CN1295129A - 利用转基因番茄生产人胰岛素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以转基因番茄为生物反应器生产人胰岛素。依据植物偏爱的原则设计胰岛素基因密码子,人工合成该基因并将其置于果实专一性高表达启动子下游转入番茄。番茄果实产生大量人胰岛素不仅可以成为口服产品,用于防治某些类型的糖尿病,亦可提纯胰岛素,做成注射剂。定位重组系统对基因调控技术的应用及控制植物激素在种子发育中表达,使此种番茄种子败育,或种子虽可育,其中胰岛素基因已被删除,避免后代种子被重复利用。
Description
本发明是利用番茄果实做为一种植物生物反应器来制造人胰岛素。这种人胰岛素可以通过生吃番茄，做为一种口服制剂通过消化道上皮粘膜进入血液循环。同时也可以从这种番茄果实提取高表达量的人胰岛素，而获得注射用人胰岛素。
本发明的主要创新之点在于(1)选用植物偏爱的密码子，人工合成人胰岛素基因，(2)采用番茄果实专一性启动子，使胰岛素的表达部位集中于果实，而且含量很高；(3)定位重组系统对外源基因的调控和植物激素在种子发育过程中受到调节，使生产胰岛素的番茄果实不含有可以继续种植的种子，或种子胚胎中的人胰岛素基因已被删除。这一技术不但防止了人胰岛素基因以某种方式进入普通番茄，并且保证了人胰岛素番茄生产者的持久经济利益。
生物反应器是近来未许多生物技术研发部门十分关注的领域。诸如奶牛、奶山羊乳腺生物反应器生产人的生长因子。在植物生物反应器研究中利用马铃薯块茎生产乙肝疫苗的研究受到广泛的重视。番茄做为可生食的蔬菜或果品，用它来生产口服的多肽类药物具有很大的应用潜力。人胰岛素对于胰岛素依赖的尿病患者的治疗是十分重要的。某些糖尿病患者的代谢调节与自体免疫功能相关。
口服胰岛素已被证明对某些类型的尿病治疗是有效的〔Reddy S etat，Panereas 2000，20(1)：55-60；Ploix C et at，Diabetes1999，48(1)2150-6；Ramiya VK，Maclaren NK，Horm Res 1997，48 suppl 4：67-70〕
本项发明的技术要点之一是胰岛素基因的人工合成。之所以不采用天然人胰岛素的DNA序列，是因为我们采用植物偏爱的密码子可提高该基因在植物中的表达量。我们所用的人胰岛素基因编码了天然胰岛素A链和B链的氨基酸顺序，但DNA顺序与天然人胰岛素基因的DNA顺序并不相同。
本项发明的要点之二是关于番茄果实专一性启动了的克隆及应用。文献中已有的番茄果实专一性启动子的资料(Mark JJ et at，1993 Plant Mol Biol21：625-640〕，其中包含了4Kb的核苷酸序列。我们合成并设计了一对引物扩增851bp的序列。实验证明这一启动子区域不仅具有十分特异的果实专一性，而且表达量明显高于通用的组成型表达启动子CaMV35S。
本项发明的要点之三是利用定位重组系统(Cre-Lox，FLP-FRT，及R-RsGin-gix)来控制外源基因(果实专一性启动子驱动下的人胰岛素基因)在子代中的行为。这种定位重组系统的应用原理在Odell JT and BussellSH，Rusell：Use of Site-Specific Recombination Systems in Plants，J Passkowski(ed)Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants219-270及本项发明申请人的著述(《定位重组系统在外来基因活性调控中的应用》见于林忠平等编：《走向21世纪的植物分子生物学》，科学出版社P66-71)中曾有过叙述，但在本项申请中的实验设计却是新颖的。我们使果实专一性启动子与人胰岛素的融合基因处于两个同向的可被重组酶(如Cre)识别的位点(如lox P)之间。同时在另外一个亲本中设计了被阻断的重组酶基因(如Cre)，此基因的阻断序列(blocking fragment)的上游端具有胚胎发育专一性启动子。当阻断序列在物理的(如热激处理)或化学的(如铜离子诱导)基因表达调控系统的作用下被删除时，重组酶基因便开始工作，在重组酶的识别和催化下，果实专一性启动子驱动的人胰岛基因便被删除。所以F1代番茄植株的果实中含有人胰岛素基因及其表达产物，而在其种子(F2)中胰岛素融合基因已被删除。
上述发明的要点之四是将番茄果实专一性启动子人胰岛素基因所构成的融合基因置于亲本之一。同时在第二个亲本中设置了胚珠发育特异性启动子驱动下的植物激素调控基因或致死基因。两个亲本交配之后，F1代果实可以产生胰岛素，但不能形成可育的种子。为了使生产过程中的实际操作变得更加易行。我们使第一个亲本中还携有一个重组酶基因(如Cre)；在第二个亲本中使植物激素调控基因或致死基因处于被阻断的状态下，在阻断序列两端设置了识别位点(如lox P)这样两个亲本均能正常繁殖后代。而它们的杂交后代便因植物激素调控基因或致死基因的激活，虽能结果却不能形成可育的种子。
在这里植物激素调控基因可以是来自农杆菌T-DNA的异戊烯基转移酶基因或吲哚乙酸合成相关基因iaa M，致死基因可以是来自芽孢杆菌的barnase基因。
其余技术要领包括农杆菌介导的对番茄的遗传转化技术或其它的遗传转化技术，以及对胰岛素的分离和纯化技术，胰岛素的测定检验技术等。
在本发明的一个实施方案中，关于人胰岛素基因的合成，选用植物偏爱的密码子。为此在人胰岛素A链63个碱基中更换了13个碱基。在B链90个碱基中更换了18个碱基。在A链与B链之间我们设计了6个氨基酸的连接片段。此连接片段的氨基酸种类及顺序的设计原则是保持人胰岛素天然的三维结构特征。我们将人工合成的包含人胰岛素A链与B链及中间小段连接顺序克隆于pGEM-11Z载体中的EcoRI和BamHI位点，并经质粒酶切图谱的分析及序列分析加以确定，该质粒命名为pllZ-ins。在这一实施方案中，人胰岛素基因片段可以通过PCR扩增得到，扩增时，使用的引物见序列表中的序列1和2。
本发明的一个实施方案中，我们将人胰岛素基因置于番茄果实专一性表达的启动子(P2a12)的调控之下，完成一个中间载体的构建之后，再置于一种双元表载体中(见图1)。PCR程序扩增该启动子的引物见序列表中序列3和4。
在本发明的一个实施方案中，人胰岛素基因置于组成型表达启动子CaMV35S启动子的调控之下。再转入中间载体中。再进一步转入双元表达载体，完成一个植物表达载体的构建(见图2)。
在本发明的一个实施方案中，采用定位重组系统Cre-lox及FLP-FRT来控制胰岛素基因在F2代的删除，(见图3)。
在本发明的一个实施方案中通过异戊烯基转移酶(ipt)基因在种子发育过种中的过量表达，造成种子败育。这一技术在文献(Nadia Ficcadenti etad 1999 Molecular Breeding 5(5)463-470)中曾有报道。但利用重组系统控制植物激素的表达，造成种子败育，使F2代种子不能再利用是本发明的一处创新。这一技术的应用使含胰岛素的番茄的生产过程得到有效的控制。使人胰岛素基因比较方便地保持在一定的品种中和一定的亲本中。这种实施方案见4图所示。
Claims (9)
1、本发明为番茄果实生产人胰岛素的方法。该方法利用人工合成的外源的人胰岛素基因在
番茄中在果实专一性启动子或其他高效表达启动子的驱动下表达，这时包含了人胰岛素
基因通过转基因的途径导入番茄，并在果实和其它可食用部位大量表达。这种外源导入
的基因存在于适当的亲本中，再传递到子代(F1代)，与此同时利用定位重组系统使这种
产生人胰岛素的基因转录单位在F2代被删除掉或且利用激素调控基因(如iaa M基因，ipt
基因)或某种可致死的基因(如某种RNase基因)阻止F2代种子的正常发育。这种人胰
岛素基因表达的植物，应不仅限于番茄，应可扩展到其它蔬菜类和瓜果类作物如黄瓜、
西瓜、甜瓜、茄子、黄瓜、南瓜等。还应扩展到其它水果类植物，如香蕉、苹果、梨、
菠萝等。还应扩展到块根、块茎类植物，如胡罗卜、萝卜、甘薯、木薯、马铃薯等。
2、权利要求第1项中关于人工合成的人胰岛素基因。该基因的人工合成，将不仅限于植物
偏爱的密码子的使用(包括单子叶植物偏爱密码子的使用和双子叶植物偏爱密码子的使
用)，应扩展到有利于表达量提高及更有效的人胰岛素基因结构的改造。
3、权利要求2中关于基因结构的改造应扩展到关于人胰岛素A链与B链之间的连接关系。
包括A链和B链之间自主的断裂结构的设计，以及将A链和B链编码顺序分别放在不
同的转录单位之中。
4、权利要求1所涉及启动子的应用不仅限于番茄果实专一性启动子，也包括其它器官中高
水平表达的启动子，如块茎根或其它贮藏器官(如种子)可大量表达的启动子，虽然不
是专一性表达的启动子。
5、权利要求1的叙述中关于定位重组系统的应用包括Cre-lox、FLP-FRT、R-RS及Gin-gix
四种定位重组系中单独应用一种系统也包括不同种定位重组系统的配合应用。
6、权利要求1中不仅涉及番茄一种植物。在应用于番茄时，我们已采用的实施方案中将
外源基因置于不同的亲本中，通过杂交一代(F1)来获得商业应用的胰岛素。在不同植
物中应用时，将不限于把外源基因分置于两个亲之中，可以把外源基因同时或先后置于
同一植株中，再通其它基因调控途径，达到高效的可调控的制造人胰岛素。
7、权利要求1和5的叙述中涉及控制人胰岛素基因在F2代种子中不能被再利用的方法。
种子不是唯一的繁殖器官。这种通过定位重组系统删除特定目标DNA的方法，应可延伸 到其它的组织和器官。
8、权利要求1和4。在采用激素调控基因或导致植物组织衰退的基因(如RNase基因)时，也不应限于在种子部位的表达，应包括其它一些器官(如芽或再生芽)的表达。
9、权利要求1提到的人工合成的人胰岛素基因的表达产物。这种基因表达产物应扩展到对人胰岛素受体部位起作用的人胰岛素类似物或其它多肽产物。
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