CN1299234A

CN1299234A - 用于高脂血症遗传治疗的方法和化合物

Info

Publication number: CN1299234A
Application number: CN98813961A
Authority: CN
Inventors: C·J·斯特尔; B·T·克伦; P·T·班迪奥帕迪亚; J·罗伊－乔杜里
Original assignee: Albert Einstein College of Medicine; University of Minnesota System
Current assignee: Albert Einstein College of Medicine; University of Minnesota System
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2001-06-13
Also published as: WO1999040789A1; KR20010034493A; EP1054595A1; EP1054595A4; AU9295898A; CA2320965A1; JP2002534353A; US6524613B1

Abstract

本发明涉及在编码三个载脂蛋白Apo A1、Apo B和Apo E的基因中引入特定的改变。在Apo A1上的改变是引入一个半胱氨酸残基,以至可以形成二硫键连接的Apo A1同型二聚体和Apo A1/A2异型二聚体。在Apo B上的改变是引入终止密码子或移码突变,其引起一种截短的Apo B蛋白的产生。在Apo E上的改变是引入已经被鉴定为是保护性的特定的位点突变。这些已被改变的蛋白在患者肝脏内的产生降低了该患者形成动脉硬化症的危险性。在一个实施例中,遗传改变的引入是通过使用嵌合体,混合的RNA/DNA,双链寡核苷酸。

Description

用于高脂血症遗传治疗的方法和化合物

本申请要求申请系列编号60/074,497(1998年2月12日申请)和申请系列编号09/108,006(1998年6月30日申请)的优先权。

1．发明领域

本发明涉及通过在编码载脂蛋白B(Apo B)、编码载脂蛋白E(ApoE)和载脂蛋白A1(Apo A1)的基因上引入遗传修饰用于在体内矫正引起遗传缺陷的疾病、以及阻止这些疾病的重组诱发剂寡核苷酸碱基对的使用的方法和组合物。

2．发明背景

2.1使用嵌合突变载体在所培养的细胞中实现遗传改变

本说明书中所包括的出版物或专利申请并不承认该申请中的出版物或发明，如果有的话，先于本发明或源自除本发明者以外的人士的观念。

已发表的重组诱发剂寡核苷碱基例子的术语定为嵌合突变载体(Chimeric Mutational Vectors,CMV)或嵌合质粒体，因为它们含有2’-O-修饰的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。

一段具有互补的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸并含有一段与噬菌体M13 mp 19的一段片段同源的序列的寡核苷酸，如Kmiec,E.B.等所描述，1994年11月，分子和细胞生物学，14,7163-7172。该寡核苷酸具有单个连续的核糖核苷片段。Kmiec等显示该寡核苷酸为来自Ustilago maydi的REC2同源配对酶的一种底物。

专利出版物WO 95/15972,1995年6月15日发表，和副本美国专利编号5,565,350(’350专利)描述了双链体CMV用于在真核细胞中引入遗传变化。已经报道了在Ustilago maydis基因和鼠ras基因中的例子。后一例子被设计用于将一个转化突变引入ras基因中，以至该ras基因在NIH 3T3细胞中的成功突变将引起在软琼脂中的细胞集落生长(“转化”)。’350专利报道NIH 3T3的最大转化率小于0.1％，也就是，暴露于ras双链体CMV中的每106个细胞中大约有100个转化体。在Ustilago maydis系统中，转化体的比率为每106中大约有600个。一种被设计将一种突变引入到人bcl-2基因中的嵌合载体如Kmiec,E.B.所描述，1996年2月，肿瘤学研究，23,188。

一种被设计用于修复K-ras的密码子12上的突变的双链体CMV如Kmiec,E.B.所描述，1995年10月，药物传递进展综述，17,333-40。该双链体CMV在Capan 2(一种来自人胰脏腺癌的细胞株)上进行试验，使用LIPOFECTINTM将双链体CMV引入到Capan2细胞中。在双链体CMV被引入的24小时以后，收集细胞并提取基因组DNA；通过PCR扩增一段含有K-ras的密码子12的片段，并通过等位基因特异性探针杂交来估计转化比率。据报道修复的比率大约为18％。

一种设计用于修复编码肝脏/骨骼/肾脏类型的碱性磷酸酶的基因上的突变的双链体CMV如Yoon,K.等所报道，1996年3月，美国国家科学院院报93,2071。该碱性磷酸酶基因通过一种质粒被瞬时引入到CHO细胞中。6小时以后引入双链体CMV。该质粒在双链体CMV引入的24小时以后被回收并进行分析。结果显示该碱性磷酸酶基因中大约有30到38％被双链体CMV修复。

WO 97/41411和副本美国专利编号5,760,012(E.B.Kmiec,A.Cole-Strauss和K.Yoon)，和出版物Cole-Strauss A.，等，1996年9月，科学273，1386公布双链体CMV被用于造血细胞的遗传疾病的治疗，如，镰状细胞病、地中海贫血症和家族性脾性贫血。美国专利申请系列编号08/664,487(E.B.Kmiec,1996年6月17日申请)描述了具有非天然核苷酸的双链体CMV用于特定的定点诱变。该申请和Kmiec及其同事的某些出版物中所描述的双链体CMV含有一段DNA∶DNA同源双链的中心片段和RNA∶DNA杂合双链或2’-OMe-RNA∶DNA杂合双链的侧翼序列。

Kmiec及其同事的工作考虑到当这些细胞暴露于CMV时，它们具有有丝分裂活性，也就是，增生的细胞。Kmiec及其同事使用了一种CMV/脂质体的大分子载体复合物，其中将CMV与一种预先形成的脂质体或脂囊泡混合。在这种复合物中，该CMV被认为是黏附在脂质体的表面。

Kren等，1997年6月，肝脏病学，25，1462-1468，报道了在非复制的、初级组织培养大鼠肝细胞中，成功地使用一种CMV来诱变凝固辅助因子Ⅸ基因。Kren等，1998年3月，自然医学，4,285，报道在体内使用一种CMV来将一种遗传上的缺陷引入到相同的基因上。

2.2使用聚氮丙啶大分子载体在体内和体外转染

分支的链状聚氮丙啶已经被作为载体使用，在体内及体外将核酸引入到真核细胞中，Boussif,O.，等，1995，美国国家科学院院报92，7297；Abdallah,B.等，1996，人类基因治疗，7,1947；Boletta,A.，等，1997,8,1243-1251。半乳糖苷化的聚氮丙啶在体外用于将DNA引入到培养的HepG2肝癌细胞株中由Zanta，等报道，1997年10月1日，生物缀合化学，8,839-844。某一蛋白配基，转铁蛋白同聚氮丙啶的偶连及其用于将一个测试基因引入到培养的细胞中(通过使用转铁蛋白受体)如Kircheis,R.，等所述，1997，基因治疗，4,409-4-18。分支的链状聚氮丙啶含有具宽pK’范围的二级和三级的氨基以及，因此这些聚氮丙啶在聚赖氨酸很少或没有活性的pH(即约小于8)下具有充分的缓冲能力，Tang,M.K.,& Szoka,F.C.,1997，基因治疗4,823-832。分支的链状polyalkanylimine(包括聚氮丙啶)作为载体将核酸引入细胞中的用途如WO 96/02655所描述，J-P.Behr等。

线性聚氮丙啶在体内和体外成功地转染某一基因如Ferrari,S.，等所报道，基因治疗，4,1100-1106。含有一种线性polyalkanylimine和一个核酸的组合物如专利出版物WO 93/20090所公布，S.Stein等。

2.3脂质载体在体内转染中的作用

已经描述了将脂质体或脂囊泡用于将编码一种外源蛋白的DNA引入到细胞中。最常使用的技术是将DNA黏附到一个带正电荷的脂质体的表面，而不是包裹DNA，虽然包裹DNA的技术是已知的。美国专利编号4,235,871和4,394,448是相关的。该领域由Smith,J.G.，等综述，1993，生物化学与生物物理学报，1154,327-340和Staubinger.,R.M.，等，1987，酶学方法，185,512。DOTAP，一种在脂质体中以在体内转染肝细胞的阳离子脂质，如Fabrega,A.J.，等所描述，1996，移植，62,1866-1871。含有阳离子脂类的脂质体在转染各种成年子鼠细胞中的应用已在zhu,N，等，1993，科学261,209中描述。含有磷脂酰丝氨酸的脂类形成包裹DNA的脂质体以用于转染的用途如Fraley,R.，等所述，1981，生物化学20,6978-87。

2.4脱唾液酸糖蛋白受体用于肝细胞特异性转染

美国专利编号5,166,320和5,635,383公布了转染肝细胞，通过形成一种DNA的复合物、一种多聚阳离子的大分子载体和一种脱唾液酸糖蛋白受体的配基。在一个实施例中，该大分子载体是聚赖氨酸。含有乳糖脑苷酯的脂质体用于体内转染肝细胞如Nandi,P.K.，等所述，1986，生命的化学杂志，261,16722-16722。脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体与一种报告质粒一起转染肝细胞的用途如Hara等所描述，1995，基因治疗，2,764-788。半乳糖苷化的聚氮丙啶在转染培养中的肝细胞中的用途如Zanta M-A.，等所描述，abst.pub.1997年10月1日，生物缀合化学，8,839-844。

2.5 Apo B100、Apo B48和血清LDL的减少

肝脏和肠脂蛋白分泌：肝脏及肠形成并分泌脂蛋白以传递脂质。这些脂蛋白的术语分别为极低密度脂蛋白(very low densitylipoproteins,VLDL)和乳糜微粒。VLDL和乳糜颗粒在大小和它们的主要蛋白组分上有所不同。VLDL的主要蛋白是Apo B 100，含有4536个氨基酸；乳糜颗粒的主要蛋白是Apo B48，其包括Apo B100的N-末端2152个氨基酸。Apo B48和Apo B100由单个基因编码，其转录产物在6666位核苷酸(密码子2179)上被一段特定的胞啶脱氨酶(称为载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBE))修饰。该酶的活性将C转化为U，结果形成一个终止密码子。

VLDL(其包含Apo B100)和乳糜颗粒(其含有Apo B48)都在血管系统中将甘油三酸酯传递到某一转运位点。然而，在甘油三酸酯水解和传递之后，VLDL被转变为LDL，而乳糜颗粒不是。高水平的循环LDL本身和一种高比例的LDL∶HDL增加了动脉粥样硬化的危险性。因此，已经有人认为降低Apo B48与Apo B100的比例将具有有利的效果。

在许多特定的哺乳动物中，如大鼠和小鼠，肝脏和肠的脂类分泌物中高百分比地含有Apo B48。这些物种具有明显较低比例的LDL∶HDL,Greve J.，等，1995,Proc.Zool.Soc.,Calcutta,47,93-100。在其他物种，如人和兔，肝细胞缺乏APOBE，因此肝细胞仅产生VLDL。

一种降低人类的动脉粥样硬化症的策略已经被引入到编码载脂蛋白B编辑酶催化元件的基因(APOBEC-1)中，在一种组成性启动子控制下，以将Apo B100转录产物转变为Apo B48转录产物。APOBED-1在正常及遗传高血脂的Watanabe兔的肝细胞中的瞬时表达不引起LDL水平的瞬时降低，Greeve,J.，等，1996,J.Lipid Res.37,2001-17.然而，APOBEC-1未受控的产生是突变的并可能引起肝细胞增生和肝细胞癌，Yamanaka,S.，等，1995，美国国家科学院学报，92,8483-8487。

已经观察了对于编码缩短的Apo B 100基因是纯合体或混合的杂合体的个体，Malloy等，1981,J.Clin.Invest.67,1441；Hardman,D.A.，等，1991,J.Clin.Invest.88,1722。这些个体具有少量或缺乏LDL。例如，删除核苷酸5391-5394导致一个移码突变和一个缩短的Apo B(B37)。这些病人大多数常常无症状，Steinberg,D.，等，1979,J.Clin.Invest.64,292；Young,S.G.，等，1988，科学，241,591；Young,S.G.,1987,J.Clin.Invest.79,1831.Reviewed Linton,M.F.,1993,J.Lipid.Res.34,521；Kane,J.P.& Havel,R.J.,1995，第57章，遗传性疾病的代谢基础，Scriver等编辑(McGraw Hill,New York)。类似地，每3000人中有1人具有100mg/dl或更少的血清胆固醇水平，这是由于该个体在缩短的Apo B基因上是杂合体，出处同上，第1866页。

导致Apo B比Apo B 31短的截短不循环。已经研究了被截短的ApoB 86、87和90。Apo B 86和Apo B 87不与LDL相关，而Apo B 90与其相关。每种突变均与β低脂蛋白血症相关，Linton,M.L.，等，1990,Clin.Res.38,286A(摘要)；Tennyson,G.E.，等，1990，Clin.Res.38,482A(摘要)；Kruhl,E.S.，等，1989，动脉硬化，9,856。

2.6 Apo E多形现象和Ⅲ型高脂血症

载脂蛋白E是含有Apo B48的脂蛋白的LDL受体的主要配基。有三种人类Apo E的等位基因的形式，它们彼此存在一个或两个氨基酸的区别：Apo E2(Cys¹¹²Cys¹⁵⁸)；Apo E3(Cys¹¹²Arg¹⁵⁸)；以及Apo E4(Arg¹¹²Arg¹⁵⁸)。在等位基因的发病率上存在重要的地理变化。除了非洲，E2的变化率在4％和12％之间，E3在70％和85％之间以及E4在7.5％和25％之间。在苏丹，这些发病率分别为8.1％、61.9％以及29.1％,Mahley,R.W.& Rall,S.C.,Jr.,1995,61章，遗传性疾病的代谢基础，Scriver等编辑(McGraw Hill,New York)。因此，北美和欧洲大约有1％的人群是Apo E 2/2纯合体。在这些纯合体中，大约有2％至10％之间的人群表现出Ⅲ型高血脂症。然而，反常的是，没有发展成明显的Ⅲ型高血脂症的Apo E 2/2纯合体表现出低于平均的与胆固醇相关的LDL，Davignon,J.,1988，动脉硬化8,1。

E4等位基因也与一种主要疾病(Alzheimer’s Disease)发生率的提高和冠状动脉疾病危险性的增加相关，Roses,A.D.,1996,Ann.NY Acad.Sci.802,50-57；Okumoto,K.,& Fujiki,Y.,1997，自然遗传学17,263；Kuusi,T.，等，1989，动脉硬化，9,237。在Apo E基因的转录起始位点的5’端第491位核苷区域上的多整性也独立地与Alzheimer’s疾病的危险性提高相关。491-A基因型上的个别纯合体中具有Alzheimer’s的危险性提高，然而491-T基因型上的个别纯合体或杂合体不具有危险性的提高，Bullido,M.J.,1998，等，自然遗传学18,69-71。

在大多数个体中，E2等位基因与血清胆固醇和LDL的最低水平相关。然而，E2/E2纯合体人群中大约有5％(他们受到环境或遗传的压力)发展成Ⅲ型高脂血症。最普遍的压力是甲状腺机能减退、未治疗过的糖尿病、酒精中毒和显著的体重增加。除去这些压力的结果通常是高脂血症的控制。具有Ⅲ型高脂血症的病人很少具有突变的ApoE基因，Mahley & Rail，出处同上。表61-5。

2.7 Apo A1和HDL

高密度脂蛋白(HDL)将胆固醇和磷脂从肝外的位置运输到肝脏内。特别地，HDL被认作将脂质沉着物从血管内皮细胞移走，并且所观察到的HDL-胆固醇(HDL-C)的水平和冠状动脉疾病之间的负相关是由于这一功能，Eisenberg,S.,1984,J.Lipid Research 25,1017；Gordon,D.J.，等，1986，循环74,1217。HDL通过肝脏和肠以新生的含有四个apo A1分子(其为一种243个氨基酸的蛋白)的HDL颗粒的形式分泌。该新生的HDL将游离的胆固醇从细胞膜和/或其它脂蛋白上在物理上吸引出来。所得到的颗粒含有apo A1、磷脂、和胆固醇。这种颗粒是卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT)的底物，该酶将游离的胆固醇酯化成胆固醇脂类。更疏水的胆固醇脂类的存在将新生的HDL最初转换成一种更稳定的成熟HDL3以及继而成HDL3颗粒。

胆固醇酯转移蛋白将酯化的胆固醇从HDL3和HDL2颗粒中除去，并将它们传递到LDL，以及因此通过LDL受体传递到肝细胞中。

已经发现了两种apo A1的突变体，其中的HDL水平下降。这些突变是错义突变，其用一个半胱氨酸取代了一个精氨酸，Weisgraber,K.H.，等，1983，生命的化学杂志.258,2508(apo A1 milano(Arg-CYS)173)；Bruckert,E.，等，1997，动脉硬化128,121(apoA1 R151C(Arg-Cys)151)。该突变是占优势的，也就是，HDL的水平在受影响的个体(他们在该突变上是杂合体)中被降低。关于这一点的一种解释是突变的apo A1蛋白形成了胱氨酸连接的野生型apo A2分子的异型二聚体，其与同型二聚体一样，是在HDL中发现的一种较小的载脂蛋白。

令人惊讶的是即使该脂质的分布概况，即低HDL和提高的三甘油三酯，是通常与动脉硬化症的加速相关的一种，这些突变不与动脉硬化症相关，相反，更准确的，其被认作是保护动脉硬化症的。

保护的机制没有被建立。关于apo A1 milano载体的大量(N=33)回顾性流行病学研究显示在这些个体中的冠状动脉疾病发病率低，然而，这一事实的重要性的认识必须在Limone sul Garda村庄中的非染病居民中类似的低发病率的背景下，Gualandri,V.，等，1985,Am.J,Hum.Gen.37,1083。体外研究显示突变的apo A1不能更有效地补充质膜胆固醇，Bielicki,J.K.，等，1997,Arterioscier ThrombVasc Biol 17,1637。有直接的证据证明外源apo A1 milano的施用，不是野生型apo A1，以与磷脂形成复合物的形式，在一种公认的动脉硬化症模式系统中是保护性的，Ameli,S.等，1994，循环90,1935；Shah,P.K.，等，1998，循环97,780。

3．发明概要

本发明涉及治疗和/或预防的方法，其包括在某一患者个体内引入特定的遗传改变。在一个实施方案中，该特定的遗传改变阻断了ApoB 100的合成以及因此降低了LDL胆固醇的水平。在一种选择性实施例中，该特定的变更将一种Apo E4等位基因转变成一种Apo E3或Apo E2等位基因，其与动脉硬化症及Alzheimer氏疾病的危险率降低相关。在另一个可选的实施方案中，本发明涉及到在具有由继承性的遗传缺陷引起的疾病的患者肝细胞的基因中纠正这些缺陷。

本发明进一步包括治疗和/或避免由编码apo A1的基因上的突变引起的动脉硬化症，和对于引入这些突变有用的化合物。这些有助于本发明实践的突变是插入一个半胱氨酸残基的突变，其形成了一个胱氨酸并导致了同型二聚体和含有apo A2的异型二聚体的形成。

本发明中的实施方案可以使用目前已知的或以后将开发的，任何寡核苷酸或其类似物或衍生物进行实践，其可以在患者个体的肝细胞基因组中引起特定的遗传上的改变(此后称“重组诱发剂寡核苷碱基”)，例如，一种如美国专利编号5,565,350、编号5,731,181、和编号5,760,012中所描述的嵌合的突变载体(CMV)。可选择地，该重组诱发剂寡核苷碱基可以是一种异型双链的突变载体或非嵌合突变载体，如美国专利申请编号09/078,063和编号09/078,064(1998年3月12日申请)中所描述的，因此它们均作为参考结合于本说明书中。

在一个优选的实施方案中，该重组诱发剂寡核苷碱基与一种大分子载体复合，该载体连接有一个特定的配基。选择该配基以与一种细胞表面受体结合，该受体内在化到肝细胞中，通过网格蛋白包被的凹陷进入核内体中。与这些配基结合的细胞表面受体此处称为“网格蛋白包被的凹陷受体”。肝脏的网格蛋白包被的凹陷受体的例子包括低密度脂蛋白(LDL)受体和脱唾液酸糖蛋白受体。

在特定的实施方案中，该大分子载体可以是1)一种直径在25nm和400nm之间的水核心脂囊泡，其中的水核心含有CMV；2)一种直径在25nm和400nm之间的脂质微球，具有一个脂质中心，其中的脂质中心含有CMV的一种亲脂性盐；或3)CMV的一种多聚阳离子盐。这些盐的多聚阳离子的例子包括聚氮丙啶、聚赖氨酸和组蛋白H1。在一个实施方案中，该多聚阳离子是一种线性的多聚氮丙啶(PEI)盐，其具有的大多数平均分子量为大于500道尔顿及小于1.3Md。可选择地，该多聚阳离子可以是一种分支的链状聚氮丙啶。

4．附图概述

图1是一种在本发明中有用的CMV的一个实施方案的图解。

图2A-2C显示人APO E基因的基因组序列及其外显子的翻译。内含子为小写字母，外显子为大写字母。

图3A-3G显示人APO A1基因(序列编号59)的序列。5．定义

本发明的理解将依据以下定义。

一种寡核苷碱基是一种核苷碱基的聚合物，该聚合物可以通过Watson-Crick碱基配对与具有互补序列的DNA杂交。

核苷碱基包含一个碱基，其是一种嘌呤、嘧啶、或它们的衍生物或类似物。核苷碱基包括肽核苷碱基、肽核酸的亚基、和吗啉核苷碱基以及核苷和核苷酸。核苷是含有戊糖呋喃糖基序的核苷碱基，如一种随意取代的核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。核苷可以通过多个连接基序中的一个连接起来，其可能含有或不含有一个磷。由未被替代的磷酸二脂键连接的核苷称为核苷酸。

一种寡核苷碱基链具有单一的5’和3’末端，它们是该多聚体的末端核苷碱基。一种特定的寡核苷碱基链可以含有所有类型的核苷碱基。一种寡核苷碱基化合物是一种含有一个或多个寡核苷碱基链(它们互补并通过Watson-Crick碱基配对杂交)的复合物。核苷碱基为脱氧核糖型或核糖型。核糖型核苷碱基是含有核苷碱基的戊糖呋喃糖，其中的2’碳是一种被氢氧根、卤代烷或卤素取代的次甲基。脱氧核糖型核苷碱基是除了核糖型核苷碱基之外的核苷碱基，其包括所有不含有戊糖呋喃糖基序的核碱基。

一种寡核碱基链通常包括寡核碱基链和寡核碱基链的片段或区域。一种寡核碱基链具有一个3’末端和一个5’末端。当一个寡核苷碱基链与一条链同延时，其链的3’和5’末端也是所得到链的3’和5’末端。

一个区域是一个寡核碱基的一个部分，其序列是来自一些特定的来源，如，一种CMV具有至少15个核苷的一个区域，该区域具有人β-球蛋白基因的一个片段的序列。一个片段是具有一些特征的结构特性的CMV的一个部分。一个给定的片段或一个给定的区域可以含有2’-脱氧核苷及核糖核苷酸。然而，一种核糖型片段或一种2’-脱氧核糖型片段仅分别含有核糖型和2’-脱氧核糖型核碱基。6．本发明的详细描述

6.1嵌合突变载体的结构

嵌合的突变载体(CMV)由寡核碱基组成，也就是，核碱基的多聚体，该多聚体在具有合适序列的DNA上形成了嘌呤和嘧啶的Watson-Crick碱基对(杂交)。每种CMV被分为至少有15个核碱基的一个一级和一个第二链，它们均彼此互补。这些链能够，但不是必须共价连接。核碱基含有一个碱基，其可以是一个嘌呤或一个嘧啶或它们的类似物或衍生物。存在两种类型的核碱基。核糖型核碱基是具有一个2’氢氧根、取代的2’-氢氧根或2’-盐-取代的核酸糖的核糖核苷。除了核糖型核碱基之外的所有核碱基是脱氧核糖型核碱基。因此，脱氧型核碱基包括肽核碱基。如此处所用到的，只有含有至少三个邻近的核糖型核碱基(它们与脱氧核糖型核碱基杂交)的重组诱发剂寡核碱基是理想的CMV。

第一和第二链的序列含有至少两个与靶基因同源的区域，即，具有与靶基因的片段相同的序列，以及一个或多个与靶基因不同以将遗传上的变化引入到靶基因中的区域(“突变区域”)。该突变区域位于同源区域的中间。在本发明的特定实施方案中，每个侧翼同源区域中含有一段至少三个核糖型核碱基的核糖型片段，其形成了一个杂合的双链，优选的是至少有六个核糖型核碱基以及更优选的是全长至少有10个脱氧型核碱基，但不超过25个，优选的是不超过20个，更优选的是不超过15个核糖型核碱基。该杂交-双链-形成的核糖型寡核碱基片段不需要与该突变区域毗邻。在本发明的特定实施方案中，该核糖型的寡核碱基片段通过一部分含有脱氧核糖型的核碱基的同源区域，从该突变区域中分离出来。在这些实施方案中，该突变区域也由脱氧核糖型的核碱基组成。因此，该突变区域和一种或两种同源区域的一个部分一起形成同源双链的插入片段，其将杂交双链的两个片段分隔开来。

所有同源区域的全长优选的是至少有16个核碱基，以及更优选的是其全长约从20个核碱基至60个核碱基。

优选地，突变的区域含有20个或更少的碱基，更优选的是6个或更少的碱基以及最优选的是3个或更少的碱基。该突变区域可以具有与分隔靶基因区域(其与CMV的同源区域同源)的序列长度不同的长度，以使产生在靶基因上的一个插入或缺失。当CMV被用于将一个缺失引入到靶基因中时，没有如突变区域中的可识别的碱基。相反地，该突变受两个在靶基因中被分隔开来的两个同源区域的并排的影响。为了本发明的目的，某一CMV(其将一个缺失引入到靶基因中)的突变区域的长度被认作是缺失的长度。在一个实施方案中，该突变区域是从6到1个碱基的缺失或者更优选的是3到1个碱基。多个独立的突变可以通过仅一个CMV引入，在这种情况下，在相同的CMV中存在多个突变区域。可选择地，多个CMV可以被同时用于将多个遗传上的变化引入到一个基因中，或者，可选择地将多个基因中的遗传上的变化引入到相同细胞中。此处的突变区域也称为异源区域。

在一个实施例中，该CMV是介于40至100个核碱基之间的单个寡核碱基。在一个可选择的实施方案中，该CMV含有一个第一和一个第二寡核碱基链，每条在20到100个碱基之间；其中的第一链(chain)包括第一链(strand)以及第二链(chain)包括第二链(strand)。这些第一和第二链可以通过其它核碱基共价连接，或者可选择地，可以仅通过Watson-Crick碱基配对相联。在一个可选的实施方案中，该CMV是一条为单一寡核碱基链的第一链和一条第二链，其与第一链互补，包括两条寡核碱基链，它们与第一链通过键连接。第二链的两条链的结合长度是第一链的长度。

连接子：第一和第二链的共价连接可以通过寡聚链烷二醇形成，如聚乙烯乙二醇、聚-1,3-丙二醇或聚-1,4-丁二醇。适合连接两条杂交的核酸链的不同连接子的长度是本技术的熟练人员所了解的。一个聚乙烯乙二醇连接子具有从6个到3个乙烯单元并且末端为磷基序是合适的，Durand,M.等，1990，核酸研究18,6353；Ma,M.Y-X.，等，1993，核酸研究21,2585-2589。一种优选的可选择的连接子是二-磷酸丙基-反式-4,4’--stilbenedicarboxamide,Letsinger,R.L.,et alia,1994,J.Am.Chem.Soc.116,811-812,Letsinger,R.L.et alia,1995,J.Am.Chem.Soc.117,7323-7328，它们作为参考结合于本说明书中。这些连接子可以通过常规的固相合成被插入到CMV中。可选择地，CMV的链可以分别合成然后进行杂交，链键连接的形成是使用了如专利出版物WO 97/05284(1997年2月13日，Letsinger R.L.et alia)中所描述的含有thiophoryl的stilbenedicarboxamide。

在另一个可选择的实施方案中，该连接子可以是单个的链状寡核碱基，其含有抗核酸酶的核碱基，如2’-氧-甲基、2’-烯丙基或2’-氟-核糖核苷酸。四核苷酸序列TTTT、UUUU和UUCG以及三核苷酸序列TTT、UUU、或UCG是尤其优选的核苷酸连接子。

核苷酸：在一个可选择的实施方案中，本发明可以使用含有脱氧核苷酸或脱氧核苷以及被2’-氧所取代的核糖核苷酸或核糖核苷的CMV进行实践。合适的取代包括Kmiec Application所教授的取代，C_1-6链烷。可选择的取代包括美国专利编号5,334,711(Sproat)中所教授的取代，以及专利出版物欧洲专利629 387和欧洲专利679657(共同地，为Martin的申请)中所教授的取代，它们作为参照结合于本说明书中。如此处所用到的，一个2’-氟、氯或溴衍生的一种核糖核苷酸或一种具有如the Martin Applications或Sproat中所描述的2’-氧取代的一种核糖核苷酸的术语为一种“2’-取代的核糖核苷酸”。一种2’-取代的核糖核苷酸的尤其优选的实施方案是2’-氟、2’-甲基氧、2’-丙氧基，2’-烯丙氧基，2’-羟乙氧基，2’-甲氧乙氧基，2’-氟丙氧基，和2’-三氟丙氧基取代的核苷酸。在更优选的实施方案中，2’-取代的核糖核苷酸是2’-氟，2’甲氧基，2’-甲基氧乙基氧、以及2’-烯丙基氧取代的核苷酸。

2’-取代的核糖核苷的定义类似。2’-取代的核糖核苷酸尤其优选的例子是2’-氟、2’-甲基氧、2’-丙基氧、2’-烯丙基氧、2’-羟基乙基氧、2’-甲基氧乙基氧、2’-氟丙基氧及2’-三氟丙基氧取代的核糖核苷酸。在一个更优选的实施例中，在2’-取代的核糖核苷酸上是2’-氟、2’-甲基氧、2’-甲基氧乙基氧、以及2’-烯丙基氧取代的核糖核酸。

术语“抗核酸酶的核糖核苷”包含2’-取代的核糖核苷，包括2’-取代的核糖核苷酸以及所有除了核糖核酸以外的2’-羟基核糖核苷。在一个优选的实施方案中，该CMV优选地含有至少三个以及更优选的含有六个抗核酸酶的核糖核苷。在一个优选的实施方案中，该CMV不含有对核酸酶敏感的核糖核苷。在一个可选的优选实施方案中，每隔一个核糖核苷是核酸酶抗性的。特定的2’-封闭基团可以更容易地在嘌呤或嘧啶上进行合成。在CMV的一个实施方案中，仅核糖核苷嘌呤或仅核糖核苷嘧啶是核酸酶抗性的。

重组诱发剂寡核碱基包括非嵌合的突变寡核碱基和改进的CMV以及它们在真核细胞和无细胞系统中的使用如美国专利申请系列编号09/078,063(1998年5月12日申请)和系列编号09/078,064(1998年5月12日申请)中所描述，它们在整体上均作为参照结合于本说明书中。这些突变的寡核碱基可以和本申请中所描述的CMV一样的方式进行使用。

6.2嵌合突变载体的基因特异性结构

图1表示依据本发明的一个实施方案的CMV的图表。在该图中，片段“a”和“c-e”是CMV的靶基因特异性片段。片段“a”和“c-e”的序列彼此互补。片段“f”和“h”也彼此互补，但与特定的靶基因无关，其选择仅是为了确保杂交的稳定来保护3’和5’末端。3’和5’末端的附加保护可以通过使5’和3’末端绝大多数结合有一个硫代磷酸酯、磷酸酯或任何其他抗核酸酶的结合。片段“f”和“h”的序列可以是5’-GCGCG-3’或其置换。片段“g”和“b”可以是任何连接子，其共价连接两条链，如，四个不配对的核苷酸或一个烷氧基低聚体，如聚乙二醇。当片段“g”和“b”由其他核碱基组成时，则片段“a”,“c-f”和“h”各自为一条寡核碱基链。

核糖型核碱基片段是片段“c”和“e”，它们通过与片段“a”的互补部分的Watson-Crick碱基配对形成杂交双链。片段“a”可以具该基因的编码或非编码链的序列。

表Ⅰ包括序列编号4-编号21，表Ⅲ包括序列编号22-25和54-58，它们是可以在本发明的实践中使用的序列的例子。在每种情况下的突变区域下划线并以黑体表示。具有其序列选自表Ⅰ中的序列的片段“a”的CMV可以被用于本发明的实践中。可选择地，片段“a”可以具有与表Ⅰ中的序列互补的序列。如此处所用到的，一种CMV或其它类型的重组诱发剂寡核碱基包含一个序列，如果CMV或重组诱发剂寡核碱基的任一条链含有给序列或含有包括核糖型核碱基(其尿嘧啶碱基取代了胸腺嘧啶碱基)的一种序列。因此，例如，一种具有序列5’-agucuggaugGGTAAgccgcccuca-3’(序列编号26)的CMV被认为具有序列编号4的序列，其中的小写字模表示核糖型核碱基，大写字母表示脱氧核糖型核碱基。

患者可以依据以下Factor Ⅸ实施例的指导，用对Apo B或Apo E特异性的重组诱发剂寡核碱基进行治疗。更特定的，该重组诱发剂寡核碱基可以以分开的剂量给予，其间隔允许鉴定该剂量的表型效果，即，对LDL胆固醇降低程度的估计和对负反应的观察。患者禁食血清中的胆固醇降低到低于对照人群(80-90mg/dl)的第五位百分位数的水平可以被用作治疗的终点；可选择地，也可以使用禁食LDL血清胆固醇降低到平均年龄对照的正常值(100-140)以下。剂量的数目和大小可以被修饰以控制表型效果的程度。在与特异性遗传上的变化表现为理想相反的事件中，可以施用一种具有适当倒转特异性变化的序列的重组诱发剂寡核碱基，以至未被修饰的Apo B或Apo E基因的片段可以被降低。对剂量大小和数目的修饰和施用相反的重组诱发剂寡核碱基使被改变的基因的数目可以在患者体内进行调整，以至可以引起预定数目的表型变化。

6.2.1 Apo B基因的特异性变化

序列编号1含有Apo B的氨基酸序列以及序列编号2含有Apo BcDNA的序列。

在某一患者体内的血清胆固醇尤其是与LDL相联的胆固醇水平可以通过在该患者的肝脏Apo B基因中引入突变来进行降低。该突变可以是任何引起Apo B在氨基酸1433(Apo B 31)和氨基酸3974(Apo B 87)之间的翻译产物终止的突变。(在本说明书中，Apo B的氨基酸编号指4553个氨基酸的主要翻译产物，即，成熟的Apo B 100加上27个氨基酸前导序列。成熟的Apo B 100包括4536个氨酸，成熟的Apo B 48包括2152个氨基酸。)优选的翻译产物在氨基酸1841(Apo B 40)和2975(Apo 65)之间被终止。该翻译产物可以通过引入一个移码突变被终止，即，通过从该基因中加入或缺失一个或两个核苷酸，或者通过引入一个终止密码子(一个TAA、TAG或TGA)。优选的终止密码子是TAA。为了检测突变的引入，优选的是具有突变引入或去除的回文序列，其是限制性酶的底物。

选择CMV的序列，使其具有两个至少10个核碱基的同源区域，优选的是每个区域至少具有12个核碱基，Apo B基因的一个片段介于编码氨基酸1433(nt 4425)和3974(nt 12048)的核苷酸之间，优选的是位于编码氨基酸1841(nt 5649)和2975(nt 9051)的核苷酸之间。在本说明书中，nt 6666是密码子2180的第一个核苷酸，该核苷酸被APOBE改变。在一个优选的实施例中，在Apo B基因的序列中这两个同源的区域被单个核碱基隔开，其中CMV将一个碱基替代引入到ApoB基因中。可选择地，这两个同源区域在Apo B基因中可以毗邻以及在CMV中被一个或两个核碱基隔开，以至一个或两个碱基的插入是由于CMV在Apo B基因中的行为。可选择地，这些同源区域Apo B基因中可以被从CMV的序列中缺失的一个或两个核苷酸隔开，以至CMV的行为导致了在基因中一个或两个碱基的缺失。

Apo B cDNA的核苷酸4425-12，048由外显子26(nt 4342-11913)，外显子27(nt 11914-12028)和外显子28(nt 12029-12212)编码；见表Ⅰ，和GENBANK Accession No。19828，其作为参照结合于本说明书中。当一个改变是在nt 11913的3’位置上制造时，必须注意的是外显子/内含子的分界线。位于外显子/内含子分界线的10-15个核苷酸之内的突变必须被鉴定，以至CMV的同源区域继续内含子的序列而不是外显子的序列。

这些同源区域每个的长度可以在10到15个核碱基之间；这两个区域不需要有相同的长度。含有一个鸟嘌呤或胞嘧啶碱基的核碱基的部分是设计所考虑的(GC片段)。优选的是当该同源区域含有12个或更少的核碱基时，该GC片段至少为33％及优选的为50％。当GC片段小于33％时，该同源区域的长度优选的是13、14或15个核碱基。

表Ⅰ含有18个举例性的实施方案，序列编号4-21，以及表Ⅲ含有9个举例性的实施方案，序列编号22-25及54-58，均为适于用作本节中所描述的本发明的实施例的实践的CMV的序列。合适的CMV可以使用序列编号4-10、12和16-20的nt 3-23来制造。序列编号11和13-15具有较少的GC片段；适于本发明的实践的CMV可以被构建含有序列编号11和13-15的残基3-25。

6.2.2 Apo E基因的特异性改变

在另一个实施方案中，本发明包括将特异性改变引入到Apo E基因中。E4纯合体的个体患有动脉硬化症的危险性提高，尤其是冠状动脉疾病、和Alzheimer病。因此，本发明的一个实施方案是在残基112上引入替代Arg□Cys，以将E4等位基因转变成E3等位基因，以及任意地，在残基158上将E3或E4等位基因转变成某一患者肝细胞的Apo E基因上的E2等位基因。这些替代可以通过使用一种含有序列编号22和编号23的nt 3-23序列或其互补序列的寡核碱基(更优选的是含有序列编号22和编号23或其互补序列的寡核碱基)被引入。另外，在没有遗传或环境压力的个体中，该E3等位基因导致LDL水平降低以及动脉硬化症和冠状动脉疾病的危险性降低。因此，在E3/E3个体中的这些危险性可以通过引入(Arg→Cys)¹⁵⁸取代以将个体的Apo E基因转换成E2等位基因来降低。

遭受Ⅲ型高脂血症的Apo E2/E2纯合体的个体可以通过将E2等位基因转换成E3等位基因进行治疗，通过制造一个Arg→Cys¹⁵⁸替代来达到。这种替代可以通过使用一种含有序列编号24的nt 3-23序列或其互补序列的寡核碱基来制造，更优选的是一种含有序列编号24或其互补序列的寡核碱基。

不依赖于Apo E等位基因，在-491-A上为纯合体的个体发展成Alzheime病的危险性提高，Bullido,M.J.,1998，等，自然遗传学18,69-71。这些个体可以方便地用含有序列编号25中的nt 3-23序列的寡核碱基进行治疗。

6.2.3Apo B和Apo E基因突变的修复

序列编号3包括Apo E基因组的DNA序列。

本发明的另一个实施方案涉及到使用CMV来修复Apo B和Apo E基因中分别引起β低脂蛋白血症和dysbetaliproteinemia的突变。位于外显子/内含子接壤的10-15个核苷酸以内的突变必须被鉴定，以至该CMV的同源区域延长内含子的序列而不延长外显子。显示外显子和内含子接壤的Apo E4的基因序列由Paik等给出，1985，美国国家科学院院报82,3445，其作为参照结合于本说明书中。Apo B基因的外显子/内含子的接壤在表Ⅱ中给出，与基因文库Apo B基因组序列的GENBANK登记号一起。

6.2.4Apo A1基因的特异性改变

Apo A1是一种243个氨基酸的蛋白。氨基酸99-230由六个66个碱基对的原型序列的串联重复编码。该重复与共有序列的同源性在80％到64％之间。不考虑关于理论的限制，氨基酸120到230的构象被认为是螺旋状的。这些氨基酸的序列使该螺旋为两性分子，即，该螺旋具有一个疏水表面和一个亲水表面，其含有极性氨基酸。

最适合本发明的实践的突变是用半胱氨酸替代极性氨基酸。特别合适的突变是在紧靠极性氨基酸的精氨酸残基上，因为在apo A1中使用的精氨酸密码子(CGC)可以通过单个碱基的改变被转换成TGC半胱氨酸密码子。因此，依据本发明，特别合适的突变位点是精氨酸149、151、153、171和173。

6.3适合体内使用的配制品

关于CMV和一种大分子载体的现有技术的配制品在体内使用上具有局限性，因为其CMV的低产量以及因为该CMV无法抵御胞外酶。本发明提供了三种可选择的克服了较早技术的局限性的大分子载体。这些载体是聚氮丙啶(PEI)、水核心脂囊泡(其也称为单层脂质体)和脂质微球体。

每种载体可以进一步提供一种配基，其与靶细胞的一种细胞表面蛋白互补。这些配基对于提高CMV被靶细胞吸收的量及特异性均有用。在本发明的一个实施方案中，该靶细胞是一种肝细胞，其配基是一种半乳糖的单糖类或乳糖的二糖类，其与脱唾液酸糖蛋白受体结合。

6.3.1多聚阳离子载体

当在体外施用于细胞或在体内施用于患者时，本发明可以使用任何非毒性的多聚阳离子。合适的例子包括多碱的氨基酸(如聚赖氨酸、聚精氨酸)、碱性蛋白质(如组蛋白Hi)、和合成的多聚体，如分支的线性聚氮丙啶：

(-NHCH₂CH₂-)x[-N(CH₂CH₂NH₂)CH₂CH₂-]_y。

本发明可以用任何具有平均分子量大于500道尔顿、优选的是约10Kd以内、更优选的是约25Kd的分支链状多聚氮丙啶(PEI)，(大规模的分子量的确定是通过光散射)。适合度的较高界限是通过PEI的毒性和溶解度来确定。分子量大于1.3Md的毒性和溶解度使这种PEI原料较不合适。高分子量PEI作为一种载体来用DNA转染某一细胞的用途如Boussif,0。等所描述，1995，美国国家科学院院报92,7297，其作为参照结合于本说明书中。PEI溶液可以依据Boussif等的程序进行制备。

CMV载体复合物的形成是通过混合CMV的一种水溶液和PEI的一种中性水溶液，其比例是每个CMV磷酸盐对应9个到4个氮。在一个优选的实施例中，该比例是6。该复合物的形成可以，如，通过混合PEI的一种10mM溶液(在0.15M NaCl中，pH7)和CMV以形成的最终CMV浓度为100到500nM之间。

另外，某一网格蛋白包被的凹陷受体的配基可以被附加到多聚阳离子或多聚阳离子的一个片段上。在一个实施例中，该配基是一种与脱唾液酸糖蛋白受体结合的单糖或二糖，如乳糖、半乳糖、或N-乙酰基半乳糖胺。任何技术可以被用于附加这些配基。配基与聚乙烯亚单位的最适比可以通过荧光标记CMV并且将带荧光的CMV/分子载体/配基的复合物直接注射到感兴趣的组织中，并确定荧光吸收的程度，其是依据Kren等的方法，1997，肝脏病学25,1462-1468。

使用乳糖化的PEI(具有的比例为每个氮对应0.4-0.8个乳糖苷基团)和未修饰的PEI的比例为1∶1的混合物可以获得优良的结果。该混合物的使用是以比例为每个CMV磷酸盐对应4到9个PEI氮。寡核苷酸磷酸盐与氮的一个优选的比例为1∶6。使用具有质量平均分子量为25Kd和800Kd的PEI可获得良好的结果，它们在商业上是可供的，由Aldrich Chemical Co.提供，分别在目录编号40,872-7和18,197-8中。线性PEI(如Ferrarri,S.等所描述，1997，基因治疗4,1100-1106，及其销售商标为EXGEN 500TM)尤其适合本发明的实践，因为其与分支链状的PEI相比毒性较低。

在一个可选择的实施例中，该多聚阳离子载体可以是一种碱性蛋白如组蛋白Hi，其可以用一种网格蛋白包被的凹陷受体替代。一种组蛋白和CMV的比例为1∶1(w/w)的混合物可以被用于本发明的实践中。

6.3.2在载体中有用的脂质

本发明中结合到脂囊泡和脂质微球体载体中的脂质的选择并不苛刻。脂质微球体的构建可以使用净化过的脂质生物制剂(如大豆油(Sigma Chem.Co.))和磷脂酰胆碱(EPC(Avanti Polar Lipids))。其它在制备脂质微球体和/或脂囊泡中有用的脂质包括中性脂质，如二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、和二油酰基磷脂酰胆胺(DOPE)，阴离子脂质，如二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)和阳离子脂质，如二油酰三甲基氨基丙烷(DOTAP)、dioctadecyidiamidbglycyl精胺(DOGS)和二油酰三甲基氨(DOTMA)和DOSPER(1,3-二-油酰基氧-2-(6-羧基-spermyl)-丙基-氯化四乙酸盐，由Boehringer-Mannheim在商业上提供)。另外可以用于本发明的脂质的离子可以在Gao,X.和Huany,L.,1995，基因治疗2,710中找到。糖配基可以以糖脑苷脂的形式加入，如乳糖脑苷脂或半乳糖脑苷脂(Avanti Polar Lipids)。

脂质的特定选择并不苛刻。氢化的EPC或溶血卵磷脂可以取代EPC被使用。DPPC(dipalmitoyl磷脂酰胆碱)，可以结合使用以提高传递系统的效率和/或稳定性。

6.3.3脂质微球体载体的构建

脂质微球体可以通过以下过程构建。将磷脂的一种甲醇或氯仿甲醇溶液加入到一个小试管中，溶剂通过氮蒸气除去以留下一层脂质薄膜。CMV的一种亲脂型盐的形成是通过混合CMV的一种水盐溶液和一种阳离子脂质的乙醇溶液。当阳离子类与CMV阴离子(磷酸盐)相比，大约超过其4倍物质的量时，可以获得好的结果。将亲脂的盐溶液加入到该脂质薄膜上，轻轻搅拌，接着加入与磷脂质量相等的一定量的中性脂质。CMV的浓度可以高于总脂质量的大约3％(w/w)。

在加入中性脂质之后，将乳剂在4℃超声降解约1小时，直到形成了一种没有明显分离现象的乳状悬浮液。将该悬浮液挤压通过多聚碳酸盐的过滤器，直到获得的最终直径为约50nm。当靶细胞是一种网状内皮细胞时，脂质微球体的优选直径为约100-200nm。然后可以漂洗带有CMV的脂质微球体并将其放入一种治疗上可接受的载体或组织培养基中。脂质微球体的容量大约为2.5mg CMV/500μl微球体悬浮液。

6.3.4脂囊泡的构建

一种脂质薄膜的形成是通过将一种脂质的氯仿甲醇溶液放置在一个试管中，接着通过氮蒸气除去溶剂。加入CMV的一种水的盐溶液，以至CMV的量为脂质量的20％和50％(w/w)之间，在终溶液中，水溶剂的量大约为脂质量的80％(w/w)。在轻轻搅拌之后，将含有脂质体的液体加压通过连续有效的聚碳酸盐过滤器薄膜直到获得的最终直径为约50nm。通过连续有效的聚碳酸盐过滤器导致聚阿迈灵脂质体转变为单一的阿迈灵脂质体，即囊泡。当该靶细胞是一种网状内皮细胞时，该脂质微球体的优选直径为约100-200nm。然后可以漂洗带有CMV的脂质微球体并将其放入一种治疗上可接受的载体或组织培养基中。

将该CMV埋入该囊泡的水核心内。加入的CMV中大约有50％被埋入。

一种碱基改变的过程包括形成一种含有PEI/CMV浓缩物的水溶液(比例为大约每个CMV磷酸盐对应4个PEI亚胺)。当该脂质体带正电荷时，该浓缩物尤其有用，即，该脂囊泡含有来自阳离子脂质(如DOTAP、DOTMA或DOSPER)的阳离子的浓度大于来自阴离子脂质(如DOPS)的阴离子的浓度。脂囊泡的容量大约为150μg CMV每500μl的脂囊泡悬浮液。

在一个优选的实施方案中，该脂囊泡包括阴离子磷脂(DOPS)和一种中性磷脂(如DOPE或DOPC)的混合物。其它可以用于制备脂囊泡的带正电荷的磷脂包括二油酰磷脂酸(DOPA)和二油酰磷脂酰甘油(DOPG)。在一个更为优选的实施方案中，该中性脂质是DOPC，并且DOPS与DOPC的比例在2∶1到1∶2之间，优选的是约1∶1。带负电荷与中性脂质的比例应大于1∶9，因为带电脂质的存在小于10％会由于囊泡的的融合导致脂囊泡不稳定。

一种特定的脂囊泡配制品可以通过使用该配制品来转染某一靶细胞群来进行测试，质粒的全长约5.0kb，其在被转染的靶细胞中表达一定量的易检测的产物。如果质粒和PEI一起以亚胺∶磷酸盐的比例为9-4∶1进行浓缩，则脂囊泡可以和该质粒一起被用于转染某一细胞。脂囊泡配制品方和质粒一起转染细胞的能力是该配制品将CMV引入到细胞内并引起变化的能力的显示。

特定的脂质，尤其是多聚阳离子脂质，可能对特定的细胞系或原代细胞培养具有毒性。该脂囊泡的配制品应该被调整以避免这种毒性的脂质。

网格蛋白包被的凹陷受体的配基可以通过多种方法被引入到脂囊泡中。脑苷脂，如乳糖脑苷脂或半乳糖脑苷脂可以被引入到脂质混合物中并结合到囊泡内以产生一种脱唾液酸糖蛋白受体的配基。

在一个可选择的实施例中，该脂囊泡进一步包括一个完整的膜蛋白，其本身插入到囊泡的脂质双分子层中。在一个特定的实施例中，该蛋白是一种来自病毒(可选地称为仙台病毒Sendai Virus和日本使红血球凝集病毒Hemagglutinating Virus of Japan(HVJ))的融合剂(F-蛋白)。已经报导了含有F-蛋白的脂囊泡的制备和使用以将DNA引入到肝脏、心肌和内皮细胞。见，如美国专利编号5,683,866、国际申请PCR JP97/00612(以WO 97/31656发表)。另见，Ramani,K.等.，1996,FEBS Letters 404,164-168；Kaneda,Y.等，1989，生命的化学杂志，264,121126-12129；Kaneda,Y.等，1989，科学，243,375；Dzau,V.J.等，美国国家科学院院报93,11421-11425；Aoki,M.等，1997，生命的化学杂志29,949-959。

6.4制剂在体内的应用

本发明中的CMV可以以50到250μg/μm的剂量直接肠道外施用到靶器官中。当靶器官是肝脏肌肉或肾脏时，该CMV/大分子载体复合物可以直接注射到器官中。当靶器官是肝脏时，可以使用静脉内注射到肝脏的肝或门静脉内(具暂时的循环梗阻)。可选择地，该CMV/大分子复合物可以进一步包括一种对准肝脏的配基，如一种乳糖或半乳糖的糖类，其使得CMV/大分子复合物可以肠道外施用而进入到大循环中。

当靶器官是肺或其组织时，如细支气管上皮细胞，CMV/大分子复合物可以通过气溶剂施用。小颗粒的气溶剂传递脂质体/DNA复合物的描述见Schwarz L.A.等，1996，人类基因治疗7,731-741。

当靶器官是血管内皮时，如在体质性血小板异常症中，该CMV/大分子复合物可以直接呈递到体循环中。其它器官的瞄准可以通过使用与配基一起的脂质体，配基使得脂质体可以通过循环系统的内皮细胞从脉管中溢出。

考虑到酶解的缺点，可以通过修正受影响组织大约1％细胞的基因以获得治疗的效果。在一种实质细胞在其内部具有延长的生命的组织(如肝脏)中，用CMV的治疗可以重复进行以获得提高的治疗效果。

7．实施例

7.1CMV/大分子载体复合物

7.1.1脂质微球体

材料

卵磷脂(EPC)、DOTAP和半乳糖脑苷脂(Gc)(Avanti PolarLipids)；大豆油(Sigma Chemical Co.)；dioctadecyidiamidoglycyl精胺(Promega)。

方法

EPC,DOTAP和Gc预先以设定的浓度溶解在氯仿或无水乙醇中，并以干粉状于-20℃下储存在小的玻璃容器中直至使用。将EPC(40-45mg),DOTAP(200μg)and Gc(43μg)溶液分装在小的10×75mm硼硅酸管中并在氮蒸气下除去溶剂。CMV溶于0.15MNaCl(~80-125μg/250-300μl)；DOGS(在乙醇中的浓度为10mg/ml)以加入CMV的3-5倍的质量溶解在0.15M NaCl中，达到终浓度为250-300μl。将两种溶液轻柔搅拌以混合内容物，然后将CMV溶液缓慢加入到DOGS溶液中。通过轻轻敲打及颠倒试管几次混合内容物。将含有DOGS组合物的溶液加入到干的脂质中，接着加入大豆油(40-45mg)，将混合物快速震荡几秒钟并在一种FS-15(Fisher Scientific)水浴超声波仪中，在4℃温度控制的室内水浴超声持续1小时。有时，将试管从水浴中移开并震荡。从统一来看，形成了乳状悬浊液(没有明显的油状小滴的分离)，其从一系列聚碳酸盐膜挤压通过达到孔径大小为50nm。制备物在4℃下保存直至使用并在使用前震荡。

7.1.2带负电荷的靶脂囊泡

原料

二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、半乳糖脑苷脂(Gc)或乳糖脑苷脂(Avanti Polar Lipids)。

方法

DOPS、DOPC和Gc以摩尔比为1∶1∶0.16(共500μg脂质)溶解在氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然后在氮蒸气中干燥以获得一种单一的脂质膜。将CMV以500μl溶解在0.15M NaCl中(约为100-250μg/500μl)。将溶液在室温下加入到脂质薄膜上。脂质通过轻柔震荡和加热的轮流(在37-40℃的水浴中)进行完全的分散。在形成了均一的乳状悬浊液之后，通过使用一种Liposofast^_小型挤压机将其挤压通过一系列多聚碳酸盐薄膜(孔径大小为0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)。挤压是以5到7倍通过每个孔径的尺寸。制备之后，将脂囊泡储存在4℃下直至使用。在这些条件下，该脂囊泡可以稳定至少一个月。最终的产物可以被冻干。

7.1.3中性的靶脂囊泡

原料

二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、半乳糖脑苷脂Gc)或乳糖脑苷脂(Avanti Polar Lipids)。

方法

DOPS、DOPC和Gc以摩尔比为1∶1∶0.16(共500μg脂质)或DOPC∶Gc(1∶0.08)溶解在氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然后在氮蒸气中干燥以获得一种单一的脂质膜。将寡核苷酸(或嵌合分子)以500μl溶解在0.15 M NaCl中(约为100-250μg/500μl)。将溶液在室温下加入到脂质薄膜上。在形成了均一的乳状悬浊液之后，通过使用一种Liposofast^_小型挤压机将其挤压通过一系列多聚碳酸盐薄膜(孔径大小为0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)。挤压是以5到7倍通过每个孔径的尺寸。制备之后，将脂囊泡储存在4℃下直至使用。所制备的脂囊泡大小可以在稳定约5天。

7.1.4带正电荷的靶脂囊泡

原料

二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰三甲氨丙烷(DOTAP)、半乳糖脑苷脂(Gc)或乳糖脑苷脂(Avanti Polar Lipids)。聚氮丙啶(PEI)(M.W.800Kd),Fluka Chemicals。

方法

DOPC、DOTAP和Gc(6∶1∶0.56)(共500μg脂质)溶解在氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然后在氮蒸气中干燥以获得一种单一的脂质膜。将PEI用水以45mg/100ml的浓度溶解。溶液的pH用HCl调节到约7.6。该PEI贮存液每次新鲜制备并稀释到约50nmol氨/微升。CMV在0.15MNaCl中溶解以达到浓度为250μl中有约125μg CMV。将CMV进一步稀释到250μl 0.15 M NaCl中以至每克分子寡核苷酸/嵌合磷酸盐对应4克分子的PEI胺。将PEI溶液逐滴加入到CMV溶液中(均在室温下进行)并震荡5-10分钟。然后将PEI组合物溶液加入到直至薄膜上并将该直至如以上所描述的进行分散。在形成了一个均一的乳状悬浊液之后，通过使用一种Liposofast^_小型挤压机将其挤压通过一系列多聚碳酸盐薄膜(孔径大小为0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)。挤压是以5到7倍通过每个孔径的尺寸。制备之后，将脂囊泡储存在4℃下直至使用。在这些条件下，该脂囊泡稳定至少一个月。为了稳定性的长久和提高，可以将终产物冻干。

7.1.5乳糖苷化的-PEI/PEI复合物

PEI(25kDa)从Aldrich Chemical(Milwaukee,WI)购买。PEI(800kDa)从Fluka chemicals(Ronkonkoma,NY,USA)购买。PEI的乳糖苷化是通过修饰以前所描述的将低聚糖与蛋白结合的方法。简要地，3到5毫升PEI(0.1至1.2M单体)在醋酸铵(0.2M)或Tris缓冲液(0.2M)(pH7.6)中的溶液和7到8毫克兰色硼氢化钠(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)及大约30毫克的乳糖一水化物(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)一起孵育。反应在聚丙烯试管中进行，试管盖紧，在37℃下摇动水浴。10天之后，将反应混合物对蒸馏水(500ml)透析48小时，换水1至2次。纯化后的复合物通过0.2微米的过滤器进行过滤灭菌，于4℃储存。与PEI结合的糖(如半乳糖)的量的确定是通过苯酚-石炭酸法。

游离胺(初级+二级)在乳糖苷化的PEI中的克分子数的确定如下：使用PEI的一种0.02M贮存液建立标准曲线；将几个贮存的分装部分用去离子水在玻璃试管中稀释到1ml，然后向每管中加入50微升的茚三酮试剂(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo)并剧烈震荡10秒。颜色的产生在室温下需要10到12分钟。然后在一台Beckman DU-64分光光度计上读取(4分钟以内)在485nm下的O.D.值。将20至50微升L-PEI样品的分装部分如以上所述进行处理，并从标准曲线中确定游离胺的克分子数目。乳糖苷化的-PE(L-PEI)复合物的制备如下：每毫摩尔RNA/DNA磷酸盐中，等价于3毫摩尔胺的L-PEI和等价于3毫摩尔胺的PEI，一起混合依所需在0.15M NaCl中进行稀释；将混合物逐滴加入到嵌合物的溶液中并震荡达5分钟。

为了确证嵌合的寡核苷酸和PEI或L-PEI的完全结合，对没有组合和组合过的嵌合体进行凝胶分析(4％LMP琼脂糖)。为了确定由嵌合体的组合所提供的对核酸酶降解的防护程度，将样品用RNA酶和DNA酶处理。在氯仿苯酚抽提之后，使用肝磷脂使该组合物分解(50单元/微克核酸)，并将产物在4％LMP琼脂糖凝胶上进行分析。

7.2PEI/CMV调节大鼠和人因子Ⅸ变化的证明

胎牛血清从Atlanta Biologicais,Inc.(Atlanta,GA)获得。末端转移酶、荧光素-12-dUTP、Expand^TM高度保真PCR系统、dNTP和高纯度PCR模板制备试剂盒从Boehringer Mannheim Corp.(Indianapolis,IN)获得。Reflection^TMNEF-496放射自显影胶片和Reflection^TMNEF-491增感屏从DuPont NEN^_Research Products(Boston,MA)获得。聚氮丙啶(PEI)800 kDa从Fluka Chemical Corp.(Ronkonkoma,NY)获得。[γ-³²p]ATP从ICN Biochemicals,Inc.(Costa Mesa,CA)获得。pCR^TM2.1从Invitrogen(San Diego,CA)获得。OPTIMEM^TM,Dulbecco’氏改良的Eagle氏培养基，William’s Emedium和寡核苷酸365-A及365-C从Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD)获得。30,000mol wt截流的旋转过滤器从Millipore Corp.(Bedford,MA)购买。Dil和SlowFade^TMantifademounting medium从Molecular Probes,Inc.(Eugene,OR)获得。T4多聚核苷酸激酶从New England Biolabs,Inc.(Beverly,MA)购买。MSI MagnaGraph薄膜从Micron Separations,Inc.(Westboro,MA)购买。用于PCR扩增的引物从Oligos Etc.,Inc.(Wilsonville,OR)获得。四甲胺氯化物从Sigma Chemical Company(St.Louis,MO)购买。所有其它化学制品为分子生物学或试剂级，从AldrichChemical Company(Milwaukee,WI)、Curtin Matheson Scientific,Inc.(Eden Prairie,MN)、和Fisher Scientific(Itasca,IL)购买。

寡核苷酸合成。嵌合的RNA/DNA寡核苷酸HIXF、RIXF和RIXR是合成的。CMV由DNA和2’-O-甲基RNA氨基磷酸核苷酸单体一起在一种ABI394合成仪中制备。该DNA氨基磷酸核苷酸外环的氨基可以由苯甲酰基(腺苷和胞啶)及异丁酰基(鸟苷)防护。在2’-O-甲基RNA氨基磷酸中的防护基团对于腺苷为苯氧乙酰基，对于胞啶为异丁酰基，以及对于鸟苷为二甲基甲酰胺。在合成之后通过在55℃下、在乙醇/浓缩的氢氧化铵中加入20小时除去碱性防护的基团。未加工的寡核苷酸在含有7M尿素的15％聚丙酰胺凝胶中电泳，并使用紫外影象显示DNA。将嵌合分子从凝胶薄片中洗提下来，通过沉淀进行浓缩并使用G-25螺旋柱脱盐。纯化后的寡核苷酸中大于95％为全长。

野生型和“突变型”大鼠因子Ⅸ的序列为(序列编号27) 365wt AAA GAT TCA TGT GAA GGA GAT AGT GGG GGA CCC CAT GTT

Lys Asp Ser Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val

(序列编号28)

(序列编号29)mt AAA GAT TCA TGT GAA GGA GAT CGT GGG GGA CCC CAT GTT

Arg

RIXR,RIXF和HIXR CMV的结构如下：

嵌合寡核苷酸

RIXR (序列编号30)

TGCGCG-ccccagggggTGCTAgaggaaguguTT TT T

TCGCGC GGGGTCCCCCACGATCTCCTTCACAT

3′5′

RIXRC (序列编号31)TGCGCG-acacuuccucTAGCAcccccuggggTT TT TTCGCGC TGTGAAGGAGATCGTGGGGGACCCCT

3′5′

RIXF (序列编号32)TGCGCG-acacuuccucTAGCAcccccuggggTT TT TTCGCGC TGTGAAGGAGATCGTGGGGGACCCCT

3′5′

HIXF (序列编号33)TGCGCG-acaguuccucTAGCAcccccuggggTT TT TTCGCGC TGTCAAGGAGATCGTGGGGGACCCCT

大写字母为脱氧核糖核苷酸，小写字母为2’OMe-核糖核苷酸。异源区域的核苷酸下划线。

细胞培养、转染及肝细胞分离。HuH-7细胞在含有10％(体积/体积)热失活的胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagie’s培养基中保存，在潮湿的CO中，温度为37℃。在转染的24小时以前在每35毫米的培养皿中涂层1×10⁵个细胞。在转染的时候，将细胞用OPTIMEMTM培养基清洗两次，转染在1毫升同样的培养基中进行。转染后18小时，在每个35毫米的培养皿中加入含有20％(体积/体积)热灭活的胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagie’s培养基，并在收集DNA分离物之前将细胞再保持30小时。制备一种PEI(800kDa)10mM贮存液，pH7.0。简要地，将10mM PEI转染嵌合寡核苷酸，转染以每个嵌合磷酸盐对应PEI氮的9个等价物，在100微升0.15M NaCl中，其终浓度为150nM(4微克)、300nM(8微克)、450nM(12微克)。18小时之后，加入另外的2ml培养基以降低嵌合体浓度到分别为50nM、100nM、和150nM，以保持培养30小时。HuH-7囊泡控制的转染使用了与HulXF转染中使用的相同量的PEI，但为了寡核苷酸而替代成一种等体积的10mMTris-HCl。

原代大鼠肝细胞是从250克雄性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague-Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)中分离，通过以前所描述的(Fan等，Oncogene 12:1909-1919,1996，其作为参照结合于本说明书中)两步胶原酶灌注，并以密度为每个35mm培养皿中有4×105个细胞。培养物在William’s E培养基中保持，该培养基补充有10％热灭活的FBS、26mM碳酸氢钠、23mM HEPES、0.01U/ml胰岛素、2mML-谷酰胺、10nM地塞米松、5.5mM葡萄糖、100U/ml盘尼西林和100U/ml链霉素。涂层24小时之后，用相同的培养基漂洗肝细胞两次并加入新鲜的培养基1毫升，使用PEI/嵌合寡核苷酸组合物以与用于HuH-7细胞相同的浓度转染细胞。18小时之后，加入2毫升另外的培养基并在6或30小时之后收集细胞。

直接注射嵌合寡核苷酸到肝脏中。将雄性Sprague-Dawley大鼠(约175克)维持在标准的12小时光照-黑暗周期中并喂食ad libitum标准的实验室食品。将大鼠麻醉，中线切开使肝脏暴露。当肝脏静脉和门静脉进入尾状叶时，在该处夹上夹子，将75微克的嵌合体/PEI组合物以终体积为250-300微升直接注入尾状叶。将该叶结扎15分钟，然后通过移去夹子收集血流。缝合切口之后，允许动物从麻醉中苏醒并供给食物和水随意取用。将等体积的Tris-HCI pH7.6替代嵌合的寡核苷酸以进行赋形剂对照。注射的24和48小时之后，将动物杀死，除去尾状叶并切开注射位点周围的组织以进行DNA分离。分离DNA并通过PCR扩增大鼠因子Ⅸ基因的末端外显子。

嵌合分子的核吸收。使用末端转移酶和荧光素-12-dUTP，依据厂商的介绍，对嵌合双链3’末端进行标记，然后将其与未标记的寡核苷酸以2∶3的比例混合。依据以上所描述的进行转染，24小时以后，将细胞在室温下、在磷酸缓冲盐(含有4％聚甲醛(质量/体积))中固定10分钟。固定之后，依据厂商的介绍，使用Dil的5微摩溶液将细胞在0.32M蔗糖中复染色。在用0.32M蔗糖洗涤之后再用磷酸缓冲盐(pH7.4)洗涤，在磷酸缓冲盐中用SlowFade^TM抗褪色记数培养基将细胞涂在盖玻片上并使用一种MRC1000共焦显微镜(BioRad,Inc.,Hercules,CA)进行检查。如以上所描述的，用荧光素标记的嵌合物原位注射肝尾状叶并在注射的24小时之后收集肝尾状叶。将该叶纵向切开，用OCT埋入并冷冻。低温截面被切割成约10微米厚，使用磷酸缓冲盐pH7.4(含有4％聚甲醛(质量/体积))在室温下固定10分钟。固定之后，依据厂商的介绍，使用Dil的5微摩溶液将细胞在0.32M蔗糖中复染色。在用0.32M蔗糖洗涤之后再用磷酸缓冲盐(pH7.4)洗涤，在磷酸缓冲盐中用SlowFade^TM抗褪色记数培养基将细胞涂在盖玻片上*并使用一种MRC1000共焦显微镜(BioRad,Inc.,Hercules,CA)进行检查。固定细胞和切片组织的梯度收集是以1微米为间隔，以确定嵌合体在核中的存在。

DNA分离和克隆。在转染的24和48小时之后通过破碎收集细胞。大于100-150碱基对的基因组DNA的分离是依据厂商的介绍，使用高纯度的PCR模板制备试剂盒。在人肝脏因子Ⅸ基因的第八个外显子的317-nt片段的PCR扩增是用500ng分离的DNA进行的。所使用的引物依据人因子Ⅸ cDNA的核苷酸1008-1032和1300-1324，分别为5’-CATTGCTGACAAGGAATACACCAAC-3’(序列编号34)和5’-ATTTGCCTTTCATTGCACACTCTTC-3’(序列编号35)。引物在58℃退火20秒，延伸是在72℃持续45秒，以及变性在在94℃下进行45秒。鼠因子Ⅸ基因的374-nt片段的PCR扩增的进行是使用了来自初级肝细胞或肝脏尾状叶的500ng分离DNA。依据鼠因子Ⅸ cDNA的核苷酸433-457及782-806，所使用的引物为5’-ATTGCCTTGCTGGAACTGGATAAC-3’(序列编号36)和5’-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3’(序列编号37)。引物在59℃退火20秒，延伸是在72℃持续45秒，以及变性在在94℃下进行45秒。样品的扩增使用Expand Hi-fidelity^TM聚合酶进行30个循环。来自人和鼠因子Ⅸ基因的PCR扩增产物依据厂商的介绍，被亚克隆到TA克隆载体pCR^TM2.1中，连接物被用于转化冰冻的感受态大肠杆菌。

克隆杂交和序列测定。在涂平板的18到20小时之后，将菌落转移到MSI MagnaGraph尼龙膜上，依据厂商的介绍复制并进行杂交。滤膜的杂交进行24小时，使用了17基体的寡核苷酸探针365-A(5’-AAGGAGAT-AGTGGGGGA-3’)(序列编号38)或365-C(5’-AAGGAGATCGTGGGGGA-3’)(序列编号39)，其中下划线的核苷酸是诱变的靶位点。探针为³²P-末端标记，依据厂商的介绍，使用的[γ-³²]ATP(＞7,000 Ci/mmol)和T4核苷酸激酶。杂交在37℃下、在含有2×氯化钠，其含有1％SDS柠檬酸钠、5×Denhardt’s和200微克/毫升超声变性的鱼精子DNA中进行。杂交之后，将过滤膜在1×氯化钠磷酸盐EDTA、0.5％SDS清洗并在54℃下在50mM Tris-HCl、pH8.0含有3M氯化四甲铵、2mM EDTA、pH8.0、0.1％SDS中清洗。放射自显影在NEN^_在-70℃下，使用增感屏在NENO Reflection胶膜上进行。从鉴定为与365-A或365-C杂交的克隆中使用Qiagen minprep试剂盒(Chatsworth,CA)制备质粒DNA，并使用mp13反向质粒，在ABI 370A测序仪(Perkin-Elmer,Corp.,Foster City,CA)上对质粒DNA进行测序。

体内结果

用荧光素对嵌合的寡核苷酸进行标记，并将其用于确定直接注射到肝脏的尾状叶是否可行。结果显示在尾状叶中临近注射位点的肝细胞对经过荧光素标记的嵌合分子的摄取和在分离的初级肝细胞以及HuH-7细胞中所观察到的是类似的。虽然在细胞质中存在着一些点状的物质，但经过标记的物质是在核中所检测到的主要物质。实际上，在距离注射位点最远的肝细胞中仅观察到核标记。把没有经过标记的PEI/RIXF嵌合复合物和赋形物对照以相同的协议直接注射到尾状叶中，并在注射24及48小时后把动物处死。如方法中所述的方法分离肝脏DNA，用PCR扩增一段跨越靶核碱基交换位点的374nt的序列。在进行亚克隆并用PCR扩增物质转化大肠杆菌之后，进行被转化克隆的复制滤膜转移。将滤膜与特异针对365-A(野生型)或365-C(因子Ⅸ突变型)的32-标记的17-基体寡核苷酸杂交，并如方法中所描述的进行杂交之后的处理。接受RIXF嵌合分子直接肝脏注射的大鼠在24及48小时均表现出A-C转化的频率为％。相反，赋形剂对照物显示出不与365-C探针杂交。培养与来自RIXF处理的动物的365-C探针杂交的克隆，分离质粒DNA并对其进行序列分析以确定A→C的转换。扩增的374nt片段的末端与引物精确地符合，所观察到的唯一核苷酸改变是在靶交换位点的A→C。

7.3乳糖苷化的-PEI/CMV介导的大鼠因子Ⅸ改变的证明

7.3.1结果

与乳糖苷化的-PEI和PEI的混合物复合的CMV的制备是使用了如以上章节6.1.5中所描述的RIXR寡核苷酸。也构建了一种定向因子Ⅸ的相同区域的互补链的CMV(RIXRc)。

在Ser365的靶核苷酸通过嵌合的寡核苷酸的转变

荧光素标记的嵌合分子在核的定位显示了在分离出来的大鼠肝细胞中的有效转染。然后用未标记的嵌合分子因子RIXRc和RIXR以可比较的浓度、使用800kDa作为载体，对所培养的肝细胞进行转染。另外，同时进行赋形剂对照物转染。转染的48小时之后，收集细胞并分离DNA，依据章节6.1.5中所描述的进行杂交。在Ser365上的A→C定向的核苷酸转变的确定是通过PCR-扩增并克隆的374-nt片段的因子Ⅸ基因的外显子8的复制克隆转移的杂交(Sarkar,B.,Koeberl,D.D.& Somer,S.S.，“六种物种中因子Ⅸ基因的催化结构域和激活台端的直接测序，”Genomics,6,133-143,1990)。该17基体的寡核苷酸探针依据cDNA序列的710到726位核苷，用于区别野生型365-A(5’-AAGGAGATAGTGGGGGA-3’)(序列编号40)或转换的365-C(5’-AAGGAGATCGTGGGGGA-3’)(序列编号41)。

计算靶核苷酸的全体转化频率，通过依据与两种寡核苷酸探针杂交的克隆总数来区分与365-C寡核苷酸杂交的克隆。RIXc的结果概括在表Ⅲ。在Ser365的A→C转化仅在用RIXR或RIXRc转染的原代肝细胞中观察到。赋形剂转染的细胞或其它嵌合体寡核苷酸转染的细胞均没有获得任何与365-C寡核苷酸探针杂交的克隆(未发表的观察)。另外，没有观察到365-C寡核苷酸探针与来自DNA的克隆杂交，该DNA从未处理的肝细胞中分离出来并在0.5到1.5微克寡核苷酸的存在下进行PCR-扩增。使用章节6.1.5中所描述的乳糖化的PEI衍生物，在分离的肝细胞中的A→C转化也为剂量依赖性。对从培养的细胞中分离出来的RNA进行RT-PCR和杂交分析，该细胞用证实为A→C转化频率变化为从11.到22.3％的乳糖化PEI转染。

在完整肝脏中通过嵌合寡核苷酸的位点定向交换

荧光素标记的寡核苷酸也用于在直接注射到肝脏的尾状叶之后确定细胞对嵌合分子的吸收。结果显示在尾状叶中的注射位点附近的肝细胞与在分离的大鼠肝细胞中所观察到的类似，显示出对荧光素标记的嵌合体的吸收。虽然在肝细胞的细胞质中存在一些点状的物质，但所标记的物质是主要存在于细胞核中的。事实上，在原理注射位点的区域仅能观察到标记的核。然后将未标记的RIXT嵌合寡核苷酸和赋形剂对照通过尾静脉注射25kDa PEI在体内进行施用，注射的5天之后收集肝脏组织。分离肝脏DNA并将其进行一段跨越靶核苷酸交换位点的374-nt序列的PCR扩增，使用与初级肝细胞中所使用的相同的引物。亚克隆并用PCR扩增的产物转化E。coli之后，进行被转化克隆的复制滤膜转移。将滤膜与相同的32P标记的特异性针对365-A(野生型)或365-C(突变型)的17-基体寡核苷酸进行杂交，并进行杂交之后的处理。用100微克RIXR嵌合核苷酸处理的大鼠表现出A→C转化频率变化为13.9％至18.9％，，然而，在两次注射中接受总量为350微克的大鼠显示出40％的转化。相反赋形剂对照没有显示与365-C探针的杂交。分离的RNA的RT-PCR杂交显示在高剂量的肝脏中A→C转化频率为26.4％至28.4％。赋形剂处理的大鼠的APTT的变化为对照值的89.7％至181.9％(131.84％+32.89％)，然而寡核苷酸处理的动物的APTT变化为48.9％至61.7％(53.8％±4.8％)。

确定对于正常(n=9)和双倍注射的动物(n=3)，在Hepes缓冲液(50mM Hepes/100mM NaCl/0.02％NaN₃,pH7.4)中大鼠测试血浆1/10稀释液的APTT时间。从log-log标准曲线中确定复制样品中的因子Ⅸ活性，该曲线是在从来自12只正常雄性大鼠(6-8周龄)的汇聚血浆的稀释液(1∶10至1∶80)的APTT上建立的。正常大鼠的APTT变化为对照值的89.7％至181.9％(mean=131.84％±32.89％)，然而两次注射动物的APTT变化为49.0％至61.7％(mean=53.8％±5.8％)。对于正常大鼠，APTT凝血时间以秒表示变化为从60.9秒至81.6秒(mean=71.3±7.3秒)，然而对于两次感染的大鼠，APTT时间变化为92.3秒至98.6秒(mean=96.3±2.9秒)。

在分离的肝细胞和完整的肝脏中的突变的因子Ⅸ基因的序列分析

对野生型和突变的基因进行直接测序，以确定薄膜杂交在体外和体内研究中的结果。分析了至少10种独立的、来自完整肝脏或分离的肝细胞的、与365-A或365-C杂交的克隆。测序的结果显示与365-A杂交的克隆(图6，上部一组)表现出野生型Ⅸ序列，即，在所报道的cDNA序列的Ser³⁶⁵上为A。相反，来自因子RIXR_C转染的初级肝细胞、与365-C寡核苷酸探针杂交的克隆在Ser³⁶⁵上转变为C。在来自转染的大鼠肝脏的、与17基体365-C寡核苷酸探针杂交的克隆中观察到相同的A→C的转化。对因子Ⅸ基因的完整的374-nt PCR扩增区域的所有克隆进行测序，除了在Ser³⁶⁵上显示出来的变化外，没有观察到其它的变化。最后，来自初级肝细胞及完整肝脏的、与扩增过程中所使用的引物准确对应的374-nt PCR扩增的基因组DNA的起始和结束位点，显示所克隆和测序的DNA来自基因组DNA而不是非降解的嵌合寡核苷酸。表Ⅲ通过克隆转移杂交在大鼠因子Ⅸ基因组DNA的Ser³⁶⁵上的A→C转换百分率PEI传递系统 365-C克隆克隆总数 A-C(％)PEI 800 kDa¹ 浓度体外 150nM 24 572 4.2

300 31 367 8.5

450 63 502 12.5Lac-PEI 800kDa体外 90 19 337 5.3

180 34 300 11.3

270 47 253 18.6Lac-PEI 25kDa体外 90 28 527 5.3

180 53 417 12.7

270 60 305 19.7Lac-PEI 25kDa² 剂量体内x1 100微克 24 166 14.5

71 386 18.4

50 360 13.9Lac-PEI 25kDa体内x2 350微克 237 601 39.4

228 563 40.5

271 678 40.0

¹显示原代肝细胞转染的数据代表了两种实验的途径。

²以300微升5％葡萄糖的体积通过尾部静脉注射在体内施用嵌合体/PEI复合物。三只动物在每种剂量下的结果分别显示出来。

7.3.2材料和方法

体内传递嵌合寡核苷酸。将雄性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague-Dawley,Inc.)(约50克)维持在标准的12小时光照-黑暗周期中并随意喂食标准的实验室食品。赋形剂对照和乳糖化的25kDaPEI以比例为每个嵌合磷酸盐对应6个PEI氮的等价物在300微升5％蔗糖中施用(Abdallah,B.等，“在体内将基因转移成年哺乳动物脑部的一种有效的非病毒载体：聚氮丙啶”，人类基因治疗，7,1947-1954,1996.)。然后在连续的天数里，以单一的剂量100微克或分开的剂量150微克和200微克通过尾部静脉注射施用分装物。注射的5天之后，移去肝脏组织以进行DNA和RNA分离。DNA的分离如以前所描述(Kren,B.T.,Trembley,J.H.& Steer,C.J.，“大鼠肝脏再生过程中mRNA稳定型的改变”Am.J.Physiol.,270,G763-G777,1996)，以进行大鼠因子Ⅸ基因的外显子8的PCR扩增。分离RNA以依据厂商的介绍，使用RNAexol和RNAmate(Intermountian Scientific Corp.,Kaysville,UT)对其进行RT-PCR扩增与基因组DNA相同的区域。

因子Ⅸ活性分析。在第二次尾静脉注射的20天以后收集来自赋形剂(n=9)和寡核苷酸(n=3)处理的大鼠的血样于0.1体积的0.105M柠檬酸钠/柠檬酸中。在2500xg、然后在1500xg下离心，将所得到的血浆储存在-70℃下。从激活的部分促凝血酶原激活时间(APTT)中确定Ⅸ活性。简要地，在Hepes缓冲液(50mM Hepes/100mMNaCl/0.02％NaN₃,pH7.4)中的50微升APTR试剂(DADE,Miami,FL)、50微升人因子Ⅸ缺陷血浆(George King Biomedical,Overland,KS)、以及50微升大鼠测试血浆的1/10稀释液在一台ST4血凝度测量器(American Bioproducts,Parsippany,NJ)中在37℃下孵育3分钟。通过加入在Hepes缓冲液中的50微升33mM CaCl₂激活凝血。复制样品的因子Ⅸ活性的确定是在从APTT构建的log-log标准曲线中，APTT为来自正常雄性大鼠(n=12)的汇聚血浆的稀释液(1∶10至1∶80)。

DNA/RNA分离和克隆。细胞在转染之后通过破碎收集。基因组DNA的分离使用高纯度的PCR模板制备试剂盒(Boehringer Mannheim,Corp.,Indianapolis,IN)。依据厂商的介绍，RNA的分离使用了RNAzolTM B(Tel-Test,Inc.,Friendswood,TX)。PCR扩增大鼠因子Ⅸ基因的一段374-nt片段是与从原代肝细胞或肝组织的300ng分离出来的DNA一起进行的。所设计的引物分别与大鼠因子Ⅸ cDNA的核苷酸433-457和782-806对应，为5’-ATTGCCTTGCTGGAACTGGATAAAC-3’(序列编号42)和5’TTGCTTT CATTGCACATTCTTCAC-3’(序列编号43)(Oligos Etc.,Wilsonville,OR)。引物在59℃下退火20秒，延伸在72℃下进行45秒以及变性是在94℃下进行45秒。样品使用ExpandHi-fidelity^TM聚合酶(Boehringer Mannheim,Corp.)扩增30个循环。将来自肝细胞和完整的肝脏因子Ⅸ基因的PCR扩增产物亚克隆到TA克隆载体pCR^TM2.1(invitrogen,San Diego,CA)中，并将连接的产物用于转化可被冷冻的E.coli中。为了排除PCR杂质，在PCR-扩增反映之前，将300ng的对照DNA与0.5、1.0和1.5微克的寡核苷酸一起孵育。另外，1.0微克的嵌合体克隆被用做PCR扩增的“模板”。

使用Titian^TM在试管RT-PCR系统Boehringer Mannheim,Corp.)中进行RT-PCR扩增。依据厂商的介绍，使用与DNA PCR扩增中所使用的相同的引物。为了排除DNA污染，用RQ1 DNase free RNase(PromegaCorp.,Madison,WI)处理RNA样品，RNA酶解的RNA样品的RT-PCR阴性对照与RT-PCR反应同时进行。每步PCR反应均连接到相同的TA克隆载体上并转化到耐冰冻的大肠杆菌中。

克隆杂交和测序。平板接种的18到20小时之后，依据厂商的介绍，将克隆转移到MS1 MagnaGraph尼龙膜上，复制并进行杂交。薄膜与17基体寡核苷酸探针365-A(5’AAGGAGATAGTGGGGGA-3’)(序列编号44)或365-C(5’-AAGGAGATCGTGGGGGA-3’)(序列编号45)(生命技术，Inc.,Gaithersburg,MD)杂交24小时，其中下划线的核苷酸是诱变的靶位点。探针为³²p-末端-标记，使用了(γ-³²p)ATP(＞7,000Ci/mmol)和T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs,Inc.,Beverly MA)。杂交在37℃下、在含有1％SDS的柠檬酸钠、5xDenhardt’s和200微克/毫升超声变性的鱼精蛋白的2x氯化钠中进行。杂交之后，将滤膜用1x氯化钠磷酸钠EDTA 0.5％SDS清洗，然后在54℃下在50mM Tris-HCI,pH8.0(含有3M氯化四甲胺、50mMTris-HCI、pH8.0、0.1％SDS)(Melchior,W.B.& Von Hippel,P.h.“dA.dT和dG.dC碱基对在DNA中相对稳定性的改变，”美国国家科学院院报美国，70,298-302,1973。)中清洗1小时。放射自显影是在NENz Reflection胶片上进行，在-70℃下，使用增感屏。使用Qiagen miniprep试剂盒(Chatsworth,CA)，从鉴定为与365-A或365-C杂交的克隆中制备质粒DNA，并使用mp13顺向和反向引物对其进行自动测序，引物也为一种基因特异性引物，5’GTTGACCGAGCCACATGCCTrAG-3’(序列编号46)，依据大鼠因子ⅨcDNA，使用一台AB1 370A测序仪(Perkin-Elmer,Corp.,Foster City,CA)。

7.4对于在降低人体内的LDL水平中有用的CMV的例子

一种适合修饰其序列含有序列编号5中的序列的Apo B的CMV如以下所给出：

Apo B 41/UR(突变体→野生型) (序列编号第47号)

u GCGCG gac ccg acc gaa uuc ggu aac ugu au

u u

u CGCGC CTG GGC TGG CTT AAG CCA TTG ACA Tu

3′5′

一种适合修饰其序列含有序列编号12中的序列的Apo B的CMV如以下所给出：

Apo B 5/U88(mut→WT) (序列编号第48号)

u GCGCG cug uuc aaa gug uaC GGA TCC ucu uug acu gac gauu uu u

u CGCGC GAC AAG TTT CAC ATG CCT AGG AGA AAC TGA CTG CTu

3′5′

7.5在GUNN大鼠中的一种CRIGLER-NAJJAR-类似的突变的纠正

具有高胆红素血症的突变大鼠，称为Gunn大鼠，在编码胆红素-尿嘧啶磷酸葡糖醛酸盐葡糖醛酰转移酶(UGT1A1)基因上有单个核苷酸的删除.Roy Chowdhury,J.，等，1991，生命的化学杂志，266，18294。患有Ⅰ型克-纳综合症的人类患者也具有UGT1A1基因的突变体，导致终身的高胆红素血症和后继的脑损伤。Bosma,P.J.，等，1992,FASEB J.6,2859；Jansen,P.L.M.，等，Progress In LiverDiseases,Xill,Boyer,J.L.,& Ockner,R.K.，编辑(W.B.Saunders,Phil.1995),125-150页。CN3的结构，一种设计来纠正Gunn大鼠突变的CMV如以下所给出。

CN3(突变→WT) (序列编号第49号)

T GCGCG gg gac uua caG GAC CTT TAC uga ctt cua TT TT T

T CGCGC CC CTG AAT GTC CTG GAA ATG ACT GCC GAT T

3′5′

依据以上介绍(除了载体为章节6.2.2中的带负电的糖基化的脂囊泡或乳糖化的-PEI载体)用150nM Gunn CN3以寡核苷酸磷酸盐与亚胺的比例为1∶4处理Gunn大鼠原代培养的肝细胞。结果为带负电的脂质体为8.5％转换率，依据乳糖苷化的-PEI载体为3.6％转换率。

如以上所描述的，将1毫克/千克的CN3与25kDa乳糖-PEI或带负电的Gc脂囊泡(Gc-NLV)组合，将其注射到Gunn大鼠体内。基因转换速度的确定是依据描述因子Ⅸ的过程进行克隆和杂交。以下所显示的结果表明大约15％到25％的UGT1A1基因的拷贝被转换。

G在UGT-1基因的核苷酸1239上的插入频率(在Gunn大鼠中)

载体剂量 G克隆/全部克隆频率(％)

GC-NLV 1mg 112/815 15.4

208/761 27.3

185/974 18,9

39/273 14.61

78/403 19.32

25 kDa PEI 1mg 188/838 22.4

(乳糖基化) 254/1150 22.1

245/997 24.6

¹所确定的初始转换频率

²70％部分肝切除术的7天之后确定的转换频率

用如以上所描述的、与25 kDa Lac-PEI复合的1毫克/千克CN3连续5天注射Gunn大鼠。在最后注射的25天之后，血清胆红素从6.2mg/dl降低到3.5mg/dl，并在该水平下进一步保存25天。

7.6一种因子Ⅸ突变在狗中的纠正

Chapel Hill品种的狗，其具有一种导致动物血友病的(G→A)1477突变，被用于获取原代培养的肝细胞。已经合成了四种用于纠正该突变的CMV。DIX1(突变→WT) (序列编号第50号)T gcgcg auu caa aga aTT GAC CCT AAT AAT cga ccc cTT TT TT CGCGC TAA GTT TCT TAA CTG GGA TTA TTA GCT GGG GT

3′5′

DIX2(突变→WT) (序列编号第51号)T gcgcg caa aga auu gAC CCT AAT aau cga cTT TT TT CGCGC GTT TCT TAA CTG GGA TTA TTA GCT GT

3′5′

DIX3(突变→WT) (序列编号第52号)u gcgcg auu caa aga auu gac ccu aau aau cga ccc cuu uu uu CGCGC TAA GTT TCT TAA CTG GGA TTA TTA GCT GGG Gu

3′5′

DIX4(突变→WT)(序列编号第53号)u gcgcg auu caa aga auu gac ucu aau aau cga ccc cuu uu uu CGCGC TAA GTT TCT TAA CTG GGA TTA TTA GCT GGG Gu

通过用2’-0-甲基RNA取代插入的DNA片段以及用四尿嘧啶取代四胸腺嘧啶接头将DIX1从DIX3中区别开来。DIX4与DIX3在其突变区域上含有一个错配的突变载体上区别开来。在DIX中，5’(较低)链编码理想的(野生型)序列，同时3’(较高)链具有目标的序列，即，突变序列。

用360nM D1X1与25kDa Lac-PEI或含有半乳糖脑苷脂的水核心、带负电的脂囊泡(Gc-NLV)复合，处理肝细胞。结果在下表中给出。

在因子Ⅸ基因的核苷酸1477上的A到G的转换频率

(来自Hemophilia B狗的Chapel Hill品种的原代肝细胞)载体转染次数浓度 G克隆/全部频率(％)

克隆GC-NLV 一次 360nM 30/195 15.44

30/218 13.76

两次 30/118 25.4Lac-PEI 一次* 360nM 20/141 14.225 kDa 48/348 13.3

两次 21/107 19.6

*RT-PCR在并列转染的培养物中导致A到G的转换频率为11.1％。

每个DIX2-DIX4也在以上所描述的原代培养的狗肝细胞中进行测试。结果显示DIX2效果不好，可能是由于GC的百分比低(25％)。在后继的实验中，DIX3的结果约为16％转换率，然而并列的实验DIX1得出10％转换率以及DIX4的结果约与DIX1一致。

人载脂蛋白B-100基因外显子的GenBank序列参考

表Ⅱ

外显子号码	CDNA范围	GenBank登记序列参考
外显子号码	CDNA范围	GenBank登记序列参考	1	126至207	M19808
2	208至246	M19808	1	126至207	M19808
2	208至246	M19808	3	247至362	m19809
4	363至508	M19810	3	247至362	m19809
4	363至508	M19810	5	509至662	M19811
6	663至818	M19812	5	509至662	M19811
6	663至818	M19812	7	819至943	M19813
8	944至1029	M19813	7	819至943	M19813
8	944至1029	M19813	9	1030至1249	M19815
10	1250至1477	M19816	9	1030至1249	M19815
10	1250至1477	M19816	11	1478至1595	M19818
12	1596至1742	M19818	11	1478至1595	M19818
12	1596至1742	M19818	13	1743至1954	M19820
14	1955至2192	M19820	13	1743至1954	M19820
14	1955至2192	M19820	15	2193至2359	M19821
16	2360至2561	M19823	15	2193至2359	M19821
16	2360至2561	M19823	17	2562至2729	M19824
18	2730至2941	M19824	17	2562至2729	M19824
18	2730至2941	M19824	19	2942至3124	M19825
20	3125至3246	M19825	19	2942至3124	M19825
20	3125至3246	M19825	21	3247至3457	M19827
22	3458至3633	M19828	21	3247至3457	M19827
22	3458至3633	M19828	23	3634至3821	M19828
24	3822至3967	M19828	23	3634至3821	M19828
24	3822至3967	M19828	25	3968至4341	M19828
26	4342至11913	M19828	25	3968至4341	M19828
26	4342至11913	M19828	27	11914至12028	M19828
28	12029至12212	M19828	27	11914至12028	M19828
28	12029至12212	M19828	29	12213至13816	M1982B

SEQ10 表1 C/C# NA改变 AA AA ％APOB100 限制位点No. 序列(5′→3′) 改变4 AGTCTGGATGGGTAAGCCGCCCTCA 15 A_T K_Stop 1701 36.9 无5 CTGGGCTGGCTTAAGCCATTGACAT 13 C_A S_TAA 1876 40.8 +CTTAAG6 GCTCTCTGGGGATAACATACTGGGC 14 G_T E_Stop 1921 41.8 无7 GATGCCGTTGAGTACCCCCAAGAAT 13 A_T K_Stop 2047 44.5 无8 GAGAGGAATCGATAAACCATTATAG 10 C_T Q_Stop 2085 45.4 +ATCGAT9 TGTAAGAAAATAAACAGCAGCCCTG 10 C_A Y_Stop 2110 45.9 无10 GCAGCCCTGGGATAACTCCCACAGC 16 A_T K_Stop 2116 46.0 无11 GCAAGCTAATGATTAGCTGAATTCATTCAAT 8 T_G Y_Stop 2124 46.2 +AGCT12 CAAGTTTCACATGCCTAGGAGAAACTGACTG 11 A_T K_Stop 2138 46.5 +CCTAGG13 ATATACAAATTGCATGAGATGATGCCAAAAT 9 T_G L_Stop 2159 47.0 +CATG14 AAACTATCTCAACTGTAGACATATATGATAC 8 C_T Q_Stop 2174 47.3 -CTGCAG15 GCTAATATTATTGATTAAATCATTGAAATTA 3 G_T E_Stop 2204 48.0 +TTAA16 TGATGAGCACTAGCATATCCGTGTA 11 T_G Y_Stop 2216 48.3 +CTAG17 CTGCAGCAGCTTTAGAGACACATAC 12 A_T K_Stop 2270 49.4 -CTTAAG18 AACAGTGAGCTGTAGTGGCCCGTTC 14 C_T Q_Stop 2684 58.6 无19 CAGACTTCCGTTAACCAGAAATCGC 12 T_A L_Stop 2712 59.2 +GTTAAC20 AAAGGGTCATGGTAATGGGCCTGCC 14 A_T K_Stop 2930 64.0 无21 ACATATATGATATAATTTGATCAGT 5 C_T Q_Stop 2180 47.5 生理性的

表ⅢSeq ID No. 序列(5′→3′) G/C# AA改变 NA改变 AA 基因

22 ATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGG 18 R_C C_T 112 Apo E

23 GACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGT 15 R_C C_T 158 Apo E

24 GACCTGCAGAAGCGCCTGGCAGTGT 16 C_R T_C 158 Apo E

25 TAAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCC 13 NA A_T -491 Apo E

54 GGCGAGGACATGTGCGACCGGGCGC 19 R_C C_T 149 Apo A1

55 GAGATGCGCGACTGCGCGCGCGCCC 20 R_C C_T 151 Apo A1

56 CGCGACCGCGCGTGCGCGCATGTGG 20 R_C C_T 153 Apo A1

57 AGCGACCAGCTGTGCCAGCGCTTGG 17 R_C C_T 171 Apo A1

58 GAGCTGCGCCAGTGCTTGGCCGCGC 19 R_C C_T 173 Apo A1

序列表<110>1．Steer,Clifford J.

2．Kren,Betsy T.

3．Bandyopadhyay,Paramita

4．Roy-Chowdhury,Jayanta<120>基因治疗高血脂症的方法和复合物

<130>7991-033-228

<150>60/074,497

<151>1998-02-12

<150>09/108,006

<151>1998-06-30

<160>59

<170>适用于Windows3.0版本的FastSEQ

<210>1

<211>4563

<212>PRT

<213>智人

<400>1Met Asp Pro Pro Arg Pro Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Pro Ala1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Ala Arg Ala Glu Glu Glu Met Leu

20 25 30Glu Asn Val Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Ala Thr Arg Phe Lys His

35 40 45Leu Arg Lys Tyr Thr Tyr Asn Tyr Glu Ala Glu Ser Ser Ser Gly Val

50 55 60Pro Gly Thr Ala Asp Ser Arg Ser Ala Thr Arg Ile Asn Cys Lys Val65 70 75 80Glu Leu Glu Val Pro Gln Leu Cys Ser Phe Ile Leu Lys Thr Ser Gln

85 90 95Cys Ile Leu Lys Glu Val Tyr Gly Phe Asn Pro Glu Gly Lys Ala Leu

100 105 110Leu Lys Lys Thr Lys Asn Ser Glu Glu Phe Ala Ala Ala Met Ser Arg

115 120 125Tyr Glu Leu Lys Leu Ala Ile Pro Glu Gly Lys Gln Val Phe Leu Tyr

130 135 140Pro Glu Lys Asp Glu Pro Thr Tyr Ile Leu Asn Ile Lys Arg Gly Ile145 150 155 160Ile Ser Ala Leu Leu Val Pro Pro Glu Thr Glu Glu Ala Lys Gln Val

165 170 175Leu Phe Leu Asp Thr Val Tyr Gly Asn Cys Ser Thr His Phe Thr Val

180 185 190Lys Thr Arg Lys Gly Asn Val Ala Thr Glu Ile Ser Thr Glu Arg Asp图2A1 cctatccctgggggagggggcgggacagggggagccctataattggacaagtctgggatccttgagtcctACTCAGCCCCAG83 CGGAGGTGAAGGACGTCCTTCCCCAGGAGCCGgtgagaagcgcagtcgggggcacggggatgagctcaggggcctctagaaa165 gagctgggaccctgggaagccctggcctccaggtagtctcaggagagctactcggggtcgggcttggggagaggaggagcgg247 gggtgaggcaagcagcaggggactggacctgggaagggctgggcagcagagacgacccgacccgctagaaggtggggtgggg329 agagcagctggactgggatgtaagccatagcaggactccacgagttgtcactatcattatcgagcacctactgggtgtcccc411 agtgtcctcagatctccataactggggagccaggggcagcgacacggtagctagccgtcgattggagaactttaaaatgagg493 actgaattagctcataaatggaacacggcgcttaactgtgaggttggagcttagaatgtgaagggagaatgaggaatgcgag575 actgggactgagatggaaccggcggtggggagggggtggggggatggaatttgaaccccgggagaggaagatggaattttct657 atggaggccgacctggggatggggagataagagaagaccaggagggagttaaatagggaatgggttgggggcggcttggcaa739 atgtgctgggattaggctgttgcagataatgcaacaaggcttggaaggctaacctggggtgaggccgggttgggggcgctgg821 gggtgggaggagtcctcactggcggttgattgacagtttctccttccccagACTGGCCAATCACAGGCAGGAAGATGAAGGT

M K V903 TCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGgtatgggggcggggcttgctcggttccccccgctcctccccctctca

L W A A L L V T F L A985 tcctcacctcaacctcctggccccattcagacagaccctgggccccctcttctgaggcttctgtgctgcttcctggctctga1067 acagcgatttgacgctctctgggcctcggtttcccccatccttgagataggagttagaagttgttttgttgttgttgtttgt1149 tgttgttgttttgtttttttgagatgaagtctcgctctgtcgcccaggctggagtgcagtggcgggatctcggctcactgca1231 agctccgcctcccaggtccacgccattctcctgcctcagcctcccaagtagctgggactacaggcacatgccaccacacccg1313 actaacttttttgtattttcagtagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtctggaactcctgacctcaggtgatcLys Ser Val Ser Ile Pro Ser Leu Asp Pro Ala Ser Ala Lys Ile Glu

645 650 655Gly Asn Leu Ile Phe Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Met

660 665 670Leu Lys Thr Thr Leu Thr Ala Phe Gly Phe Ala Ser Ala Asp Leu Ile

675 680 685Glu Ile Gly Leu Glu Gly Lys Gly Phe Glu Pro Thr Leu Glu Ala Leu

690 695 700Phe Gly Lys Gln Gly Phe Phe Pro Asp Ser Val Asn Lys Ala Leu Tyr705 710 715 720Trp Val Asn Gly Gln Val Pro Asp Gly Val Ser Lys Val Leu Val Asp

725 730 735His Phe Gly Tyr Thr Lys Asp Asp Lys His Glu Gln Asp Met Val Asn

740 745 750Gly Ile Met Leu Ser Val Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Ser Lys

755 760 765Glu Val Pro Glu Ala Arg Ala Tyr Leu Arg Ile Leu Gly Glu Glu Leu

770 775 780Gly Phe Ala Ser Leu His Asp Leu Gln Leu Leu Gly Lys Leu Leu Leu785 790 795 800Met Gly Ala Arg Thr Leu Gln Gly Ile Pro Gln Met Ile Gly Glu Val

805 810 815Ile Arg Lys Gly Ser Lys Asn Asp Phe Phe Leu His Tyr Ile Phe Met

820 825 830Glu Asn Ala Phe Glu Leu Pro Thr Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Ile

835 840 845Ser Ser Ser Gly Val Ile Ala Pro Gly Ala Lys Ala Gly Val Lys Leu

850 855 860Glu Val Ala Asn Met Gln Ala Glu Leu Val Ala Lys Pro Ser Val Ser865 870 875 880Val Glu Phe Val Thr Asn Met Gly Ile Ile Ile Pro Asp Phe Ala Arg

885 890 895Ser Gly Val Gln Met Asn Thr Ash Phe Phe His Glu Ser Gly Leu Glu

900 905 910Ala His Val Ala Leu Lys Pro Gly Lys Leu Lys Phe Ile Ile Pro Ser

915 920 925Pro Lys Arg Pro Val Lys Leu Leu Ser Gly Gly Asn Thr Leu His Leu

930 935 940Val Ser Thr Thr Lys Thr Glu Val Ile Pro Pro Leu Ile Glu Asn Arg945 950 955 960Gln Ser Trp Ser Val Cys Lys Gln Val Phe Pro Gly Leu Asn Tyr Cys

965 970 975Thr Ser Gly Ala Tyr Ser Asn Ala Ser Ser Thr Asp Sar Ala Ser Tyr

980 985 990Tyr Pro Leu Thr Gly Asp Thr Arg Leu Glu Leu Glu Leu Arg Pro Thr

995 1000 1005Gly Glu Ile Glu Gln Tyr Ser Val Ser Ala Thr Tyr Glu Leu Gln Arg

1010 1015 1020Glu Asp Arg Ala Leu Val Asp Thr Leu Lys Phe Val Thr Gln Ala Glu1025 1030 1035 1040Gly Ala Lys Gln Thr Glu Ala Thr Met Thr Phe Lys Tyr Asn Arg Gln

1045 1050 1055Ser Met Thr Leu Ser Ser Glu Val Gln Ile Pro Asp Phe Asp Val Asp

1060 1065 1070Leu Gly Thr Ile Leu Arg Val Asn Asp Glu Ser Thr Glu Gly Lys Thr

1075 1080 1085Ser Tyr Arg Leu Thr Leu Asp Ile Gln Asn Lys Lys Ile Thr Glu Val

1090 1095 1100Ala Leu Met Gly His Leu Ser Cys Asp Thr Lys Glu Glu Arg Lys Ile1105 1110 1115 1120Lys Gly Val Ile Ser Ile Pro Arg Leu Gln Ala Glu Ala Arg Ser Glu

1125 1130 1135Ile Leu Ala His Trp Ser Pro Ala Lys Leu Leu Leu Gln Met Asp Ser

1140 1145 1150Ser Ala Thr Ala Tyr Gly Ser Thr Val Ser Lys Arg Val Ala Trp His

1155 1160 1165Tyr Asp Glu Glu Lys Ile Glu Phe Glu Trp Asn Thr Gly Thr Asn Val

1170 1175 1180Asp Thr Lys Lys Met Thr Ser Asn Phe Pro Val Asp Leu Ser Asp Tyr1185 1190 1195 1200Pro Lys Ser Leu His Met Tyr Ala Asn Arg Leu Leu Asp His Arg Val

1205 1210 1215Pro Gln Thr Asp Met Thr Phe Arg His Val Gly Ser Lys Leu Ile Val

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<210>3<211>3805<212>DNA<213>智人<220><221>外显子<222>(71)…(114)<223>外显子1<221>外显子<222>(872)…(937)<223>外显子2<221>外显子<222>(2031)…(2223)<223>外显子<221>外显子<222>(2805)…(3663)<223>外显子4<400>3cctatccctg ggggaggggg cgggacaggg ggagccctat aattggacaa gtctgggatc 60cttgagtcct actcagcccc agcggaggtg aaggacgtcc ttccccagga gccggtgaga 120agcgcagtcg ggggcacggg gatgagctca ggggcctcta gaaagagctg ggaccctggg 180aagccctggc ctccaggtag tctcaggaga gctactcggg gtcgggcttg gggagaggag 240gagcgggggt gaggcaagca gcaggggact ggacctggga agggctgggc agcagagacg 300acccgacccg ctagaaggtg gggtggggag agcagctgga ctgggatgta agccatagca 360ggactccacg agttgtcact atcattatcg agcacctact gggtgtcccc agtgtcctca 420gatctccata actggggagc caggggcagc gacacggtag ctagccgtcg attggagaac 480tttaaaatga ggactgaatt agctcataaa tggaacacgg cgcttaactg tgaggttgga 540gcttagaatg tgaagggaga atgaggaatg cgagactggg actgagatgg aaccggcggt 600ggggaggggg tggggggatg gaatttgaac cccgggagag gaagatggaa ttttctatgg 660aggccgacct ggggatgggg agataagaga agaccaggag ggagttaaat aggaatggg 720ttgggggcgg cttggtaaat gtgctgggat taggctgttg cagataatgc aacaaggctt 780ggaaggctaa cctggggtga ggccgggttg ggggcgctgg gggtgggagg agtcctcact 840ggcggttgat tgacagtttc tccttcccca gactggccaa tcacaggcag gaagatgaag 900gttctgtggg ctgcgttgct ggtcacattc ctggcaggta tgggggcggg gcttgctcgg 960ttccccccgc tcctccccct ctcatcctca cctcaacctc ctggccccat tcagacagac 1020cctgggcccc ctcttctgag gcttctgtgc tgcttcctgg ctctgaacag cgatttgacg 1080ctctctgggc ctcggtttcc cccatccttg agataggagt tagaagttgt tttgttgttg 1140ttgtttgttg ttgttgtttt gtttttttga gatgaagtct cgctctgtcg cccaggctgg 1200agtgcagtgg cgggatctcg gctcactgca agctccgcct cccaggtcca cgccattctc 1260ctgcctcagc ctcccaagta gctgggacta caggcacatg ccaccacacc cgactaactt 1320ttttgtattt tcagtagaga cggggtttca ccatgttggc caggctggtc tggaactcct 1380gacctcaggt gatctgcccg tttcgatctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca 1440ccgcacctgg ctgggagtta gaggtttcta atgcattgca ggcagatagt gaataccaga 1500cacggggcag ctgtgatctt tattctccat cacccccaca cagccctgcc tggggcacac 1560aaggacactc aatacatgct tttccgctgg gccggtggct cacccctgta atcccagcac 1620tttgggaggc caaggtggga ggatcacttg agcccaggag ttcaacacca gcctgggcaa 1680catagtgaga ccctgtctct actaaaaata caaaaattag ccaggcatgg tgccacacac 1740ctgtgctctc agctactcag gaggctgagg caggaggatc gcttgagccc agaaggtcaa 1800ggttgcagtg aaccatgttc aggccgctgc actccagcct gggtgacaga gcaagaccct 1860gtttataaat acataatgct ttccaagtga ttaaaccgac tcccccctca ccctgcccac 1920catggctcca aagaagcatt tgtggagcac cttctgtgtg cccctaggta gctagatgcc 1980tggacggggt cagaaggacc ctgacccgac cttgaacttg ttccacacag gatgccaggc 2040caaggtggag caagcggtgg agacagagcc ggagcccgag ctgcgccagc agaccgagtg 2100gcagagcggc cagcgctggg aactggcact gggtcgcttt tgggattacc tgcgctgggt 2160gcagacactg tctgagcagg tgcaggagga gctgctcagc tcccaggtca cccaggaact 2220gaggtgagtg tccccatcct ggcccttgac cctcctggtg ggcggctata cctccccagg 2280tccaggtttc attctgcccc tgtcgctaag tcttgggggg cctgggtctc tgctggttct 2340agcttcctct tcccatttct gactcctggc tttagctctc tggaattctc tctctcagct 2400ttgtctctct ctcttccctt ctgactcagt ctctcacact cgtcctggct ctgtctctgt 2460ccttccctag ctcttttata tagagacaga gagatggggt ctcactgtgt tgcccaggct 2520ggtcttgaac ttctgggctc aagcgatcct cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt 2580agaggcatga gcaccttgcc cggcctccta gctccttctt cgtctctgcc tctgccctct 2640gcatctgctc tctgcatctg tctctgtctc cttctctcgg cctctgcccc gttccttctc 2700tccctcttgg gtctctctgg ctcatcccca tctcgcccgc cccatcccag cccttctccc 2760ccgcctcccc actgtgcgac accctcccgc cctctcggcc gcagggcgct gatggacgag 2820accatgaagg agttgaaggc ctacaaatcg gaactggagg aacaactgac cccggtggcg 2880gaggagacgc gggcacggct gtccaaggag ctgcaggcgg cgcaggcccg gctgggcgcg 2940gacatggagg acgtgtgcgg ccgcctggtg cagtaccgcg gcgaggtgca ggccatgctc 3000ggccagagca ccgaggagct gcgggtgcgc ctcgcctccc acctgcgcaa gctgcgtaag 3060cggctcctcc gcgatgccga tgacctgcag aagcgcctgg cagtgtacca ggccggggcc 3120cgcgagggcg ccgagcgcgg cctcagcgcc atccgcgagc gcctggggcc cctggtggaa 3180cagggccgcg tgcgggccgc cactgtgggc tccctggccg gccagccgct acaggagcgg 3240gcccaggcct ggggcgagcg gctgcgcgcg cggatggagg agatgggcag ccggacccgc 3300gaccgcctgg acgaggtgaa ggagcaggtg gcggaggtgc gcgccaagct ggaggagcag 3360gcccagcaga tacgcctgca ggccgaggcc ttccaggccc gcctcaagag ctggttcgag 3420cccctggtgg aagacatgca gcgccagtgg gccgggctgg tggagaaggt gcaggctgcc 3480gtgggcacca gcgccgcccc tgtgcccagc gacaatcact gaacgccgaa gcctgcagcc 3540atgcgacccc acgccacccc gtgcctcctg cctccgcgca gcctgcagcg ggagaccctg 3600tccccgcccc agccgtcctc ctggggtgga ccctagttta ataaagattc accaagtttc 3660acgcatctgc tggcctcccc ctgtgatttc ctctaagccc cagcctcagt ttctctttct 3720gcccacatac tgccacacaa ttctcagccc cctcctctcc atctgtgtct gtgtgtatct 3780ttctctctgc cctttttttt ttttt 3805

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>4agtctggatg ggtaagccgc cctca 25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>5ctgggctggc ttaagccatt gacat 25

<210>6

<211>25

<212>DNA<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>6gctctctggg gataacatac tgggc 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>7gatgccgttg agtagcccca agaat 25

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>8gagaggaatc gataaaccat tatag 25

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>9tgtaagaaaa taaagagcag ccctg 25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>10gcagccctgg gataactccc acagc 25

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>构建序列<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>11gcaagctaat gattagctga attcattcaa t 31

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>12caagtttcac atgcctagga gaaactgact g 31

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>构建序列

<220><223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>13atatacaaat tgcatgagat gatgccaaaa t 31

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>14aaactatctc aactgtagac atatatgata c 31

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>构建序列<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>15gctaatatta ttgattaaat cattgaaatt a 31

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>16tgatgagcac tagcatatcc gtgta 25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>17ctgcagcagc tttagagaca catac 25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>18aacagtgagc tgtagtggcc cgttc 25

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>19cagacttccg ttaaccagaa atcgc 25

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>20aaagggtcat ggtaatgggc ctgcc 25

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>21acatatatga tataatttga tcagt 25

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>22atggaggacg tgtgcggccg cctgg 25

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>23gacctgcaga agtgcctggc agtgt 25

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>24gacctgcaga agcgcctggc agtgt 25

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>25taaggtcagg agtttgagac cagcc 25

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段-DNA和RNA

<400>26agucuggaug ggtaagccgc ccuca 25

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<212>DNA

<213>R.Rattus

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<211>13

<212>PRT

<213>R.Rattus

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<211>39

<212>DNA

<213>R.Rattus

<400>29aaagattcat gtgaaggaga tcgtggggga ccccatgtt 39

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<211>68

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>30ggggtccccc acgatctcct tcacattttu gugaaggaga tcgtggggga ccccgcgcgt 60tttcgcgc 68

<210>31

<211>68

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>31tgtgaaggag atcgtggggg accccttttg ggguccccca cgatcuccuu cacagcgcgt 60tttcgcgc 68

<210>32

<211>68

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>32tgtgaaggag atcgtggggg accccttttg ggguccccca cgatcuccuu cacagcgcgt 60tttcgcgc 68

<210>33

<211>68

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>33tgtcaaggag atcgtggggg accccttttg ggguccccca cgatcuccuu gacagcgcgt 60tttcgcgc 68

<210>34

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

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<210>35

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

<400>35atttgccttt cattgcacac tcttc 25

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

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<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

<400>37ttgcctttca ttgcacattc ttcac 25

<210>38

<211>17

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>寡聚核苷酸探针

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<211>17

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>寡聚核苷酸探针

<400>39aaggagatcg tggggga 17

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<211>17

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>寡聚核苷酸探针

<400>40aaggagatag tggggga 17

<210>41

<211>17

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>寡聚核苷酸探针

<400>41aaggagatcg tggggga 17

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<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

<400>42attgccttgc tggaactgga taaac 25

<210>43

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

<400>43ttgcctttca ttgcacattc ttcac 25

<210>44

<211>17

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>寡聚核苷酸探针

<400>44aaggagatag tggggga 17

<210>45

<211>17

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>寡聚核苷酸探针

<400>45aaggagatcg tggggga 17

<210>46

<211>23

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>PCR引物

<400>46gttgaccgag ccacatgcct tag 23

<210>47

<211>68

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>47ctgggctggc ttaagccatt gacatuuuua ugucaauggc uuaagccagc ccaggcgcgu 60uuucgcgc 68

<210>48

<211>88

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RN

<400>48gacaagtttc acatgcctag gagaaactga ctgctuuuua gcagucaguu ucucctaggc 60augugaaacu ugucgcgcgu uuucgcgc 88

<210>49

<211>76

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>49ccctgaatgt cctggaaatg actgccgatt tttaucttca gucatttcca ggacauucag 60gggcgcgttt tcgcgc 76

<210>50

<211>80

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>50taagtttctt aactgggatt attagctggg gttttcccca gctaataatc ccagttaaga 60aacuuagcgc gttttcgcgc 80

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<211>68

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>51gtttcttaac tgggattatt agctgttttc agcuaataat cccaguuaag aaacgcgcgt 60tttcgcgc 68

<210>52

<211>80

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RNA

<400>52taagtttctt aactgggatt attagctggg guuuucccca gcuaauaauc ccaguuaaga 60aacuuagcgc guuuucgcgc 80

<210>53

<211>80

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸-DNA和RN

<400>53taagtttctt aactgggatt attagctggg guuuucccca gcuaauaauc ucaguuaaga 60aacuuagcgc guuuucgcgc 80

<210>54

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>54ggcgaggaca tgtgcgaccg ggcgc 25

<210>55

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>55gagatgcgcg actgcgcgcg cgccc 25

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<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

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<210>57

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>57agcgaccagc tgtgccagcg cttgg 25

<210>58

<211>25

<212>DNA

<213>构建序列

<220>

<223>治疗性寡聚核苷酸片段

<400>58gagctgcgcc agtgcttggc cgcgc 25

<210>59

<211>8966

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(703)…(748)

<221>CDS

<222>(1678)…(2280)

<400>59ctaaagaaga gcactggtgg gaggacaggg cgggggaagg gggaggggag tgaagtagtc 60tccctggaat gctggtggtg ggggaggcag tctccttggt ggaggagtcc cagcgtccct 120cccctcccct cctctgccaa cacaatggac aatggcaact gcccacacac tcccatggag 180gggaagggga tgagtgcagg gaaccccgac cccacccggg agacctgcaa gcctgcagca 240ctcccctccc gcccccactg aacccttgac ccctgccctg cacgccccgc agcttgctgt 300ttgcccactc ctatttgccc agtcccaggg acagagctga tccttgaact cttaagttcc 360acattgccag gaccagtgag cagcaacagg gccagggctg ggcttatcag cctcccagcc 420cagaccctgg ctgcagacat aaataggccc tgcaagagct ggctgcttag agactgcgag 480aaggaggtgc gtcctgctgc ctgccccggc actctggctc cccagctcaa ggttcaggcc 540ttgccccagg ccgggcctct gggtacctga ggtcttctcc cgctctgtgc ccttctcctc 600acctggctgc aatgagtggg ggagcacggg gcttctgcat gctgaaggca ccccactcag 660ccaggccctt cttctcctcc aggtccccca cggcccttca ggatgaaagc tgcggtgctg 720accttggccg tgctcttcct gacgggtagg tgtcccctaa cctaggagcc aaccatcggg 780gggctttctc cctaaatccc cgtggcccac cctcctgggc agaggcagca ggtttctcac 840tggccccctc tcccccacct 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Claims

1．一种降低患者血液中LDL的方法，包括改变该患者肝细胞中的Apo B基因，以使被改变的Apo B基因的转录产物含有一个框内的终止密码子，籍此被改变的基因编码的蛋白具有至少1433个氨基酸且不超过3974个氨基酸。

2．如权利要求1中所述的方法，其进一步包括的步骤是确定在该患者体内Apo B基因的改变对LDL水平的影响以及随后调整改变的ApoB基因在该患者体内的数目。

3．如权利要求1中所述的方法，其中被改变的基因编码的蛋白具有至少1841个氨基酸且不超过2975个氨基酸。

4．如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中被改变的基因编码的蛋白具有序列编号1中的一个片段的序列，该片段至少具有1-1841个氨基酸且不超过1-2975个氨基酸。

5．如权利要求1-4中任一项所述的方法，其包括施用一种含有第一和第二同源区域的重组诱发剂寡核碱基，每个区域的序列至少有10个选自序列编号2的nt 4342-11913的核碱基，以此完成对Apo B基因的改变。

6．如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中的患者禁食LDL血清胆固醇降低到140mg/dl以下。

7．一种用于修饰人Apo B基因的含有一种寡核碱基的组合物，该寡核碱基包括：

a．第一和第二同源区域，每个区域的全长至少含有8个核碱基，总共的全长含有至少20个核碱基，这些同源区域均与序列编号2中的nt 5649-9051序列片段同源，以及

b．一个位于第一和第二同源区域之间的异源区域，

以使将异源区域的序列引入到Apo B基因中从而导致所编码的蛋白缩短。

8、如权利要求7中所述的组合物，其中的第一和第二同源区域各含有杂交双链的至少3个连续的核碱基对。

9．如权利要求7或8中所述的组合物，其中第一和第二同源区域的长度之和的全长不超过60个核碱基。

10．如权利要求7-9中任一项所述的组合物，其中的同源区域一起包括杂交双链的9至25个之间的核碱基对。

11．如权利要求7-10中任一所述的组合物，其中每个同源区域的GC含量(fraction)至少为33％。

12．如权利要求7-10中任一项所述的组合物，其中同源区域中的GC含量至少为50％。

13．如权利要求7-10中任一所述的组合物，其中寡核碱基的序列包括序列编号4-21或其互补序列中的任一的至少21个核碱基片段的序列。

14．如权利要求7-10中任一项所述的组合物，其中寡核碱基的序列包括序列编号4-21或其互补序列中的任一的至少25个核碱基片段的序列。

15．如权利要求7-14中任一项所述的组合物，其进一步包括：

a．水性；以及

b．一种选自下列一组中的大分子载体，该组包括

Ⅰ水核心的脂囊泡、其中的水核心含有寡核碱基

Ⅱ脂质微球体，其包括寡核碱基的亲脂盐，以及

Ⅲ一个平均分子量在500道尔顿到1.3Md之间的多聚阳离子，其中的多聚阳离子和寡核碱基形成盐。

16．如权利要求15中所述的组合物，其中的大分子载体进一步包括网格蛋白包被的凹陷受体的配基。

17．如权利要求16中所述的组合物，其中的网格蛋白包被的凹陷受体是选自转铁蛋白、烟碱酸、肉毒碱、胰岛素和胰岛素样生长因子-1的受体。

18．如权利要求16中所述的组合物，其中的网格蛋白包被的凹陷受体是一种脱唾液酸糖蛋白受体。

19．如权利要求15-18任一项所述的组合物，其中的大分子载体是带负电荷、水核心的脂囊泡。

20．如权利要求16-18任一项所述的组合物，其中的水核心脂囊泡进一步包括脑苷脂。

21．如权利要求15-20任一项所述的组合物，其中的水核心脂囊泡包括二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰丝氨酸。

22．如权利要求16、18、19和21中任一项所述的组合物，其中的大分子载体是含有融合诱发剂F-蛋白的水核心脂囊泡。

23．如权利要求15-22任一所述的组合物，其中的寡核碱基包括：

a．第一和第二同源区域，它们总共的全长至少为16且不超过60个核碱基，该区域与哺乳动物的靶基因同源；以及

b．一个介于第一和第二同源区域之间的异源区域，其全长至少有1个且不超过20个核碱基，该区域与靶基因异源并且其含有变化。

24．一种在患者中治疗和/或预防的方法，其包括通过引入选自以下的替代：(Arg→Cys)¹¹²，(Arg→Cys)¹⁵⁸和(Cys→Arg)¹⁵⁸，来改变该患者肝细胞内的Apo E基因。

25．如权利要求24中所述的方法，其中的患者是Apo E4的纯合体并且该改变包括替代(Arg→Cys)¹¹²。

26．如权利要求24或25中所述的方法，其包括施用一种具有包括序列编号22的序列的嵌合突变载体。

27．如权利要求24中所述的方法，其中的治疗或预防包括降低该患者的禁食血清LDL胆固醇的水平，其改变包括替代(Arg→Cys)¹⁵⁸。

28．如权利要求24或27所述的方法，其包括施用一种具有包括序列编号23的序列的嵌合突变载体。

29．如权利要求24中所述的方法，其中的患者患有Ⅲ型高脂血症，其改变包括替代(Cys→Arg)¹⁵⁸。

30．如权利要求24或29中所述的方法，其包括施用一种具有包括序列编号24的序列的重组诱发剂寡核碱基。

31．一种改变人的Apo E基因的组合物，其包括的重组诱发剂寡核碱基具有的序列包括序列编号22-25或其互补物中任一的至少21个核碱基片段的序列。

32．一种在患者体内改善动脉硬化症的方法，其包括改变该患者肝细胞内的Apo A1基因，以使该改变的Apo A1蛋白形成二聚体。

33．如权利要求32中所述的方法，其进一步包括的步骤是确定在该患者体内的Apo A1基因的改变对HDL水平的影响，以及随后调整改变的Apo A1基因在该患者体内的数目。

34．如权利要求32中所述的方法，其中被改变的基因编码的蛋白中半胱氨酸替代精氨酸，其位点选自以下位置的残基中：149、151、153、171和173。

35．如权利要求34中所述的方法，其中的方法包括施用一种具有包括序列编号54、编号55、编号56、编号57和编号58的至少20个核苷酸序列的序列的重组诱发剂寡核碱基。

36．如权利要求35中所述的方法，其包括的步骤有对该患者施用含有以下组分的组合物：

a)重组诱发剂寡核碱基；

b)一种水性；以及

c)一种选自以下群体的大分子载体：

(ⅰ)一种水核心的脂囊泡，其中的水核心含有寡核碱基，

(ⅱ)一种脂质微球体，其包括一个寡核碱基的亲脂型盐，以及

(ⅲ)一种具有的平均分子量为500道尔顿到1.3Md的多聚阳离子，其中的多聚阳离子和寡核碱基一起形成了一种盐。

37．如权利要求36中所述的方法，其中的大分子载体是带负电荷的、水核心的脂囊泡。

38．如权利要求36中所述的方法，其中的大分子载体进一步包括网格蛋白包被的凹陷受体的配基。

39．如权利要求38中所述的方法，其中的网格蛋白包被的凹陷受体是一种脱唾液酸糖蛋白受体。

40．如权利要求32中所述的方法，其包括对该患者使用一种含有以下组分的组合物：

a)一种重组诱发剂寡核碱基；

b)一种水性；以及

c)一种选自以下群体的大分子载体

(ⅰ)一种水核心的脂囊泡，其中的水核心含有寡核碱基，

(ⅱ)一种脂质微球体，其包括一种寡核碱基的亲脂型盐，以及

(ⅲ)一种具有的平均分子量为500道尔顿到1.3Md的多聚阳离子，其中的多聚阳离子和该寡核碱基一起形成盐。

41．如权利要求40中所述的方法，其中的大分子载体是带负电荷的、水核心的脂囊泡。

42．如权利要求40中所述的方法，其中的大分子载体进一步包括一种网格蛋白凹陷受体的配基。

43．如权利要求42中所述的方法，其中的网格蛋白凹陷受体是一种脱唾液酸糖蛋白受体。

44．一种用于修饰人Apo A1基因的组合物，其包括一种寡聚核基碱基，该寡核碱基含有的序列所包括的片段具有选自包括序列编号54、编号55、编号56、编号57和编号58的的群体的序列。

45．如权利要求44中所述的组合物，其进一步包括：

a)一种水性；以及

b)一种选自含有以下组分的群体的大分子载体

(ⅰ)一种水核心的脂囊泡，其中的水核心含有寡核碱基，

(ⅲ)一种具有的平均分子量为500道尔顿到1.3Md的多聚阳离子，其中的多聚阳离子和寡核碱基一起形成盐。

46．如权利要求45中所述的组合物，其中的大分子载体进一步包括网格蛋白包被的凹陷受体的配基。

47．如权利要求46中所述的组合物，其中的网格蛋白包被的凹陷受体是选自转铁蛋白、烟酸、肉毒碱、胰岛素和胰岛素样生长因子-1的受体。

48．如权利要求46中所述的组合物，其中的网格蛋白包被的凹陷受体是一种脱唾液酸糖蛋白受体。

49．如权利要求45-48任一所述的组合物，其中的大分子载体是带负电荷的、水核心的脂囊泡。

50．如权利要求46-48任一所述的组合物，其中的水核心脂囊泡进一步包括脑苷脂。

51．如权利要求45-50任一所述的组合物，其中的水核心脂囊泡包括二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰丝氨酸。

52．如权利要求46、48、49和51的任一所述的组合物，其中的大分子载体是一种含有融合诱发剂的F-蛋白的水核心的脂囊泡。