[go: up one dir, main page]

CN120026027A - 针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途 - Google Patents

针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN120026027A
CN120026027A CN202510486667.5A CN202510486667A CN120026027A CN 120026027 A CN120026027 A CN 120026027A CN 202510486667 A CN202510486667 A CN 202510486667A CN 120026027 A CN120026027 A CN 120026027A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dsrna
coleopteran insects
group
dscopi
arf1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202510486667.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王仁杰
李敬彬
于佳梅
李佳宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guiyi Technology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Guiyi Technology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guiyi Technology Shanghai Co ltd filed Critical Guiyi Technology Shanghai Co ltd
Priority to CN202510486667.5A priority Critical patent/CN120026027A/zh
Publication of CN120026027A publication Critical patent/CN120026027A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/10—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds
    • A01N57/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-oxygen bonds or phosphorus-to-sulfur bonds containing heterocyclic radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P7/00—Arthropodicides
    • A01P7/04—Insecticides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明旨在利用RNAi技术，通过施用靶向跳甲黄曲条跳甲关键基因的dsRNA，以达到有效防控黄曲条跳甲的目的。本发明公开了一种针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途。本发明还公开了dsRNA分子及其农药组合物在防治鞘翅目昆虫，杀害鞘翅目昆虫或抑制鞘翅目昆虫生长中的应用。本发明的双靶dsRNA以及dsRNA复配方案具有近于或高于传统化学农药的黄曲条跳甲防治效果，同时具备dsRNA农药的安全性和易降解性，能够有效克服现有化学农药高毒、高残留的问题。

Description

针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途
技术领域
本发明属于生物农药技术领域，具体地说，是关于针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途。
背景技术
黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata，Fabricius），隶属于鞘翅目（Coleoptera），叶甲科（Chrysommelidae），是广泛分布于世界各地的重要害虫。黄曲条跳甲的寄主植物主要是含有芥子油的十字花科蔬菜，例如白菜、萝卜、西兰花等。目前针对黄曲条跳甲的防治手段仍然是喷施化学农药。高毒高残留农药的滥施，已严重地危及人们的健康，并对环境和生态造成了污染和危害。在过去的二十年中，化学农药的使用导致了跳甲耐药性的快速发展，从而造成农户使用更大剂量杀虫剂的恶性循环，跳甲的预防和防治难度越来越大。因此，迫切需要发展安全、有效、绿色环保的策略来控制跳甲带来的危害。
RNA农药是利用RNAi 技术控制农业有害生物的有效方式，其具有安全、绿色环保、防控效率高的特点。已有研究报道dsRNA 在3种不同代表性农业土壤（粉壤土、壤土、黏土）中的生物降解潜力，dsRNA的半衰期（DT50）低于30 h，而DT90小于35 h。因此，无论土壤质地、pH值、粘土含量或其他差异如何，dsRNA都不太可能在土壤中持续存在或积累。在水生系统中，dsRNA已被证明在水-沉积物微观环境中的水相和缺乏水相的仅沉积物系统中会被迅速降解。研究显示，在无菌水中制备的dsRNA更稳定，这表明 dsRNA 是被微生物所降解。喷洒在烟草叶片表面的dsRNA在被降解前5天表现出对巨细胞病毒的RNAi活性。此外，在共聚焦显微镜下观察到，将dsRNA应用于叶片表面并在24小时后冲洗以模拟降雨事件，结果显示dsRNA很容易被冲走。
人体接触 dsRNA的主要接触途径包括意外口服接触、皮肤吸收和呼吸道吸入。人体消化道具有广泛的物理和生化障碍，这些生物屏障包括唾液和胃肠道中的核酸酶等，它们共同限制了被摄入的 dsRNA进入血液和器官。关于皮肤吸收，皮肤最外层的角质层是一个强大的屏障，避免dsRNA被直接吸收。如果皮肤损伤，dsRNA 绕过表皮屏障，作为亲水性大分子dsRNA需要依赖特定载体才能通过脂质双分子层进行运输，人体存在的dsRNA酶也会快速的代谢和清除外来dsRNA。此外，在 dsRNA 靶标片段的设计初期，通过生物信息学分析比对田间非靶标生物的基因序列，避免脱靶效应，以保护天敌生物、传粉媒介和分解者的安全。显然，任何可能对人类产生不利影响的dsRNA都需要显示出与人类基因组序列的一致性，防脱靶效应也是核酸农药安全性的最终保障。
外壳蛋白复合物 1（COPI）是一种多亚基复合物，其中COPI-gamma（COPI-γ）亚基和ADP核糖基化因子1（ADP-Ribosylation Factor 1，COPI-ARF1）是外壳蛋白复合物 1（COPI）的重要组成亚基和核心成分，其覆盖细胞内囊泡并参与细胞内蛋白质运输。
囊泡运输（Vesicle trafficking）是真核细胞所特有的物质运输方式，对维持细胞稳态至关重要。囊泡的形成涉及到包被蛋白（Coat proteins）的招募和组装。如同网格蛋白，COPⅠ外被体在出芽小泡的胞质溶胶面聚合, 形成COPⅠ 被膜小泡, 小泡形成之后快速解聚。COPⅠ 的某些亚基（如β亚基）具有衔接蛋白的作用，可同膜蛋白的细胞质结构域结合，促进小泡的形成，由COPⅠ 作为外被的小泡称为COPⅠ 被膜小泡。COPⅠ 被膜小泡介导从顺面高尔基体网状区（Cis Golgi network, CGN）到内质网（Endoplasmic reticulum, ER）以及高尔基体囊膜内部之间的物质运输，例如介导囊泡的逆向转运功能，即COPⅠ 被膜小泡会将细胞中含双赖氨酸基序的蛋白，高尔基体糖基转移酶类，KDEL蛋白等逆向运输到细胞内的特定区域。COPⅠ 被膜小泡在保持内质网和高尔基体的完整性、调节细胞内脂质代谢、维持细胞稳态及机体的生长发育中发挥重要作用。COPⅠ 功能缺陷会导致脂质代谢异常、肿瘤以及神经系统疾病的发生。COPI-ARF1 在细胞内膜系统的功能调节中扮演着关键角色，主要参与调节囊泡的形成、运输及膜交换过程。有研究表明敲除COPI-ARF1 的神经元促进了小鼠脊髓和后脑中过氧化脂质、脂滴和ATP 的积累，并导致神经炎症、脱髓鞘和神经变性。
昆虫体内的双链核糖核酸酶（dsRNase）是一类重要的酶类，它们具有降解双链RNA（dsRNA）的特异性，这种降解作用对于昆虫抵御外源dsRNA的入侵具有重要意义，能够保护昆虫自身的基因表达不受干扰。同时，dsRNase还参与了昆虫体内的RNA干扰（RNAi）过程，通过调节dsRNA的降解效率来影响RNAi的效果。
鉴于RNA农药优异的安全性、特异性和可降解性，若使用RNAi技术，可靶向跳甲COPI-γ与COPI-ARF1，使其细胞器间不能完成囊泡运输，扰乱其细胞的生物过程，从而导致跳甲死亡。然而，目前暂未有针对黄曲条跳甲 COPⅠ 的 RNA 生物农药的报道，考虑到其危害的严重性，仍存在着靶向黄曲条跳甲COPⅠ 的RNA农药的未满足的需求。此外，由于RNA农药通常为双链RNA，进入昆虫体内的RNA农药的效果也会因为其dsRNase的降解作用而大打折扣。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明旨在利用RNAi 技术，通过施用靶向黄曲条跳甲关键基因的dsRNA，以达到有效防控黄曲条跳甲的目的。此外，针对昆虫体内含有的dsRNase，本发明针对dsRNase的保守域设计干扰片段，与其他dsRNA共同施用，以提高干扰效果。
在一个方面，本发明提供了针对鞘翅目昆虫的dsRNA，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括选自如下的正义链和反义链的任一组合：
核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反义链；核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反义链；核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反义链；和，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反义链。
在一个方面，本发明提供了针对鞘翅目昆虫的dsRNA，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括选自如下的正义链和反义链的任一组合：
核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反义链；核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反义链；和，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反义链。
在另一个方面，本发明提供了针对鞘翅目昆虫的dsRNA，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反义链。
在另一个方面，本发明提供了针对鞘翅目昆虫的dsRNA，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反义链。
在另一个方面，本发明提供了针对鞘翅目昆虫的dsRNA，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反义链。
在另一个方面，本发明提供了针对鞘翅目昆虫的dsRNA，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反义链。
在另一个方面，本发明提供了一种制备如本文任一实施方案中所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA的方法，所述方法包括以下步骤：
S1：提取鞘翅目昆虫的总RNA；
S2：由总RNA反转录得到cDNA；
S3：以cDNA为模板，经PCR扩增得到dsRNA。
在另一个方面，本发明提供了一种制备如本文任一实施方案中所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA的方法，所述方法包括：构建表达载体，使用表达载体表达dsRNA；或者，构建表达宿主细胞，使用表达宿主细胞表达dsRNA。
在另一个方面，本发明提供了一种农药组合物，所述农药组合物包括如本文任一实施方案中所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA，以及农药可接受的稀释剂，载体或促溶剂。
在一个或多个实施方案中，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA靶向鞘翅目昆虫的COPI-γ基因和COPI-ARF1基因。
优选地，所述农药组合物包括正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的dsRNA和正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的dsRNA。
优选地，所述农药组合物包括正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的dsRNA。
在一个或多个实施方案中，所述农药组合物还包括靶向鞘翅目昆虫的dsRNase基因的dsRNA。
在一个或多个实施方案中，所述靶向鞘翅目昆虫的dsRNase基因的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反义链。
在一个或多个实施方案中，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA靶向鞘翅目昆虫的dsRNase基因和选自COPI-γ基因和COPI-ARF1基因中的一种或两种。
优选地，所述农药组合物包括正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的dsRNA，和选自正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的dsRNA，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的dsRNA和正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的dsRNA的一种或多种的组合。
更优选地，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的dsRNA，正义链的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的dsRNA和正义链的核苷酸序列如SEQID NO：3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的dsRNA。
更优选地，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的dsRNA和正义链的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的dsRNA。
在一个或多个实施方案中，所述农药组合物中针对鞘翅目昆虫的dsRNA的浓度为1～5000 mg/L。
优选地，所述农药组合物中针对鞘翅目昆虫的dsRNA的浓度为10～3000 mg/L。更优选地，所述农药组合物中针对鞘翅目昆虫的dsRNA的浓度为50～3000 mg/L。进一步优选地，所述农药组合物中针对鞘翅目昆虫的dsRNA的浓度为500～2000 mg/L。
优选地，所述农药组合物包括0.01～0.5%（w/v）吐温。更优选地，所述农药组合物包括0.01～0.2%（w/v）吐温。更优选地，所述吐温选自吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温80、吐温81、吐温85中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了如本文任一实施方案中所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA在防治鞘翅目昆虫中的用途，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA用于杀害鞘翅目昆虫或抑制鞘翅目昆虫生长。
在另一个方面，本发明提供了如本文任一实施方案中所述的农药组合物在在防治鞘翅目昆虫中的用途，所述农药组合物用于杀害鞘翅目昆虫或抑制鞘翅目昆虫生长。
在另一个方面，本发明提供了一种防治鞘翅目昆虫的方法，所述方法包括使用如本文任一实施方案所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA。
在另一个方面，本发明提供了一种防治鞘翅目昆虫的方法，所述方法包括使用如本文任一实施方案中所述的农药组合物。
优选地，所述鞘翅目昆虫为叶甲科昆虫。更优选地，所述叶甲科昆虫为黄曲条跳甲。
本发明提供的靶向鞘翅目昆虫的dsRNA，与现有技术相比具有如下有益效果：
1、针对黄曲条跳甲5号染色体的设计了靶向其COPⅠ-γ和COPⅠ-ARF1基因的dsRNA，针对黄曲条跳甲8号染色体的设计了靶向其dsRNase基因的dsRNA，所述dsRNA具有显著的黄曲条跳甲相应目的基因的表达抑制率以及致死率。
2、根据靶向黄曲条跳甲COPⅠ-γ和COPⅠ-ARF1基因的单靶dsRNA，设计得到了同时靶向COPⅠ-γ和COPⅠ-ARF1的双靶dsRNA，并进一步分别将单靶dsRNA和双靶dsRNA与dsRNase复配施用，对黄曲条跳甲相应目的基因的表达抑制率以及致死率进一步提升。
3、本发明的双靶dsRNA以及dsRNA复配方案具有近于或高于传统化学农药的黄曲条跳甲防治效果，同时具备dsRNA作为生物农药的安全性和易降解性，能够有效克服现有化学农药高毒、高残留的问题。
附图说明
图1是黄曲条跳甲外壳蛋白复合物1-γ（COPⅠ-γ）和黄曲条跳甲外壳蛋白复合物1-ARF1（COPⅠ-ARF1）联合靶标的PCR扩增流程示意图。
图2是dsRNA合成产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是显微注射dsRNA后黄曲条跳甲死亡率结果。
图4是显微注射dsRNA后黄曲条跳甲靶标基因的表达量结果。其中，图4中的A是COPⅠ-γ基因的表达量结果；图4中的B是COPⅠ-ARF1基因的表达量结果；图4中的C是dsRNase基因的表达量结果。
图5是室内生测中注射dsRNA后黄曲条跳甲的死亡率统计结果。其中，图5中的A是显微注射dsCOPⅠ-γ和/或dsRNase后黄曲条跳甲的死亡率统计结果；图5中的B是显微注射dsCOPⅠ-ARF1和/或dsRNase后黄曲条跳甲的死亡率统计结果；图5中的C是显微注射dsCOPⅠ-γ＆ARF1和/或dsRNase后黄曲条跳甲的死亡率统计结果。
图6是室内生测中注射dsRNA后黄曲条跳甲的dsCOPⅠ-γ基因和dsCOPⅠ-ARF1基因的表达水平结果。
图7是田间防治黄曲条跳甲成虫试验的小区规划示意图。
图8是田间防治黄曲条跳甲成虫试验的成虫减退率图。
具体实施方式
实施例1：RNA干扰靶点设计
本实施例的1，2，3号靶点源于黄曲条跳甲5号染色体（GenBank序列号:OU900098.1）；4号靶点源于黄曲条跳甲 8号染色体（GenBank序列号: OU900101.1）。
靶点 1：黄曲条跳甲外壳蛋白复合物1-γ（Coat protein complex I-γ, COPⅠ-γ）
正义链（490 bp）：
GAUAAAGUUGUUGUACAAGUUUUUAUCGUUUUUGCUAAGUAUGCUGCUGUAAUAAGUGGCUCUGUCUCUGACUUCAUCGUCAGAGUCCAUUUGGCAUCUGGCUAGUAAUACUUGAAUAUUUUCUAACAAAUCGGGACACGAGGCUCCGAAUUGGGCCAUGGCAGAAACAGCGGCUGCUCUUAUAGAAGGGCACUCUAAGAUGACGCGGUUGUAAAUGAAACGGAUAUAUCUGGAAGGUUGUUUGGUUUUCGGUCCUUCUCUACCAAGCAGAUGCAAUAUUCUAACAGCUAAAGAAACGUGUUCGCAAUCUUCAAUAAACUCGCACAGAUGAGCCAAACCCGAUUCUUUAGCUUCAGGAUUAUCCUCGAUAAUGGUGAUUAUGGUGUCCGCAAUGGAAGCUUUGUAUUCCAAACCGCCUUCAUCUCUUAGCAUGGCCGAUAAAAAGUUCAUGAGAGUGUUGUGCUUUCGAGGGAAUUUAAGAGCCAGCGCU（SEQ ID NO：1）
反义链（490 bp）：
AGCGCUGGCUCUUAAAUUCCCUCGAAAGCACAACACUCUCAUGAACUUUUUAUCGGCCAUGCUAAGAGAUGAAGGCGGUUUGGAAUACAAAGCUUCCAUUGCGGACACCAUAAUCACCAUUAUCGAGGAUAAUCCUGAAGCUAAAGAAUCGGGUUUGGCUCAUCUGUGCGAGUUUAUUGAAGAUUGCGAACACGUUUCUUUAGCUGUUAGAAUAUUGCAUCUGCUUGGUAGAGAAGGACCGAAAACCAAACAACCUUCCAGAUAUAUCCGUUUCAUUUACAACCGCGUCAUCUUAGAGUGCCCUUCUAUAAGAGCAGCCGCUGUUUCUGCCAUGGCCCAAUUCGGAGCCUCGUGUCCCGAUUUGUUAGAAAAUAUUCAAGUAUUACUAGCCAGAUGCCAAAUGGACUCUGACGAUGAAGUCAGAGACAGAGCCACUUAUUACAGCAGCAUACUUAGCAAAAACGAUAAAAACUUGUACAACAACUUUAUCC（SEQ ID NO：2）
靶点 2：黄曲条跳甲外壳蛋白复合物1-ARF1（Coat protein complex I-ARF1,COPⅠ-ARF1）
正义链（490 bp）：
CCUUCGUAGAGACCGUCUCCGCUGGUGGCGCACGUGGCCUGUAUGUACCAGUUACGGUUGCGCAACGAAUGUAAUCCGAGCUUAUCGGUGAUUUCGGCGGCGUUCAUGGCGUUCGGCAAAUCCUGCUUGUUGGCGAAUAUCAGAAGAACGGCGUCCCGGAGCUCGUCUUCGGCCAGCAUGCGCAUCAGCUCGUCUUUGGCCUCGGUGAUACGCUCCCUGUCGUUGCUGUCGACUACGAAGAUUAGGCCCUGCGUAUUUUGAAAAUAGUGUCUCCACAAUGGCCUAAUUUUAUCCUGACCACCGACAUCCCACACAGUAAAGCUGAUAUUCUUAUAUUCUACAGUCUCGACAUUAAAACCAAUAGUUGGGAUGGUUGUUACAAUUUCUCCUAAUUUUAGUUUAUAUAAAAUUGUGGUUUUACCAGCAGCAUCUAAACCUACCAUCAAUAUCCUCAUUUCCUUUUUGCCGAAGAGGCCUUUAAAUAAAUUAG（SEQ ID NO：3）
反义链（490 bp）：
CUAAUUUAUUUAAAGGCCUCUUCGGCAAAAAGGAAAUGAGGAUAUUGAUGGUAGGUUUAGAUGCUGCUGGUAAAACCACAAUUUUAUAUAAACUAAAAUUAGGAGAAAUUGUAACAACCAUCCCAACUAUUGGUUUUAAUGUCGAGACUGUAGAAUAUAAGAAUAUCAGCUUUACUGUGUGGGAUGUCGGUGGUCAGGAUAAAAUUAGGCCAUUGUGGAGACACUAUUUUCAAAAUACGCAGGGCCUAAUCUUCGUAGUCGACAGCAACGACAGGGAGCGUAUCACCGAGGCCAAAGACGAGCUGAUGCGCAUGCUGGCCGAAGACGAGCUCCGGGACGCCGUUCUUCUGAUAUUCGCCAACAAGCAGGAUUUGCCGAACGCCAUGAACGCCGCCGAAAUCACCGAUAAGCUCGGAUUACAUUCGUUGCGCAACCGUAACUGGUACAUACAGGCCACGUGCGCCACCAGCGGAGACGGUCUCUACGAAGG（SEQ ID NO：4）
靶点3：黄曲条跳甲外壳蛋白复合物1-γ&ARF1（Coat protein complex I-γ&ARF1, COPⅠ-γ&ARF1）
正义链（490 bp）：
UCUCUACCAAGCAGAUGCAAUAUUCUAACAGCUAAAGAAACGUGUUCGCAAUCUUCAAUAAACUCGCACAGAUGAGCCAAACCCGAUUCUUUAGCUUCAGGAUUAUCCUCGAUAAUGGUGAUUAUGGUGUCCGCAAUGGAAGCUUUGUAUUCCAAACCGCCUUCAUCUCUUAGCAUGGCCGAUAAAAAGUUCAUGAGAGUGUUGUGCUUUCGAGGGAAUUUUCCGAGCUUAUCGGUGAUUUCGGCGGCGUUCAUGGCGUUCGGCAAAUCCUGCUUGUUGGCGAAUAUCAGAAGAACGGCGUCCCGGAGCUCGUCUUCGGCCAGCAUGCGCAUCAGCUCGUCUUUGGCCUCGGUGAUACGCUCCCUGUCGUUGCUGUCGACUACGAAGAUUAGGCCCUGCGUAUUUUGAAAAUAGUGUCUCCACAAUGGCCUAAUUUUAUCCUGACCACCGACAUCCCACACAGUAAAGCUGAUAUUCUUAUAUUCUACAG（SEQ ID NO：5）
反义链（490 bp）：
CUGUAGAAUAUAAGAAUAUCAGCUUUACUGUGUGGGAUGUCGGUGGUCAGGAUAAAAUUAGGCCAUUGUGGAGACACUAUUUUCAAAAUACGCAGGGCCUAAUCUUCGUAGUCGACAGCAACGACAGGGAGCGUAUCACCGAGGCCAAAGACGAGCUGAUGCGCAUGCUGGCCGAAGACGAGCUCCGGGACGCCGUUCUUCUGAUAUUCGCCAACAAGCAGGAUUUGCCGAACGCCAUGAACGCCGCCGAAAUCACCGAUAAGCUCGGAAAAUUCCCUCGAAAGCACAACACUCUCAUGAACUUUUUAUCGGCCAUGCUAAGAGAUGAAGGCGGUUUGGAAUACAAAGCUUCCAUUGCGGACACCAUAAUCACCAUUAUCGAGGAUAAUCCUGAAGCUAAAGAAUCGGGUUUGGCUCAUCUGUGCGAGUUUAUUGAAGAUUGCGAACACGUUUCUUUAGCUGUUAGAAUAUUGCAUCUGCUUGGUAGAGA（SEQ ID NO：6）
靶点4：黄曲条跳甲双链核糖核酸酶 dsRNase（Double-stranded Ribonuclease,dsRNase）
正义链（476 bp）：
GAUGGAUGAAUUGUACAACAACGAUGUCCAACGGCAAACUAUUAACAGGCAAUUGGGUUUACCUGAAGAAGAUACUAGUUACGUUAAACCGCAUGGUACGCGUUAUUUAGCUAGAGGUCAUUUAACAGCCAAAGCGGAUUUCAUGUACAAUGCUGAACAGCAAGCCACUUUUCACUACAUUAACUCGGCGCCACAAUGGCAAUCUUUCAAUGCACGCAACUGGUUUUACUUGGAGAGAAACCUCAGGAAUUUCGUUGCCGAGAAAUACAUCGACGUACUAGUGUACACAGGAACUUACGGAGCAUUAACUCUACCUCACGCAUCAACCGGCGAGGAGACGGACGUUUACUUCUACUUCGACUCGAACGGUGAAAGGUUCGUUCCAAUUCCGGAGCUGUUCUGGAAAGUGGCCUACGAUCCGGUCCAUAGAGCAGGUGUAGCGGUAAUCGGAUUGAAUAAUCCCUAUCAAACAGACA（SEQ ID NO：7）
反义链（476 bp）：
UGUCUGUUUGAUAGGGAUUAUUCAAUCCGAUUACCGCUACACCUGCUCUAUGGACCGGAUCGUAGGCCACUUUCCAGAACAGCUCCGGAAUUGGAACGAACCUUUCACCGUUCGAGUCGAAGUAGAAGUAAACGUCCGUCUCCUCGCCGGUUGAUGCGUGAGGUAGAGUUAAUGCUCCGUAAGUUCCUGUGUACACUAGUACGUCGAUGUAUUUCUCGGCAACGAAAUUCCUGAGGUUUCUCUCCAAGUAAAACCAGUUGCGUGCAUUGAAAGAUUGCCAUUGUGGCGCCGAGUUAAUGUAGUGAAAAGUGGCUUGCUGUUCAGCAUUGUACAUGAAAUCCGCUUUGGCUGUUAAAUGACCUCUAGCUAAAUAACGCGUACCAUGCGGUUUAACGUAACUAGUAUCUUCUUCAGGUAAACCCAAUUGCCUGUUAAUAGUUUGCCGUUGGACAUCGUUGUUGUACAAUUCAUCCAUC（SEQ ID NO：8）
GFP（后续用作对照，黄曲条跳甲不含相关基因）
正义链（416 bp）：
AAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCACGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGCGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAA（SEQ ID NO：19）
反义链（416 bp）：
UUCACCUUGAUGCCGUUCUUCUGCUUGUCGGCCAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUGUAGUUGUACUCCAGCUUGUGCCCCAGGAUGUUGCCGUCCUCCUUGAAGUCGAUGCCCUUCAGCUCGAUGCGGUUCACCAGGGUGUCGCCCUCGAACUUCACCUCGGCGCGGGUCUUGUAGUUGCCGUCGUCCUUGAAGAAGAUGGUGCGCUCCUGGACGUAGCCUUCGGGCAUGGCGGACUUGAAGAAGUCGUGCUGCUUCAUGUGGUCGGGGUAGCGGCUGAAGCGCUGCACGCCGUAGGUCAGGGUGGUCACGUGGGUGGGCCAGGGCACGGGCAGCUUGCCGGUGGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCGUAGGUGGCAUCGCCCUCGCCCUCGCCGGACACGCUGAACUU（SEQ ID NO：20）
实施例2：干扰用dsRNA合成
单靶基因片段的扩增
使用Snap Gene 17.0 软件设计跳甲靶标扩增引物，在5’端添加T7启动子序列，得到如表1所示的各引物序列（T7启动子序列用小写字母表示）。
提取黄曲条跳甲总RNA，反转录获得cDNA，再以cDNA为模板，按照表2的程序进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后纯化回收。
表1：dsCOPⅠ-γ、dsCOPⅠ-ARF1和dsRNase扩增引物
表2： PCR扩增程序
双靶基因片段的扩增
使用Snap Gene 17.0 软件设计跳甲靶标扩增引物，在5’端添加T7 启动子序列（taatacgactcactatagg），得到如表3所示的各引物序列。
提取黄曲条跳甲总RNA，反转录获得 cDNA，再以 cDNA 为模板，按照表2的程序进行PCR 扩增，扩增流程如图1所示，PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后纯化回收。
表3：dsCOPⅠ-γ&ARF1扩增引物
体外转录合成dsRNA
以纯化后的PCR产物作为模板，使用体外转录试剂盒进行体外转录合成dsRNA，dsRNA合成溶液体系成分如表4所配制。
PCR产物于37℃保温2h后加入50µL DNaseI，于37℃消化1h。DNaseI消化完成后，再加入10µL蛋白酶K消化30min。蛋白酶K消化完成后，使用100kD默克超滤管将dsRNA置换至水中，得到包括四种靶标dsRNA以及对照dsRNA（即dsGFP，靶向GFP的dsRNA）的溶液，各dsRNA序列如实施例1所示。采用Nanodrop测定各dsRNA样品浓度，并采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
电泳结果如图2所示（“M“代表Marker；“1”代表dsCOPⅠ-γ；“2”代表dsCOPⅠ-ARF1；“3”代表dsCOPⅠ-γ&ARF1；“4”代表dsRNase；“5”代表dsGFP），5个样品的条带长度均接近于500 bp，但略小于500 bp，可见回收得到的正确条带长度的dsRNA。
表4：dsRNA合成溶液体系成分
实施例3：单靶标dsRNA显微注射
通过显微注射技术可以将提前制备的 dsRNA或者 siRNA 溶液，使用显微注射仪器直接导入到成虫、蛹、幼虫或者胚胎中，以此可以将样品直接导入昆虫的细胞和血淋巴等。
选取新羽化的黄曲条跳甲成虫（日龄<12 h）用于试验。将实施例2中得到的各dsRNA溶液上样于显微注射仪中，向试虫腹部注射，每头跳甲注射200 nL dsRNA，浓度为500ng/µL。在注射后第5天，各组收集3头跳甲作为一个样本，对于每个样本各做3个平行重复。将收集到的跳甲样本快速置于液氮中的离心管中，并保存于-80 ℃冰箱。
按注射的靶标dsRNA不同，分为dsCOPⅠ-γ组，dsCOPⅠ-ARF1组，dsCOPⅠ-γ& ARF1组和dsRNase组；另设阴性对照组，以注射相同浓度和体积的dsGFP溶液代替注射靶标dsRNA溶液。
提取黄曲条跳甲样本的RNA，并反转录为cDNA。以黄曲条跳甲的Actin基因作为内参基因，通过RT-qPCR检测目的基因（COPⅠ-γ，COPⅠ-ARF1和dsRNase）的mRNA表达水平。目的基因和内参基因的qPCR引物序列如表5所示。
表5：黄曲条跳甲qPCR引物
显微注射结果显示，相比对照组而言，四种靶标的dsRNA对跳甲均有显著防效（图3，P＜0.05）。在注射处理后第5天，跳甲的死亡率显著上升，分别为46.4%（dsCOPⅠ-ARF1组），41.3%（dsCOPⅠ-γ组），42.8%（dsCOPⅠ-γ&ARF1组），25%（dsRNase组）；注射后第9天，dsCOPⅠ-ARF1组的死亡率达到 86.1%, dsCOPⅠ-γ组的死亡率达到74.2%，dsCOPⅠ-γ&ARF1组的死亡率达到 83%；注射后第11天，dsCOPⅠ-γ组的死亡率达到 93.5%，dsCOPⅠ-ARF1组的死亡率达到 100%，dsCOPⅠ-γ&ARF1组死亡率达到 100%，dsRNase组死亡率达到68%。
RT-qPCR结果（图4，***表示经T检验差异显著P<0.05）显示，在显微注射后5天，三种单靶目的基因（COPⅠ-γ、COPⅠ-ARF1、dsRNase）mRNA水平的表达量均有显著下调，其中dsCOPⅠ-γ组的目的基因COPⅠ-γ的表达量下调了70.1%（图4，A）；dsCOPⅠ-ARF1组的目的基因COPⅠ-ARF1的表达量下调了83.3%（图4，B）；dsRNase组的目的基因dsRNase的表达量下调了80.1%（图4，C）。
上述结果表明，通过显微注射技术将dsRNA直接注射到跳甲成虫体内，能够通过诱发RNAi，以高致死率有效防控跳甲。
实施例4：黄曲条跳甲成虫室内生测试验
为了进一步验证dsRNA的干扰效果，将实施例2得到的dsRNA母药（dsCOPⅠ-γ、dsCOPⅠ-ARF1、dsCOPⅠ-γ&ARF1和dsRNase），使用无菌水分别配制成500mg/L浓度的溶液。再将dsRNase与其他3个靶标RNA复配。按溶液中dsRNA的不同，分为dsCOPⅠ-γ组，dsCOPⅠ-ARF1组，dsCOPⅠ-γ&ARF1组，dsRNase组，dsCOPⅠ-γ+dsRNase组，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase组和dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase组，其中，复配组（dsCOPⅠ-γ+dsRNase组，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase组和dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase组）中dsRNA的总浓度为500mg/L，各组中单种dsRNA的浓度为250mg/L；另外，以500mg/L的dsGFP溶液作为阴性对照。
取新鲜甘蓝叶片，用清水简单冲洗后制成直径5cm叶盘晾干。用浸叶法处理叶盘，即叶盘分别用各组dsRNA溶液或各对照组的溶液浸泡，全面浸泡4s后取出，置于阴凉通风处自然晾干，用于饲喂跳甲。
采用室内饲养的健康活跃跳甲，每组取15头，放入预先放置有浸叶法处理的叶盘的塑料广口瓶中，并用橡皮筋和透气纱网封口，置于25±2℃、光暗交替各12小时植物培养架上培养，以此作为一个样本。对于每个样本各做4个平行重复。
致死效果测定
于开始上述培养后的第1、3、5、7、9、11天，分别调查跳甲存活率。死亡标准为：将试虫置于培养皿中，轻触虫体后，若观察到10秒内无任何动静或其他反应则视为死亡；存活率（%）= 存活虫数/总虫数×100%；死亡率（%）=（1-存活虫数/总虫数）×100%。
如图5所示，在开始培养后第1天，除dsRNase组外，各dsRNA组的死亡率显著高于阴性对照组（dsGFP组）；在开始培养后第3天起，包括dsRNase组的各dsRNA组的死亡率显著高于阴性对照组（dsGFP组）；在开始培养后第11天，各单用组（dsCOPⅠ-γ组，dsCOPⅠ-ARF1组，dsCOPⅠ-γ&ARF1组，dsRNase组）的死亡率从大到小依次为，dsCOPⅠ-γ&ARF1组96.7%（图5，C），dsCOPⅠ-ARF1组89.3%（图5，B），dsCOPⅠ-γ组 86.7%（图5，A），dsRNase组53.3%（图5，A～C）。
值得注意的是，在开始培养后的第1～11天内，在达到最高的死亡率之前，各复配组（dsCOPⅠ-γ+dsRNase组，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase组和dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase组）的死亡率基本显著高于各dsRNA单用组（dsCOPⅠ-γ组，dsCOPⅠ-ARF1组，dsCOPⅠ-γ&ARF1组和dsRNase组）。结果表明，与dsRNase复配后，各dsRNA对黄曲条跳甲的致死率提高，达到相同致死率的作用时间显著减少。
目的基因表达抑制效果测定
于开始上述培养后的第5天，参照实施例3的方法，通过RT-qPCR测定目的基因（COPⅠ-γ和COPⅠ-ARF1）的mRNA表达水平。试验结果数据采用Prism10软件进行ANOVA检验统计分析，采用多重比较分析组间显著性。
如图6所示，相比于阴性对照组（dsGFP组），其他组的COPⅠ-γ基因或COPⅠ-ARF1基因的表达水平均显著下降。此外，各复配组（dsCOPⅠ-γ+dsRNase组，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase组和dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase组）的COPⅠ-γ基因表达水平或COPⅠ-ARF1表达水平显著低于各dsRNA单用组（dsCOPⅠ-γ组，dsCOPⅠ-ARF1组和dsCOPⅠ-γ&ARF1组）。结果表明，与dsRNase复配后，各靶标dsRNA对目标基因的沉默效率显著提高。
由以上室内生测的结果可以看出，靶向单靶的dsCOPⅠ-γ和dsCOPⅠ-ARF1以及靶向双靶的dsCOPⅠ-γ&ARF1均能显著降低目的基因的表达，并有效致死黄曲条跳甲，其中靶向双靶的dsCOPⅠ-γ&ARF1的效果相对最好。这三种靶标dsRNA与dsRNase进一步复配后，对目的基因表达的抑制效果以及对黄曲条跳甲的致死率得到显著提升。可见，COPⅠ-ARF1和COPⅠ-γ是用于跳甲防控的有效靶标。
实施例5：田间防治黄曲条跳甲成虫试验
试验地和分组：试验地设在上海市浦东新区硅羿科技蔬菜基地，试验地常年种植菜心Brassica rapa var. chinensis (L.) Kitam，种植行间距20 cm，株间距15 cm。部分试验地的如图7所规划，试验地设有数个试验区，试验区周围设有保护行和水渠；每个试验区含三个小区，小区面积为48 m2，共有27个小区。试验时黄曲条跳甲发生为害较严重。试验小区的土地平整后成畦，排灌方便，土质为沙壤。试验根据如表6所示的方案分为9组，每组对应到1个区。
表6：黄曲条跳甲成虫田间防治分组
农药组合物的制备：将实施例2得到的dsCOPⅠ-γ、dsCOPⅠ-ARF1、dsCOPⅠ-γ&ARF1和dsRNase分别用无菌水稀释成500mg/L药液，再将dsRNase与其他3个靶标RNA复配。按溶液中dsRNA的不同，分为dsCOPⅠ-γ组，dsCOPⅠ-ARF1组，dsCOPⅠ-γ&ARF1组，dsRNase组，dsCOPⅠ-γ+dsRNase组，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase组和dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase组，其中，复配组（dsCOPⅠ-γ+dsRNase组，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase组和dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase组）中dsRNA的总浓度为500mg/L，各组中单种dsRNA的浓度为250mg/L；另外，以500mg/L的dsGFP溶液作为阴性对照。用无菌水将哒螨灵稀释成500mg/L浓度的药液作为阳性对照，用无菌水将dsGFP稀释成500mg/L浓度的药液作为阴性对照。最后，于上述各稀释后的药液加入0.1%（w/v）的吐温-20，制备得到各农药组合物。
在观察到黄曲条跳甲成虫为害时，用3WBD-16L背负式电动喷雾器进行第1次施药，3天后进行第2次施药，每次施药记录施药次数和施药日期。试验期间不施用防治其它病虫害的任何农药。施药时应先在各dsRNA的试验区四周喷对应制剂的药带。药带和水渠均可将跳甲限定在所属方形试验区内，防止其逃逸。第1次给药处理7天后，每小区根据五点取样法，每点随机选取5株植物，调查活成虫数，以统计各组相对于阴性对照组的成虫减退率。试验结果数据采用Prism10软件进行ANOVA检验统计分析，采用多重比较分析组间显著性。
田间防治试验的统计结果如图8所示，不同组的成虫减退率存在显著差异（P＜0.05）。阴性对照dsGFP组成虫减退率仅为（5.2±1.1）%，表明其对跳甲无显著干扰作用；阳性对照哒螨灵组减退率达（81.3±2.5）%（标注B），证实了传统化学药剂的杀虫效力。单靶组中，dsCOPI-γ组减退率为（62.1±3.4）%（标注D），dsCOPⅠ-ARF1组为（68.7±2.9）%（标注CD），dsRNase组减退率为（43.6±2.7）%（标注E），可见靶向COPI-γ、COPⅠ-ARF1或dsRNase的dsRNA均具有显著的黄曲条跳甲防治作用。双靶组效果更优，dsCOPI-γ&ARF1组减退率达（86.5±2.1）%（标注AB）；复配组中，dsCOPI-γ&ARF1+dsRNase组的减退率达（92.4±1.8）%（标注A），为各组最高值。
综上所述，dsGFP组的低减退率验证了实验体系中阴性对照的有效性，排除非特异性干扰影响。哒螨灵作为阳性对照，其高减退率为证实基因干扰手段提供效果参照。本发明的针对三种靶标（COPI-γ，COPⅠ-ARF1和dsRNase）的dsRNA均有优异的跳甲防治效果，同时又具备dsRNA农药的安全性和易降解性，能够有效克服现有化学农药高毒、高残留的问题。其中，双靶组的dsCOPⅠ-γ&ARF1方案以及复配组中的dsCOPⅠ-γ+dsRNase，dsCOPⅠ-ARF1+dsRNase，dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase三种方案的防治效果均接近于相同浓度（500mg/L）的传统化学农药哒螨灵，其中特别地，dsCOPⅠ-γ&ARF1+dsRNase方案的效果最好，且优于哒螨灵。

Claims (10)

1.针对鞘翅目昆虫的dsRNA，其特征在于，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的反义链。
2.一种制备如权利要求1所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：提取鞘翅目昆虫的总RNA；
S2：由总RNA反转录得到cDNA；
S3：以cDNA为模板，经PCR扩增得到dsRNA。
3.一种农药组合物，其特征在于，所述农药组合物包括如权利要求1所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA，以及农药可接受的稀释剂，载体或促溶剂。
4.如权利要求3所述的农药组合物，其特征在于，所述农药组合物还包括靶向鞘翅目昆虫的dsRNase基因的dsRNA。
5.如权利要求3所述的农药组合物，其特征在于，所述靶向鞘翅目昆虫的dsRNase基因的dsRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的正义链，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示的反义链。
6.如权利要求3所述的农药组合物，其特征在于，所述农药组合物中针对鞘翅目昆虫的dsRNA的浓度为1～5000 mg/L。
7.如权利要求1所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA在防治鞘翅目昆虫中的用途，其特征在于，所述针对鞘翅目昆虫的dsRNA用于杀害鞘翅目昆虫或抑制鞘翅目昆虫生长。
8.如权利要求3-6中任一项所述的农药组合物在防治鞘翅目昆虫中的用途，其特征在于，所述农药组合物用于杀害鞘翅目昆虫或抑制鞘翅目昆虫生长。
9.一种防治鞘翅目昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1所述的针对鞘翅目昆虫的dsRNA。
10.一种防治鞘翅目昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求3-6中任一项所述的农药组合物。
CN202510486667.5A 2025-04-18 2025-04-18 针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途 Pending CN120026027A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510486667.5A CN120026027A (zh) 2025-04-18 2025-04-18 针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202510486667.5A CN120026027A (zh) 2025-04-18 2025-04-18 针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN120026027A true CN120026027A (zh) 2025-05-23

Family

ID=95737701

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202510486667.5A Pending CN120026027A (zh) 2025-04-18 2025-04-18 针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN120026027A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121137074A (zh) * 2025-11-14 2025-12-16 中国农业科学院草原研究所 一种采用树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒增强鳞翅目昆虫RNAi效率的方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107148478A (zh) * 2014-10-13 2017-09-08 美国陶氏益农公司 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体gamma亚单位核酸分子

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107148478A (zh) * 2014-10-13 2017-09-08 美国陶氏益农公司 赋予鞘翅目和半翅目害虫抗性的copi外被体gamma亚单位核酸分子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION NO.OU900098: ""Phyllotreta striolata genome assembly, chromosome:5"", 《GENBANK DATABASE》, 16 June 2022 (2022-06-16), pages 1 - 4 *
ACCESSION NO.OU900101: """Phyllotreta striolata genome assembly, chromosome:8""", 《GENBANK DATABASE》, 16 June 2022 (2022-06-16), pages 1 - 3 *
MUJUAN GUO等: ""RNAi assays in the striped flea beetle (Phyllotreta striolata) suggest Psγ-COPI and PsArf1COPI as potential molecular targets for pest control"", 《PESTICIDE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY》, 23 April 2023 (2023-04-23), pages 1 - 9 *
PENG, YC等: ""Identification of a double-stranded RNA-degrading nuclease influencing both ingestion and injection RNA interference efficiency in the red flour beetle Tribolium castaneum"", 《INSECT BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY》, 1 October 2020 (2020-10-01), pages 1 - 36 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN121137074A (zh) * 2025-11-14 2025-12-16 中国农业科学院草原研究所 一种采用树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒增强鳞翅目昆虫RNAi效率的方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. A promising approach to an environmentally friendly pest management solution: nanocarrier-delivered dsRNA towards controlling the destructive invasive pest Tuta absoluta
CA2927427C (fr) Micropeptides et leur utilisation pour moduler l&#39;expression de genes
CN113106108B (zh) 一种增强生防菌杀灭白蚁效果的双链核酸Dicer-1 dsRNA
CN120026027A (zh) 针对鞘翅目昆虫的dsRNA及其农药组合物和用途
US20230034423A1 (en) Methods of multi-species insect pest control
CN109852617B (zh) 一种豌豆蚜海藻糖酶基因的rna干扰序列的制备方法及应用
CN120700003B (zh) 用于防治槟榔黄化病的dsRNA纳米化制剂及其制备方法和应用
CN120365399B (zh) 点蜂缘蝽唾液蛋白rp402及其作为靶点在防治大豆症青中的应用
JP2009263362A (ja) 二本鎖ｒｎａを用いた害虫駆除剤
US10781447B2 (en) Transgenic microalgae and use thereof as a feed for delivery of interfering RNA molecules
Das et al. The role of polyplexes in developing a green sustainable approach in agriculture
CN104754945A (zh) 用于抑制和/或其控制生物系统生长的含有寄生性、致病性或侵染性的生物系统的核酸的组合物及其制备方法
KR20240103105A (ko) vATPase를 표적으로 하는 꽃노랑총채벌레 방제용 조성물 및 이를 이용한 꽃노랑총채벌레의 방제방법
JP2015524436A5 (zh)
CN118497206B (zh) 防治橘小实蝇的dsRNA及农药复合物
CN113621620A (zh) 具有调控小菜蛾免疫功能的基因及其制备方法和应用
Zhang et al. Imidazole-modified graphene quantum dots can effectively promote the efficient silencing of the larval cuticle protein gene HaLCP17 in Helicoverpa armigera.
CN113881679B (zh) 一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物
CN110592044A (zh) 蛋白激酶Fused编码基因及其在防治小菜蛾中的应用
CN113100235B (zh) 一种提高dsRNA杀虫效果的配方
CN105838727B (zh) 用于控制昆虫侵袭的核苷酸序列及其方法
Hunter et al. Invention of RNAi Biopesticides to Psyllid Vectors and Bacterial Pathogens of Citrus: Future Technologies for Gene Targeting
US11505805B2 (en) Polynucleotide and method for controlling insect invasion
CA3102041C (en) Polynucleotide and method for controlling insect invasion
Lü Environmental Science

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination