CN120005848A - 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶突变体技术领域。所述突变体通过对SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第197位、第345位、第407位、第412位氨基酸进行单点突变或多点突变得到；所述突变包括将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第197位突变为H、第345位突变为N、第407位突变为M、第412位突变为D。本发明提供的酶突变体可以制备得到多糖基化的黄酮，转化率高，纯化方法简单便捷，糖基供体残留量小，适用于工业化生产和应用。

Description

一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和酶突变体技术领域，尤其是涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

环糊精糖基转移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）是一种功能多样的酶，具有催化水解、环化、歧化和偶联反应的能力，在食品和制药工业中具有广泛的应用潜力。歧化反应是CGTase催化的一种分子间转糖基化反应。该反应通过破坏供体分子的糖苷键，并将葡萄糖基团转移到受体分子上，从而改变受体分子的物理化学性质。这种反应在药物修饰和食品添加剂的生产中具有潜在的应用价值，例如，可以催化药物分子的糖基化修饰，从而提高药物的稳定性和生物利用度。

黄酮类化合物是植物次级代谢的重要产物，药理研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性，已在保护肝脏、治疗心血管疾病等医学临床上广泛应用。然而，黄酮、黄酮醇以及查耳酮等分子之间排列紧密、引力较大而难溶于水，导致其生物利用度低。通过结构修饰来增强黄酮类化合物的溶解性，对提高其生物利用度具有重要意义。

目前，黄酮类化合物常见的结构修饰有糖基化、甲基化、酰基化等，其中糖基化修饰已成为近年来国内外的研究热点和重点。为了改善天然黄酮自身的缺陷，通过糖基化对其进行结构改造，在改变黄酮类化合物结构的同时，也增强了生物活性，赋予其丰富的功能。

例如，通过酶促反应将葡萄糖连接到芦丁上制备葡糖基芦丁，其溶解度比芦丁提高了约1.2万倍，具有良好的应用前景。浙江工业大学郑建永研究团队将嗜热脂肪芽孢杆菌环糊精糖基转移酶(CGTase)在枯草芽孢杆菌SCK6中胞外表达，并催化了芦丁的转糖基化反应，最佳转化率达80.13%，糖基化的芦丁的得率为56.1%，纯度为74.3%。然而，其催化芦丁转糖基的产物以单糖基化产物为主，而多糖基化产物比例较低。而在实际工业生产中，获得更多的多糖基化芦丁有助于开发芦丁更多的应用场景，这是亟待解决的问题之一。

此外，目前多糖基化黄酮的分离纯化方法存在明显短板，现有方法基本只适用于单糖基化黄酮产物的分离，多糖基黄酮的分离研究严重不足。在分离单糖基化黄酮产物时，通常先通过淀粉酶对底物进行酶解，之后再开展分离工作，这种操作方式下，糖基供体（可溶性淀粉、糊精等）被水解成单糖，在后续的纯化过程中容易被去除；但在分离多糖基化黄酮产物时，由于部分多糖基化黄酮产物也会被淀粉酶分解，所以无法采用先经淀粉酶处理底物再进行分离的方式，残留的糖基供体难以去除。因此，为了填补多糖基化黄酮分离领域的技术空白，进一步推动多糖基化黄酮相关研究和应用的发展，探索出一种有效的多糖基化黄酮的分离纯化方法，显得尤为重要且紧迫。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用。本发明提供的酶突变体可以制备得到多糖基化黄酮，转化率高，纯化方法简单便捷，糖基供体残留量小，适用于工业化生产和应用。

本发明的技术方案如下：

一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体通过对SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第197位、第345位、第407位、第412位氨基酸进行单点突变或多点突变得到。

进一步地，所述突变包括将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第197位突变为H、第345位突变为N、第407位突变为M、第412位突变为D。

本发明还提供了所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌通过将编码所述突变体的基因克隆至pET-28a载体的NcoI和XhoI位点，然后转化至大肠杆菌得到。

进一步地，所述大肠杆菌的菌株为W3110(DE3)。

本发明进一步提供了一种多糖基化黄酮的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1、制备所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，或使用所述基因工程菌发酵得到的环糊精葡萄糖基转移酶突变体；

S2、添加糖基供体、黄酮和环糊精葡萄糖基转移酶突变体进行催化反应；

S3、通过分离纯化去除糖基供体，获得高纯度多糖基化黄酮。

所述黄酮包括芦丁或具有下式I结构所示的二氢黄酮醇，或具有下式II结构所示的黄酮醇：

（式I）

其中R1-R6基团为-H或-OH；

（式II）

其中R1-R6基团为-H或-OH。

优选的，所述二氢黄酮醇具有下式III所述结构：

（式III）

优选的，所述黄酮醇具有下式IV所述结构：

（式IV）

优选的，步骤S2所述糖基供体为β-环糊精、麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉中的一种或多种。

优选的，步骤S2所述糖基供体的添加量为1-300 g/L，黄酮添加量为1-100 g/L，酶添加量为0.1-10 g/L。

优选的，步骤S2所述催化反应的温度为40-75 ℃，反应pH为5.5-8.5，反应时间为1-24 h。

优选的，步骤S3所述的纯化条件为：选用苯乙烯型中极性树脂纯化，上样量为1BV；除杂剂选用水，用量3-5 BV；解吸剂选用30%乙醇，收集1.5-2.5 BV解吸液，随后对解吸液进行旋蒸干燥，即得到高纯度多糖基化黄酮。

本发明有益的技术效果在于：

1、本发明通过大量实验和分子对接预测分析寻找到最佳突变位点和突变方式，得到的突变体可以利用廉价的糖基供体催化黄酮的糖基化反应得到多糖基化黄酮，显著提高了转化率。

2、本发明制备得到的多糖基化黄酮与现有技术的突出区别在于，本发明催化的糖基化产物以多糖基化产物为主，而非单糖基化产物为主。

3、本发明提供的多糖基化黄酮的纯化方法操作方法简单，可很好地去除糖基供体，糖基供体残留量小于0.1%，从而得到高纯度的多糖基化黄酮，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为实施例2不同种类的环糊精作为糖基供体和野生型酶WT进行催化反应的HPLC分析图；

图2为实施例2不同种类的环糊精葡萄糖基转移酶的相对活性分析；

图3为实施例3酶突变体HNMD的最适温度分析；

图4为实施例3酶突变体HNMD的最适pH分析；

图5为实施例3不同糖基供体和酶突变体HNMD进行催化反应的HPLC分析图；

图6为实施例4筛选不同树脂纯化多糖基化芦丁；

图7为实施例5不同梯度乙醇解吸去除糖基供体的效果；

图8为实施例5中30%乙醇解吸用量对于多糖基化芦丁组成影响；

图9为实施例6高纯度多糖基化芦丁的HPLC分析图；

图10为实施例7高纯度多糖基化化合物I的HPLC分析图；

图11为实施例8高纯度多糖基化化合物II的HPLC分析图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。

实施例1：环糊精葡萄糖基转移酶突变体的构建和表达

环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示氨基酸序列，针对大肠杆菌密码子偏好性，设计了该酶的DNA编码序列（SEQ ID No.2），委托北京擎科生物科技股份有限公司进行全基因合成并克隆至pET28a质粒的NcoI和XhoI位点之间，获得重组质粒pET-WT。DNA编码序列不含有终止密码子，与质粒上的His tag进行融合表达。

以重组质粒pET-WT为模板，使用高保真酶和引物对197-F/197-R、345-F/345-R、407-F/407-R、412-F/412-R反向扩增质粒，引物序列如表1所示，获得带有15-20 bp同源臂的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小，验证正确的条带经过胶回收后，使限制性内切酶DpnI去除残留的质粒模板，然后通过Gibson组装构建重组质粒。重组质粒通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单克隆进行测序验证，验证正确的单突变重组质粒分别命名为pET-197H、pET-345N、pET-407M、pET-412D。以突变后的重组质粒，更换不同的引物进行多轮迭代突变，获得同时含有上述四个突变位点的重组质粒pET-HNMD重组质粒经过热激法转化大肠杆菌W3110(DE3)感受态，含有相应重组质粒的阳性菌株分别命名为EC197H、EC345N、EC407M、EC412D、ECHNMD。

表1 引物序列

分别挑选上述五种重组菌株单菌落分别接种至LB培养基，37℃、200 rpm培养过夜，然后以3%接种量接种至新的TB培养基中，37℃培养至OD为0.6-0.8左右，降温至25℃，并加入终浓度为0.2 mM 的IPTG诱导重组蛋白表达，诱导时间为14-18 h。

其中LB培养基的配方为：酵母粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L。

TB培养基的配方为：‌蛋白胨‌ 12g /L、酵母粉24 g/L、甘油‌ 4 g/L、磷酸氢二钾9.4 g/L、磷酸二氢钾 2.2 g/L。

培养好的菌液通过离心收集菌体，使用等体积的pH=7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液进行重悬，然后通过高压均质机进行破碎。离心收集上清液，使用镍离子螯合柱对重组蛋白进行分离纯化，然后使用12 kD的半透膜在低温下进行透析，以去除多余的盐分。菌株EC197H、EC345N、EC407M、EC412D、ECHNMD纯化后的重组蛋白即为环糊精葡萄糖基转移酶突变体，分别命名为197H、345N、407M、412D、HNMD。

实施例2：芦丁糖基化反应和催化验证

芦丁糖基化反应的操作步骤如下所示：按实施例1的方法制备环糊精葡萄糖基转移酶及其五种重组菌发酵生成的酶突变体，在250 mL锥形瓶中加入50 mL pH 6.5的磷酸盐缓冲液，然后加入6 g/L芦丁，60 g/L糖基供体，300 mg/L环糊精葡萄糖基转移酶或其突变体（浓度由BCA法测定），在60℃条件下催化反应4 h，取样使用乙腈稀释一定倍数进行HPLC检测糖基化产物。HPLC检测条件如下表所示。

表2 色谱条件

首先选取验证所需的糖基供体。糖基供体种类对糖基化反应有较大影响，以α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精为糖基供体，按上述条件使用野生型酶WT进行催化糖基化反应，结果如图1所示，芦丁糖基化反应产物为混合物，G1-G5分别代表连接1-5个糖基的芦丁。在催化反应中，芦丁上被接入一个或多个葡萄糖基，其中接入一个糖基的糖基化芦丁（G1）含量最多，随着糖基的增多，含量逐渐减少，糖基个数大于5的糖基化芦丁（G5）较少。α-环糊精作为糖基供体时糖基化产物最多，其次为γ-环糊精，β-环糊精最少。然而α-环糊精和γ-环糊精价格较高，不适合作为糖基化供体。

以廉价的β-环糊精作为糖基供体，以芦丁转化率为指标，考察了野生型酶WT和不同突变体EC197H、EC345N、EC407M、EC412D、ECHNMD的催化效果。结果如图2所示，不同的突变体催化芦丁的转化率不同，其中突变体HNMD催化剩余的芦丁最少，转化率为81.3%，具有良好的催化效果。

实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶突变体HNMD催化条件的优化

以高浓度的β-环糊精为糖基供体（300 g/L），加入50 g/L芦丁和1 g/L酶HNMD，以芦丁的剩余量为指标，参考实施例2中的条件进行催化，考察了温度和pH对酶突变体HNMD活性的影响，结果如图3、图4所示，该突变体最适温度为65℃，在40-75℃范围内具有较好的活性，最适pH为7.5，在pH5.5-8.5范围内具有较好的活性。

在pH 7.5和65℃条件下，加入50 g/L芦丁和300 g/L不同的廉价糖基供体（β环糊精、麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉）和10 g/L酶突变体HNMD，每隔2 h在不同时间取样进行HPLC检测，直到芦丁含量不再下降。不同糖基供体催化结束时间依次为6 h、8 h、16 h和22h。催化结束后的HPLC分析结果如图5所示，G1-G6分别代表连接1-6个糖基的芦丁。糖基化产物均以多糖基化产物为主（糖基大于1），最多可达14个糖基。芦丁转化率与糖基供体分子量有关，糖基供体分子量越小，芦丁转化率越高，多糖基化产物越多。

实施例4：筛选不同树脂纯化多糖基化芦丁

准备树脂1（苯乙烯型非极性树脂），树脂2（苯乙烯型中极性树脂），树脂3（苯乙烯型弱极性树脂）树脂各100 mL备用。在pH 7.5和65℃条件下，加入50 g/L芦丁和300 g/L β-环糊精，反应6 h制备多糖基化芦丁制备100 mL催化液。反应完成后，对催化液进行抽滤除杂，取滤液准备上柱（1 BV=100 mL），吸附完全后，用3 BV水顶料和除杂，结束后用4 BV 95%乙醇解吸旋干备用。

树脂纯化结果如图6所示，结果表明，树脂2解吸成品中的多糖基化芦丁数量多于树脂1和树脂3，因此选择树脂2为后续纯化树脂。

实施例5：不同梯度乙醇解吸去除糖基供体

通过优化不同梯度乙醇从而进一步去除多糖基化芦丁中的糖基供体。在pH 7.5和65℃条件下，加入50 g/L芦丁和300 g/L β-环糊精，反应6 h制备多糖基化芦丁制备100 mL催化液。滤液过树脂2树脂（1 BV=100 mL），吸附完全后，用水除杂，结束后用不同梯度乙醇进行解吸，将各梯度解吸液旋干后测定结果。

按实施例2的方法检测多糖基化芦丁，苯基键合硅胶柱和视差折光检测器检测检测糖基供体残留量，分析条件如下。色谱柱：苯基键合硅胶柱（Venusil XBP Polar-Phenyl4.6×250 mm, 5μm）；柱温：40℃；流速：1.0 m L/min；进样量：10 μL；流动相：甲醇-水（90∶10）；示差折光检测器。

多糖基化芦丁检测结果如图7所示，结果表明，30%乙醇解吸后主要为多糖基化芦丁产物，而乙醇洗脱浓度过大后，容易将芦丁洗脱下来，同时40%乙醇解吸液和50%乙醇解吸液检测的糖基供体残留量小于0.1%，因此后续选用30%乙醇作为解吸剂。

取100 mL上游液体抽滤，滤液过树脂2（1 BV=100 mL），吸附完全后，用水除杂，结束后用30%乙醇持续解吸，间隔0.5 BV收集解吸液，多糖基化芦丁未检出后停止解吸，而后分别将解吸液旋干后测定结果。

结果如图8所示，解析液中多糖基化芦丁的组成受解析用量的影响，解析液用量越低，多糖基化芦丁含量越高，而2.5 BV后已经检测不到多糖基化芦丁含量。同时检测了解析液中糖基供体的残留量，1.0 BV仍可以检测出0.5%糖基供体残留量，而1.5 BV以后其糖基供体残留量低于0.1%，因此综合考虑选用30%乙醇解吸收集为1.5-2.5 BV。

实施例6：高纯度多糖基化芦丁的制备

在pH 7.5和65℃条件下，加入50 g/L芦丁、300 g/L β-环糊精、10 g/L酶突变体HNMD，在65 ℃、pH7.5条件下反应6 h。反应结束后抽滤去除杂质，滤液过树脂2（1 BV=1 L），吸附完全后，用4 BV水除杂，而后用4 BV 30%乙醇进行解吸，收集1.5-2.5 BV解吸液，对解吸液于50℃下进行浓缩，浓缩完毕后于50℃真空干燥得到样品，样品用液相检测多糖化基芦丁和糊精含量。多糖基化芦丁检测结果如图9所示，G1-G6分别代表连接1-6个糖基的芦丁。可以看到产物样品中含量含有连接了不同糖基的产物，且连接多个糖基的产物占比较高。本实施例的多糖基化芦丁的得率为0.71 g/g芦丁，芦丁残留量为3.0%，糖基供体残留量为0.08%，纯度较高。

实施例7：高纯度多糖基化化合物I的制备

在pH 7.5和65℃条件下，加入50 g/L化合物I（化学结构如式III所示）、300 g/Lβ-环糊精、10 g/L酶突变体HNMD，在65 ℃、pH7.5条件下反应6 h。反应结束后抽滤去除杂质，滤液过树脂2（1 BV=1 L），吸附完全后，用4 BV水除杂，而后用4 BV 30%乙醇进行解吸，收集1.5-2.5 BV解吸液，对解吸液于50℃下进行浓缩，浓缩完毕后于50℃真空干燥得到样品，样品用液相检测多糖基化化合物I和糊精含量，检测波长290 nm，其他条件同实施例2和实施例5。多糖基化化合物I检测结果如图10所示，可以看到产物样品中含量含有连接了不同糖基的产物，且连接多个糖基的产物占比较高。本实施例的多糖基化化合物I的得率为0.75 g/g化合物I，化合物I残留量为0.8%，糖基供体残留量为0.07%，纯度较高。

实施例8：高纯度多糖基化化合物II的制备

在pH 7.5和65℃条件下，加入50 g/L化合物II（化学结构如式Ⅳ所示）、300 g/Lβ-环糊精、10 g/L酶突变体HNMD，在65 ℃、pH7.5条件下反应6 h。反应结束后抽滤去除杂质，滤液过树脂2（1 BV=1 L），吸附完全后，用4 BV水除杂，而后用4 BV 30%乙醇进行解吸，收集1.5-2.5 BV解吸液，对解吸液于50℃下进行浓缩，浓缩完毕后于50℃真空干燥得到样品，样品用液相检测多糖基化化合物II和糊精含量，检测条件同实施例2和实施例5。多糖基化化合物II检测结果如图11所示，可以看到产物样品中含量含有连接了不同糖基的产物，且连接多个糖基的产物占比较高。本实施例的多糖基化化合物II的得率为0.81 g/g化合物II，化合物II残留量为1.2%，糖基供体残留量为0.06%，纯度较高。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体通过对SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第197位、第345位、第407位、第412位氨基酸进行单点突变或多点突变得到。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变包括将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第197位突变为H、第345位突变为N、第407位突变为M、第412位突变为D。

3.一种表达权利要求1或2所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将编码所述突变体的基因克隆至pET-28a载体的NcoI和XhoI位点，然后转化至大肠杆菌得到。

4.一种多糖基化黄酮的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、制备权利要求1或2所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，或使用权利要求3所述基因工程菌发酵得到的环糊精葡萄糖基转移酶突变体；

S2、添加糖基供体、黄酮和环糊精葡萄糖基转移酶突变体进行催化反应；

S3、通过分离纯化去除糖基供体，获得高纯度多糖基化黄酮。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述黄酮包括芦丁或具有下式I结构所示的二氢黄酮醇，或具有下式II结构所示的黄酮醇：

（式I）；

其中R1-R6基团为-H或-OH；

（式II）

其中R1-R6基团为-H或-OH。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述二氢黄酮醇具有下式III所述结构：

（式III）

所述黄酮醇具有下式IV所述结构：

（式IV）。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述糖基供体为β-环糊精、麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉中的一种或多种。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述糖基供体的添加量为1-300 g/L，黄酮添加量为1-100 g/L，酶添加量为0.1-10 g/L。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述催化反应的温度为40-75℃，反应pH为5.5-8.5，反应时间为1-24 h。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的纯化条件为：选用苯乙烯型中极性树脂纯化，上样量为1 BV；除杂剂选用水，用量3-5 BV；解吸剂选用30%乙醇，收集1.5-2.5 BV解吸液，随后对解吸液进行旋蒸干燥，即得到高纯度多糖基化黄酮。