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CN120000844A - 一种水凝胶及其在促进糖尿病创面愈合中的应用 - Google Patents

一种水凝胶及其在促进糖尿病创面愈合中的应用 Download PDF

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CN120000844A CN202510396952.8A CN202510396952A CN120000844A CN 120000844 A CN120000844 A CN 120000844A CN 202510396952 A CN202510396952 A CN 202510396952A CN 120000844 A CN120000844 A CN 120000844A
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孙国明
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Zhejiang University Of Technology Shengzhou Innovation Research Institute Co ltd
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Abstract

本申请提供一种水凝胶及其在促进糖尿病创面愈合中的应用，属于生物医用材料领域。水凝胶的支架结构中包含有羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶和苯硼酸功能化的透明质酸，该水凝胶同时具有pH响应性和葡萄糖响应性。本案水凝胶用于糖尿病创伤的愈合，可增强抗氧化能力、清除ROS、缓解炎症并促进血管生成，有利于促进糖尿病患者创伤的愈合。

Description

一种水凝胶及其在促进糖尿病创面愈合中的应用
技术领域
本申请涉及一种水凝胶及其在促进糖尿病创面愈合中的应用，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
糖尿病病症中，慢性糖尿病创面是糖尿病的一种常见且严重的并发症，若未得到有效治疗，可能导致截肢甚至死亡。皮肤创面修复是一个动态且高度协调的过程，主要包括炎症期、增生期和重塑期。但高血糖通过诱导产生过量的活性氧(ROS)、炎症和pH失衡，干扰了伤口愈合的所有阶段，使创面的愈合过程常常停滞在炎症阶段，给糖尿病伤口的治疗带来了巨大挑战。响应性支架通过靶向的化学和生物相互作用可以改善这些不利的微环境条件，为糖尿病伤口治疗提供了有前景的解决方案。
理想的创面敷料还应具备吸收多余渗出液、防止环境污染、促进皮肤修复和再生的能力，并能有效递送治疗药物或调节生物分子，如水凝胶。水凝胶是一种具有三维(3D)多孔结构的材料，具有良好的吸水性，非常适合用于吸收过量的创面渗出液，并创造湿润的创面环境，从而促进伤口愈合。但目前用于慢性糖尿病创面的水凝胶多是通过引入载药微球，负载抗菌、抗氧化、促增殖等活性物质，但在糖尿病患者的低pH、高血糖的特殊环境中应用时，效果仍然不够理想。
发明内容
有鉴于此，本申请首先提供了一种水凝胶，该水凝胶具有pH和葡萄糖响应性，并可增强抗氧化能力、清除ROS、缓解炎症并促进血管生成，有利于促进糖尿病患者创口的愈合。
具体地，本申请是通过以下方案实现的：
一种水凝胶，所述水凝胶的支架结构中包含有羰基肼(CDH)修饰的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和苯硼酸(PBA)功能化的透明质酸(HA)。
上述方案中提供的水凝胶支架结构中，羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶赋予水凝胶以良好的pH响应性，而苯硼酸功能化的透明质酸则赋予水凝胶以良好的葡萄糖响应性，该水凝胶表现出优异的机械性能、生物相容性和生物可降解性，同时，将可逆共价化学键(如二硫键、硼酸酯键和酰腙键)引入水凝胶中，可以实现对葡萄糖、酶、pH、温度和ROS等特定刺激的响应性药物释放，有效减少ROS，改善炎症微环境，促进血管生成，并显著增强糖尿病伤口愈合过程中的胶原沉积和组织重塑，以有效支持慢性糖尿病创面的愈合。
进一步的，作为优选：
所述支架结构中还引入了3,4-二羟基苯甲醛(DB)，在酸性和高糖环境中，酰腙键和硼酸酯键发生断裂，从而促进DB的释放，赋予水凝胶以强抗氧化性，从而缓解了氧化作用对糖尿病伤口愈合的延迟。更优选的，所述水凝胶中，3,4-二羟基苯甲醛在水凝胶中的含量为0.02～0.08％。
所述羰基肼修饰甲基丙烯酰化明胶的方法为：将甲基丙烯酰化明胶溶解后，加入羰基肼、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和溶剂，调节pH至4.5～5.5，室温条件下反应结束后，去离子水透析，完成羰基肼修饰甲基丙烯酰化明胶。更优选的，所述N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和溶剂先加去离子水混合均匀后，再以混合液的形式滴加到加有羰基肼的甲基丙烯酰化明胶中，羰基肼修饰甲基丙烯酰化明胶中，该混合液实现活化羰基的作用。所述N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBt)的摩尔比为1:1。
所述苯硼酸功能化透明质酸的方法为：透明质酸溶解后，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物和苯硼酸，保持pH在5.5～6.5，室温下反应结束后，去离子水透析，得到苯硼酸功能化的透明质酸。更优选的，所述苯硼酸为3-氨基苯硼酸或4-羧基苯硼酸。
所述水凝胶的制备方法为：将羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶、苯硼酸功能化的透明质酸和光引发剂添加到磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，搅拌至完全溶解得到混合液，混合液经紫外线照射固化，得到水凝胶。更优选的，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)。所述混合液中，羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶的浓度为5～20％(w/v)，苯硼酸功能化的透明质酸的浓度为0～2％(w/v)，并优选为0.5～2％(w/v)，光引发剂的浓度为0.1～0.3％(w/v)。发出紫外线的紫外灯的光线的波长为365nm，功率为20W。
申请人第二方面目的，是提供了上述水凝胶在促进糖尿病创面愈合中的应用。明胶和透明质酸(HA)自身具有优异生物活性和生物相容性，具有上述特征的水凝胶引入羰基肼(CDH)对明胶甲基丙烯酰化(GelMA)进行修饰，得到pH响应性的明胶衍生物(GelMA-CDH)；同时，利用苯硼酸修饰透明质酸，合成了葡萄糖响应性的HA衍生物(HA-PBA)。
本申请提供的水凝胶可响应葡萄糖和pH变化，可作为支架用于慢性糖尿病伤口的治疗。该水凝胶呈现出蜂窝状多孔结构，具有优异的机械性能、吸水性能、可降解性及良好的粘附能力和生物相容性，并抑制炎症、促进血管生成，解决了伤口管理中的关键挑战，为慢性糖尿病伤口治疗提供了一种有前景且有效的解决方案，并推动了伤口护理领域的进一步发展。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请中GHD水凝胶的制备及用于糖尿病伤口愈合的原理示意图；
图2为本申请中GelMA、GelMA-CDH、HA-PBA的结构表征，
A：明胶、GelMA、GelMA-CDH的的1H NMR对照图(D2O)，
B：HA、HA-PBA的1H NMR对照图(D2O)，
C：GelMA、GelMA-CDH、HA-PBA的FTIR光谱图；
图3为本申请中GHD水凝胶的微观结构检测结构，
A：各GHD水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)，比例尺＝10μm，
B：各GHD水凝胶的孔径对照图；
图4为本申请中GHD水凝胶的吸水膨胀曲线；
图5为本申请中GHD水凝胶的机械性能图，
A：GHD水凝胶的应力-应变曲线，
B：GHD水凝胶的压缩模量图；
图6为本申请中GHD水凝胶的体外降解图；
图7为本申请中GHD水凝胶DB释放试验结果，
A：不同pH条件下GHD水凝胶中DB的释放情况对照图，
B：DB在含葡萄糖的PBS溶液中的释放情况，显著性水平：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝5；
图8为本申请中GHD水凝胶的生物相容性试验结果，
A：GHD水凝胶的CCK-8实验结果，
B：GHD水凝胶的活/死细胞染色结果，比例尺＝200μm，
C：GHD水凝胶的溶血实验结果，
D：GHD水凝胶的EDEAD试验得到的细胞活力分析，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝5；
图9为本申请中GHD水凝胶对细胞迁移行为的影响，
A：体外划痕愈合实验结果，比例尺＝100μm，
B：GHD水凝胶的的细胞迁移行为的量化结果，
显著性水平：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝5；
图10为本申请中GHD水凝胶的体内降解和生物相容性，
A：GHD水凝胶-4水凝胶的皮下植入后的照片，
B：GHD-4的降解行为统计图，
C：GHD-4水凝胶组织学切片的H&E染色代表性图像，比例尺＝100μm(上图)、50μm(下图)，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝6；
图11为本申请中GHD水凝胶的ROS清除能力，
A：DPPH自由基清除实验评估水凝胶的抗氧化能力，
B：使用DCFH-DA染色检测细胞内的ROS，比例尺＝150μm，
C：DCFH-DA染色后ROS的量化分析，显著性水平：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝5；
图12为本申请GHD水凝胶的粘附特性，
A：水凝胶在不同材料表面的粘附能力，
B：组织残留物与GHD水凝胶功能基团之间的相互作用，
C：水凝胶对组织的粘附能力，
D：搭接剪切粘附测试的示意图，
E：GHD水凝胶对组织的粘附强度，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝5；
图13为本申请GHD水凝胶治疗后皮肤伤口愈合的组织学分析，
A：糖尿病慢性伤口模型的建立和治疗示意图，
B：使用水凝胶支架处理全层皮肤损伤后的伤口愈合过程，
C：伤口愈合率的量化分析，
D：治疗7天和14天后的H&E染色代表性图像，比例尺＝200μm(左)、100μm(右)，
E：第14天再上皮化的定量分析，
F：治疗7天和14天后Masson三色染色的代表性图像，比例尺＝200μm(左)和100μm(右)，
G：第14天胶原沉积的定量分析，
显著性水平：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝6；
图14伤口愈合组织的免疫荧光分析，
A：伤口组织在治疗7天和14天后的TNF-α染色图像，
B：伤口组织在治疗7天和14天后的CD31和α-SMA染色图像，
C：TNF-α的量化分析，
D：CD31的量化分析，
E：α-SMA的量化分析，比例尺＝50μm，
F：治疗7天和14天后伤口组织的MMP-9图像，
G：MMP-9的量化分析，比例尺＝50μm，
显著性水平：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，结果以“平均值±标准差(SD)”表示，n＝6。
具体实施方式
为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请的技术方案。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本实施例提供了一种GHD水凝胶，下面结合附图，描述本申请实施例。
明胶从Sigma购买，透明质酸从MACKLIN购买(上海，中国)。甲基丙烯酸酐、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)、4-羧基苯硼酸、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸(EDC)、1-羟基苯并三氮唑单水合物(HOBt)、羰基肼(CDH)、3-氨基苯硼酸和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自阿拉丁(上海，中国)。活/死细胞染色试剂盒、细胞毒性检测试剂盒购自贝福泰(上海，中国)。二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光染料购自赛百盛(北京，中国)。
SD大鼠(180～220克，4～6周)购自汉丰生物科技有限公司(北京，中国)。所有动物实验程序均经过河北大学动物伦理委员会的批准。
参阅图1，图1示出本实施例GHD水凝胶的制备原理示意图。
制备步骤如下：
步骤一，合成GelMA：将10g明胶溶解于100mL碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，保持50℃。随后，逐滴加入0.375mL甲基丙烯酸酐，并用1.0N NaOH溶液将pH调至9。反应3小时后，使用1.0N HCl中和反应溶液，并过滤以去除未反应物。最终产物用去离子水(diH2O)透析5天，并冻干3天。
步骤二，合成GelMA-CDH：将1.0g GelMA加入50mL去离子水中，在40℃搅拌至完全溶解。待溶液冷却后，加入1.21g羰基肼。将EDC(2mmol)、HOBt(2mmol)、DMF(6.5mL)和去离子水(6.5mL)加入烧杯中，混合液逐滴加入GelMA/羰基肼溶液中。使用1.0NHCl将混合溶液的pH调至在5.0附近，反应在室温下持续24小时。最终产物用去离子水透析5天，随后冻干3天。
步骤三，合成HA-PBA：将1g HA溶解于200mL去离子水中，搅拌至完全溶解。然后加入1.0g 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物和0.5g 3-氨基苯硼酸。使用1.0M HCl将混合物的pH维持在6.0，并在室温下搅拌72小时。最终产物用去离子水透析5天，并冻干3天。
步骤四，制备GHD水凝胶：首先，将不同浓度的DB溶解在PBS中。然后将20％(w/v)的GelMA-CDH溶液、2.0％(w/v)的HA-PBA溶液和0.2％(w/v)的LAP光引发剂加入PBS中，搅拌至完全溶解。随后，将DB溶液加入GelMA-CDH/HA-PBA/LAP溶液中，充分涡旋混合。最终混合液中GelMA-CDH、HA-PBA和LAP的浓度分别为10％、1％和0.1％(w/v)。将混合液转移至模具中，使用紫外线照射(365nm，20W)固化形成水凝胶，不同DB含量的水凝胶分别记作GHD-0(即未添加DB)、GHD-1(DB添加量为0.02％)、GHD-2(DB添加量为0.04％)、GHD-3(DB添加量为0.06％)、GHD-4(DB添加量为0.08％)，GHD-0的固化时间约为38s，GHD-1的固化时间约为42s，GHD-2的固化时间约为47s，GHD-3的固化时间约为51s，GHD-4的固化时间约为60s。GelMA-CDH、HA-PBA和DB在紫外光照下发生光交联，形成圆形的GHD水凝胶，并可根据模型生成多种形状。
性能评价：
1.GHD水凝胶的微观结构观察
GelMA、GelMA-CDH、HA-PBA的化学结构通过1H NMR(D2O)和FTIR光谱进行确认(图2)。
与明胶相比，GelMA在5.3ppm、5.5ppm处出现新峰，表明乙烯基(─CH＝CH2)的成功接入明胶结构中；在GelMA进一步与CDH反应后得到的GelMA-CDH结构中，在7.5ppm和8.0ppm处观察到源于CDH的新峰(图2A)。与HA相比，在7.2和8.0ppm处观察到新的峰，这些峰为PBA的苯环特征峰(图2B)。
图2C的FITR光谱分析结果进一步证明了明胶和HA的成功修饰：1655cm-1和1543cm-1处的带对应于GelMA中的—CH＝CH2—，而CDH中的酰胺键出现在1240cm-1和3222cm-1处。在HA-PBA中，1459cm-1处的峰对应于苯环，1340cm-1处的峰归因于B-O的伸缩振动，表明GHD水凝胶结构中引入了PBA基团。
MA和CDH的取代率通过Fluoraldehyde TM试剂盒进行定量分析：GelMA-CDH的甲基丙烯酰化和酰胺化程度分别约为60％和37％，HA-PBA的酰胺化程度约为28％。
各水凝胶在PBS溶液中膨胀至平衡状态后，冻干处理。随后，对冻干水凝胶的表面及其横截面进行金层喷镀，并通过扫描电子显微镜(SEM)分析其微观结构，结果如图3所示。
GHD水凝胶具有均匀的多孔网络结构(图3A)，孔径范围为7μm至15μm(图3B)，表明该水凝胶具有良好的保湿能力和吸收过量伤口渗出液的潜力。随着DB含量的增加，水凝胶的孔径减小，可能是由于交联密度增加所致。
2.GHD水凝胶的溶胀行为测试：
在37℃、pH＝7.4的PBS溶液中，完全浸泡冻干水凝胶样品(初始重量记作M0)，并在不同时间点(如1、2、4、6、8、12和24小时)取出样品，使用滤纸擦去表面多余水分后称重，分别记作Mt。
溶胀率(SR)＝[(Mt-M0)/M0]×100％。
GHD水凝胶的吸水溶胀曲线如图4所示：各GHD水凝胶在2小时内均显著溶胀，体积达到初始大小的数百倍，显示出其快速吸收伤口渗出液的潜力。这种快速的溶胀行为可能归因于其丰富的亲水基团和三维聚合物网络；然而随着DB含量的增加，GHD水凝胶的溶胀比随之降低，可能是由于新化学键的形成导致。
3.GHD水凝胶的机械性能表征：
将所有水凝胶样品制备为厚度8mm、直径10mm的圆柱形。使用10mm/min的压缩速率进行压缩试验，以获得应力-应变曲线，并通过10％至20％应变范围内线性区域的斜率计算得出压缩模量。
不同DB含量的GHD水凝胶的应力-应变曲线表现出类似的弹性行为(图5A)，本案所提供的GHD水凝胶的压缩模量基本都在2～10KPa(图5B)，与正常皮肤组织相当，表明其适用于皮肤伤口的应用。
4.GHD水凝胶的体外降解与DB释放行为
1)在PBS溶液(37℃，pH＝7.4)中进行水凝胶的体外降解实验：将水凝胶样品浸泡在PBS溶液中，摇床速率为100rpm。在设定时间点，取出水凝胶样品，滤纸擦干表面水分后称重，计算水凝胶的重量比(％)＝Mt/M0×100％。
体外降解结果如图6所示：水凝胶在超过2周内保持稳定，表明GHD水凝胶可以在整个伤口愈合过程中提供持久的保护。
2)DB的释放行为：使用葡萄糖浓度为3.0mg/mL、pH＝6.5的PBS溶液模拟糖尿病创面的微环境，将不同含量DB的各水凝胶样品(GHD-0、GHD-1、GHD-2、GHD-3、GHD-4)浸泡在30mL不同的PBS溶液中，在37℃、100rpm的条件下孵育。在预设时间点，取上清液并用新鲜PBS缓冲液替换。根据Lambert-Beer定律绘制DB释放曲线。
以pH＝6.5、pH＝7.4为例，申请人模拟了糖尿病伤口环境，观察GHD水凝胶中DB的释放情况，以评估该水凝胶对pH和葡萄糖的响应行为，结果如图7所示：在最初的15小时内，DB迅速释放(约20％)，随后呈现出持续释放的趋势(图7A)。这种行为可能源于DB在GHD水凝胶基质中的可逆共价键。在糖尿病伤口环境中，GHD水凝胶的DB累积释放量约为PBS中的两倍(图7B)，显示出独特的pH/葡萄糖响应释放行为，使DB得以更有效地发挥作用。
综合上述参数可以看出：体外研究表明，该水凝胶具有优异的生物相容性，并能增强细胞迁移能力；本案所提供的各GHD水凝胶均具有显著的溶胀能力、良好的机械性能、可降解性及独特的pH/葡萄糖响应释放特性，这是其成为慢性糖尿病伤口支架的基础所在。
5.GHD水凝胶的细胞相容性
1)通过CCK-8染色法评估水凝胶的体外细胞毒性：将3T3细胞培养在96孔板中24小时，随后用含水凝胶浸提液的培养基孵育。在不同天数(如1、2和3天)取出培养板，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续孵育3小时。随后，将100μL上清液转移至新的96孔板，并在450nm波长下测定OD值。此外，使用活/死细胞染色法验证水凝胶的细胞毒性。在预定时间点，将用水凝胶浸提液培养的细胞与Calcein-AM和PI在37℃、避光条件下孵育30分钟。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞形态并拍照。
生物安全性是组织工程支架的重要考量因素。DECCK-8实验表明，GHD水凝胶支架在1、2和3天内与3T3细胞表现出良好的兼容性(图8A)。此外，活/死细胞染色进一步证实了GHD水凝胶的优异细胞相容性(图8B)，与未添加本案水凝胶浸提液的对照组(CTRL)相比，未观察到显著差异(8D)。
2)水凝胶的血液相容性：采集成年SD大鼠尾静脉血1.0mL，置于含抗凝剂的真空管中。通过1200rpm离心5min分离红细胞，并用PBS洗涤5次，最终稀释至5％(v/v)的PBS溶液。将0.5mL含水凝胶浸提液的PBS溶液与0.5mL红细胞储备液混合，在37℃、100rpm条件下孵育1h。PBS和0.1％ Triton X-100分别作为阴性和阳性对照。孵育结束后，将混合液以1200rpm离心5min，取0.1mL上清液至96孔板中，并在540nm波长下测定吸光度。
水凝胶的溶血率(％)＝[(Ah–Ap)/(At–Ap)]×100％，Ah、At、Ap分别指水凝胶组、Triton X-100组(即阳性对照组)、PBS组(即阴性对照组)在540nm波长下的吸光度。
用GHD水凝胶提取物处理的红细胞(RBCs)表现出极低的溶血率(约5％)，证实该水凝胶具有良好的生物相容性(图8C)。结果表明，GHD水凝胶支架在生物学上是安全的。
6.划痕愈合实验
使用细胞划痕实验评估水凝胶促进细胞增殖的能力：将3T3细胞培养于6孔板，直至细胞铺满孔板底部。随后，使用无菌移液枪头在细胞单层上垂直划出一道划痕，并用PBS反复清洗以去除脱落的细胞。随后，细胞在含10％ FBS的DMEM培养基中继续培养，并加入水凝胶浸提液。在预定时间点观察细胞迁移情况，使用显微镜拍摄照片，并利用ImageJ软件分析迁移情况。
24小时后，GHD水凝胶组的细胞迁移率超过50％，显著高于对照组CTRL(～29.8％)(图9A)。在GHD-4水凝胶组中，划痕区域在48小时后几乎完全闭合(图9B)。上述结果证实，本案所提供的GHD水凝胶能够有效促进3T3细胞迁移，通过促进成纤维细胞募集到伤口部位，可以加速愈合过程。
7.体内降解测试及生物相容性
动物护理和手术均依据河北大学附属医院批准的实验方案进行。实验选取180-200g的雄性SD大鼠。在麻醉后，使用脱毛膏去除大鼠背部毛发，并用碘伏消毒皮肤3次。在背部正中使用手术刀切开约2cm的纵向切口，小心地用组织剪分离皮下软组织，将制备好的GHD水凝胶植入切口处的皮下组织。切口缝合后，再次用碘伏消毒。
在预定时间点，取出水凝胶，拍照记录其降解情况。为评估水凝胶的体内生物相容性，取出周围组织，使用冷冻切片机切成0.6μm厚的组织切片，并进行HE染色分析。所有切片均使用显微镜观察并拍照。
GHD水凝胶的体内降解和生物相容性如图10所示：GHD-4水凝胶表现出显著的降解特性(图10A)，在两周内质量损失约50％(图10B)，表明其具有良好的生物降解性。组织学染色结果显示，在早期阶段(第3天和第7天)，植入边缘存在少量炎症细胞浸润。然而，随着时间的推移(第10天和第14天)，这些炎症反应逐渐减弱，并被健康组织所取代(图10C)，证实GHD-4水凝胶在体内的良好生物安全性。
上述体外和体内研究结果均表明，GHD水凝胶具有优异的生物相容性，能够促进细胞增殖和迁移，并表现出最小的异物反应，使其成为安全的伤口愈合支架的候选材料。
8.GHD水凝胶的抗氧化效率实验
通过两种方法评估水凝胶的抗氧化效率。首先，使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除实验评估水凝胶的自由基清除能力。简而言之，将新鲜制备的水凝胶浸提液(10μL)加入新配制的DPPH乙醇溶液中，避光条件下在37℃孵育30分钟。取上清液(0.1mL)转移至96孔板中，并在515nm波长下测定光密度(OD)。
水凝胶的DPPH清除率(％)＝(A空白–A水凝胶)/A空白×100％，A空白、A水凝胶分别指空白组(DPPH+乙醇)、凝胶组(DPPH+乙醇+水凝胶)在515nm波长下的光密度。
过量的ROS生成是导致糖尿病患者伤口愈合延迟的关键因素。未含DB的水凝胶对DPPH的清除率有限(约41.5％)，而GHD水凝胶表现出强大的抗氧化活性，清除率超过90％，且呈浓度依赖性(图11A)。
由于抗氧化性能对糖尿病创面愈合至关重要，因此进一步通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)试剂盒评估水凝胶的细胞内ROS清除能力：将3T3细胞接种于12孔板中，培养24小时后，使用1.0μL/mL DCFH-DA溶液孵育细胞20分钟，避光条件下进行。孵育结束后，使用无血清培养基洗涤3次以去除细胞外未结合的DCFH-DA。随后，细胞分别与含有水凝胶浸提液(10mg/mL或5.0mg/mL)和Rosup(1.0μg/mL)的DMEM培养基孵育30分钟。Rosup处理组作为阳性对照，未处理组作为阴性对照。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞，并利用ImageJ软件分析荧光强度。
与CTRL组相比，在H2O2处理下，细胞产生高水平的ROS，表现为增强的绿色荧光信号。GHD水凝胶处理后，绿色荧光强度显著降低，表明其有效的ROS清除作用(图11B)。与空白对照组Blank相比，GHD水凝胶处理组的ROS水平显著降低。值得注意的是，GHD-4水凝胶使荧光强度降低了约70％，进一步证实了其有效的ROS清除能力(图11C)。
综上结果突显了本案GHD水凝胶优异的抗氧化特性，这对于缓解氧化应激并促进糖尿病伤口愈合具有重要作用。
9.GHD水凝胶的粘附强度
使用搭接剪切测试评估水凝胶的粘附性能。新鲜猪皮反复用去离子水清洗，去除皮下脂肪层，并用去离子水清洗表皮，随后切割成10×50mm的长条形片。将0.5mL水凝胶涂抹于两片猪皮之间，并使用万能材料测试机进行拉伸测试，测试条件为5cm夹持距离和10mm/min的拉伸速度。
除了猪皮外，还使用玻璃基材评估水凝胶的粘附能力，方法相同。此外，我们使用水凝胶粘合不同材料(塑料、铁、木材、玻璃)，以进一步测试其粘附能力。
粘附性水凝胶支架可以牢固地附着在伤口部位，从而增强保护作用并促进支架与组织的相互作用。具体而言，GHD-4水凝胶表现出对多种基材(包括塑料、金属、木材、玻璃和皮肤如上文的猪皮)的优异粘附性(图12A)。
该水凝胶能够牢固地粘附在皮肤组织上，即使在拉伸、弯曲或扭曲等机械变形下仍保持强附着力(图12C)。GHD-4水凝胶的强粘附性主要归因于水凝胶中的官能团(如醛基、硼酸酯基和邻二羟基)与皮肤组织中的氨基和羧基之间形成的氢键和席夫碱键(图12B)。
此外，申请人还对GHD-4水凝胶进行了搭接剪切测试(图12D)。结果显示，该水凝胶在皮肤组织上的粘附强度约为12kPa，表现出强大的粘附力(图12E)。
上述结果凸显了GHD水凝胶的强粘附性能，可牢固粘附在伤口部位，防止外部感染。DB的引入使得水凝胶能够在酸性和高糖环境下按需释放，从而有效地促进伤口愈合过程。
10.体内糖尿病创面愈合实验
动物护理和手术均依据河北大学附属医院批准的实验方案(IACUC-2021XS025)进行。选取180～200g的雄性SD大鼠，建立1型糖尿病模型。简而言之，在禁食12小时后，SD大鼠腹腔注射65mg/kg的STZ溶液，并每3天监测一次血糖水平。1周后，血糖水平超过300mg/dL(16.7mmol/L)的大鼠被选作1型糖尿病模型。此外，在大鼠背部制作直径8mm的全层皮肤缺损，以评估水凝胶的促愈合能力。创面分别使用GHD-0水凝胶和GHD-4水凝胶处理，并用TegadermTM敷料覆盖以固定水凝胶(图13A)。对照组未接受任何治疗。
在预定时间点观察并记录创面情况，使用ImageJ软件测量创面面积。实验过程中，定期使用水凝胶或PBS处理创面，并记录伤口愈合面积。收集的创面组织用4％固定液固定，以便进一步进行组织学分析。简而言之，组织切片经HE染色和Masson染色处理，所有切片均使用显微镜(OLYMPUS，日本)观察和拍照。此外，使用免疫荧光染色检测7天和14天时TNF-α、MMP-9、CD31和α-SMA的表达。
经过2周的治疗后，GHD-4水凝胶将伤口面积显著缩小至94.6％(图13B和13C)，而对照组(CTRL)的伤口未完全愈合，仅缩小了74.6％。该结果表明，GHD-4水凝胶具有促进糖尿病伤口快速修复的能力。
为进一步评估其皮肤修复能力，我们在第7天和第14天收集伤口样本，并进行了HE染色和Masson染色分析。第7天时，对照组(CTRL)仍存在表皮缺损，而GHD-4处理组在痂下已形成一层薄的表皮(图13D)。这种改善可能归因于GHD水凝胶的抗氧化活性，降低了细胞氧化应激，促进了分泌性生长因子的活性和细胞迁移。
到了第14天，GHD-4水凝胶组的表皮再生率显著优于对照组(CTRL)，分别为92.2％和53.7％(图13E)。此外，Masson染色显示GHD-4水凝胶组的胶原沉积显著增强。在第14天时，GHD-4处理伤口的胶原沉积率达到95.4％，而对照组(CTRL)仅为59.3％(图13F和13G)。这些发现凸显了GHD-4水凝胶在通过促进胶原沉积来加速伤口愈合中的重要作用。
总体而言，这些结果表明，GHD-4水凝胶能够通过加速表皮再生和增强胶原沉积来有效调节糖尿病伤口的愈合。
为研究GHD-4水凝胶在伤口愈合中发挥作用的机制，我们通过免疫荧光染色分析了关键的炎症和血管生成因子，如图14所示。慢性糖尿病伤口通常表现为持续的炎症。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是伤口微环境中炎症的重要标志物。在第7天和第14天，GHD-4水凝胶处理组的TNF-α表达显著低于对照组(图14A和14C)，表明GHD-4水凝胶具有良好的抗炎作用。
在糖尿病伤口中，长期升高的ROS和促炎细胞因子会诱导基质金属蛋白酶(MMPs)的过度表达，特别是MMP-9。这种酶会降解细胞外基质(ECM)组件和生长因子，从而阻碍组织修复和再生。GHD-4水凝胶在第7天和第14天显著降低了伤口组织中MMP-9的表达(图14F、14G)。这一发现表明，GHD-4水凝胶通过降低MMP-9水平来缓解炎症，从而保护ECM，促进组织修复和再生。此外，ROS的分泌和积累还会对血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖和生物活性产生不利影响，导致血管生成受损，从而影响新生肉芽组织的营养供应，并最终延迟伤口愈合。
为了评估血管生成情况，我们使用了CD31和α-SMA作为内皮细胞和平滑肌细胞的标志物。免疫染色显示，与对照组相比，GHD-4水凝胶处理组的CD31和α-SMA表达水平显著提高(图14B)。
具体而言，经过7天的处理，GHD-4水凝胶组的CD31表达显著增强(图14D)，而α-SMA表达水平在第14天显著上升(图14E)。
上述这些结果表明，GHD-4水凝胶能够抑制炎症，通过支持血管内皮细胞功能和促进新生血管的形成，并增强胶原沉积，从而增强了血管生成，显著加速糖尿病伤口的修复。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种可行实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，实施例也并非用以限制本发明权利要求项中的保护范围。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，凡是未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术。

Claims (10)

1.一种水凝胶，其特征在于：所述水凝胶的支架结构中包含有羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶和苯硼酸功能化的透明质酸，同时具有pH响应性和葡萄糖响应性。
2.根据权利要求1所述的一种水凝胶，其特征在于：所述支架结构中引入有3,4-二羟基苯甲醛。
3.根据权利要求2所述的一种水凝胶，其特征在于：所述水凝胶中，3,4-二羟基苯甲醛在水凝胶中的含量为0.02~0.08%。
4.根据权利要求1所述的一种水凝胶，其特征在于，所述羰基肼修饰甲基丙烯酰化明胶的方法为：将甲基丙烯酰化明胶溶解后，加入羰基肼、N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸、1-羟基苯并三唑和溶剂，调节pH至4.5~5.5，室温条件下反应结束后，去离子水透析，完成羰基肼修饰甲基丙烯酰化明胶。
5.根据权利要求4所述的一种水凝胶，其特征在于：所述N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸、1-羟基苯并三唑和溶剂先加去离子水混合均匀后，再以混合液的形式滴加到加有羰基肼的甲基丙烯酰化明胶中。
6.根据权利要求4所述的一种水凝胶，其特征在于：所述N-（3-二甲氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺氢氯酸、1-羟基苯并三唑的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求1所述的一种水凝胶，其特征在于：所述苯硼酸功能化透明质酸的方法为：透明质酸溶解后，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物和苯硼酸，保持pH在5.5~6.5，室温下反应结束后，去离子水透析，得到苯硼酸功能化的透明质酸。
8.根据权利要求1~7任一项所述的一种水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法为：将羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶、苯硼酸功能化的透明质酸和光引发剂添加到磷酸缓冲盐溶液中，搅拌至完全溶解得到混合物，混合液经紫外线照射固化，得到水凝胶。
9.根据权利要求8所述的一种水凝胶，其特征在于：所述混合物中，羰基肼修饰的甲基丙烯酰化明胶的浓度为5~20%，苯硼酸功能化的透明质酸的浓度为0.5~2%，光引发剂的浓度为0.1~0.3%。
10.一种权利要求1所述水凝胶在促进糖尿病创面愈合中的应用。
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