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CN120005850B - 一种提高伏马毒素降解酶热稳定性的方法及应用 - Google Patents

一种提高伏马毒素降解酶热稳定性的方法及应用

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CN120005850B
CN120005850B CN202510163833.8A CN202510163833A CN120005850B CN 120005850 B CN120005850 B CN 120005850B CN 202510163833 A CN202510163833 A CN 202510163833A CN 120005850 B CN120005850 B CN 120005850B
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CN
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degrading enzyme
seq
fumonisin
fumonisin degrading
mutant
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赵新战
赵军旗
王楠
罗学刚
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Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
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Abstract

本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及通过形成二硫键提高伏马毒素降解酶热稳定性的方法。本发明涉及的伏马毒素降解酶FumD突变体对比野生型伏马毒素降解酶热稳定性均表现出显著提高效果。该酶主要应用于畜牧饲料加工、食品生产等行业，以降低伏马毒素对动物及人类的健康危害。本发明获得热稳定性提升的伏马毒素降解酶突变体有利于该酶在更高温度下保持活性，适应于更加高温的生产环境，减少酶的使用量和更换频率，同时稳定性的提升便于运输和保存，因此可以降低工业成本的投入。

Description

一种提高伏马毒素降解酶热稳定性的方法及应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及热稳定性提升的伏马毒素降解酶突变体及应用。
背景技术
伏马毒素主要由轮枝梭菌和增殖梭菌以及其他镰刀菌属产生，其结构由两个甲基(-CH3)、一个氨基(-NH2)、一至四个羟基(-OH)和两个三羧酸酯基团组成，这些基团位于不同位置以及线性聚酮化合物衍生的主链。目前已知的伏马毒素同系物有15种以上，分别为伏马毒素A、B、C和P其中FB1毒性最强含量最高。农业中最常感染的群体是玉米、小麦、大麦、黄豆等谷物类。对食品安全构成严重威胁。人类摄入伏马毒素污染的食品可能引发肝脏病变、免疫系统抑制、神经管缺陷、肾毒性等疾病。目前针对伏马毒素的降解方式已经有比较多的研究，但是传统的物理、化学方法仅仅只是降低伏马毒素的危害，并不能彻底消除甚至会出现其他不利的影响。而生物酶法具有反应环境友好、效率高、无残留、营养损失小等特点。而具有良好热稳定性的伏马毒素降解酶可以耐受酶制剂过程中的高温处理条件，并且可以增加酶的使用时间，从而降低生产成本和提高酶使用效率。
发明内容
为了能够利用生物酶法高效降解伏马毒素，提出并完成本发明。
本发明的目的在于提供一种热稳定提高的伏马毒素降解酶突变体。
本发明的再一目的在于提供一种热稳定性提高的伏马毒素降解酶基因。
本发明的再一目的在于提供一种包括上述基因的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供一种包括上述基因的重组菌株。
本发明的再一目的在于提供制备伏马毒素降解酶的方法。
本发明的再一目的是提供一种提高伏马毒素降解酶热稳定性方法。
根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：
QTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMCFGSQVGSGEGCGVSPSKACQPSK
本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C的基因，该基因的基因组序列如SEQ ID NO:2所示
SEQ ID NO:2
caaacagatgatccaaaattagttagacatacacaatctggtgcagttgaaggagttgaaggtgatgttgaaacttttttaggtattccttttgctgctcctccagtaggtgacttacgttggcgtccaccagcaccacctcgtgcttgggctggtacaagagatggtcgtcgttttgctcccgattgcattggaaacgagcgtcttcgtgaaggttcacgtgctgctggtacatcagaggactgtttatatttaaatatttggtcaccaaaacaagttggaaaaggtggtttaccagttatgatttgggtttacggaggaggtttctctggtggttctggtgctgttccttactacgacggatctgcacttgctcagaagggagttgttgttgttacatttaattatcgtgctggtattttaggatttttagcacatccagctttatctaaggaatcacctaatggagtatctggtaattatggacttttagatatgttagctgcttttaagtgggttcaaaataatatacgtgaatttggaggagatccaaaccgtgtaacagttttcggtgagtcagctggtgcttcagcattaggattattattaacatcaccactttcagaatctgcatttaatcaagctattcttcaatctcccggtcttgcacgtccacttgctacactttcagagtcagaagcaaatggtttagaacttggtgctgacatttctgctcttcgtcgtgctgatgctggagaattaactaaaattgctcaatcccgtattcctatgtctcgtcaatttacaaaaccacgtccaatgggacctattttagatggatatgttttacgtactcttgatgttgatgcatttgcaaaaggagcatttagaaaaattccagttcttgttggtggaaatgctgacgagggtcgtgcatttactgatcgtcttccagttaaaactgttttagaatatcgtgcatatttaacagaacaatttggagacgaagctgacgcttgggaacgttgttatcccgctaattcagatgctgacgttcccgctgctgttgcacgtttattcggagattctcaatttaataatggtattgaattattatccgctgcttttgcaaaatggcgtacaccattatggcgttatcgtttcactggtattcccggtgctggtagacgtcccgctacacatggtgatgaaattccttatgttttcgcaaatttaggtccatcttcagtttctatgttcggttcattagaaggaggagctggagcttctgatattaagttagcaacagaaatgtctgctgcttgggtttcattcgctgttcacggtgttcccgatcaaggtacaaaatcacattggccacgttttgaacgtagaggagaaattatgtgtttcggatcacaagttggttctggtgagggttgtggagtttctccttctaaagcatgtcaaccttcaaaa
根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/P44C/A168C，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:3：
QTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPCAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLCAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMCFGSQVGSGEGCGVSPSKACQPSK
本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/P44C/A168C的基因，该基因的基因组序列如SEQ ID NO:4所示
SEQ ID NO:4
caaacagatgatccaaaattagttagacatacacaatctggtgcagttgaaggagttgaaggtgatgttgaaacttttttaggtattccttttgctgctcctccagtaggtgacttacgttggcgtccatgtgcaccacctcgtgcttgggctggtacaagagatggtcgtcgttttgctcccgattgcattggaaacgagcgtcttcgtgaaggttcacgtgctgctggtacatcagaggactgtttatatttaaatatttggtcaccaaaacaagttggaaaaggtggtttaccagttatgatttgggtttacggaggaggtttctctggtggttctggtgctgttccttactacgacggatctgcacttgctcagaagggagttgttgttgttacatttaattatcgtgctggtattttaggatttttagcacatccagctttatctaaggaatcacctaatggagtatctggtaattatggacttttagatatgttatgtgcttttaagtgggttcaaaataatatacgtgaatttggaggagatccaaaccgtgtaacagttttcggtgagtcagctggtgcttcagcattaggattattattaacatcaccactttcagaatctgcatttaatcaagctattcttcaatctcccggtcttgcacgtccacttgctacactttcagagtcagaagcaaatggtttagaacttggtgctgacatttctgctcttcgtcgtgctgatgctggagaattaactaaaattgctcaatcccgtattcctatgtctcgtcaatttacaaaaccacgtccaatgggacctattttagatggatatgttttacgtactcttgatgttgatgcatttgcaaaaggagcatttagaaaaattccagttcttgttggtggaaatgctgacgagggtcgtgcatttactgatcgtcttccagttaaaactgttttagaatatcgtgcatatttaacagaacaatttggagacgaagctgacgcttgggaacgttgttatcccgctaattcagatgctgacgttcccgctgctgttgcacgtttattcggagattctcaatttaataatggtattgaattattatccgctgcttttgcaaaatggcgtacaccattatggcgttatcgtttcactggtattcccggtgctggtagacgtcccgctacacatggtgatgaaattccttatgttttcgcaaatttaggtccatcttcagtttctatgttcggttcattagaaggaggagctggagcttctgatattaagttagcaacagaaatgtctgctgcttgggtttcattcgctgttcacggtgttcccgatcaaggtacaaaatcacattggccacgttttgaacgtagaggagaaattatgtgtttcggatcacaagttggttctggtgagggttgtggagtttctccttctaaagcatgtcaaccttcaaaa
根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/F59C/A115C，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:5：
QTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRCAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGCVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMCFGSQVGSGEGCGVSPSKACQPSK
本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/F59C/A115C的基因，该基因的基因组序列如SEQ ID NO:6所示
SEQ ID NO:6
caaacagatgatccaaaattagttagacatacacaatctggtgcagttgaaggagttgaaggtgatgttgaaacttttttaggtattccttttgctgctcctccagtaggtgacttacgttggcgtccaccagcaccacctcgtgcttgggctggtacaagagatggtcgtcgttgtgctcccgattgcattggaaacgagcgtcttcgtgaaggttcacgtgctgctggtacatcagaggactgtttatatttaaatatttggtcaccaaaacaagttggaaaaggtggtttaccagttatgatttgggtttacggaggaggtttctctggtggttctggttgtgttccttactacgacggatctgcacttgctcagaagggagttgttgttgttacatttaattatcgtgctggtattttaggatttttagcacatccagctttatctaaggaatcacctaatggagtatctggtaattatggacttttagatatgttagctgcttttaagtgggttcaaaataatatacgtgaatttggaggagatccaaaccgtgtaacagttttcggtgagtcagctggtgcttcagcattaggattattattaacatcaccactttcagaatctgcatttaatcaagctattcttcaatctcccggtcttgcacgtccacttgctacactttcagagtcagaagcaaatggtttagaacttggtgctgacatttctgctcttcgtcgtgctgatgctggagaattaactaaaattgctcaatcccgtattcctatgtctcgtcaatttacaaaaccacgtccaatgggacctattttagatggatatgttttacgtactcttgatgttgatgcatttgcaaaaggagcatttagaaaaattccagttcttgttggtggaaatgctgacgagggtcgtgcatttactgatcgtcttccagttaaaactgttttagaatatcgtgcatatttaacagaacaatttggagacgaagctgacgcttgggaacgttgttatcccgctaattcagatgctgacgttcccgctgctgttgcacgtttattcggagattctcaatttaataatggtattgaattattatccgctgcttttgcaaaatggcgtacaccattatggcgttatcgtttcactggtattcccggtgctggtagacgtcccgctacacatggtgatgaaattccttatgttttcgcaaatttaggtccatcttcagtttctatgttcggttcattagaaggaggagctggagcttctgatattaagttagcaacagaaatgtctgctgcttgggtttcattcgctgttcacggtgttcccgatcaaggtacaaaatcacattggccacgttttgaacgtagaggagaaattatgtgtttcggatcacaagttggttctggtgagggttgtggagtttctccttctaaagcatgtcaaccttcaaaa
根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/L140C/A258C，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO:7：
QTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGCLGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKICQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMCFGSQVGSGEGCGVSPSKACQPSK
本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/L140C/A258C的基因，该基因的基因组序列如SEQ ID NO:8所示
SEQ ID NO:8
caaacagatgatccaaaattagttagacatacacaatctggtgcagttgaaggagttgaaggtgatgttgaaacttttttaggtattccttttgctgctcctccagtaggtgacttacgttggcgtccaccagcaccacctcgtgcttgggctggtacaagagatggtcgtcgttttgctcccgattgcattggaaacgagcgtcttcgtgaaggttcacgtgctgctggtacatcagaggactgtttatatttaaatatttggtcaccaaaacaagttggaaaaggtggtttaccagttatgatttgggtttacggaggaggtttctctggtggttctggtgctgttccttactacgacggatctgcacttgctcagaagggagttgttgttgttacatttaattatcgtgctggttgtttaggatttttagcacatccagctttatctaaggaatcacctaatggagtatctggtaattatggacttttagatatgttagctgcttttaagtgggttcaaaataatatacgtgaatttggaggagatccaaaccgtgtaacagttttcggtgagtcagctggtgcttcagcattaggattattattaacatcaccactttcagaatctgcatttaatcaagctattcttcaatctcccggtcttgcacgtccacttgctacactttcagagtcagaagcaaatggtttagaacttggtgctgacatttctgctcttcgtcgtgctgatgctggagaattaactaaaatttgtcaatcccgtattcctatgtctcgtcaatttacaaaaccacgtccaatgggacctattttagatggatatgttttacgtactcttgatgttgatgcatttgcaaaaggagcatttagaaaaattccagttcttgttggtggaaatgctgacgagggtcgtgcatttactgatcgtcttccagttaaaactgttttagaatatcgtgcatatttaacagaacaatttggagacgaagctgacgcttgggaacgttgttatcccgctaattcagatgctgacgttcccgctgctgttgcacgtttattcggagattctcaatttaataatggtattgaattattatccgctgcttttgcaaaatggcgtacaccattatggcgttatcgtttcactggtattcccggtgctggtagacgtcccgctacacatggtgatgaaattccttatgttttcgcaaatttaggtccatcttcagtttctatgttcggttcattagaaggaggagctggagcttctgatattaagttagcaacagaaatgtctgctgcttgggtttcattcgctgttcacggtgttcccgatcaaggtacaaaatcacattggccacgttttgaacgtagaggagaaattatgtgtttcggatcacaagttggttctggtgagggttgtggagtttctccttctaaagcatgtcaaccttcaaaa
根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/T188C/A446C，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
SEQ ID NO:9：
QTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVCVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFCVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMCFGSQVGSGEGCGVSPSKACQPSK
本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/T188C/A446C的基因，该基因的基因组序列如SEQ ID NO:10所示
SEQ ID NO:10
caaacagatgatccaaaattagttagacatacacaatctggtgcagttgaaggagttgaaggtgatgttgaaacttttttaggtattccttttgctgctcctccagtaggtgacttacgttggcgtccaccagcaccacctcgtgcttgggctggtacaagagatggtcgtcgttttgctcccgattgcattggaaacgagcgtcttcgtgaaggttcacgtgctgctggtacatcagaggactgtttatatttaaatatttggtcaccaaaacaagttggaaaaggtggtttaccagttatgatttgggtttacggaggaggtttctctggtggttctggtgctgttccttactacgacggatctgcacttgctcagaagggagttgttgttgttacatttaattatcgtgctggtattttaggatttttagcacatccagctttatctaaggaatcacctaatggagtatctggtaattatggacttttagatatgttagctgcttttaagtgggttcaaaataatatacgtgaatttggaggagatccaaaccgtgtatgtgttttcggtgagtcagctggtgcttcagcattaggattattattaacatcaccactttcagaatctgcatttaatcaagctattcttcaatctcccggtcttgcacgtccacttgctacactttcagagtcagaagcaaatggtttagaacttggtgctgacatttctgctcttcgtcgtgctgatgctggagaattaactaaaattgctcaatcccgtattcctatgtctcgtcaatttacaaaaccacgtccaatgggacctattttagatggatatgttttacgtactcttgatgttgatgcatttgcaaaaggagcatttagaaaaattccagttcttgttggtggaaatgctgacgagggtcgtgcatttactgatcgtcttccagttaaaactgttttagaatatcgtgcatatttaacagaacaatttggagacgaagctgacgcttgggaacgttgttatcccgctaattcagatgctgacgttcccgctgctgttgcacgtttattcggagattctcaatttaataatggtattgaattattatccgctgcttttgcaaaatggcgtacaccattatggcgttatcgtttcactggtattcccggtgctggtagacgtcccgctacacatggtgatgaaattccttatgttttcgcaaatttaggtccatcttcagtttctatgttcggttcattagaaggaggagctggagcttctgatattaagttagcaacagaaatgtctgctgcttgggtttcattctgtgttcacggtgttcccgatcaaggtacaaaatcacattggccacgttttgaacgtagaggagaaattatgtgtttcggatcacaagttggttctggtgagggttgtggagtttctccttctaaagcatgtcaaccttcaaaa
本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶突变体编码基因的重组载体，将本发明的伏马毒素降解酶突变体编码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核酸序列与表达调控序列相连接进而表达突变体蛋白。
根据本发明的提高伏马毒素降解酶热稳定性的方法，包括以下步骤：
对氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的马毒素降解酶分别将其470和481位置的氨基酸残基由谷苏酰胺(T)突变为半胱氨酸(C)和亮氨酸(L)突变为半胱氨酸(C)。
根据本发明的提高伏马毒素降解酶热稳定性的方法，当对氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示的马毒素降解酶进行T470C/L481C突变时，所述方法进一步包括进行P44C/A168C、F59C/A115C、L140C/A258C、或T188C/A446C突变的步骤。
根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶FumD，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
QTDDPKLVRHTQSGAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWAGTRDGRRFAPDCIGNERLREGSRAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSGGSGAVPYYDGSALAQKGVVVVTFNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKWVQNNIREFGGDPNRVTVFGESAGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEANGLELGADISALRRADAGELTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAKGAFRKIPVLVGGNADEGRAFTDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADVPAAVARLFGDSQFNNGIELLSAAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANLGPSSVSMFGSLEGGAGASDIKLATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTFGSQVGSGEGLGVSPSKACQPSK
本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶FumD的基因，该基因的基因组序列如SEQID NO：12所示。
caaacagatgatccaaaattagttagacatacacaatctggtgcagttgaaggagttgaaggtgatgttgaaacttttttaggtattccttttgctgctcctccagtaggtgacttacgttggcgtccaccagcaccacctcgtgcttgggctggtacaagagatggtcgtcgttttgctcccgattgcattggaaacgagcgtcttcgtgaaggttcacgtgctgctggtacatcagaggactgtttatatttaaatatttggtcaccaaaacaagttggaaaaggtggtttaccagttatgatttgggtttacggaggaggtttctctggtggttctggtgctgttccttactacgacggatctgcacttgctcagaagggagttgttgttgttacatttaattatcgtgctggtattttaggatttttagcacatccagctttatctaaggaatcacctaatggagtatctggtaattatggacttttagatatgttagctgcttttaagtgggttcaaaataatatacgtgaatttggaggagatccaaaccgtgtaacagttttcggtgagtcagctggtgcttcagcattaggattattattaacatcaccactttcagaatctgcatttaatcaagctattcttcaatctcccggtcttgcacgtccacttgctacactttcagagtcagaagcaaatggtttagaacttggtgctgacatttctgctcttcgtcgtgctgatgctggagaattaactaaaattgctcaatcccgtattcctatgtctcgtcaatttacaaaaccacgtccaatgggacctattttagatggatatgttttacgtactcttgatgttgatgcatttgcaaaaggagcatttagaaaaattccagttcttgttggtggaaatgctgacgagggtcgtgcatttactgatcgtcttccagttaaaactgttttagaatatcgtgcatatttaacagaacaatttggagacgaagctgacgcttgggaacgttgttatcccgctaattcagatgctgacgttcccgctgctgttgcacgtttattcggagattctcaatttaataatggtattgaattattatccgctgcttttgcaaaatggcgtacaccattatggcgttatcgtttcactggtattcccggtgctggtagacgtcccgctacacatggtgatgaaattccttatgttttcgcaaatttaggtccatcttcagtttctatgttcggttcattagaaggaggagctggagcttctgatattaagttagcaacagaaatgtctgctgcttgggtttcattcgctgttcacggtgttcccgatcaaggtacaaaatcacattggccacgttttgaacgtagaggagaaattatgacattcggatcacaagttggttctggtgagggtcttggagtttctccttctaaagcatgtcaaccttcaaaa
本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C、T470C/L481C/P44C/A168C、T470C/L481C/F59C/A115C、T470C/L481C/L140C/A258C、和T470C/L481C/T188C/A446C编码基因的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌。
本发明还提供了一种制备伏马毒素降解酶的方法，包括以下步骤:
(1)将携带伏马毒素降解酶突变体基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
(2)重组菌株培养至对数生长期，在适宜条件下进行伏马毒素降解酶表达；
(3)分离纯化获得伏马毒素降解酶。
其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌感受态细胞，优选大肠杆菌菌体为BL21(DE3)。
本发明还提供上述伏马毒素降解酶突变体的应用，尤其是在降解伏马毒素的应用。
本发明的伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C、T470C/L481C/P44C/A168C、T470C/L481C/F59C/A115C、T470C/L481C/L140C/A258C、和T470C/L481C/T188C/A446C与伏马毒素降解酶FumD性状相比，各伏马毒素降解酶突变体的热稳定性均高于伏马毒素降解酶FumD。应用本发明的方法可以获得性状优良的伏马毒素降解酶突变体，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。
附图说明
图1为伏马毒素降解酶突变体的蛋白电泳图，其中，M：Marker；1：伏马毒素降解酶野生型FumD；2：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C；3：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/P44C/A168C；4：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/F59C/A115C；5：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/L140C/A258C；6：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/T188C/A446C；
图2显示伏马毒素降解酶突变体的活性。
图3显示伏马毒素降解酶突变体的热稳定性。
具体实施方式
以下实施例中涉及的试验材料和试剂：
1、菌株及载体:大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)；
2、培养基：大肠杆菌培养基LB(1％蛋白陈，0.5％酵母提取物、1％NaC1，pH7.0)。
实施例1重组伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C、T470C/L481C/P44C/A168C、T470C/L481C/F59C/A115C、T470C/L481C/L140C/A258C、和T470C/L481C/T188C/A446C的制备。
以伏马毒素降解酶FumD为模版，通过定点突变的方式获得伏马毒素降解酶突变体的质粒pET28a(+)-FumD-T470C/L481C、pET28a(+)-FumD-T470C/L481C/P44C/A168C、pET28a(+)-FumD-T470C/L481C/F59C/A115C、pET28a(+)-FumD-T470C/L481C/L140C/A258C、和pET28a(+)-FumD-T470C/L481C/T188C/A446C。转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/FumD-T470C/L481C、BL21(DE3)/FumD-T470C/L481C/P44C/A168C、BL21(DE3)/FumD-T470C/L481C/F59C/A115C、BL21(DE3)/FumD-T470C/L481C/L140C/A258C、和BL21(DE3)/FumD-T470C/L481C/T188C/A446C。
将携带重组质粒的BL21(DE3)菌株过夜活化，然后接种到100mL LB液体培养基中，在37℃220rpm条件下振荡培养，待菌液浓度OD600达到0.6左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，随后25℃下诱导蛋白表达20h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，镍柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE结果表明，重组伏马毒素降解酶在大肠杆菌中得到了表达，如图1所示，泳道1：伏马毒素降解酶野生型FumD；泳道2：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C；泳道3：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/P44C/A168C；泳道4：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/F59C/A115C；泳道5：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/L140C/A258C；泳道6：伏马毒素降解酶突变体T470C/L481C/T188C/A446C；
实施例2伏马毒素降解酶突变降解FB1活性测定
2.1高效液相色谱检测伏马毒素降解酶突变体酶的酶活，具体方法如下:
(1)FB1标准储备液:称取适量的FB1标品，用50％的乙腈水溶解，配制成浓度为50μg/mL的FB1标准液，-4℃保存；
(2)样品的制备:取镍柱纯化后的伏马毒素降解酶45μL，与5μL的FB1标准储备液混匀，37℃，避光水浴反应20min，反应结束后100℃失活10分钟终止反应；
(3)样品衍生化:向反应液中加入50％乙腈水200μL，250μLOPA衍生液，使FB1终浓度为10μg/ml，充分混匀，过0.22um的滤膜，5min后HPLC检测。通过与FB1的标品的峰图对比，来确定伏马毒素降解酶突变体的酶活性。图2所示，伏马毒素降解酶突变体的活性与野生型FumD相比几乎没有差距，突变体没有出现活性降低的情况。
2.2测定伏马毒素降解酶突变体的热稳定性
取适量野生型及突变体伏马毒素降解酶在45和55℃分别处理0分钟、30分钟和60分钟。处理结束后，以实施案例2.1的方式检测酶的活性。每种温度梯度进行三组平行实验。如图3所示，伏马毒素降解酶突变体在45和55℃处理一小时与野生型相比稳定性有显著性提升，其中T470C/L481C比野生型提升约2.5倍，T470C/L481C/P44C/A168C、T470C/L481C/F59C/A115C稳定性比T470C/L481C提升20％，T470C/L481C/L140C/A258C、T470C/L481C/T188C/A446C稳定性比T470C/L481C提升10％。
(1)伏马毒素降解率：用水解型伏马毒素HFB1的峰面积m0与伏马毒素FB1标品峰面积m的比值表示；
(2)相对活性：用突变体降解率wo与野生型降解率w的比值表示；
以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种热稳定性提高的伏马毒素降解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。
2.一种热稳定性提高的伏马毒素降解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9所示。
3.一种伏马毒素降解酶的编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1或2所述的热稳定性提高的伏马毒素降解酶突变体。
4.根据权利要求3所述的伏马毒素降解酶的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、或SEQ ID NO:10所示。
5.包括权利要求3所述的伏马毒素降解酶的编码基因的重组载体。
6.包括权利要求3所述的伏马毒素降解酶的编码基因的重组菌株。
7.权利要求1或2所述的热稳定性提高的伏马毒素降解酶突变体用于降解伏马毒素的应用。
8.一种提高伏马毒素降解酶FumD的热稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将如SEQ ID NO：11所示的伏马毒素降解酶FumD进行突变，突变后的氨基酸序列如SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、或SEQ ID NO:9任一项所示。
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