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CN120019076A - 用于靶向溶酶体降解的组合物及其使用方法 - Google Patents

用于靶向溶酶体降解的组合物及其使用方法 Download PDF

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CN120019076A
CN120019076A CN202380069681.4A CN202380069681A CN120019076A CN 120019076 A CN120019076 A CN 120019076A CN 202380069681 A CN202380069681 A CN 202380069681A CN 120019076 A CN120019076 A CN 120019076A
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cancer
seq
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target protein
egfr
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CN202380069681.4A
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Pine Tree Treatment Co
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Abstract

本公开提供了基于双特异性结合分子的降解剂的组合物，该降解剂经由溶酶体途径降解靶蛋白，比如癌细胞上的蛋白。所述双特异性结合分子特异性地与感兴趣的靶蛋白和与神经纤毛蛋白‑1(NRP1)结合。本公开还提供了使用所述基于双特异性结合分子的降解剂的方法，比如增强癌症治疗的治疗功效。

Description

用于靶向溶酶体降解的组合物及其使用方法
相关申请
本申请要求2022年7月30日递交的美国临时申请号63/369,948和2022年11月7日递交的美国临时申请号63/423,454的优先权，其两者的全部内容特此通过参考结合。
背景技术
蛋白降解调节细胞稳态的许多方面。内源性蛋白降解机制已重新编程，以通过一种称为靶向蛋白降解的方法消除各种细胞内底物。靶向蛋白降解(TPD)已成为一种优于常规抑制的有前途的治疗策略。与抑制剂不同，降解剂可实现蛋白水平的催化和持久敲低。蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)由两个部分组成，它们结合靶标和泛素连接酶(E3)，由柔性接头分隔。然而，由于其细胞内机制作用，PROTAC限于靶向细胞内蛋白。
已经开发了溶酶体降解平台，比如细胞因子受体靶向嵌合体(KineTac)和溶酶体靶向嵌合体(LYTAC)，其使用E3/USP消除致病蛋白。KineTacs平台为基因编码的双特异性抗体，由结合其同源细胞因子受体的细胞因子臂和用于感兴趣蛋白的靶标结合部分组成。然而，KineTac限于应用于T细胞上的细胞因子受体，并且如果靶蛋白也存在于T细胞上，则可降解靶蛋白。由抗体-聚糖缀合物组成的LYTAC平台通过将靶蛋白穿梭到溶酶体进行降解来降解细胞表面和细胞外蛋白。因此，本领域需要用于溶酶体降解平台的另外方法。
发明内容
本公开涉及新型和独特的双特异性结合分子，该分子由完全重组的双特异性结合结构域组成，该结构域利用神经纤毛蛋白-1(NRP1)介导的内化来靶向各种治疗相关的靶蛋白，特别是细胞表面受体，比如受体酪氨酸激酶(RTK)，以用于溶酶体降解。因此，本公开提供一种基于双特异性结合分子的降解剂，该降解剂降解靶蛋白，比如癌细胞上的靶蛋白。双特异性结合分子特异性地与感兴趣的靶蛋白和神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合。本公开进一步地涉及使用NRP1依赖性双特异性结合分子的方法，该分子通过溶酶体降解途径诱导靶蛋白的降解。本公开提供使用双特异性结合分子抑制肿瘤生长的方法，例如增强癌症治疗的治疗功效。
本公开涉及一种双特异性结合分子，该结合分子包含靶蛋白结合结构域和神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合结构域，该结合结构域为抗体或其NRP-1结合片段。在一些实施方案中，双特异性结合分子包含特异性地与其同源蛋白受体结合的靶蛋白结合结构域和与其同源受体结合的NRP1结合结构域。在一些实施方案中，靶蛋白和NRP1为膜相关的。在一些实施方案中，双特异性结合分子与NRP1的结合导致与双特异性结合分子结合的靶蛋白内化。在一些实施方案中，双特异性结合分子与NRP1的结合随后诱导靶蛋白的溶酶体降解。
在某些实施方案中，双特异性分子的靶蛋白结合结构域与受体酪氨酸激酶(RTI)结合。因此，在一个方面，本公开涉及一种双特异性结合分子，其包含：
(a)特异性地与受体酪氨酸激酶(RTK)结合的靶蛋白结合结构域；和
(b)与NRP1结合的神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合结构域，该结构域包含抗体或其NRP-1结合片段，
其中双特异性结合分子与靶蛋白和与NRP1的结合导致靶细胞中靶蛋白的溶酶体降解。
在一个实施方案中，RTK为EGFR。在另一个实施方案中，RTK不是表皮生长因子受体(EGFR)(即靶蛋白为RTK，条件是RTK不是EGFR)。
在其他实施方案中，RTK选自EGFR家族受体、HER家族受体、胰岛素生长因子受体(IGFR)、Met受体酪氨酸激酶(MET)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和血管内皮生长因子(VEGFR)。
在一个实施方案中，受体酪氨酸激酶为cMET。在一个实施方案中，受体酪氨酸激酶为HER2。在一个实施方案中，受体酪氨酸激酶为IGF1R。
在一个实施方案中，靶细胞为癌细胞。在实施方案中，癌细胞选自肺癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌。在一个实施方案中，癌细胞为非小细胞肺癌(NSCLC)细胞。
在实施方案中，靶蛋白结合结构域和NRP1结合结构域各自独立地选自IgG、半抗体、单结构域抗体、纳米抗体、Fab、单特异性Fab2、Fc、scFv、微型抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VHH结构域、骆驼科抗体和肽体。
在一个实施方案中，NRP1结合结构域
包含：
(i)包含CDR1、CDR2和CDR3区(分别是HCDR1、HCDR2和HCDR3)的抗体重链可变(VH)结构域，其中HCDR1由SEQ ID NO:79中所示的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:80中所示的序列组成，和HCDR3由SEQ ID NO:81-84中任何一项所示的序列组成；和
(ii)包含CDR1、CDR2和CDR3区(分别是LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗体轻链可变(VL)结构域，其中LCDR1由SEQ ID NO:85-87中任何一项所示的序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:88中所示的序列组成，和LCDR3由SEQ ID NO:89中所示的序列组成。
在一个实施方案中，
(i)HCDR1由SEQ ID NO:79中所示的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:80中所示的序列组成，和HCDR3由SEQ ID NO:84中任何一项所示的序列组成；和
(ii)LCDR1由SEQ ID NO:85中所示的序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:88中所示的序列组成，和LCDR3由SEQ ID NO:89中所示的序列组成。
在其他方面中，本公开涉及编码本公开的双特异性结合分子的核酸、包含本公开核酸的表达载体以及包含本公开核酸(例如表达载体)的能够进行蛋白表达的细胞。
在另一个方面，本公开涉及本公开的双特异性结合分子在制造用于在受试者中治疗癌症的药物中的用途。
在另一个方面，本公开涉及在细胞中诱导靶蛋白的溶酶体降解的方法，该方法包括使细胞与本公开的双特异性结合分子接触，使得在细胞中诱导靶蛋白的溶酶体降解。在实施方案中，细胞包含靶蛋白中的一种或多种突变和/或过表达靶蛋白。在实施方案中，细胞对靶蛋白的抑制剂的反应性具有抗性或难治性。
在一个实施方案中，靶蛋白为EGFR。在一个实施方案中，靶蛋白为RTK而非EGFR。在一个实施方案中，靶蛋白为cMET。在一个实施方案中，靶蛋白为HER2。在一个实施方案中，靶蛋白为IGF1R。
在另一个方面，本公开涉及在具有肿瘤的受试者中抑制肿瘤生长的方法，该方法包括给予受试者本公开的双特异性结合分子，使得肿瘤在受试者中的生长受到抑制。在实施方案中，肿瘤包含靶蛋白中的一种或多种突变和/或过表达靶蛋白。在实施方案中，肿瘤对靶蛋白的抑制剂的反应性具有抗性或难治性。
在一个实施方案中，靶蛋白为EGFR。在一个实施方案中，靶蛋白为RTK而非EGFR。在一个实施方案中，靶蛋白为cMET。在一个实施方案中，靶蛋白为HER2。在一个实施方案中，靶蛋白为IGF1R。
在实施方案中，双特异性结合分子静脉内、腹膜内、鞘内、脑室内或脑实质内给予。
本公开涉及一种双特异性结合分子，该分子包含特异性地与靶蛋白结合的靶蛋白结合结构域和与NRP1结合的神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合结构域。在一些实施方案中，靶蛋白和NRP1为膜相关的。在一些实施方案中，靶蛋白为细胞表面受体蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白为跨膜蛋白。
在一些实施方案中，靶蛋白包括受体酪氨酸激酶(RTK)。在一些实施方案中，酪氨酸激酶包括表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、受体酪氨酸激酶Met(MET)和受体血管内皮生长因子(VEGFR)。
在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶包括EGFR/HER1/Erb1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、MET、RON、PDGFR、PDGFRα、PDGFRβ、CSF-1R、Kit、FLT-3、VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。
在一些实施方案中，靶蛋白包括EGFR。在一些实施方案中，EGFR选自EGFR/HER1/Erb1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3和HER4/ErbB4。在一些实施方案中，靶蛋白为EGFR。
在一些实施方案中，靶蛋白包括FGFR。在一些实施方案中，FGFR1选自FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。
在一些实施方案中，靶蛋白包括受体酪氨酸激酶MET。在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶MET为MET或巨噬细胞-刺激蛋白受体(MST1R/RON)。
在一些实施方案中，靶蛋白包括PDGFR。在一些实施方案中，PDGFR选自PDGFR、PDGFRα、PDGFRβ、CSF-1R、Kit和FLT-3。
在一些实施方案中，靶蛋白包括VEGFR。在一些实施方案中，VEGFR选自VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。
在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶选自EGFR/HER1/Erb1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4 VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。
在一些实施方案中，靶蛋白包括受体丝氨酸/苏氨酸激酶(RSTK)、G蛋白偶联受体(GPCR)、免疫检查点受体和离子通道受体。
在一些实施方案中，靶蛋白包括受体丝氨酸/苏氨酸激酶(RSTK)。在一些实施方案中，RSTK包括ACVRL1、ACVR1、ACVR1B、ACVR1C、BMPR1A、BMPR1B、TGFBR1、ACVR2A、ACVR2B、AMHR2、BMPR2和TGFBR2。
在一些实施方案中，靶蛋白包括G蛋白偶联受体(GPCR)。在一些实施方案中，GPCR选自CXCR4、CCR5、FFAR2、GLP2R、5-HT1A受体、5-HT2A受体、5-HT4受体、5-HT5A受体、M1受体、M2受体、A1受体、A2A受体、α1A-肾上腺素能受体、α2A-肾上腺素能受体、β1-肾上腺素能受体、β3-肾上腺素能受体、AT1受体、BB1受体、B1受体、CB1受体、CB2受体、趋化素受体1、CCR1、CX3CR1、ACKR3、CCK1受体、GPR3、GPR12、GPR17、GPR32和GPR35。
在一些实施方案中，靶蛋白包括免疫检查点受体。在一些实施方案中，免疫检查点受体选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA、SIGEC7和PD-L1。
在一些实施方案中，靶蛋白包括离子通道受体。在一些实施方案中，离子通道受体选自KCa1.1、KCa2.1、CatSper1、TPC1、CNGA1、HCN1、Kir1.1、Kir3.2、RyR1、TRPA1、TRPC3、TRPM1、TRPP1、TRPV1、K2P1.1、K2P10.1、Cav1.1、Cav2.1、Kv1.1、Kv1.8、Kv11.2、Hv1、Nav1.1和Nav1.2。
在一些实施方案中，靶蛋白包括膜相关靶蛋白，其中双特异性结合分子的靶蛋白结合结构域与细胞表面受体结合。在一些实施方案中，双特异性结合分子的靶蛋白结合结构域与膜相关靶蛋白的细胞外表位结合。在一些实施方案中，靶细胞包括肿瘤细胞。在一些实施方案中，靶细胞为癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞选自肺癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌。在一些实施方案中，靶细胞包括免疫细胞。
在一些实施方案中，靶蛋白结合结构域和NRP1结合结构域各自独立地选自IgG、半抗体、单结构域抗体、纳米抗体、Fab、单特异性Fab2、Fc、scFv、微型抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VHH结构域、骆驼科抗体和肽体。
在一些实施方案中，靶蛋白结合结构域和NRP1结合结构域一起形成双特异性结合分子、双特异性双体抗体、双特异性Fab2、双特异性骆驼科抗体或双特异性肽体scFv-Fc、双特异性IgG、杵臼双特异性IgG、Fc-Fab和杵臼双特异性Fc-Fab、细胞因子-IgG融合物、细胞因子-Fab融合物和细胞因子-Fc-scFv融合物。在一些实施方案中，靶蛋白结合结构域包括Fc-Fab和NRP1结合结构域包括Fc-融合物。在另一个实施方案中，双特异性结合分子为免疫球蛋白G1(IgG1)或其变体。在另一个实施方案中，IgG1为人类IgG1或其变体。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含：含有通过肽接头与第一单链可变片段(scFv)融合以产生第一重链融合多肽的第一重链以及通过肽接头与第二scFv融合以产生第二重链融合多肽的第二重链的两条相同的重链多肽，其中第一和第二scFv相同；以及含有第一轻链和第二轻链的两条相同的轻链，其中每个重链融合多肽序列为SEQ ID NO:1-11或39中的任何一项和轻链多肽序列为SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，重链融合多肽序列为SEQ ID NO:11和轻链多肽为SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ IDNO:13中所示的氨基酸序列(GGGGS)n，其中n各自独立地为1-20之间的整数。在一些实施方案中，本公开进一步提供编码SEQ ID NO:15-24或40中任何一项所示的各重链融合多肽和SEQ ID NO:25中所示的轻链多肽的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，双特异性结合分子包含：(a)含有通过肽接头与第一单链可变片段(scFv)融合以产生第一重链融合多肽的第一重链以及通过肽接头与第二scFv融合以产生第二重链融合多肽的第二重链的两条相同的重链多肽，其中第一和第二scFv相同；和(b)含有第一轻链和第二轻链的两条相同的轻链，其中(i)重链融合多肽包含可变重链(VH)、恒定重链1(CH1)、CH2、CH3和含有位于CH3的C-末端的NRP1结合结构域的短链可变片段(scFv)；和(ii)轻链多肽包含可变轻链(VL)和恒定轻链(CL)，其中重链融合多肽和轻链多肽的VL和VH包含与靶蛋白结合的靶蛋白结合结构域和含有与NRP1结合的NRP1结合结构域的scFv。
在一些实施方案中，双特异性结合分子的NRP1结合结构域包含：
(i)含有CDR1、CDR2和CDR3区(分别是HCDR1、HCDR2和HCDR3)的抗体重链可变(VH)结构域，其中HCDR1由SEQ ID NO:79中所示的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:80中所示的序列组成，和HCDR3由SEQ ID NO:81-84中任何一项所示的序列组成；和
(ii)含有CDR1、CDR2和CDR3区(分别是LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗体轻链可变(VL)结构域，其中LCDR1由SEQ ID NO:85-87中任何一项所示的序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:88中所示的序列组成，和LCDR3由SEQ ID NO:89中所示的序列组成。
在另一个实施方案中，
(iii)HCDR1由SEQ ID NO:79中所示的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:80中所示的序列组成，和HCDR3由SEQ ID NO:84中任何一项所示的序列组成；和
(iv)LCDR1由SEQ ID NO:85中所示的序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:88中所示的序列组成，和LCDR3由SEQ ID NO:89中所示的序列组成。
在一些实施方案中，靶蛋白的双特异性结合分子的结合亲和力(KD)<0.1nM。在一些实施方案中，NRP1的双特异性结合分子的结合亲和力(KD)在0.1nM-100nM之间的范围内。在一些实施方案中，靶蛋白的结合抗体的结合亲和力(KD)为双特异性结合分子对NRP1的结合亲和力(KD)的至少2、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或多于100倍大。
在一些实施方案中，双特异性结合分子(双特异性抗体)为抗体-药物缀合物(ADC)的一部分，其中双特异性结合分子经由接头与药物缀合。本文提供了用于ADC化合物的合适药物的非限制性实例。
在一些实施方案中，EGFRxNRP1双特异性抗体抑制HUVEC细胞中VEGF介导的VEGFR2磷酸化。在一些实施方案中，双特异性结合分子与靶蛋白和NRP1的结合在体外诱导EGFRT790M/L858的强烈降解。在一些实施方案中，靶蛋白的降解导致靶细胞增殖的抑制。在一些实施方案中，EGFRxNRP1双特异性抗体降低体外细胞活力。
在一些实施方案中，双特异性结合分子减少奥希替尼敏感的异种移植小鼠模型中的肿瘤体积。在一些实施方案中，双特异性结合分子减少奥希替尼抗性或奥希替尼难治异种移植小鼠模型中的肿瘤体积。在一些实施方案中，用双特异性结合分子的治疗增强抗肿瘤功效。
在一些实施方案中，编码双特异性结合分子的核酸如表2所示。在一些实施方案中，核酸可操作地连接于启动子。
提供了包含双特异性结合分子的核酸的表达载体。在一些实施方案中，载体进一步包含启动子，其中启动子可操作地连接于核酸。
本公开提供能够进行蛋白表达，包含双特异性结合分子的核酸的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞包含癌细胞。
在另一个实施方案中，本公开提供用于制备双特异性结合分子的方法，其中该方法包括(a)提供能够进行蛋白合成，包含本文公开的核酸的细胞；和(b)诱导双特异性结合分子的表达。
本公开还提供一种药用组合物。在一些实施方案中，药用组合物包含双特异性结合分子、核酸、载体或工程化细胞以及药学上可接受的载剂。
本公开还提供双特异性结合分子在制造用于在受试者中治疗癌症的药物的用途。
本公开提供在受试者中治疗癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括给予需要它的受试者治疗有效量的双特异性结合分子、核酸、载体、工程化细胞或本文提供的药用组合物。在一些实施方案中，双特异性结合分子腹膜内给予。
本公开进一步提供在受试者中预防癌症的方法。在一些实施方案中，提供了抑制肿瘤细胞生长的方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含一个或多个单位剂量的药用组合物以及向需要它的受试者提供一个或多个单位剂量的药用组合物的说明书。
在一些实施方案中，疾病包括肿瘤性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病或神经系统疾病。
在某些实施方案中，肿瘤性疾病包括肺癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌。在一个实施方案中，肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。
本发明的其他特征和优点将从以下具体实施方式和权利要求中显而易见。
附图说明
图1：特异性地与靶蛋白和神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合的双特异性结合分子的示意图。
图2A-2K：图表显示分离的双特异性EGFRxNRP1双特异性抗体与重组人类EGFR(huEGFR)的结合动力学。本文测试了结合亲和力测定的EGFRxNRP1抗体如下：每种EGFRxNRP1双特异性抗体由重链融合多肽和轻链多肽组成。分别为构建体1(SEQ ID NO:1和12)、构建体2(SEQ ID NO:2和12)、构建体3(SEQ ID NO:3和12)、构建体4(SEQ ID NO:4和12)、构建体5(SEQ ID NO:5和12)、构建体6(SEQ ID NO:6和12)、构建体7(SEQ ID NO:7和12)、构建体8(SEQ ID NO:8和12)、构建体9(SEQ ID NO:9和12)、构建体10(SEQ ID NO:10和12)、构建体11(SEQ ID NO:11和12)。通过Octet Red 96系统(Fortebio)定量与huEGFR的结合亲和力。图表上的每行传感图代表特定浓度(从左到右10、5、2.5nM)下的结合动力学。
图3A-3K：图表显示分离的双特异性EGFRxNRP1抗体与重组人类NRP1(huNRP1)的结合动力学。本文测试了结合亲和力测定的EGFRxNRP1双特异性抗体构建体如下：每种EGFRxNRP1双特异性抗体由重链融合多肽和轻链多肽组成。分别为构建体1(SEQ ID NO:1和12)、构建体2(SEQ ID NO:2和12)、构建体3(SEQ ID NO:3和12)、构建体4(SEQ ID NO:4和12)、构建体5(SEQ ID NO:5和12)、构建体6(SEQ ID NO:6和12)、构建体7(SEQ ID NO:7和12)、构建体8(SEQ ID NO:8和12)、构建体9(SEQ ID NO:9和12)、构建体10(SEQ ID NO:10和12)、构建体11(SEQ ID NO:11和12)。通过Octet Red 96系统(Fortebio)定量与huNRP1的结合亲和力。图表上的每行传感图代表特定浓度(从左到右10、5、2.5nM)下的结合动力学。
图4：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体1对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。测定经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体1(SEQ ID NO:1和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平。在存在或不存在构建体1(1μM)的情况下将HUVEC细胞预温育30min，并用VEGF165(2.2ng/ml)处理另外10min以诱导VEGFR2激活。通过使用抗磷酸化VEGFR2(Y1175)对全细胞裂解物进行蛋白质印迹来检测VEGFR2信号传导激活。通过使用Image J软件光密度测定分析用总VEGFR2进行归一化来量化相对p-VEGFR2表达。pVEGFR2印迹下方显示的数字为pVEGFR2相对于总VEGFR2的归一化数量。
图5A-5B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体2对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。通过使用抗磷酸化VEGFR2(Y1175)进行蛋白质印迹来测定经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体2(SEQ ID NO:2和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图5A)。将HUVEC细胞与构建体2(从右到左，从1μM起的6倍连续稀释浓度)一起预温育30min，并用VEGF165(2.2ng/ml)处理另外10min以诱导VEGFR2激活。(图5A)。使用Prism9将构建体2对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图5B)。(n＝2)
图6A-6B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体3对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体3(SEQ ID NO:3和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图6A)。使用Prism9将构建体3对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图6B)。(n＝2)实验方法和材料与图5A和5B中描述的相同。
图7A-7B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体4对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体4(SEQ ID NO:4和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图7A)。使用Prism9将EGFRxNRP1双特异性抗体构建体4对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图7B)。(n＝2)
图8A-8B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体5对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。经具有重链融合多肽的EGFRxNRP1双特异性抗体构建体5(SEQ ID NO:5和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图8A)。使用Prism9将EGFRxNRP1双特异性抗体构建体5对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图8B)。
(n＝2)
图9A-9B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体6对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体6(SEQ ID NO:6和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图9A)。使用Prism9将EGFRxNRP1双特异性抗体构建体6对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图9B)。(n＝2)
图10A-10B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体7对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体7(SEQ ID NO:7和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图10A)。使用Prism9将EGFRxNRP1双特异性抗体构建体7对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图10B)。(n＝2)
图11A-11B：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11对VEGF介导的VEGFR2磷酸化的影响。经EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11(SEQ ID NO:11和12)的总VEGFR和p-VEGFR2的表达水平(图11A)。使用Prism9将EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11对VEGFR2磷酸化的抑制计算为相对于对照的％P-VEGFR2(图11B)。(n＝2)。
图12A-12B：EGFRxNRP1双特异性抗体对H1975细胞生长率的影响。将细胞与各种浓度的EGFRxNRP1双特异性抗体一起温育72小时，并且评估细胞生长且将其表示为相对于对照的(％)生长率。构建体1(SEQ ID NO:1和12)(图12A)；和构建体3(SEQ ID NO:3和12)、构建体7(SEQ ID NO:7和12)、构建体9(SEQ ID NO:9和12)和构建体11(SEQ ID NO:11和12)(图12B)。
图13A-13F：EGFRxNRP1双特异性抗体在H1975异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性。小鼠用各种EGFRxNRP1双特异性抗体构建体、帕尼单抗或媒介物(对照)以各种剂量处理。构建体1(SEQ ID NO:1和12)，以10mg/kg，ip，BIW(图13A)；构建体1(SEQ ID NO:1和12)，以5mg/kg(图13B)；SEQ ID NO:2(构建体2)，以6.825mg/kg(图13C)；构建体3(SEQ ID NO:3和12)，以5mg/kg(图13D)；构建体7(SEQ ID:7和12)，以6.85mg/kg(图13E)；以及构建体7、构建体9(SEQID:9和11)和构建体11(SEQ ID NO:11和12)，分别以6.87mg/kg(图13F)或作为阴性对照的PBS，经由腹膜内途径(ip)给予小鼠。
EGFRxNRP1双特异性抗体构建体3、7、9和12比构建体1更有效地抑制肿瘤生长，构建体1在CH3中具有NRP1结合结构域但不具有scFv。
图14：EGFRxNR:1双特异性抗体构建体11诱导EGFRT790M/L858R和NRP1的强烈降解。将H1975细胞与帕尼单抗、抗NRP1 mAb、抗NRP1 mAb加帕尼单抗(Pnm)或构建体11一起温育，并探测分离的全细胞裂解物的蛋白质印迹，以分别使用单克隆抗EGFR抗体和抗NRP1抗体检测EGFR和NRP1。非特异性蛋白肌动蛋白用作上样对照。
图15：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11通过溶酶体降解途径诱导EGFR和NRP1的降解。通过与溶酶体蛋白降解抑制剂巴弗洛霉素A1而不是与蛋白酶体抑制剂MG132共处理，经构建体11的EGFR和NRP1降解得到恢复。
图16：提出的EGFRxNRP1双特异性抗体介导的EGFR降解机制的示意图。
图17：EGFRxNR:1双特异性抗体构建体11(SEQ ID NO:11和12)介导的H1975细胞中EGFRT790M/L858R的降解。H1975细胞用浓度在0.77nM-1μM之间的构建体11、帕尼单抗或埃万妥单抗(从右到左，1μM的6倍连续稀释)处理16小时。全细胞裂解物被用于蛋白质印迹以检测EGFR和肌动蛋白。肌动蛋白被用于上样对照。在H1975细胞中，即使在0.77nM的浓度下，构建体11处理也诱导了EGFRT790M/L858R的强烈降解。
图18A-18C：EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11(SEQ ID NO:11和12)在各种奥希替尼异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性。评估了构建体1在奥希替尼敏感的H1975(图18A)、奥希替尼抗性的H1975-OR(图18B)和奥希替尼难治性H1975-HGF(图18C)异种移植小鼠模型中对肿瘤生长的抑制作用。异种移植小鼠用bs构建体11、奥希替尼、帕尼单抗、埃万妥单抗或IgG1同种型对照处理，并在植入后指定天数时定量肿瘤体积(mm3)。
图19A-19C为证实与抗cMET单克隆抗体(PTX-413)相比较，用cMETxNRP1双特异性抗体构建体(PTX-414)处理后cMET和NRP1的降解的图表。图19A显示HCC827细胞的结果。图19B显示ACHN细胞的结果。图19C显示H1975细胞的结果。
图20为证实与抗HER2单克隆抗体(PTX-401)相比较，用HER2xNRP1双特异性抗体构建体(PTX-402)处理BT474细胞后HER2和NRP1的降解的图表。
图21A-21B为证实与抗IGF1R单克隆抗体(PTX-417)相比较，用IGF1RxNRP1双特异性抗体构建体(PTX-418)处理后IGF1R和NRP1的降解的图表。图21A显示MCF-7细胞的结果。图21B显示ACHN细胞的结果。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。因此，以下术语旨在具有以下含义：
单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指涉，除非上下文另外明确地规定。
如本文使用的，术语“人类EGFR”或“EGFR”是指人类表皮生长因子受体蛋白(UniProKB/Swiss-Pro No.P00533)并且包括由细胞(包括肿瘤细胞)自然表达或在用EGFR基因或cDNA转染的细胞上表达的EGFR的任何变体、同工型和物种同源物。
如本文使用的，术语“人类NRP1”或“NRP1”是指人类神经纤毛蛋白-1蛋白(UniProKB/Swiss-Pro No.O14786)并且包括由细胞(包括肿瘤细胞)自然表达或在用NRP1基因或cDNA转染的细胞上表达的NRP1的任何变体、同工型和物种同源物。
如本文使用的，术语“受体酪氨酸激酶(receptors tyrosine kinase)”或“受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase)”或“RTK”是指作为受体(即结合配体)并磷酸化酪氨酸残基的蛋白。
如本文使用的，术语“非受体酪氨酸激酶(non-receptors tyrosine kinase)”或“非受体酪氨酸激酶(Non-Receptor Tyrosine Kinase)”或“非RTK”是指不是RTK的蛋白，即不是受体和/或不磷酸化酪氨酸残基的蛋白。
如本文使用的，术语“给予(administering)或给予(administration)”所公开的双特异性结合分子或其多肽包括使用任何合适的制剂或给予途径，例如如本文所述的，向受试者递送如本文所述的本发明的多肽或组合物，或者其前药或其他药学上可接受的衍生物。
术语“和/或”当在两个或更多个项目的列表中使用时，意指所列项目中的任何一个均可单独采用，或者可采用所列项目中两个或更多个的任何组合。
如本文使用的，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”用于指涉疾病或病症，意指至少实现了与折磨受试者的病症相关症状的改善，其中改善在广义上用于指涉至少降低参数的大小，所述参数例如与所治疗的病症相关的症状。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于获得治疗益处的方法。治疗益处通过与安慰剂相比较肿瘤是否缩小、保持相同大小或无进展存活时间增加来确定。因此，治疗包括预防(即降低临床症状发展的风险，包括导致临床症状不发展，例如防止疾病进展)和抑制(即阻止临床症状的发展或进一步发展，例如减轻或完全抑制活动性疾病)。
如本文使用的，“受试者”可指患有癌症的任何动物，例如哺乳动物，比如实验动物、农场动物、宠物等。在一些实施方案中，该动物为灵长类动物，优选地为人类。如本文使用的，术语“受试者(subject)”和“受试者(subject)”可互换使用。术语“受试者(subject)”和“受试者(subject)”是指动物(例如鸟类，比如鸡、鹌鹑或火鸡，或者哺乳动物)，特别是“哺乳动物”，包括非灵长类动物(例如牛、猪、马、羊、兔、豚鼠、大鼠、猫、狗和小鼠)和灵长类动物(例如猴、黑猩猩和人类)，并且更具体地讲为人类。在一个实施方案中，受试者为非人类动物，比如农场动物(例如马、牛、猪或羊)或宠物(例如狗、猫、豚鼠或兔)。在一个优选实施方案中，受试者为“人类”。
如本文使用的，术语“融合”是指将具有相同或不同功能或结构的两个分子统一起来，并且融合的方法可包括能够将肽与蛋白、小分子药物、纳米颗粒或脂质体结合的任何物理、化学或生物方法。优选地，融合可由接头肽介导，并且例如，接头肽可融合于抗体轻链可变区(Fc)片段的C-末端。或者，通过整合多肽序列内的多个结构域来融合两个分子。
如本文使用的，术语“接头”或“柔性接头”为将两个多肽亚基连接在一起的分子或肽。接头肽序列可包括氨基酸序列亚基(GGGGS)n，其中n定义亚基重复的数量。亚基重复的数量决定接头肽的柔韧性。柔性的肽接头允许两个结合结构域之间的更大柔韧性。
如本文使用的，“有效量”是指足以引起期望的抗癌反应的量。在本发明中，期望的生物反应为抑制细胞增殖。给予受试者的双特异性结合分子的确切量将取决于给予方式、癌症的类型和严重程度以及受试者的特征，比如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。熟练的技术人员将能够取决于这些和其他因素确定适当的剂量。当与其他抗癌剂共同给予时，例如当与化学疗法共同给予时，第二药物的“有效量”将取决于所用药物的类型。对于批准的药物，合适的剂量为已知的，并且可由熟练的技术人员根据受试者的状况、所治疗的癌症类型和给予的本文多肽的量进行调整。在其中没有明确地注明量的情况下，应假定有效量。例如，本文公开的双特异性抗体可以每周或每两周的间隔，以约0.01-100mg/kg体重/天之间的剂量范围给予受试者。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以指涉氨基酸残基的聚合物。
如本文使用的，术语“变体”描述了与野生型、常规或主要序列具有变化的序列。这些变化可能采取氨基酸或核苷酸的缺失、取代或插入的形式。变体可含有一个或多个，包括序列变化的组合。
术语“减少(reduce)”或该词的其他形式，比如“减少(reducing)”或“减少(reduction)”，通常是指事件或特征的降低(例如一种或多种症状，或者一种蛋白与另一种的结合)。应当理解的是，这一般地与一些标准或预期值有关，换言之其为相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。
如在“结合亲和力”的上下文中使用的，术语“亲和力”是指一个分子与另一个分子的亲和力降低。例如，在一些实施方案中，蛋白、结构域或基序可以给定的亲和力特异性地与特定靶标结合，所述靶标例如肽、多肽、蛋白、碳水化合物、糖类、多糖、糖胺聚糖或其任何表位。术语“亲和力”是指分子的单个结合结构域与其结合靶标或配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和强度。分子对其靶标的亲和力可用解离常数(KD)表示，KD为解离和缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。结合相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离常数(KD)来表示，其中较小的KD表示较大的亲和力。所选多肽的结合特性(亲和力)可使用本领域众所周知的方法进行量化。一种这样的方法需要测量抗原结合结构域/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)两者均可通过计算浓度及实际缔合和解离速率来确定，(参见Nature 361:186-87(1993))。
Koff/Kon的比率使得可消除与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数KD。(参见，一般地，Davies等人，(1990)Annual Rev Biochem59:439-473)。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)为≤1μM时，本发明的重组多肽可特异性地与表位结合。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)为≤100nM时，本发明的重组多肽可特异性地与表位结合。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)为≤10nM时，本发明的重组多肽可特异性地与表位结合。在一些实施方案中，当平衡结合常数(KD)为≤100pM至约1pM时，本发明的重组多肽可特异性地与表位结合，如通过测定比如表面等离子体共振(SPR)、Octet测定或本领域技术人员已知的类似测定测量的。在一些实施方案中，KD可为10-5M或更少(例如10-6M或更少、10-7M或更少、10-8M或更少、10-8M或更少、10-10M或更少、10-11M或更少、10-12M或更少、10-13M或更少、10-14M或更少、10-15M或更少或者10-16M或更少)。
因此，只要速率常数的比率保持相同，等效亲和力就可包含不同的速率常数。因此，在一些实施方案中，“减少的结合”是指相应相互作用的亲和力的降低。相反地，“增加的结合”是指相应相互作用的结合亲和力的增加。
如本文使用的，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。
在本发明的上下文中，术语“双特异性结合分子”是指具有由不同抗体序列定义的两个不同抗原结合区的抗体。
“EGFRxNRP1双特异性抗体”或“抗EGFRxNRP1双特异性抗体”为双特异性结合分子，其包含两个不同的抗原结合结构域，其中一个与抗原EGFR1特异性地结合和其中一个与NRP1特异性地结合。类似的命名法自始至终用于结合除EGFR以外的靶标的其他双特异性结合分子，比如“HER2xNRP1双特异性抗体”或“cMETxNRP1双特异性抗体”，以描述包含一个分别与HER2或cMET特异性地结合的抗原结合结构域以及另一个与NRP1特异性地结合的抗原结合结构域的双特异性结合分子。
如本文使用的，术语“重链”可解释为包括包含重链可变区结构域(VH)的全长重链，其包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列，以及三个重链恒定区结构域CH1、CH2和CH3，或其片段。此外，如本文使用的，术语“轻链”可解释为包括包含轻链可变区结构域(VL)的全长轻链，其包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列和轻链恒定区结构域(CL)，其片段。如本文使用的，术语“Fab”是指结合抗原的区域。Fab由一条可变的重链和轻链以及一条恒定的重链和轻链组成。
如本文使用的，术语两个序列(例如氨基酸或核苷酸序列)之间的“百分比同一性”是指当最佳比对和比较时相同(对于最佳比对具有适当的插入或缺失)的位置百分比(在可能的100％中)。两个序列之间的百分比同一性为由序列共享的相同位置数量的函数(即％同一性＝相同位置的数量/总位置的数量×100)，同时考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入这些才能实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可使用数学算法来实现，如以下非限制性实例所述。用于确定两个蛋白序列之间％同源性的方法和算法在本领域得到充分确立。
例如，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.(48):444-453)算法来确定，该算法已纳入到GCG软件包(在http://www.gcg.com可获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，和长度权重为1、2、3、4、5或6。此外，蛋白氨基酸序列可用作“查询序列”，以对公共数据库进行搜索，来例如鉴定相关序列。可使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版)进行此类搜索。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白搜索，分数＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对用于比较目的，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指制备具有单分子组成的抗体分子。单克隆抗体组合物对特定表位显示单一的结合特异性和亲和力。因此，术语“人类单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，这些抗体具有衍生于人类种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。
如本文使用的，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)预期是指已向其引入表达载体的细胞，例如编码本发明抗体的表达载体。重组宿主细胞包括例如转染瘤，比如CHO、CHO-S、HEK、HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NSO细胞以及淋巴细胞。
术语“治疗”是指给予有效量的本发明治疗活性的双特异性结合分子，目的是缓解、改善、阻止或根除(治愈)症状或疾病状态。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指在所需的剂量下和时间段内有效实现期望的治疗结果的量。双特异性结合分子的治疗有效量可能根据因素比如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及双特异性结合分子在受试者种引起期望的反应的能力而异。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所超过的量。
如本文使用的，术语“组合”或“共同给予”可互换使用，以指使用多于一种疗法(例如一种或多种预防和/或治疗剂)。这些术语的使用并不限制其中给予受试者疗法(例如预防和/或治疗剂)的顺序。
如本文使用的，术语“协同作用”是指本发明的多肽与另一种疗法(例如预防或治疗剂)的组合，其比疗法的累加效应更有效。
术语“药学上可接受的盐”意指包括用相对非毒性的酸或碱制备的活性双特异性抗体的盐，取决于本文所述的双特异性抗体上发现的特定取代基。
如本文使用的，术语“非肠道”包括但不限于皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
术语“载剂”是指用于配制组合物的媒介物，并且可由多种赋形剂组成。
如本文使用的，术语“赋形剂”是指与本发明的活性成分一起(例如伴随地)或之后配制的任何药理学上无活性的、天然或合成的成分或物质。在一些实施方案中，赋形剂可为可与本发明的重组多肽一起给予，和或在制备本发明组合物中有用的任何添加剂、佐剂、粘合剂、填充剂(bulking agent)、载剂、包衣、稀释剂、崩解剂、填充物(filler)、助流剂、润滑剂、防腐剂、媒介物或其组合。赋形剂，包括本领域已知的非毒性且不与组合物的其他成分相互作用的任何此类材料。在一些实施方案中，当出于填充组合物的目的而制备组合物时，赋形剂可与重组多肽一起配制(因此经常称为填充剂(bulking agents)、填充物(filler)或稀释剂)。在其他实施方案中，赋形剂可用于在最终剂型中赋予活性成分增强，比如促进吸收和/或溶解性。在仍然其他实施方案中，赋形剂可用于提供稳定性或防止污染(例如微生物污染)。在其他实施方案中，赋形剂可用于赋予组合物物理特性(例如组合物为干燥颗粒状，或干燥可流动粉末的物理形式)。指涉赋形剂包括一种和多于一种此类赋形剂两者。E.W.Martin在Remington's Pharmaceutical Sciences中描述了合适的药用赋形剂，所述文献的公开通过参考以其全部结合至本文中。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”或变体比如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意味着包含所述的步骤、元素或整数，或者步骤、元素或整数的组，但不排除任何其他步骤、元素或整数或者元素、步骤或整数的组。
本文提及的所有专利申请、专利和印刷出版物均通过参考以其全部结合至好像每个单独的出版物、专利或专利申请均明确和单独地表明通过参考以其全部结合的相同程度。并且，本文引用的所有专利申请、专利和印刷出版物均通过参考以其全部结合至本文中，但任何定义、主题免责声明或否认除外，并且除非所包含的材料与本文的明确公开不一致，在这种情况下，以本公开中的语言为准。
本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制。事实上，除本文中描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员而言从上述描述和附图中将变得显而易见。此类修改预期属于所附权利要求的范围内。应当进一步理解，所有值均为近似值并且仅提供用于描述。
具有EGFR结合结构域和NRP1结合结构域的双特异性抗体(EGFRxNRP Ab)
如上所述，本发明涉及特异性地与靶蛋白和神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合的双特异性结合分子。
双特异性抗体具有超过单克隆抗体的许多优势。首先，双特异性结合分子的制造更有效，因为其为一种具有两个有效靶标的分子。例如，双特异性结合分子可靶向多种免疫细胞受体(CD3、CD16或CD47)或免疫检查点蛋白(PD1、LAG-3或CTLA-4)或两者兼而有之。例如，双特异性抗体可靶向肿瘤相关的必需受体比如EGFR以及免疫细胞受体或免疫检查点调节因子比如神经纤毛蛋白1NRP1。用于抗癌疗法的双特异性抗体被设计为提高抗癌效力。
EGFR结合结构域
表皮生长因子受体(EGFR)为实体瘤中最常改变的癌基因之一。EGFR信号传导增加可驱动许多癌症类型的增殖和细胞存活，包括乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、食管胃癌、肝脏、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、结肠癌和直肠癌。EGFR信号传导增加可发生自EGFR过表达，EGFR突变或EGFR信号传导通路内导致组成型激活的转导因子的突变，和/或EGFR同源配体比如EGF、肿瘤坏死因子-α(TGF-α)、双调蛋白(AREG)、表观基因(epigen)、β-细胞素、肝素结合EGF(HB-EGF)和表皮调节蛋白的水平升高。EGFR信号传导激活下游信号传导级联，包括RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR轴，其导致增殖和癌细胞存活。不幸的是，抗EGFR药物，包括酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体和放射疗法，仅在少数癌症类型有效，比如转移性结直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和晚期头颈癌。此外，治疗仅在一些受试者中改善存活率，并且初始反应通常以耐药性结束。因此，需要新的合理设计来提高治疗功效。
本公开的实施方案进一步提供在受试者中治疗癌症的方法，包括给予需要的受试者治疗有效量的双特异性结合分子。在一些实施方案中，本公开提供所公开的双特异性结合分子在制造用于治疗癌症的药物中的用途。
在双特异性结合分子的某些实施方案中，本公开提供在需要的受试者中治疗EGFR过表达癌症的方法，包括给予治疗有效量的双特异性结合分子和/或本文提供的药学上可接受的载剂或稀释剂。在某些实施方案中，EGFR过表达的癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、胃结合部腺癌、胃食管结合部腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌或任何其他过表达EGFR或EGFR激酶结构域突变的实体瘤组织。在治疗方法的一些实施方案中，该方法进一步包括给予受试者增加细胞EGFR表达的药物。
在治疗方法的某些实施方案中，EGFR过表达的癌症对用抗EGFR单克隆抗体的治疗具有抗性。在治疗方法的某些实施方案中，抗EGFR单克隆抗体为埃万妥单抗(amivantamab)、西妥昔单抗(cetuximab)、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)、玛汀-迪妥昔珠单抗(depatuxizumab mafodotin)、度戈妥珠单抗(duligotuzumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、GC1118、伊马曲单抗(Imagatuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)或HumMR1。在治疗方法的一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，EGFR-过表达对EGFR酪氨酸激酶抑制剂具有抗性或难治性。在一些实施方案中，EGFR过表达的癌症对奥希替尼为难治性的。
抗体为以高特异性和高亲和力与抗原结合，并且可中和抗原活性的蛋白。抗EGFR抗体阻断配体激活的EGFR信号传导并诱导受体内吞作用，导致蛋白酶体中的EGFR降解。当在抗体的EGFR结合结构域发生突变时，受试者可能会在治疗过程期间获得抗EGFR抗体抗性。嵌合小鼠/人类单克隆的西妥昔单抗和完全人源化单克隆抗体帕尼单抗对EGFR具有不同的结合结构域，并且因此帕尼单抗在对西妥昔单抗的抗性产生之后仍然有效，反之亦然。因此，可向对一种抗EGFR抗体获得抗性的受试者给予另一种靶向不同EGFR结合结构域的抗EGFR抗体。
帕尼单抗为以比IgG1抗EGFR嵌合人类/小鼠单克隆抗体西妥昔单抗高约8倍的亲和力结合EGFR的IgG2抗EGFR人源化单克隆抗体(Garcia-Foncillas等人.2019)。在诱导内吞作用之前，抗体结合可诱导免疫反应。帕尼单抗结合诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，并通过激活中性粒细胞和单核细胞启动抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)(Schneider-Merk等人.2010)。西妥昔单抗的IgG1 Fc结构域与自然杀伤(NK)细胞上的FcγRIIIA(CD16)受体结合以诱导ADCC。激活的NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶，导致癌细胞裂解并释放免疫刺激分子，比如干扰素-γ(IFN-γ)、TNF-α、趋化因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。NK细胞的细胞因子分泌刺激树突状细胞成熟、NK细胞串扰(cross-talk)和CD137的共表达。CD137表达募集抗EGFR CD8+T细胞，导致对表达EGFR的癌细胞的杀伤增加。成熟的树突状细胞进一步激活NK细胞并将肿瘤抗原呈递给细胞毒性CD8+T细胞。IgG1 Fc区还与巨噬细胞或浆细胞样树突状效应细胞上的Fc受体或C1补体复合物(C1q)的第一个亚基结合，以分别启动通过细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。与西妥昔单抗一样，抗EGFR抗体西妥昔单抗、耐昔妥珠单抗和尼妥珠单抗也具有用于ADCC诱导的IgG1 Fc区。
NRP1结合结构域
癌细胞过表达促进新血管快速生长的促血管生成因子。肿瘤周围的血管异常，伴随减少至肿瘤的总血流的毛细血管收缩。血流速率降低会增加肿瘤间质液压力，并减少从血管流向肿瘤的药物(Milosevic等人,1999)。与正常组织不同，肿瘤组织中淋巴管的缺乏也会助于血管生成异常和高的肿瘤间质压力。通过靶向血管内皮细胞生长因子-A(VEGF165)来抑制血管生成能够使血管形成、血管流体压力正常化，并增加治疗药物在肿瘤部位的积累(Marcucci等人.2013)。然而，抗VEGF抗体比如贝伐珠单抗可具有不良副作用，并且仅在狭窄的暴露范围内有效(Kamba和McDonald,2007)。
神经纤毛蛋白-1(NRP1)和神经纤毛蛋白-2(NRP2)受体为多功能单次跨膜糖蛋白，分别在血管生成和淋巴管生成中具有重要作用。与NRP1和NRP2结合的每个VEGF配体家族和Sema3配体的C-末端区域与NRP1和NRP2的b1结构域中的精氨酸结合口袋结合(Parker等人,2012)。通过R/K-x-x-R/K(R＝精氨酸，K＝赖氨酸，和x＝任何氨基酸)的基序发生与精氨酸结合口袋结合，该基序通常存在于NRP结合配体的C-末端区域，并且被称为“C-末端法则”(CendR)(Teesalu等人.2009)。含有C-末端法则序列的蛋白或肽能够通过C-末端精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)残基与NRP结合(Zanuy等人,2013)。
NRP1的选择性靶向对于抗EGFR癌症疗法至关重要，因为沉默NRP2会显著地增加肺癌和胃癌细胞中的EGFR表达(Rizzolio等人,2017)。此外，NRP1在许多癌细胞中过表达，包括结肠癌、黑色素瘤、星形细胞瘤、肺癌、前列腺癌和胰腺导管腺癌，并在癌症进展中起至关重要作用(Graziani和Lacal,2015)。除NRP1在多种癌症中过表达之外，NRP1还在肿瘤相关内皮细胞中过表达。NRP1起参与血管生成的配体的辅助受体的作用，比如血管内皮生长因子(VEGF165)、3类信号素(semaphorin)配体、整合素β1、TGF-β、HGF、FGF、PDGF和半乳糖凝集素-1。NRP1与受体酪氨酸激酶(RTK)比如VEGFR1和VEGFR2相互作用，并且从而助于VEGFR信号转导，导致血管生成增加。NRP1还结合分泌的3类信号素配体(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3F、Sema3G)，以起丛蛋白家族受体的辅助受体的作用，该受体也调节血管生成。
阻断NRP1配体与抗NPR1特异性结合结构域的结合降低内皮粘附分子VE-钙粘蛋白的表达，从而导致抗EGFR抗体从血管中的外渗增加。增加的外渗还降低肿瘤间质压力，允许药物更自由地从血管流向肿瘤环境。
实体瘤周围的上皮屏障由以通过细胞间粘附因子连接的间质上皮细胞密集填充的细胞间隙组成，并防止治疗剂穿透肿瘤。E-钙粘蛋白过表达助于细胞间粘附。由于在病毒(腺病毒-3)中发现了降低E-钙粘蛋白的物质，这是报道的一种情况，其中在构成病毒的蛋白中具有减少紧密结合中细胞E-钙粘蛋白的活性的仅一部分(JO-1)与抗体共同给予，从而增加抗体的抗癌作用(Beyer等人.2011)。靶向NRP1降低上皮屏障粘附分子E-钙粘蛋白和整合素β1亚基的表达，它们在许多实体瘤中过表达并增加细胞外基质连接，导致药物穿透降低。此外，整合素β1亚基参与激活生长因子受体介导的细胞增殖。
总而言之，靶向NRP1可减少VEGF165结合，以及VE-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和整合素β1的表达，这共同用于减少血管生成、肿瘤间质压力，并增加抗EGFR抗体的外渗和肿瘤穿透。
癌细胞产生抑制免疫反应的免疫检查点分子。NRP1为免疫检查点分子，并且其在肿瘤相关内皮细胞和癌细胞中的表达增加。NRP1表达通过增加Treg活性和降低肿瘤特异性CD8+T细胞反应来诱导免疫抑制(Chuckran等人.2020)。因此，除增加药物外渗和穿透之外，NRP1结合结构域还起免疫检查点抑制剂的作用。在仍然另一个方面，本公开提供一种双特异性结合分子，该分子靶向NRP1以减少癌症介导的检查点分子免疫抑制，允许在肿瘤部位的自然免疫，并增加肿瘤反应的可能性。
抗NRP1抗体MNRP1685A，也称为维森库单抗(vesencumab)，与NRP1上的VEGF165竞争性地结合，并起通过VEGFR2抑制VEGF信号传导的作用，从而影响血管生成、细胞存活、迁移、粘附和侵袭(Pan Q等人.2007)。然而，在晚期实体瘤的I期试验中用维森库单抗治疗的受试者遭受了无法忍受的副作用，包括胃肠出血、真菌血症、十二指肠梗阻、血小板减少症、蛋白尿、脱发、发音困难、疲劳和恶心，这导致进一步的试验流产(Weekes等人,2014,Patnaik等人,2014)。
NRP1作为同二聚体或异二聚体具有活性，而单体肽，比如切割的穿透肽iRGD，仅具有弱的调节NRP1生物活性的能力(Sugahara等人.2010)。因此，选择性地结合作为同二聚体的NRP1以调节生物活性的肽为优选的。不幸的是，尽管Fc重链融合的NRP结合肽A22p作为双重肽(同二聚体)呈现，但A22p结合NRP1和NRP2两者(Shin等人.2014)。因此，识别有效的同二聚体和非毒性NRP1选择性靶向分子很重要。
NRP1结合结构域包含抗体或其NRP1结合片段。例如，可使用本领域已知的NRP1抗体的全部或一部分或本文提供的抗NRP1抗体。在SEQ ID NO:41-47中阐述抗NRP1 mAb重链多肽序列的非限制性示例，其包括N-末端NPR1结合结构域。在一些实施方案中，单克隆抗体重链多肽包含包括可变重链(VH)和恒定重链1(CH1)的N-末端NRP1结合结构域，以及包含恒定重链2(CH2)和恒定重链3(CH3)的Fc结构域。在一些实施方案中，单克隆抗体包含如SEQID NO:48-54中任何一项所示的轻链多肽序列。因此，SEQ ID NO:41-47的重链可分别与SEQID NO:48-54的轻链配对。编码重链和轻链多肽的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO:55-61和62-68中所示。
对EGFR和NRP1具有亲和力的双特异性抗体
本公开提供包含重链融合多肽的双特异性抗体，其中N-末端EGFR结合结构域位于重链多肽的N-末端和NRP1结合结构域位于C-末端。双特异性结合分子的重链融合多肽在N-末端包含EGFR结合区，其包括可变重链(VH)和恒定重链1(CH1)；包含恒定重链2(CH2)、恒定重链3(CH3)的Fc结构域；以及包含与CH3的C-末端融合的NRP1结合区的短链可变片段(scFv)。包含NRP1结合结构域的scFv由通过柔性肽接头融合的可变重链(VH)和可变轻链(VL)组成。
本公开代表性双特异性抗体结构的示意图显示于图1。
示例性的bsAb重链多肽序列如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和39中所示，并且编码双特异性抗体的重链抗体多肽序列的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和40中所示。在一些方面，双特异性抗体进一步包含含有可变轻链和恒定轻链的轻链多肽序列，其与重链多肽配对并如SEQ ID NO:12中所示。编码SEQID NO:12的轻链多肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO:25中所示。在一些方面，本公开提供用于编码GGGGS亚基的多核苷酸序列，并且这些序列如SEQ ID NO:26-38中所示。表1列出了双特异性抗体的多肽序列，表2列出了编码多肽的多核苷酸序列。实施例1描述了双特异性抗体的产生的方法。
在一些方面，双特异性抗体包含抗EGFR结合臂，该结合臂包含(或由其组成)如SEQID NO:69中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:70中所示的VL氨基酸序列。在一些方面，双特异性抗体包含抗EGFR结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:71、72和73中所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3区。在一些方面，双特异性抗体包含抗EGFR结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:73中所示的氨基酸序列的重链CDR3区。在一些方面，双特异性抗体包含抗EGFR结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:74、75和76中所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在一些方面，双特异性抗体包含抗EGFR结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一些实施方案中，抗EGFR结合臂包含(或由其组成)一个或多个与上述VH、VL、HCDR或LCDR序列中的任何一种具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％同一性的序列。
在一些方面，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含(或由其组成)如SEQID NO:77中所示的VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:78中所示的VL氨基酸序列。在一些方面，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:79、80和81中所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3区。在一些方面，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的重链CDR3区。在一些方面，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:82、83和84中所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在一些方面，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的轻链CDR3区。在一些实施方案中，抗NRP1结合臂包含(或由其组成)一个或多个与上述VH、VL、HCDR或LCDR序列中的任何一种具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.8％同一性的序列。
因此，在实施方案中，本发明涉及包含含有以下的双特异性结合分子的组合物：
(a)两个相同的重链多肽并且第一重链多肽通过肽接头与第一scFv融合，以产生第一重融合多肽，第二重链通过肽接头与第二scFv融合，以产生第二重融合多肽，其中第一和第二scFv相同并与NRP1结合；和
(b)包含第一轻链和第二轻链的两条相同的轻链，
其中重融合和轻链多肽的VL和VH包含与靶蛋白结合的靶蛋白结合结构域和含有与NRP1结合的NRP1结合结构域的scFv。
在双特异性结合分子的一些实施方案中，重链融合多肽与轻链多肽配对。在一些实施方案中，重链多肽包含(a)两个相同的重链多肽并且第一重链多肽通过肽接头与第一scFv融合，以产生第一重融合多肽，第二重链通过肽接头与第二scFv融合，以产生第二重融合多肽，其中第一和第二scFv相同并与NRP1结合；和(b)包含第一轻链和第二轻链的两条相同的轻链，其中重融合和轻链多肽的VL和VH包含与靶蛋白结合的靶蛋白结合结构域和含有与NRP1结合的NRP1结合结构域的scFv。
特此提供了对EGFR和NRP1具有不同结合亲和力的双特异性抗体。在一个实施方案中，优选的是对NRP1的结合亲和力低于对EGFR。在一些实施方案中，
因此，本发明涉及包含含有以下的双特异性结合分子：
(a)两个相同的重链多肽并且第一重链多肽通过肽接头与第一scFv融合，以产生第一重融合多肽，第二重链通过肽接头与第二scFv融合，以产生第二重融合多肽，其中第一和第二scFv相同并与NRP1结合；和
(b)包含第一轻链和第二轻链的两条相同的轻链，
其中重融合和轻链多肽的VL和VH包含与靶蛋白结合的靶蛋白结合结构域和含有与NRP1结合的NRP1结合结构域的scFv。
在双特异性结合分子的一些实施方案中，重链融合多肽与轻链多肽配对。在一些实施方案中，重链多肽包含(a)两个相同的重链多肽并且第一重链多肽通过肽接头与第一scFv融合，以产生第一重融合多肽，第二重链通过肽接头与第二scFv融合，以产生第二重融合多肽，其中第一和第二scFv相同并与NRP1结合；和(b)包含第一轻链和第二轻链的两条相同的轻链，其中重融合和轻链多肽的VL和VH包含与靶蛋白结合的靶蛋白结合结构域和含有与NRP1结合的NRP1结合结构域的scFv。
在一些实施方案中，本公开提供了用于编码GGGGS亚基的多核苷酸序列，并且这些序列如SEQ ID NO:26-38中所示。表1列出了双特异性结合分子的多肽序列，和表2列出了编码多肽的多核苷酸序列。
实施例1描述了双特异性结合分子产生的方法，如实施例1所述。
在一些实施方案中，双特异性结合分子的EGFR结合结构域具有在亚纳摩尔范围内(<0.1nM)的EGFR亲和力(KD)。在一些实施方案中，双特异性结合分子的NRP1结合结构域具有从具有SEQ ID NO:1的多肽序列的双特异性结合分子构建体的70nM到具有SEQ ID NO:2、3、5、7、10和11中所示的多肽序列的双特异性抗体的亚纳摩尔范围的范围内的NRP1亲和力(KD)。因此，在一个方面，本公开提供了具有对EGFR具有在亚纳摩尔范围内的亲和力的EGFR结合结构域和对NRP1具有在亚纳摩尔范围内的亲和力的NRP1结合结构域的双特异性抗体，如实施例2的表2所示。图2A-2K显示双特异性结合分子与固定化huEGFR的结合亲和力曲线。在一些实施方案中，双特异性结合分子对EGFR的结合亲和力为<0.1nM。在一些实施方案中，双特异性结合分子对EGFR的结合亲和力为<0.01nM。图3A-3K显示双特异性结合分子与固定化huNRP1的结合亲和力曲线。在一些实施方案中，双特异性结合分子对NRP1的结合亲和力在0.01nM-1000nM之间的范围内。在一些实施方案中，双特异性结合分子对NRP1的结合亲和力在0.1nM-100nM之间的范围内。
本公开的一个方面提供了对EGFR和NRP1具有不对称结合亲和力的双特异性抗体，参见表2。在一些实施方案中，EGFR结合结构域对EGFR的KD为NRP1结合结构域对NRP1的KD的至少2、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少100或多于100倍大。不对称亲和力提供给表达EGFR的癌细胞更好的归巢，同时降低靶向NRP1的细胞毒性。
用双特异性结合分子的NRP1结合结构域阻断VEGF与NRP1的结合可抑制VEGFR2的激活，如通过VEGFR2磷酸化测量的那样。然而，具有SEQ ID NO:1重链的双特异性抗体的NRP1 KD为69.7nM，但不抑制VEGFR磷酸化(图4)。在一些实施方案中，双特异性结合分子抑制VEGFR2磷酸化以防止血管生成，参见表3和图5A-5B以及图11A-11B。在一些实施方案中，发明人发现NRP1结合结构域的解离常数(KD)并不反映双特异性结合分子抑制VEGFR2磷酸化的能力。例如，具有重链SEQ ID NO:6的双特异性结合分子在10,130nM下抑制50％VEGFR2磷酸化(IC50)，但NRP1 KD为3.76nM，而具有重链SEQ ID NO:4的双特异性结合分子在410nM下抑制50％ VEGFR2磷酸化(IC50)，但NRP1 KD为8.8nM。因此，在一些实施方案中，本公开提供了双特异性抗体，其中NRP1结合结构域亲和力和生物功能在抑制VEGFR2磷酸化方面不成比例。
在一些实施方案中，双特异性抗体抑制癌细胞生长。在一些实施方案中，包含恒定重链2和3(CH2和CH3)的双特异性结合分子Fc结构域属于IgG1或IgG2亚类。在一些实施方案中，本公开提供一种双特异性结合分子，其具有scFv的EGFR结合结构域和NRP1结合结构域，其稳健地抑制癌细胞系H1975中的细胞增殖，表4和图12A和12B。该结果表明，scFv对于双特异性结合分子作为降解剂的功能至关重要。NRP1实施例4描述了用于测量H1975癌细胞系中细胞生长抑制的双特异性结合分子IC50的方法。
对NRP1和受体酪氨酸激酶(RTK)具有结合亲和力的另外双特异性抗体
除以上描述的EGFRxNRP1双特异性抗体构建体之外，在其他实施方案中，本公开提供了对NRP1和除EGFR以外的受体酪氨酸激酶(RTK)具有结合亲和力的另外双特异性抗体构建体。非限制性实例包括以下代表性构建体。
cMETxNRP1双特异性构建体
在一个实施方案中，RTK为cMET家族成员。在一个实施方案中，RTK为cMET。在实施例8中详细描述了由cMETxNRP1双特异性抗体构建体介导的受体降解。
在实施方案中，cMETxNRP1双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:79、80和81中所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQID NO:81中所示的氨基酸序列的重链CDR3区。在实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:82、83和84中所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的轻链CDR3区。
在实施方案中，cMET结合臂包含本领域已知和可获得的抗cMET单克隆抗体(mAb)的序列，例如mAb的重链和轻链CDR(1-3)或mAb的VH/VL多肽。本领域已经描述了许多抗cMETmAb，包括例如在美国专利US 7,476,724、US 8,673,302和US 9,068,011，在US专利公布US2013/0216527、US2019/0248907和US2021/0087278以及在PCT公布WO 2010/064089中，其每一个的全部内容(包括抗cMET抗体序列)通过参考明确地结合至本文中。本领域已知的抗cMET mAb的非限制性实例包括依玛妥珠单抗(emibetuzumab)(本领域也称为LY2875358)(参见例如Rosen等人.(2017)Clin.Cancer Res.23:1910-1919；Yan等人.(2018)Invest.New Drug 36:536-544)；奥那妥珠单抗(onartuzumab)(参见例如Merchant等人.(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:e2987-e2996；Spigel等人.(2018)J.Clin.Oncol.35:412-420)和特立妥珠单抗(telisotuzumab)(参见例如Camidge等人.(2018)Annals Oncol.29:496-497；Camidge等人.(2022)JTO Clin.Res.Rep.3:100262)，其每一个的全部内容通过参考明确地结合至本文中。
HER2xNRP1双特异性构建体
在一个实施方案中，RTK为HER家族成员。在一个实施方案中，RTK为HER2。在实施例9中详细描述了由HER2xNRP1双特异性抗体构建体介导的受体降解。
在实施方案中，HER2xNRP1双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:79、80和81中所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQID NO:81中所示的氨基酸序列的重链CDR3区。在实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:82、83和84中所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的轻链CDR3区。
在实施方案中，HER2结合臂包含本领域已知和可获得的抗HER2单克隆抗体(mAb)的序列，例如mAb的重链和轻链CDR(1-3)或mAb的VH/VL多肽。本领域已经描述了许多抗HER2mAb，包括例如在美国专利10,377,825，在美国专利公布US2009/0226466、US 2010/0047230、US 2011/0313137、US 2012/0309942、US 2015/0322162、US 2017/0066829和US2018/0201692以及在PCT公布WO 2013/075382中，其每一个的全部内容(包括抗cHER2抗体序列)通过参考明确地结合至本文中。本领域已知的抗HER2 mAb的非限制性实例包括曲妥珠单抗(trastuzumab)(参见例如Romond等人.(2005)New Engl.J.Med.353:1673-1684；Hudis(2007)New Engl.J.Med.357:39-51)和帕妥珠单抗(pertuzumab)(参见例如Baselga等人.(2010)J.Clin.Oncol.28:1138-1144；Swain等人.(2015)New Engl.J.Med.372:724-734)，其每一个的全部内容通过参考明确地结合至本文中。在一个实施方案中，HER2xNRP1双特异性构建体包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列的重链和含有(或由其组成)SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列的轻链，其分别由SEQ ID NO:92和93的核酸序列编码。
IGF1RxNRP1双特异性构建体
在一个实施方案中，RTK为IGFR家族成员。在一个实施方案中，RTK为IGF1R。在实施例10中详细描述了由IGF1RxNRP1双特异性抗体构建体介导的受体降解。
在实施方案中，IGF1RxNRP1双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:79、80和81中所示的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQID NO:81中所示的氨基酸序列的重链CDR3区。在实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含分别含有(或由其组成)SEQ ID NO:82、83和84中所示的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。在一个实施方案中，双特异性抗体包含抗NRP1结合臂，该结合臂包含含有(或由其组成)SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的轻链CDR3区。
在实施方案中，IGF1R结合臂包含本领域已知和可获得的抗IGF1R单克隆抗体(mAb)的序列，例如mAb的重链和轻链CDR(1-3)或mAb的VH/VL多肽。本领域已经描述了许多抗IGF1R mAb，包括例如在美国专利US10,106,614、US10,112,998和US10,519,245，在美国专利公布US2010/0143340和US2014/0079665以及在PCT公布WO 2011/057064中，其每一个的全部内容(包括抗IGF1R抗体序列)通过参考明确地结合至本文中。本领域已知的抗IGF1RmAb的非限制性实例包括加尼妥单抗(ganitumab)(本领域也称为AMG 479)(参见例如Moody等人.(2004)J.Endocrinol.221:145-155；Tap等人.(2012)J.Clin.Oncol.30:1849-1856)、芬妥木单抗(figitumumab)(参见例如Molife等人.(2010)Brit.J.Cancer 103:332-339；Langer等人.(2014)J.Clin.Oncol.32:2059-2066)、西妥木单抗(cixutumumab)(参见例如Rathkopf等人.(2011)J.Clin.Oncol.29:e15081；Schwartz等人.(2013)Lancet14:371-382)和达罗托组单抗(dalotuzumab)(参见例如Scartozzi等人.(2010)Curr.Opin.Mol.Therap.12:361-371；Atzori等人.(2011)Clin.Cancer Res.17:6304-6312)，其每一个的全部内容通过参考明确地结合至本文中。
异种移植小鼠模型中的双特异性结合分子肿瘤生长抑制
在本公开的一些方面，用双特异性抗体治疗减少肿瘤生长。在一些实施方案中，具有重链SEQ ID NO:11和轻链SEQ ID NO:12的双特异性结合分子显著地降低肿瘤生长速率。在一些方面，添加包含NRP1结合结构域的scFv显著地提高肿瘤生长抑制的功效。实施例5描述了用双特异性抗体处理H1975异种移植小鼠模型用于肿瘤生长抑制的方法和结果。表5显示了抑制的百分比肿瘤生长和图13A-13F显示了植入后数天内的肿瘤生长。
双特异性结合分子的生物效应
总之，本公开提供了组合EGFR结合结构域与NRP1结合结构域的双特异性抗体，以通过增加EGFR亲和力来促进高EGFR表达肿瘤的归巢。双特异性结合分子将具有组合在一起以减少癌细胞增殖和存活的多种生物效应，包括通过减少VE-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和整合素β1表达来减少异常血管生成、增加外渗和穿透。NRP1靶向进一步降低EGFR表面汇集，以增强EGFR下调并抑制NRP1检查点免疫抑制。这些特征的组合提供了具有降低EGFR介导的癌细胞增殖和存活的强大能力的双特异性结合分子。
用于转胞吞(transcytosis)循环的FcRn结合
～150kD的抗体大小确保长的血清半衰期，从而获得持久的治疗效果。另外，由重链恒定区2和3(CH2和CH3)组成的抗体IgG Fc部分与新生儿Fc受体(FcRn)结合和细胞表面的Fcγ受体(FcγR)被内吞并通过转胞吞循环回到血清，这进一步延长抗体血清半衰期。FcRn或FcγR表达低的癌症与不良预后相关(Pyzik等人,2019)，并且因此，FcRn-或FcγR-介导的循环在维持抗体血清浓度中起重要作用。IgG1抗体具有比IgG2抗体更有效的FcRn和FcγR循环过程。因此，在治疗性抗体中具有IgG1 Fc结构域助于维持药物治疗水平并降低给予频率，而缩短半衰期对于诊断测试或毒性控制将是理想的。
在一些实施方案中，本发明的多肽包含一种免疫球蛋白结构域，该免疫球蛋白结构域包括包含免疫球蛋白结构域的多肽，该免疫球蛋白结构域包含选自IgG1亚类的Fc结构域。
表达构建体
如本文使用的，术语“载体”或“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具。例如，载体可包括质粒载体、粘粒载体、细菌噬菌体载体以及病毒载体比如腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。重组载体可通过操作相关领域常用的质粒(例如pSC101、pGV1106、pACYC177、ColEl、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列和pUC19等)、噬菌体(例如Agt4AB、A-Charon、AAz1和M13等)或病毒(例如CMV、SV40等)来产生。在一些实施方案中，表达载体包含编码双特异性结合分子的重链融合多肽和轻链多肽的核酸，其中编码重链融合多肽的核酸序列为SEQID NO:15-24中的任何一种和编码轻链多肽的核酸序列为SEQ ID NO:25。
在另一个方面，本公开提供了编码双特异性结合分子重链和轻链氨基酸序列的分离的多核苷酸。在重组载体中编码的多核苷酸可以操作性地连接于启动子。如本文使用的，术语“操作性地连接”是指核苷酸表达控制序列(比如启动子序列)与第二核苷酸序列之间的功能性连接。因此，调节序列可控制第二核苷酸序列的转录和/或翻译。重组载体通常可构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。作为用于表达的载体，可使用相关领域中通常用于表达来自植物、动物或微生物的外来蛋白的载体。重组载体可通过相关领域已知的各种方法构建。重组载体可使用真核细胞作为宿主来构建，具有fl复制起点、SV40复制起点、pMB1复制起点、腺复制起点、AAV复制起点、CMV复制起点和BBV复制起点等，但不限于此。
另外，可使用源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物细胞病毒的启动子(例如腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子或单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)启动子)，并且启动子通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。该载体不仅可表达根据本公开与NRP1特异性地结合的肽结构域，而且可表达具有与其融合的肽的抗体，以及接头肽。在抗体具有与其融合的肽的情况下，载体可使用在一个载体中表达肽和抗体或其片段的载体系统，以及在分别的载体中表达肽和抗体或其片段的载体系统两者。对于后者，这两种载体可通过共转化和靶向转化引入到宿主细胞中。因此，在另一个方面，本公开包括含有在SEQ ID NO:14-38中公开的核酸的载体。实施例1描述了可用于产生双特异性抗体的载体特性。
本公开的另一个方面提供用重组载体转化的宿主细胞。在相关领域已知的任何种类的宿主细胞均可用作宿主细胞。原核细胞的实例包括菌株比如大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110，或属于芽孢杆菌属的菌株(比如枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和肠道菌群(intestinal flora)以及菌株比如各种假单胞菌属物种(Pseudomonas Spp.)等。原核细胞转化可用于以大规模克隆质粒。原核生物宿主细胞可缺乏抗体组装和结构所需的翻译后修饰，并且因此，优选的实施方案为真核宿主细胞中的载体转化，比如酵母(酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞，例如SP2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)K1、CHO DG44、CHO-S、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RN和MDCK细胞系等。在一些实施方案中，宿主细胞包含表达载体，编码双特异性结合分子的重链融合多肽和轻链多肽的核酸，其中编码重链融合多肽的核酸序列为SEQ ID NO:15-24中的任何一种，和编码轻链多肽的核酸序列为SEQ ID NO:25。
本公开的另一个方面提供用于制备与NRP1特异性地结合的肽的方法，包括培养上述宿主细胞。多核苷酸和包括多核苷酸的重组载体可使用相关领域众所周知的插入方法插入到宿主细胞中。例如，当宿主细胞为原核细胞时，可根据CaCl2方法或电穿孔方法等进行转移，和当宿主细胞为真核细胞时，可通过各种方法将载体转移到宿主细胞中，包括显微镜注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转化和基因轰击(gene bombardment)等，但转移方法并不限于此。用于选择转化的宿主细胞的方法可易于根据相关领域众所周知的方法使用由所选标记表达的表型进行。例如，当所选标记为特定抗生素抗性基因时，可通过在含有抗生素、其可接受的盐及药学上可接受的载剂、稀释剂、佐剂或媒介物的培养基中培养转化体而易于选择转化体。药学上可接受的载剂包括例如药用稀释剂、赋形剂或根据预期的给予形式并与常规药用实践一致而适当地选择的载剂。
抗体-药物缀合物
在另一个方面，本公开提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与药物或其他功能化合物(也称为有效载荷)缀合的本公开双特异性抗体(蛋白降解剂)。本领域建立了ADC技术(例如综述于Strohl和Strohl(编辑)“Ch.15:Antibody-Drug Conjugates”inTherapeutic Antibody Engineering(2012)；Tumey(2020)Methods Mol.Biol.2078:1-22中)，许多ADC疗法获得FDA批准。
在ADC中，有效载荷与双特异性抗体缀合，比如经由接头和/或通过使用本领域建立的位点特异性缀合化学。
接头在ADC中的用途例如综述于Nareshkumar等人.(2015)Pharm.Res.32:3526-3540中。在一个实施方案中，接头为可切割的接头。在另一个实施方案中，接头为非可切割的接头。本领域可获得基于化学基序的合适接头，包括二硫化物、腙、肽和硫醚。
各种位点特异性缀合化学在ADC中的用途例如综述于Zhou等人.(2017)Biomedicines 5:64中。这些方法将有效载荷偶联于ADC抗体部分(即本公开的双特异性抗体)中特别限定的位点，包括半胱氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸、短肽标签和聚糖。
在一个实施方案中，ADC中使用的有效载荷对细胞具有毒性(即表现出细胞毒性)。在另一个实施方案中，ADC中使用的有效载荷对细胞为非毒性的(即不表现出细胞毒性)。
在实施方案中，ADC中使用的有效载荷起细胞毒性剂或溶细胞剂的作用。在实施方案中，ADC中使用的有效载荷起增强分子的一种或多种药代动力学特性比如血清半衰期的作用。在实施方案中，ADC中使用的有效载荷起将分子靶向于感兴趣的微环境(例如靶细胞类型或组织)的作用。在实施方案中，ADC中使用的有效载荷赋予分子一种或多种免疫调节特性。在实施方案中，ADC中使用的有效载荷赋予分子一种或多种酶特性。
在实施方案中，ADC中使用的有效载荷为细胞毒性剂或溶细胞剂，其非限制性实例包括小分子药物(例如化学治疗剂)、蛋白毒素、细菌毒素、溶细胞蛋白/肽和放射性核素。
在实施方案中，与双特异性抗体缀合的有效载荷通过选自靶向叶酸受体、抑制微管、切割DNA和抑制TOP1的机制起作用。
在实施方案中，与双特异性抗体缀合的有效载荷属于一类选自美登木素类(maytansinoid)(例如美登木素DM4)、MMAE/奥瑞他汀类(auristatin)和喜树碱类(camptothecin)的有效载荷。
在实施方案中，与双特异性抗体缀合的有效载荷选自维多汀(vedotin)、美坦新(emtansine)、戈维替康(govitecan)、他立林(talirine)、奥佐米星(ozogamicin)、帕西妥(pasudotox)、德鲁替康(deruxtecan)、莫福汀(mafodotin)、索星(soravtansine)和tesinine。
在实施方案中，与双特异性分子缀合的有效载荷为放射性核素，其非限制性实例包括90Y和111In。
在实施方案中，与双特异性分子缀合的有效载荷为蛋白毒素，比如假单胞菌属内毒素或白喉毒素。
在实施方案中，与双特异性分子缀合的有效载荷为免疫调节肽，比如Fas配体(FasL)。
在实施方案中，与双特异性分子缀合的有效载荷为生物活性肽，比如延长药理学半衰期(例如GLP1)或靶向于特定细胞。例如，降钙素已被用于将ADC靶向于破骨细胞(Newa等人.(2011)Pharm.Res.28:1131-1143)。
在实施方案中，与双特异性分子缀合的有效载荷为酶。
在实施方案中，与双特异性分子缀合的有效载荷为寡核苷酸。
药用组合物
本公开的方面进一步包括组合物。根据一些实施方案，本公开的组合物包括本公开的双特异性结合分子。例如，双特异性结合分子可为上文双特异性抗体部分中描述的任何双特异性结合分子，为简洁起见，本文纳入了这些描述但未复述。
本文描述的多肽可配制成药用组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂、稀释剂、佐剂或媒介物。在一个实施方案中，本公开提供一种药用组合物，其包含所公开的多肽以及药学上可接受的载剂、稀释剂、佐剂或媒介物。在一个实施方案中，本发明是一种药用组合物，其包含有效量的所公开的双特异性抗体或药学上。
药学上可接受的载剂或赋形剂可含有不会过度抑制多肽生物活性的惰性成分。药学上可接受的载剂应为生物相容性的，例如非毒性、非炎症性、非免疫原性或在给予受试者后没有其他不期望的反应或副作用。可采用标准的药用制剂技术。
如本文使用的，药学上可接受的载剂、佐剂或媒介物包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适于期望的特定剂型。Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载剂以及用于其制备的已知技术。除非在任何常规载剂培养基与本文描述的多肽不相容的情况下，比如通过产生任何不合期望的生物效应或以其他方式与药学上可接受的组合物的任何其他成分以有害方式相互作用，否则考虑其用途在本发明的范围内。如本文使用的，短语“副作用”包括疗法不想要的和不良作用。
可充当抗体的药学上可接受的载剂的材料可增加构象稳定性，降低蛋白动力学，抑制聚集，和保护蛋白吸附到液态空气界面，并且包括但不限于环糊精水凝胶、离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(比如人类血清白蛋白)、缓冲物质(比如吐温80、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(比如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氯化钠或锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、糖类比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂比如可可脂和栓剂蜡；油类比如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇类，比如丙二醇或聚乙二醇；酯类比如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂比如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他非毒性相容性润滑剂，比如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味、矫味和加香剂、防腐剂和抗氧化剂根据配方设计师的判断也可存在于组合物中。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含药学上可接受的盐。当本发明的多肽含有相对酸性的官能性时，可通过使此类多肽的中性形式与足够量的期望的碱接触来获得碱加成盐，所述碱要么是纯的要么是在合适的惰性溶剂中。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似盐。当本发明的多肽含有相对碱性的官能性时，可通过使此类多肽的中性形式与足够量的期望的酸接触来获得酸加成盐，所述酸要么是纯的要么是在合适的惰性溶剂中。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生于无机酸的那些，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生于相对非毒性有机酸的盐，如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，比如精氨酸盐等，以及有机酸的盐，如葡萄糖醛酸或半乳醛酸等。(参见例如Berge等人,“Pharmaceutical Salts”,Journal ofPharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本公开的某些特定多肽含有碱性和酸性官能性两者，这些官能性允许多肽转化成碱或酸加成盐。
因此，所公开的多肽可作为盐存在，比如与药学上可接受的酸的盐。本发明包括此类盐。此类盐的非限制性实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、丙酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐，以及与氨基酸比如谷氨酸的盐，以及季铵盐(例如甲基碘化物、乙基碘化物等)。可通过本领域技术人员已知的方法来制备这些盐。
多肽的中性形式优选地通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体多肽来再生。多肽的母体形式在某些物理特性方面可与各种盐形式不同，比如在极性溶剂中的溶解性。
本发明的某些多肽可以未溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于未溶剂化形式，并且包括在本发明的范围内。本发明的某些多肽可以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明考虑的用途均为等同的，并且均预期处于本发明的范围内。
在一些实施方案中，皮下制剂可含有重组人类PH20透明质酸酶(rHuPH20)，以促进抗体从注射部位的分散。
在双特异性结合分子的一些实施方案中，药用组合物包含治疗有效量的双特异性结合分子和药学上可接受的载剂。在双特异性结合分子的一些实施方案中，药用组合物进一步包含治疗有效量的双特异性结合分子和一种或多种用于化学疗法的治疗剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含一个或多个单位剂量的含有本文的双特异性结合分子和药学上有效的载剂的药用组合物，以及用于将一个或多个单位剂量的药用组合物给予需要它的受试者的说明书。
给予方法
可将本发明的组合物给予需要癌症治疗的受试者。术语“给予(administration)”或“给予(administering)”是指向需要癌症治疗的受试者提供本发明组合物的行为，例如多肽或其药学上可接受的盐。
如本文使用的，“间歇给予”包括在一段时间内给予药物(其可认为是“第一给予期”)，然后是期间不服用或以较低的维持剂量服用组合物的时间(其可认为是“停用期”)，然后是期间再次给予组合物的时期(其可认为是“第二给予期”)。通常，在给予的第二阶段期间，药物的剂量水平将与第一给予期期间给予的相匹配，但可根据医疗需要增加或减少。
在一些实施方案中，本发明的组合物可通过口服、作为栓剂、局部接触、静脉内、非肠道、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下给予或者植入缓释装置例如微型渗透泵来给予受试者。因此，给予可通过任何途径，包括非肠道和经粘膜(例如口腔、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。非肠道给予包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、脑室内等。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注或经由植入储库等。具体地讲，组合物口服、腹膜内或静脉内给予。
在一些实施方案中，通过全身静脉内(IV)或口服途径给予双特异性结合分子组合物用于肠癌，比如胃癌或肠癌(Tashima等人,2021)。用于递送的制剂可通过本领域众所周知的惯常、常规方法进行优化。用于口服给予的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性多肽之外，液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，比如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，比如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括佐剂，比如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味、矫味和加香剂。
在一些实施方案中，双特异性结合分子组合物通过皮下注射给予。可将可注射的双特异性结合分子制剂进行灭菌，例如通过经细菌保留过滤器的过滤，或通过在使用之前纳入分散于无菌水或其他无菌注射介质中的灭菌剂。为了延长本文所述多肽的作用，经常合乎期望的是减缓多肽从皮下或肌肉注射的吸收。这可通过使用水溶性不良的结晶或无定形材料的液体混悬液来实现。然后多肽的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。备选地，通过将多肽溶解或悬浮于油媒介物中来实现非肠道给予的多肽形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物比如聚丙交酯-聚乙交酯中形成多肽的微胶囊基质制成可注射贮藏库形式。取决于多肽与聚合物的比率以及所采用特定聚合物的性质，可控制多肽释放的速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也通过将多肽捕获于与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备贮藏库可注射制剂。
本文所述组合物的无菌可注射形式可为水性或油性混悬剂。可根据本领域已知的技术使用合适的分散或湿润剂和悬浮剂来配制这些混悬剂。无菌可注射制剂也可为在非毒性非肠道可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液剂。在可采用的可接受媒介物和溶剂中包括水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌、不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单-或二酯。脂肪酸，比如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备注射剂，作为天然药学上可接受的油，比如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化版本。这些油溶液剂或混悬剂还可含有长链醇稀释剂或分散剂，比如羧甲基纤维素或类似分散剂，这些分散剂通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和混悬剂。通常用于制造药学上可接受的剂型的其他常用的表面活性剂，比如吐温类、司盘类和其他乳化剂或生物利用度增强剂，也可用于配制的目的。
在一些实施方案中，该制剂包括试剂，比如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，并且优选地为锌。该制剂还可包括用于多肽稳定的赋形剂或试剂，比如缓冲剂、还原剂、成批蛋白或碳水化合物。可用于配制至少一种多肽组合物的成批蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制至少一种多肽的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。双特异性结合分子制剂还可包括表面活性剂，其可减少或防止由形成气溶胶时溶液雾化导致的至少一种多肽的表面诱导的聚集。可采用各种常规表面活性剂，比如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常将在按制剂的重量计约0.001％-4％之间的范围内。出于本发明的目的尤其优选的表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知的用于配制多肽的另外试剂，比如抗体蛋白，也可包括在制剂中。
感兴趣的靶蛋白
基因组研究已经揭示了编码受体酪氨酸激酶(RTK)比如EGFR、HER2/Erb2和MET的基因中存在各种类型的改变，以及已知与许多人类疾病相关的许多其他的，尤其是在癌症中。例如，非小细胞肺癌(NSCLC)中的EGFR突变、NSCLC中的MET外显子14跳跃突变、甲状腺髓样癌中的RET突变、NSCLC中的ALK易位和ROS1易位以及乳腺癌中HER2的扩增或过表达已有报道。
本发明提供与EGFR结合并随后通过溶酶体降解途径降解EGFR的双特异性结合分子。已知包括EGFR家族、FGFR家族、PDGFR家族、MET家族和VEGFR家族的20种受体酪氨酸激酶为NRP1的辅助受体(参见Critchley等人,Cells(2018)7(3):22)。
在一些实施方案中，本文中双特异性结合分子的靶蛋白包括但不限于致癌受体，比如受体酪氨酸激酶(RTK)和受体丝氨酸/苏氨酸激酶(RSTK)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)家族、酪氨酸激MET家族和血管内皮生长因子(VEGFR)家族。
在一些实施方案中，靶蛋白为RTK，条件是靶蛋白不是EGFR。
在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶受体包括HER1/ErbB1、HER2/ErbB2、HER3/ErbB3和HER4/ErbB4，FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4、Met和Ron、PDGFR家族PDGFRα、PDGFRβ、CSF-1R、Kit和FLT-3以及VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。
在一些实施方案中，本文双特异性结合分子的靶蛋白包括但不限于受体丝氨酸/苏氨酸激酶、G-蛋白偶联受体、免疫检查点受体和离子通道受体。
在一些实施方案中，受体丝氨酸/苏氨酸激酶为ACVR1/ALK1、ACVR2/ALK2、ACVR1B/ALK4、ACVR1C/ALK7、ACVRL1、BMPR1A、BMPR1B、TGFBR1、ActR2、ActR2B、MISR2、BMPR2、TGFBR2和TGFBR3。在一些实施方案中，G蛋白偶联受体(GPCR)为CXCR4、EBI2、CCR7、ADRB2、BAI2、FZD6、CD97、GPR153、FZD4、FZD2、F2R、ADORA2B、CD97、OPN3、GPR125、GPR126、GABBR1、CNR2、GPR92、PAR1、LPAR1、SSTR1、GPRC5B、GPRC5B、GPCR68、OXTR、LPHN2、FZD7、GABBR1、GPR125和EDG3。
在一些实施方案中，G-蛋白偶联受体选自GPCR、CCR和CXCR。
在一些实施方案中，免疫检查点受体选自CTLA4、PD-L1、PD-1和整合素。
在一些实施方案中，离子通道受体为电压门控受体。
在双特异性结合分子的一些实施方案中，本文感兴趣的靶蛋白包括但不限于疾病相关蛋白。
试剂盒
本公开的方面进一步包括试剂盒。在某些实施方案中，这些试剂盒可用于实践本公开的方法，例如包括将本公开的药用组合物给予受试者以在受试者中增强抗肿瘤免疫力，将本公开的药用组合物给予受试者以在受试者中增强或抑制免疫反应的方法等。
因此，在某些实施方案中，本公开的试剂盒包含本公开药用组合物的一个或多个单位剂量，以及用于将药用组合物给予需要它的受试者的说明书。试剂盒中包括的药用组合物可包括任何一种本公开的双特异性抗体，例如任何一种上文描述的双特异性结合分子，为简洁起见，本文不复述。
本公开的试剂盒可包括一定量的组合物，以单位剂量存在，例如安瓿或多剂量形式。因此，在某些实施方案中，这些试剂盒可包括包含本公开双特异性结合分子的组合物的一个或多个(例如两个或更多个)单位剂量(例如安瓿)。如本文使用的，术语“单位剂量”是指适合作为用于人类和动物受试者的单位剂量的物理离散单位，每个单位均含有以足以产生期望作用的量计算的预定数量的组合物。单位剂量的量取决于各种因素，比如采用的特定双特异性结合分子、待实现的效果以及与个体中双特异性结合分子相关的药效学。在仍然其他实施方案中，这些试剂盒可包括单个多剂量的量的组合物。在某些实施方案中，本公开的试剂盒包括用于给予需要增强抗肿瘤免疫力的受试者药用组合物的一个或多个单位剂量的说明书。根据一些实施方案，本公开的试剂盒包括用于给予需要增强或抑制免疫反应的受试者药用组合物的一个或多个单位剂量的说明书。
组合疗法
在一些实施方案中，可以采用单独或与另外合适的化学治疗剂(例如奥沙利铂、伊立替康或FOLFOX)组合的多肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物(例如水合物)，以本发明方法或药用组合物实现双特异性抗体的有效量。当采用“组合疗法”时，可使用第一量的多肽或其药学上可接受的盐或溶剂化物(例如水合物)和第二量的另外合适的化学治疗剂来实现有效量。
共同给予包括以基本上同时的方式给予第一和第二量的多肽和化学治疗剂，比如以单个药用组合物，例如具有固定比率的第一和第二量的胶囊剂，或者每个以多个单独的胶囊剂。另外，这种共同给予还包括以任一顺序以依序方式使用每种多肽。
当共同给予涉及第一量的多肽和第二量的另外治疗剂的单独给予时，多肽的给予时间足够接近以具有期望的治疗效果。例如，每次给予之间可产生期望治疗效果的时间段可从数分钟到数小时的范围内，并且可考虑每种药物的特性来确定，比如效力、溶解性、生物利用度、血浆半衰期和动力学特征。例如，多肽和第二治疗剂可在彼此相距约24小时内、彼此相距约16小时内、彼此相距约8小时内、彼此相距约4小时内、彼此相距约1小时内或彼此相距约30分钟内以任何顺序给予。
更具体地讲，本发明的双特异性结合分子可在给予受试者第二抗癌剂之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)给予。
应当理解，共同给予第一量的双特异性结合分子和第二量的另外治疗剂的方法可导致增强或协同作用的治疗效果，其中该组合效应大于将会由单独给予第一量的多肽和第二量的另外治疗剂产生的累加效应。
疗法组合(例如预防或治疗剂的组合)的协同作用可允许使用较低剂量的一种或多种疗法和/或较少频次的给予受试者所述疗法。利用较低剂量的疗法(例如预防或治疗剂)和/或较不频繁地给予所述疗法的能力可降低与给予受试者所述疗法相关的毒性而不会降低所述疗法在治疗癌症中的功效。另外，协同作用可导致提高药物在预防、管理或治疗障碍方面的功效。最后，疗法组合(例如预防或治疗剂的组合)的协同作用可避免或减少与单独使用任一疗法相关的不良或不想要的副作用。
当使用本发明双特异性结合分子的组合疗法与另一种抗癌剂组合时，可给予两种治疗剂，使得每次给予之间的时间段可以更长(例如数天、数周或数月)。
可使用用于评价药物相互作用的合适方法来确定协同作用的存在。合适的方法包括例如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.6:429-453(1981))、Loewe相加性方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.PatholPharmacol.114:313-326(1926))和半数有效方程(median-effect equation)(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984))。每个以上提及的方程均可与实验数据一起应用以生成相应的图表，以助于评价药物组合的效果。与以上提及的方程相关的相应图表分别为浓度-效应曲线、等效线图(isobologram)曲线和组合指数曲线。
方法
本公开的方面包括使用本公开双特异性抗体的方法。这些方法在各种情况下均有用，包括体外和/或体内研究和/或临床应用。
在某些方面，提供了在需要它的受试者中增强抗肿瘤免疫力的方法。此类方法包括给予个体有效量的本公开药用组合物，例如包含含有靶蛋白结合结构域和NRP1结合结构域的本公开双特异性结合分子的药用组合物。在某些实施方案中，这些方法用于在个体中增强靶蛋白的抗体依赖性溶酶体降解和/或对癌细胞的细胞毒性。
在某些方面，提供了在需要它的受试者中抑制或遏制肿瘤细胞生长的方法。此类方法包括给予个体有效量的本公开药用组合物，例如包含含有靶蛋白结合结构域和NRP1结合结构域的本公开双特异性结合分子的药用组合物。
需要它的受试者可患有细胞增殖性障碍。“细胞增殖性障碍”意指其中多细胞生物体中的一个或多个细胞亚群发生不想要的细胞增殖，导致伤害，例如对生物体造成疼痛或预期寿命缩短。细胞增殖性障碍包括但不限于癌症、癌前、良性肿瘤、血管增殖性障碍(例如关节炎、再狭窄等)、纤维化障碍(例如肝硬化、动脉粥样硬化等)、银屑病、表皮和皮样囊肿、脂肪瘤、腺瘤、毛细血管和皮肤血管瘤、淋巴管瘤、痣病变、畸胎瘤、肾瘤、肌纤维瘤病、骨成形性肿瘤、发育不良肿块、系膜细胞增殖性障碍等。
在一些实施方案中，受试者患有癌症。可采用主题方法用于治疗各种癌症。如本文使用的，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞的生长和增殖，无论是恶性还是良性的，以及所有癌前和癌性的细胞和组织。术语“癌症(cancer)”和“癌性(cancerous)”是指或描述哺乳动物的生理状况，其一般地特征为细胞生长/增殖不受调节。可使用主题方法治疗的癌症实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、胆管癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、各种类型的头颈癌等。在某些实施方案中，受试者患有选自以下的癌症：实体瘤、复发性多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非小细胞肺癌、转移性黑色素瘤、黑色素瘤、腹膜癌(peritoneal cancer)、上皮性卵巢癌、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、转移性结直肠癌、结直肠癌、胰腺导管腺癌、鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、神经母细胞瘤、输卵管癌、膀胱癌、转移性乳腺癌、胰腺癌、软组织肉瘤、复发性头颈癌鳞状细胞癌、头颈癌、间变性星形细胞瘤、恶性胸膜间皮瘤、乳腺癌、鳞状非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤、转移性肾细胞癌、基底细胞癌(基底细胞上皮瘤)和胶质肉瘤。在某些方面，受试者患有选自黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌(RCC)、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的癌症。
本公开的双特异性抗体可经由选自口服(例如以片剂形式、胶囊剂形式、液剂形式等)、非肠道(例如通过静脉内、动脉内、皮下、肌内或硬膜外注射)、局部、鼻内或瘤内给予的给予途径给予。
本公开的双特异性抗体可以以治疗有效量的药用组合物给予。“治疗有效量”意指足以产生期望的结果的剂量，例如与对照相比较，足以实现有益或期望的治疗(包括预防性)结果的量，比如减轻癌症和/或免疫障碍的症状。关于癌症，在一些实施方案中，治疗有效量足以减缓肿瘤的生长，减小肿瘤的大小，和/或类似情况。可以以一次或多次给予来给予有效量。
本公开的方面包括用于治疗个体的癌症和/或免疫障碍的方法。治疗意指至少改善与个体的癌症和/或免疫障碍相关的一种或多种症状，其中改善在广义上被用于指涉至少降低参数的大小，所述参数例如与所治疗的癌症和/或免疫障碍相关的症状。因此，治疗还包括其中癌症和/或免疫障碍或者与之相关的至少一种或多种症状得到完全抑制的情况，例如防止发生或停止，例如终止，使得受试者不再患有癌症和/或免疫障碍或者至少特征为癌症和/或免疫障碍的症状。
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应解释为进一步限制。贯穿该申请中引用的图表和所有参考文献、专利和共布的专利申请的内容均通过参考明确地结合至本文中。
实施例
该说明书中的实施例并不预期且不应被用于限制本发明；提供它们仅用于说明本发明。
实施例1.双特异性抗体的产生
通过密码子优化的基因合成产生设计的蛋白，并使用Not I和Hind III限制性内切酶作为表达载体插入到pcDNA3.4中。表1显示了SEQ ID NO:1中所示的重链多肽的序列以及本文中使用的SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和39中的双特异性结合分子的重链融合多肽，其与SEQ ID NO:12中所示的轻链多肽序列组合。表2显示了SEQ ID NO:14中所示的编码重链多肽的多核苷酸序列，以及SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和40中所示的编码双特异性抗体的重链多肽的多核苷酸序列。编码与双特异性抗体的重链多肽组合的轻链多肽的多核苷酸序列阐述于SEQ ID NO:25。SEQ ID NO:26-38中所示的序列公开了用于编码肽接头的GGGGS亚基的多核苷酸序列。构建的表达载体包括用于优化转录的信号肽，Kozak序列可包含在5’非翻译区中。
为了获得用于转染的质粒构建体的量，将质粒构建体转化到One ShotTM Top10大肠杆菌感受态细胞中，然后培养过夜。通过PureLinkTM HiPure Expi质粒Megaprep试剂盒获得构建体质粒。
在CHO-S系统(Thermo Fisher Scientific Inc.)中瞬时表达融合蛋白。根据制造商的说明书单独地表达蛋白。简言之，用OPTIPROTMSFM和ExpiFectamineTM制备总计0.8μg质粒DNA，每mL CHO-S培养物的轻链与重链比率为1:1。将混合物以6×106个细胞/mL的活细胞密度和大于98％的活力添加到CHO-S细胞中。在以125RPM和19mm轨道振荡的NalgeneTM一次性PETG爱伦美氏烧瓶中，在37℃、80％湿度、8％ CO2下将细胞培养物温育过夜。第二天，培养物得到增强(ExpiCHOTM增强剂；Thermo Fisher Scientific Inc.)和饲喂(ExpiCHOTM饲料；Thermo Fisher Scientific Inc.)并转移到32℃、80％湿度、5％ CO2，以125RPM和19mm轨道振荡。第5天进行第二次饲喂，并且培养物恢复到32℃。直至第12天收获。经由以4000xg离心20分钟实现收获。使用不对称聚醚砜(PES)0.22-μM过滤器组件(Nalgene)对澄清的上清液进行灭菌。滤液储存于4℃下。直至第二天纯化。
在(GE Healthcare Life Sciences)上，使用MabSelect prismATM树脂(GE Healthcare Life Sciences)纯化所有抗体灭菌的上清液。使用50mM磷酸钠、150mMNaCl、pH 7.0缓冲液平衡树脂。然后将抗体上清液加载到柱中。用50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH 7.0缓冲液洗涤树脂，直至色谱基线恢复到柱平衡水平。然后使用100mM乙酸钠、20％甘油(pH 3.0)进行洗脱，并收集级分。立即用1M Tris(pH9)中和级分。将在波长280nm下含有明显吸光度的级分合并到Amicon10-kDa超滤装置中进行缓冲液更换。通过离心使用储存缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)去除洗脱缓冲液，在Amicon浓缩器中半稀释7次。提交材料用于SEC并然后在4℃下储存。
将阳离子交换色谱用于纯化抗体。阳离子交换色谱柱(Capto SImpAct)用1M NaOH消毒并用MQ冲洗。用50mM NaAc pH 5.5(起始缓冲液)和50mM NaAc pH5.5、1M NaCl(洗脱缓冲液)完成平衡。将蛋白A纯化的抗体以1-2g抗体/mL树脂的浓度上样。然后用50mM NaAc(pH5.5)洗涤柱。然后使用5％-60％洗脱缓冲液的梯度以25个柱体积洗脱抗体产物。分别收集CEX纯化中的每个峰，并使用Ultra-15离心过滤装置经由以4000xg离心进行浓缩，然后将缓冲液换成PBS。
在具有二极管阵列UV检测器WR的Agilent Infinity 1260II四元泵高效液相色谱(HPLC)系统上进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。将二十(20)μg抗体材料进样到XBridge蛋白BEH SEC柱上，2.5μm，4.6mm X 150mm柱。流动相为100mM磷酸盐、300mM氯化钠(pH7.0，在50℃下)，并且流速为0.3mL/min。在10分钟的采集期间，以1Hz采样率在220、280和330nm波长处检测抗体材料。
表1.双特异性结合分子的氨基酸序列
表2.编码双特异性结合分子多肽的核苷酸序列
实施例2.双特异性结合分子对EGFR和NRP1的结合亲和力
使用Octet red 96系统进行BLI结合研究，以评价双特异性抗体与重组huEGFR和huNRP1的结合。简言之，将商业来源的生物素化的huEGFR和huNRP1固定于链霉亲和素(Sa)生物传感器上，并用产生的构建体查询以进行结合和表征。使用BLI技术，对与构建体的结合评估动力学和结合亲和力(平衡结合常数，KD)两者，并以二价形式进行评价。进行这些研究以确定靶向肿瘤相关的必需受体的抗体(TAER-TAB)是否结合癌症靶标(EGFR和NRP1)，并评价它们对靶标的亲和力。使用Octet Red 96系统进行结合huEGFR和huNRP1的构建体以及KD测定。
将huEGFR和huNRP1(在其相应的固定柱中)以在2X动力学缓冲液中0.2μg/ml的浓度(加载信号范围为0.2-0.4纳米)固定到Sa生物传感器上，每个的加载时间为180秒。基线后加载进行60秒。在100nM(高亲和力结合为10nM)下开始构建体的缔合，然后进行2次1:1连续稀释，并且然后是仅含缓冲液的第四孔(空白)。在基线孔后构建体解离。通过将构建体施用于空白AMC生物传感器或链霉亲和素生物传感器表面上来产生参考传感器。缔合和解离步骤各为600秒。使用Octet分析软件分析数据，应用1:1和2:1模型拟合，报告解离常数KD(M)。
所有EGFRxNRP1双特异性抗体构建体，包括构建体1(SEQ ID NO:1和12)和构建体11(SEQ ID NO:11和12)，对EGFR具有两位数皮摩尔的结合亲和力。参见表3。对于NRP1结合，EGFRxNRP1双特异性抗体构建体2、3、5、7、9、10和11表现出亚纳摩尔亲和力，而构建体1在两位数纳摩尔下与NRP1结合。图2A-2K显示了双特异性抗体与固定化huEGFR的结合亲和力曲线。图3A-3K显示了EGFRxNRP1抗体对固定化huNRP1的结合亲和力曲线。
表3.EGFRxNRP1抗体对EGFR和NRP1的结合亲和力
实施例3.HUVEC细胞中的VEGFR2信号传导抑制
通过基于蛋白质印迹用抗磷酸化VEGFR2探测电泳细胞裂解物，测试HUVEC细胞中的EGFRxNRP1双特异性抗体对VEGFR2信号传导的抑制。HUVEC细胞在补充有EGM-2SingleQuots的6孔板中的EBM-2培养基中生长过夜。第二天，将细胞用2ml F-12K培养基与0.1mg/ml肝素、内皮细胞生长补充剂和10％ FBS一起温育4小时。为了观察对EGFRxNRP1抗体的剂量依赖性反应，细胞以用无血清培养基从最高浓度1μM 6倍连续稀释到最低浓度0.005μM的EGFRxNRP1双特异性抗体处理30分钟，然后用2.2ng/ml的VEGF165或对照处理10分钟。通过用细胞刮刀收集细胞，并与100μl的NP-40裂解缓冲液和蛋白酶/磷酸酶抑制剂一起在冰上温育20分钟，制备细胞裂解物。将上清液裂解物在以13,000rpm离心10分钟之后收集到新试管中，使用BCA蛋白测定测量蛋白量化，并在与NuPAGE LDS样品缓冲液和LDS样品还原缓冲液混合之后于70℃下变性10分钟。
将等于10μg的细胞裂解物与4μl的PageRuler Plus预染色蛋白梯一起加载到4-12％ Bis-Tris凝胶中，并在200V下运行45分钟。将凝胶用蒸馏水洗涤，并使用IBlot2Drying印迹系统转移到膜上。将膜在室温下用在1x TBST中的5％牛奶封闭1小时，并在4℃下与在1xTBST中的5％牛奶中的抗磷酸化VEGFR2(Y1175)一起温育过夜。第二天，将膜用TBST洗涤3次持续10分钟，并在室温下与5％牛奶中的二抗一起温育1小时。将膜用1xTBST洗涤3次持续10分钟。然后，将膜与SuperSignal Femto化学发光底物一起温育1-2分钟，并用Amersham ImageQuant 800成像。然后于室温下在摇床上用Restore Plus蛋白质印迹剥离缓冲液将印迹剥离15分钟，然后进行1x TBST洗涤3次，并从牛奶封闭开始重复该程序，然后温育一级抗VEGFR2抗体。
使用ImageJ软件分析磷酸化VEGFR2(Y1175)和VEGFR2的蛋白质印迹条带的强度。获得的磷酸化VEGFR2(Y1175)的条带密度通过VEGFR2归一化，并且EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11对VEGFR2磷酸化的抑制通过相对于VEGF165对照细胞裂解物(阳性对照)的比率计算。使用Prism9软件测定EGFRxNRP1双特异性抗体对VEGFR2磷酸化的IC50。参见图11A-11B。图3中的蛋白质印迹显示，用EGFRxNRP1双特异性抗体构建体1(SEQ ID NO:1和12)的双特异性结合分子温育HUVEC细胞并不抑制VEGF165介导的VEGFR磷酸化。图5-11显示了与双特异性抗体温育之后VEGFR2磷酸化抑制的蛋白质印迹和IC50图。在表4中显示了双特异性抗体的IC50。
表4.通过EGFRxNRP1抗体的VEGFR信号传导抑制
EGFRxNRP1 BsA构建体 SEQ ID NO(重链和轻链) 图 VEGF抑制(nM)
构建体1 SEQ ID NO:1,12 3 n/a(在1μM中抑制低于5％)
构建体2 SEQ ID NO:2,12 4 12.9
构建体3 SEQ ID NO:3,12 5 3.3
构建体4 SEQ ID NO:4,12 6 410
构建体5 SEQ ID NO:5,12 7 61
构建体6 SEQ ID NO:6,12 8 10130
构建体7 SEQ ID NO:7,12 9 1.74
构建体11 SEQ ID NO:11,12 10 20
实施例4：EGFRxNRP1双特异性抗体对细胞活力的作用
在H1975肺癌细胞系中测试了双特异性抗体对细胞活力的抑制。简言之，在补充有1％青霉素/链霉素和10％ FBS的RPMI1640中生长H1975肺癌细胞。将细胞胰蛋白酶化并接种到圆底的96孔3D培养板中(3,000个细胞/120μl/孔)并温育3-4小时，直至它们聚集形成3D球状体。制备5μM-0.6pM的6倍连续稀释的EGFRxNRP1双特异性抗体储备母板。用30μl的EGFRxNRP1双特异性抗体处理H1975细胞并温育72小时(一式两份)。随后，向每个孔中加入CellTiter-Glo 3D试剂和25μl无血清培养基，用箔包裹，并在摇床上温育7分钟。用Varioskan Lux多模式读板器读取板并用Prism9软件进行分析。
表5显示了EGFRxNRP1抗体的IC50。与其他EGFRxNRP1抗体构建体相比较，在C-末端具有NRP1结合结构域而未与scFv融合的EGFRxNRP1双特异性抗体构建体(SEQ ID NO:1和12)具有高IC50值(1.96μM)，如图12A所示。参见图12B。IC50值数据表明，包含EGFRxNRP1抗体的NRP1结合结构域的短链可变片段(scFv)对EGFRxNRP1抗体在抑制肿瘤细胞生长中的功能至关重要。
表5.通过EGFRxNRP1抗体的细胞生长抑制
实施例5：在H1975异种移植小鼠模型细胞系中的肿瘤生长抑制
在H1975细胞系异种移植小鼠模型中测试了EGFRxNRP1抗体抑制肿瘤生长的能力。所有细胞系均得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)。将细胞在37℃下于5％CO2温育器中维持于含有10％胎牛血清(HyClone,Logan,UT,USA)和2mmol/L谷氨酰胺(HyClone,Logan,UT,USA)的RPMI 1640(Gibco,Carlsbad,CA,USA)中。
异种移植模型
根据美国农业部、卫生与公众服务部和NIH关于实验室动物的人道关怀和使用的政策进行涉及小鼠的实验和程序。将来自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(Wilmington,MA,USA)的6-8周龄雌性无胸腺(nu/nu)小鼠饲养在无病原体的条件下，实验室食物和水任意饮食。在肿瘤细胞系植入之前，所有细胞系均感染因子(支原体等)进行了筛选。通过将含有在基质胶(Corning,Corning,NY,USA)中以1:1混合的1x 107(NCI-H1975)个细胞/小鼠的100μl皮下注射到右胁腹中来建立异种移植。对于功效研究，在随机化和治疗开始之前，允许肿瘤达到150-300mm3(每组7-10只小鼠)。
治疗和肿瘤测量
将抗体在无菌磷酸盐缓冲盐水(Corning,Corning,NY,USA)中稀释，并在随机化当天以指定的剂量水平经由i.p.注射给予，每次治疗总体积为每小鼠100μl，并然后每周两次。
使用数字卡尺测量来测量肿瘤大小，并使用公式V＝(W2×L)/2计算肿瘤体积，其中W为肿瘤宽度，和L为肿瘤长度。
统计分析
使用GraphPad Prism 7软件(La Jolla,CA,USA)进行统计分析。结果显示为平均值。使用斯氏t检验比较对照和实验组之间在单个时间点或终点的数据。对于涉及伴随重复测量的纵向数据的生长曲线分析，使用II型ANOVA。p<0.05时的统计学差异被认为是显著的。根据公式TGI(％)＝(VC1-Vt1)/(VC0-Vt0)X 100计算TGI％，其中VC1和Vt1分别为研究终点时对照和治疗组的平均肿瘤体积，并且VC0和Vt0分别为实验开始时对照和治疗组的平均肿瘤体积。表6显示了异种移植小鼠模型中EGFRxNRP1抗体对肿瘤生长的抑制和治疗-对照百分比肿瘤体积。图13-13F中的曲线显示了在用EGFRxNRP1抗体治疗的小鼠在植入后数天内的平均肿瘤体积。具有scFv NRP1结合结构域的EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11具有最高的肿瘤生长抑制，例如用EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11处理导致100％的肿瘤生长抑制。
表6.肿瘤生长抑制和治疗-对照百分比肿瘤体积
双特异性结合分子多肽 TGI％平均值 T/C％
SEQ ID NO:1,12 39.94 74.58％
SEQ ID NO:2,12 23.94 81.91％
SEQ ID NO:3,12 71.13 37.15％
SEQ ID NO:7,12 81.09％ 28.08％
SEQ ID NO:9,12 94.96％ 18.86％
SEQ ID NO:11,12 102.56％ 12.54％
实施例6.在H1975细胞中通过构建体11的EGFRT790/L858R的降解
通过结合EGFR的催化位点并阻断其激酶活性，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)已被广泛地用于治疗具有组成型活性EGFR突变的癌症。然而，它们也可诱发获得性抗性和。第一代EGFR TKI吉非替尼在治疗之后于大多数患者中诱导T790M突变。第二代EGFR TKI阿法替尼与EGFR不可逆地结合，但其对EGFR WT和EGFRT790M缺乏选择性并引起不良反应。第三代EGFR TKI奥希替尼对具有EGFRT790M突变的肿瘤有效，但某些患者可出现获得性抗性，比如C797S突变。此外，伴有EGFR WT的NSCLC对TKI无反应。因此，无论EGFR突变状态如何，通过诱导降解来靶向EGFR可为癌症治疗中抑制EGFR的更有效方法。
抗EGFR抗体可阻断配体介导的EGFR信号传导激活并诱导受体内吞作用，但EGFR受体大多被回收。在癌细胞中评价了EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11降解双突变EGFRT790 /L858R的能力，以验证构建体11的抗癌活性与EGFR蛋白水平之间的关联。携带EGFRT700M/L858R突变的H1975细胞在组织培养板中于具有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中生长。将细胞与固定的(150nM)或从最高浓度1μM 6倍连续稀释到最低浓度0.77nM的构建体11一起温育16小时。蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)或溶酶体蛋白降解抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf A1，200nM)与EGFRxNRP1双特异性抗体治疗一起使用，以确定EGFRxNRP1抗体的作用机制。通过用细胞刮刀收集细胞，并与具有蛋白酶/磷酸盐抑制剂的NP40裂解缓冲液一起在冰上温育20分钟来制备细胞裂解物。将上清液裂解物在以13,000rpm离心10分钟之后收集到新试管中，使用BCA蛋白测定测量蛋白量化，并在与NuPAGE LDS样品缓冲液和LDS样品还原缓冲液混合之后于70℃下变性10分钟。将等于20μg的细胞裂解物与4μl的PageRuler Plus预染色梯一起加载到4-12％ Bis-Tris凝胶中，并在200V下运行45分钟。用蒸馏水洗涤凝胶，并使用IBlot2 Drying印迹系统转移到膜上。将膜在室温下用在1x TBST中的5％牛奶封闭1小时，并在4℃下与在1xTBST中的5％牛奶中的抗EGFR、抗NRP1和抗β肌动蛋白一起温育过夜。第二天，将膜用TBST进行3次10分钟洗涤，并在室温下与5％牛奶中的二抗一起温育1小时。将膜用1xTBST进行3次10分钟洗涤。然后，将膜与SuperSignal Femto化学发光底物一起温育5分钟，并用BioRad ChemiDoc Touch成像系统成像。
用抗NRP1抗体(抗NRP1 mAb)、帕尼单抗(Pnm，抗EGFR抗体)、抗NRP1加帕尼单抗以及EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11(SEQ ID NO:11和12)(150nM)将人类NSCLC H1975细胞(EGFRT790/L858R)处理16小时。通过蛋白质印迹测量EGFR、NRP1和肌动蛋白水平。
用构建体11处理的细胞中总EGFR(tEGFR)和NRP1两者的水平均非常低。与之相反，用抗NRP1 mAb、帕尼单抗(Pnm)或抗NRP1 mAb加帕尼单抗处理的细胞中EGFR的水平与未处理的细胞中相似(图14)。该结果提示EGFR和NRP1的降解仅通过同时与EGFRT790/L858R和NRP1结合的EGFRxNRP1抗体构建体11实现。
通过与溶酶体蛋白降解抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf A1，200nM)共处理恢复了EGFRxNRP1双特异性抗体在H1975细胞中对EGFRT790/L858R和NRP1的降解，但通过与蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)共处理则没有(图15)。使用Baf A1和MG132抑制剂进行了类似实验，以检查构建体11在其他NSCLC细胞系中对各种EGFR形式(WT或突变体)的降解。对以下检查降解：PC9细胞中的EGFRdel19、H1299(NRASQ61K)细胞中的EGFRWT、HCC44(KRASG12C)细胞中的EGFRWT、HCC827细胞中的EGFRdel19/NRP1和H358(KRASG12C)细胞中的EGFRWT/NRP1(数据未显示)。对于检查的所有EGFR形式和细胞系，结果证实了通过与Baf A1溶酶体蛋白降解抑制剂共处理恢复了构建体11的受体降解，但通过与MG132蛋白体抑制剂共处理则没有。
一并考虑该数据，EGFRxNRP1抗体构建体11经由溶酶体蛋白降解途径诱导EGFR和NRP1的降解。该图描绘了EGFRxNRP1双特异性抗体与EGFR和NRP1的同时结合导致EGFR通过溶酶体降解途径降解，并且其与NRP1的结合对于EGFR的降解至关重要(图16)。评价了EGFR抗体帕尼单抗、埃万妥单抗和构建体-11对H1975细胞中EGFRT790/L858R降解的作用。即使在0.77nM的低浓度下，构建体11处理也显著地降低EGFRT790/L858R(tEGFR)蛋白水平，而在帕尼单抗处理的细胞和埃万妥单抗处理的细胞两者中没有明显的tEGFR降解(图16)。构建体11作为新型和独特的基于抗体的EGFR受体降解剂，可用于治疗具有EGFR突变的肿瘤。此外，EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11降解具有突变的EGFR，包括单突变(Del 19)、双突变(T790M/L858R)、三突变(T790M/C797S/L858R)和插入(InsEx20)(数据未显示)。
因此，总之，已显示EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11在种类繁多的NSCLC细胞系中通过溶酶体介导的降解途径降解EGFR的野生型和突变型两者。
实施例7.EGFRxNRP1双特异性抗体对奥希替尼抗性异种移植小鼠模型中抗肿瘤活 性的影响
奥希替尼为靶向激活突变(L858R和19号染色体缺失)和T790M突变的第三代不可逆EGFR TKI。对奥希替尼的抗性已成为治疗EGFR突变NSCLC的主要障碍。最近的研究显示，用拉泽替尼(lazertinib)加埃万妥单抗治疗的奥希替尼抗性患者的总反应率(ORR)为36％。H1975-HGF异种移植小鼠模型的临床前研究发现，拉泽替尼加埃万妥单抗的功效显著。
为了确定EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11对于对奥希替尼具有抗性的肿瘤的作用，用奥希替尼(1mg/kg，i.p.，QD)、帕尼单抗(5mg/kg，i.p.，BIW)、构建体-11(6.87mg/kg，i.p.BIW)、埃万妥单抗(5.05mg/kg，i.p.，BIW)和作为对照的IgG1同种型(5mg/kg，i.p.，BIW)治疗奥希替尼敏感、奥希替尼抗性或奥希替尼难治性异种移植小鼠。通过使干粉溶解于少量(最终体积的10％)二甲基亚砜中而将奥希替尼配制用于i.p.给予。将奥希替尼和抗体在无菌磷酸盐缓冲盐水中稀释，并如上所示在随机化当天开始，通过以每小鼠每次治疗100μl的总体积注射来给予。使用数字卡尺测量值，使用公式V＝(W2 x L)/2计算肿瘤体积，其中W为肿瘤宽度和L为肿瘤长度。使用GraphPad Prism 7软件(La Jolla,CA,USA)进行统计分析。结果显示为平均值±SEM。使用斯氏t检验比较对照和实验组之间在单个时间点或终点的数据。在奥希替尼敏感的异种移植小鼠(H1975)中，与用埃万妥单抗治疗的小鼠相比较，构建体11在抑制小鼠肿瘤生长方面高度有效。构建体11治疗在植入后继续抑制肿瘤生长至多42天，而肿瘤对奥希替尼、帕尼单抗和埃万妥单抗并未有效地反应(图18A)。奥希替尼抗性H1975-OR细胞系为通过在奥希替尼浓度增加到至多4μM的培养基中生长H1975细胞而开发的。在奥希替尼抗性的异种移植小鼠(H1975-OR)中，与埃万妥单抗治疗组相比较，构建体-11治疗组也显示出更强的肿瘤生长抑制(图18B)。奥希替尼难治性H1975-HGF细胞系为通过在H1975细胞中过表达肝细胞生长因子(HGF)来激活cMET信号传导，以减少H1975细胞系对用于其生长的EGFR信号传导的依赖性而开发的。在奥希替尼难治性异种移植小鼠(H1975-HGF)中，EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11治疗表现出与埃万妥单抗治疗相似的对肿瘤生长的抑制功效(图18C)。这些结果表明，EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11诱导EGFRT790/L858R的强烈降解，并在奥希替尼敏感的H1975中具有抗肿瘤活性。EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11在各种EGFRT790M/L858R异种移植小鼠模型中的功效如下概述于表7中。EGFRxNRP1双特异性抗体构建体11可适用于其他受体酪氨酸激酶抑制剂(RTK)抗性肿瘤。
表7.EGFRT790/L858的各种异种移植小鼠模型中的临床前概念验证
O：在敏化模式下以低剂量的功效大
Δ：以低剂量无效和在高剂量下功效良好
X：即使以高剂量也无效
我们证实了EGFRxNRP1双特异性抗体抑制肿瘤细胞生长并降低细胞活力。此外，EGFRxNRP1双特异性抗体治疗通过溶酶体降解途径降解EGFR，这通过使用溶酶体蛋白降解抑制剂或蛋白酶体抑制剂的实验6得到验证。参见图15。重要的是，仅当EGFRxNRP1双特异性抗体与EGFR和NRP1两者结合时，才检测到EGFR的降解。NRP1的存在对于靶蛋白的降解至关重要，即双特异性结合分子的功能性。
本公开提供新型的基于抗体的受体降解剂(ApReptor)平台，其具有超过其他降解剂的几个优点：(i)不需要E3/泛素特异性蛋白(USP)，(ii)不需要接头和催化酶，(iii)临床前PoC验证，(iv)药物抗性模型中的临床前验证，以及(v)对疾病相关细胞外受体广泛范围的应用。
这种基于抗体的受体降解剂(ApReptor)平台提供模块化、选择性和简单的基因编码策略，用于诱导具有广泛或组织特异性分布的细胞外和表面靶受体的溶酶体递送。AbReptor平台为个性化医疗带来巨大前景，可基于患者的遗传背景进行定制。
实施例8.通过cMETxNRP1双特异性抗体构建体的cMET受体的降解
在该实施例中，制备了与构建体11类似的双特异性抗体(BsA)构建体，其中维持了BsA的抗NRP1抗体结合臂，但使用抗cMET抗体作为BsA的另一个结合臂(而不是如构建体11中的抗EGFR)。cMETxNRP1双特异性抗体构建体的NRP1结合的KD为3.99x 10-10M。cMETxNRP1双特异性抗体构建体的cMET结合的KD为<0.1nM，这与单独抗cMET mAb的cMET结合的KD相当。
在HCC827细胞、ACHN细胞和H1975细胞中检查了cMETxNRP1 BsA构建体对NRP1和cMET的降解，其结果分别显示于图19A-19C。细胞要么未经处理(对照)，要么用单独的抗cMET抗体处理，要么用cMETxNRP1 BsA构建体处理。结果表明(正如预期的那样)，仅用BsA构建体处理导致NRP1降解。此外，在检查的三个细胞系中，用BsA构建体处理比用单独的抗cMET处理导致更大的cMET降解。这些结果证实了包含抗cMET的BsA构建体在表达cMET的癌细胞中降解cMET的能力。
实施例9.通过HER2xNRP1双特异性抗体构建体的HER2受体的降解
在该实施例中，制备了与构建体11类似的双特异性抗体(BsA)构建体，其中维持了BsA的抗NRP1抗体结合臂，但使用抗HER2抗体作为BsA的另一个结合臂(而不是如构建体11中的抗EGFR)。HER2xNRP1双特异性抗体构建体的NRP1结合的KD为2.44×10-10M。HER2xNRP1双特异性抗体构建体的HER2结合的KD为<0.1nM，这与单独抗HER2 mAb的HER2结合的KD相当。
在BT474细胞中检查了HER2xNRP1 BsA构建体对NRP1和HER2的降解，其结果显示于图20。细胞要么未经处理(对照)，要么用单独的抗HER2抗体处理，要么用HER2xNRP1 BsA构建体处理。结果表明(正如预期的那样)，仅用BsA构建体处理导致NRP1降解。此外，在检查的细胞系中，用BsA构建体处理比用单独的抗HER2处理导致更大的HER2降解。这些结果证实了包含抗HER2的BsA构建体在表达HER2的癌细胞中降解HER2的能力。
实施例10.通过IGF1RxNRP1双特异性抗体构建体的IGF1R受体的降解
在该实施例中，制备了与构建体11类似的双特异性抗体(BsA)构建体，其中维持了BsA的抗NRP1抗体结合臂，但使用抗IGF1R抗体作为BsA的另一个结合臂(而不是如构建体11中的抗EGFR)。IGF1RxNRP1双特异性抗体构建体的NRP1结合的KD为<0.1nM。IGF1RxNRP1双特异性抗体构建体的IGF1R结合的KD为<0.1nM，这与单独抗IGF1R mAb的IGF1R结合的KD相当。
在MCF-7细胞和ACHN细胞中检查了IGF1RxNRP1 BsA构建体对NRP1和IGF1R的降解，其结果分别显示于图21A-21B。细胞要么未经处理(对照)，要么用单独的抗IGF1R抗体处理，要么用IGF1RxNRP1 BsA构建体处理。结果表明(正如预期的那样)，仅用BsA构建体处理导致NRP1降解。此外，在检查的两者细胞系中，用BsA构建体处理比用单独的抗IGF1R处理导致更大的IGF1R降解。这些结果证实了包含抗IGF1R的BsA构建体在表达IGF1R的癌细胞中降解IGF1R的能力。
序列表概述

Claims (35)

1.双特异性结合分子，其包含：
(a)特异性地与受体酪氨酸激酶(RTK)结合的靶蛋白结合结构域；和
(b)包含抗体或其NRP-1结合片段的与NRP1结合的神经纤毛蛋白-1(NRP1)结合结构域，
其中所述双特异性结合分子与所述靶蛋白和与NRP1的结合导致靶细胞中所述靶蛋白的溶酶体降解。
2.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述RTK不是表皮生长因子受体(EGFR)。
3.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述RTK选自HER家族受体、胰岛素生长因子受体(IGFR)、Met受体酪氨酸激酶(MET)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和血管内皮生长因子(VEGFR)。
4.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述受体酪氨酸激酶为EGFR。
5.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述受体酪氨酸激酶为cMET。
6.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述受体酪氨酸激酶为HER2。
7.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述受体酪氨酸激酶为IGF1R。
8.根据权利要求1-7中任何一项所述的双特异性结合分子，其中所述靶细胞为癌细胞。
9.根据权利要求8所述的双特异性结合分子，其中所述癌细胞选自肺癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌和胰腺癌。
10.根据权利要求8所述的双特异性结合分子，其中所述癌细胞为非小细胞肺癌(NSCLC)细胞。
11.根据权利要求1-7中任何一项所述的双特异性结合分子，其中所述靶蛋白结合结构域和所述NRP1结合结构域各自独立地选自IgG、半抗体、单结构域抗体、纳米抗体、Fab、单特异性Fab2、Fc、scFv、微型抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VHH结构域、骆驼科抗体和肽体。
12.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述NRP1结合结构域
包含：
(i)包含CDR1、CDR2和CDR3区(分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3)的抗体重链可变(VH)结构域，其中HCDR1由SEQ ID NO:79中所示的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:80中所示的序列组成，和HCDR3由SEQ ID NO:81-84中任何一项所示的序列组成；和
(ii)包含CDR1、CDR2和CDR3区(分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗体轻链可变(VL)结构域，其中LCDR1由SEQ ID NO:85-87中任何一项所示的序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:88中所示的序列组成，和LCDR3由SEQ ID NO:89中所示的序列组成。
13.根据权利要求12所述的双特异性结合分子，其中：
(i)HCDR1由SEQ ID NO:79中所示的序列组成，HCDR2由SEQ ID NO:80中所示的序列组成，和HCDR3由SEQ ID NO:84中任何一项所示的序列组成；和
(ii)LCDR1由SEQ ID NO:85中所示的序列组成，LCDR2由SEQ ID NO:88中所示的序列组成，和LCDR3由SEQ ID NO:89中所示的序列组成。
14.根据权利要求1-7和12-13中任何一项所述的双特异性结合分子，其为抗体-药物缀合物(ADC)的一部分。
15.编码根据权利要求1-7和12-13中任何一项所述的双特异性结合分子的核酸。
16.表达载体，其包含根据权利要求15所述的核酸。
17.能够进行蛋白表达的细胞，其包含根据权利要求16所述的表达载体。
18.根据权利要求1-7和12-13中任何一项所述的双特异性结合分子在制造用于在受试者中治疗癌症的药物中的用途。
19.在细胞中诱导靶蛋白的溶酶体降解的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-7和12-13中任何一项所述的双特异性结合分子接触，使得在所述细胞中诱导所述靶蛋白的溶酶体降解。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞包含在所述靶蛋白中的一种或多种突变和/或过表达所述靶蛋白。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶蛋白为EGFR。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶蛋白不为EGFR。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶蛋白为cMET。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶蛋白为HER2。
25.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶蛋白为IGF1R。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞对所述靶蛋白的抑制剂的反应性具有抗性或难治性。
27.在患有肿瘤的受试者中抑制肿瘤生长的方法，所述方法包括给予所述受试者根据权利要求1-7和12-13中任何一项所述的双特异性结合分子，使得所述受试者中的肿瘤生长受到抑制。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤包含在所述靶蛋白中的一种或多种突变和/或过表达所述靶蛋白。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白为EGFR。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白不为EGFR。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白为cMET。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白为HER2。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述靶蛋白为IGF1R。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤对所述靶蛋白抑制剂的反应性具有抗性或难治性。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述双特异性结合分子静脉内、腹膜内、鞘内、脑室内或脑实质内给予。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119350297B (zh) * 2024-12-25 2025-04-04 浙江大学 一种特异性溶酶体靶向嵌合体分子及其制备方法和应用

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005522514A (ja) 2002-04-10 2005-07-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｈｅｒ２抗体改変体
US7476724B2 (en) 2004-08-05 2009-01-13 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antibodies
GB0503546D0 (en) 2005-02-21 2005-03-30 Hellenic Pasteur Inst Antibody
EP1945674A2 (en) 2005-11-03 2008-07-23 Genentech, Inc. Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides
UA96139C2 (uk) * 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
WO2008076257A2 (en) 2006-12-13 2008-06-26 Schering Corporation Treating cancer with anti-igflr antibody 19d12 = sch 717454
US9469691B2 (en) 2008-12-02 2016-10-18 Pierre Fabre Medicament Anti-cMET antibody
WO2010064089A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Pierre Fabre Medicament Novel anti-cmet antibody
US20140112911A9 (en) 2008-12-02 2014-04-24 Liliane Goetsch Novel anti-cmet antibody
US20110313137A1 (en) 2009-02-25 2011-12-22 Dongxing Zha Her2 antibody compositions
EP2287197A1 (en) 2009-08-21 2011-02-23 Pierre Fabre Medicament Anti-cMET antibody and its use for the detection and the diagnosis of cancer
WO2011057064A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Brian Long Igf1r inhibitor based treatment of prostate cancer
CN102167742B (zh) 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗her2单克隆抗体、其制备方法及用途
JP6055312B2 (ja) 2010-03-10 2017-01-11 ゲンマブ エー／エス Ｃ−ｍｅｔに対するモノクローナル抗体
JP2014516964A (ja) 2011-05-18 2014-07-17 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 治療用抗ｉｇｆ１ｒ合剤
CN102492039B (zh) 2011-11-21 2015-03-11 无锡天演生物技术有限公司 全人源抗人her2单抗
US10519245B2 (en) 2012-06-21 2019-12-31 Sorrento Therapeutics Inc. Antibodies which bind insulin-like growth factor receptor-1 (IGF1R) and methods of use thereof to treat cancer
AU2014385800B2 (en) 2014-03-06 2020-10-22 National Research Council Of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
CN106459194B (zh) 2014-03-06 2019-10-18 加拿大国家研究委员会 胰岛素样生长因子1受体特异性抗体及其用途
US9975960B2 (en) 2014-05-09 2018-05-22 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-HER2 antibody and anti-c-Met/anti-HER2 bispecific antibodies comprising the same
EP3310812B1 (en) 2015-06-17 2025-07-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-her2 antibodies and methods of use
WO2017171373A2 (ko) * 2016-03-29 2017-10-05 아주대학교산학협력단 Egfr 표적 제제에 대한 저항성을 억제하기 위한 조성물
US10167342B2 (en) 2016-08-29 2019-01-01 Fazel Shokri Production of hersintuzumab: a new humanized antibody against HER2 for cancer treatment
EP3512882B1 (en) 2016-09-14 2021-03-10 Merck Patent GmbH Anti-c-met antibodies and antibody drug conjugates thereof for efficient tumor inhibition
JP2020517659A (ja) * 2017-04-24 2020-06-18 イクノス サイエンシズ エスエー Ｅｇｆｒ陽性癌の治療のためのｔ細胞リダイレクト二重特異性抗体
WO2020079280A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Ichnos Sciences SA T cell redirecting bispecific antibodies for the treatment of squamous cell cancers
CR20240462A (es) * 2022-03-30 2024-12-11 Pinetree Therapeutics Inc Anticuerpos biespecíficos que comprenden un dominio de unión a nrp1 y métodos de uso de los mismos

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