酸。
61.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至56中任一项所述的双特异性多肽、权利要求57所述的融合蛋白、权利要求58所述的核酸、权利要求59所述的载体或表达构建体、或权利要求60所述的细胞；可选地，包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
62.权利要求1至56中任一项所述的双特异性多肽、权利要求57所述的融合蛋白、权利要求58所述的核酸、权利要求59所述的载体或表达构建体、或权利要求60所述的细胞在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
63.一种权利要求61所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗或预防癌症。
64.一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1至56中任一项所述的双特异性多肽、权利要求57所述的融合蛋白、权利要求58所述的核酸、权利要求59所述的载体或表达构建体、或权利要求60所述的细胞，从而治疗或预防癌症。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
SI3464361T1 (sl) * 2016-05-27 2022-01-31 Abbvie Biotherapeutics Inc. Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
CN109790220A (zh) * 2016-08-25 2019-05-21 豪夫迈·罗氏有限公司 与巨噬细胞激活剂组合的抗csf-1r抗体的间歇给药
WO2018227018A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody conjugates of immune-modulatory compounds and uses thereof
WO2019084060A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Silverback Therapeutics, Inc. CONJUGATES AND METHODS OF USE FOR THE SELECTIVE DELIVERY OF IMMUNOMODULATORY AGENTS
SG11202104180WA (en) * 2018-10-30 2021-05-28 Peter Maccallum Cancer Inst Bispecific polypeptides for engagement of car expressing immune cells with antigen presenting cells and uses thereof
EP4072593A4 (en) * 2019-12-13 2024-01-03 Cugene Inc. BIOACTIVABLE CYTOKINE DRUGS AND ASSOCIATED METHODS OF USES
MX2023008986A (es) * 2021-01-29 2023-08-15 Inst Nat Sante Rech Med Polipeptidos antigenicos de chlamydia trachomatis y usos de los mismos con fines de vacuna.
CN114316060B (zh) * 2021-12-15 2023-06-13 北京市肿瘤防治研究所 抗人cd19与cd206双特异性抗体及其制备方法和应用
CN115028731B (zh) * 2022-06-10 2023-04-07 深圳诺合达生物科技有限公司 一种抗Flag标签的抗体及其应用

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