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CN1294597A - 使用胰岛素的肽类似物治疗糖尿病的方法 - Google Patents

使用胰岛素的肽类似物治疗糖尿病的方法 Download PDF

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CN1294597A
CN1294597A CN99804276A CN99804276A CN1294597A CN 1294597 A CN1294597 A CN 1294597A CN 99804276 A CN99804276 A CN 99804276A CN 99804276 A CN99804276 A CN 99804276A CN 1294597 A CN1294597 A CN 1294597A
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Abstract

本发明涉及胰岛素(B)链的肽类似物,这些类似物总体上是由包含胰岛素天然(B)链序列的残基(9至23)的肽衍生而成。该类似物在位置(12,13,15)和/或(16)上与天然序列不同,另外还可以在位置(19)和/或其它位置上变动。提供了含有这些肽类似物的药物组合物。这些肽类似物可用于治疗和抑制糖尿病的发展。

Description

使用胰岛素的肽类似物治疗糖尿病的方法
技术领域
本发明总体上涉及胰岛素的肽类似物，更具体地涉及使用人胰岛素B链的残基9-23衍生的肽类似物治疗糖尿病的方法。
发明背景
依赖于胰岛素的糖尿病(IDDM)是一种器官特异性的自身免疫疾病，影响了一百万左右不同年龄段的美国人。这种病的特征在于广泛破坏产生胰岛素的胰岛β细胞以及葡萄糖代谢失调导致症状明显的糖尿病。IDDM的判定特点是胰岛的淋巴细胞渗入。在侵染细胞中，T细胞似乎是自身免疫危害的一种主要介导物。
Ⅰ型糖尿病的特征还在于针对包括胰岛素、GAD65、GAD67和ICA512的各种胰岛相关抗原的抗体水平上升。在远先于病症凸现时就能检测到这些抗体，并且针对这些抗原的免疫应答可以作为易感的遗传(HLA)单元型患者将发生糖尿病的前兆。
目前，患者依赖于注射胰岛素来维持血糖量正常。胰岛素是一种多肽激素，包含两个二硫键连接的链，其中A链含有21个氨基酸残基，B链含有30个残基。虽然施用胰岛素对糖尿病患者很有益，但要保持合适的剂量有困难，因为胰岛素在血清中半衰期很短。胰岛素的使用还导致各种低血糖的副作用和中和抗体的产生。
考虑到与现存糖尿病疗法相关的问题，迫切需要更加有效并排除这些不利因素的改进疗法。本发明探索了使用肽类似物对抗T细胞对胰岛素的应答以有效治疗糖尿病，同时还提供了其他相关的优点。
发明概述
本发明提供了治疗和预防糖尿病的化合物和方法。在某些方面，本发明提供了包含人胰岛素B链的残基9-23(SEQ ID No：2)的肽类似物，其中该肽类似物由于在1到4个氨基酸位置处的取代而与天然人胰岛素B链残基9-23在序列方面有不同。可以在选自残基12、13、15和16的一个或多个残基处进行这类取代，在其它残基处可以有或没有另外的取代。在某些优选的实施方案中，可以在胰岛素B链的残基9-23中的两或三个氨基酸残基处进行这样的替代。取代还可以发生在残基19处。取代优选是非保守性的，优选其中残基12、13、15、16和／或19被取代(成为，例如丙氨酸)的类似物。还优选进一步包含胰岛素B链的残基24的类似物。在某些其它的实施方案中，肽类似物包含人胰岛素B链的不超过18、不超过16或不超过15个残基。
在另外的实施方案中，肽类似物基本包括人胰岛素B链的残基9-23或9-24(SEQ ID No：2)，其中该肽类似物由于在1到4个氨基酸位置处的取代而与天然人胰岛素B链残基9-23在序列方面有不同，其中至少一个取代发生在选自残基12、13、15和16的一个残基处。
在其他方面中，本发明提供了药物组合物，它们包含上述肽类似物以及生理上可接受的载体或稀释剂。
本发明还提供了治疗和／或抑制糖尿病发展的方法，包括将治疗有效量的上述药物组合物给予患者。
参考下列详述和附图，本发明的这些和其它方面是显而易见的。另外，以下提供的各种参考文献将更加详细地描述特定方法或组合物。这些参考文献此处全文引作参考，视作每篇是个别地引入作为参考文献。
附图简述
图1描述了胰岛素B链残基9-23(SEQ ID No：2)的氨基酸序列。
图2显示了存在不同量的由丙氨酸取代不同残基(如所示)的代表性肽类似物时，一种NOD鼠的T细胞克隆对天然胰岛素B链(9-23)肽的增殖反应(以cpm计)。
图3显示了存在不同量的由丙氨酸取代16和19位上的氨基酸的代表性的肽类似物(NBI-6024；用方块表示)时，一种NOD鼠的T细胞克隆对天然胰岛素B链(9-23)肽的增殖反应(以cpm计)。作为比较，也显示了存在髓鞘碱性蛋白质衍生的无关对照肽(NBI-5096；以圆圈表示)时的增殖反应。反应以三份培养物的平均CPM±SEM表示。
图4-6的直方图显示了各个不同的糖尿病患者其T细胞系对天然B链(9-23)肽或对代表性的肽类似物的增殖反应(以cpm计)。从糖尿病患者分离外周血单核细胞，并在有胰岛素B链(9-23)肽的情况下进行培养。经胰岛素B链(9-23)重复刺激三次后，将1×105的T细胞和7×104扩散的自体PMBCs加入到包含完全培养基的圆底96孔板的每一孔中。在有NBI-6024(有16和19位丙氨酸取代的胰岛素B链9-23)、胰岛素B链(9-23)或仅有培养基时，将细胞培养5天。第4天，细胞经3H-胸苷脉冲并继续培养18个小时。然后收集培养物，使用液体闪烁法计数，数据表示为重复样品的每分钟平均数(cpm)±平均标准误差(sem)。
图7的直方图显示了一个糖尿病患者的一种T细胞系对天然B链(9-23)肽或对如所示含丙氨酸取代的代表性肽类似物的增殖反应。从糖尿病患者分离外周血单核细胞并在有胰岛素B链(9-23)肽的情况下进行培养。用胰岛素B链(9-23)重复刺激三次后，将1×105的T细胞和7×104扩散的自体PMBCs加入到包含完全培养基的圆底96孔板的每一孔中。如所示在有类似物、胰岛素B链(9-23)或仅含培养基(BKG)时，将细胞培养5天。第4天，细胞经3H-胸苷脉冲并继续培养18个小时。然后收集培养物，使用液体闪烁法计数，数据表示为重复样品的每分钟平均数(cpm)±平标准误差(sem)。
图8显示了经代表性肽类似物治疗9个星期的NOD母鼠患糖尿病的百分比。从第24天开始，10只鼠中的每只用包含残基12(空心三角)、13(方块)或16(实心三角)处的丙氨酸取代的B链(9-23)的肽类似物通过皮下进行治疗。使用对照肽-神经降压肽(圆圈)治疗的所有小鼠都患上糖尿病。
图9显示与图8相同的数据，但仅用A13类似物治疗组与对照肽(神经降压肽)治疗组对比。
图10显示了经代表性的肽类似物治疗13周后患上糖尿病的NOD鼠的百分比。在第24天用400μg神经降压肽(方块)、B链(9-23){菱形}或在残基13处含丙氨酸取代的B链(9-23)的肽类似物(三角形)开始进行皮下治疗。
图11显示了代表性的肽类似物对NOD鼠糖尿病发病率的影响。使用20mg／kg的NBI-6024(A16，19)每周一次地对四周龄的NOD母鼠(n=9)进行皮下治疗，持续12周，此后每隔一周进行治疗直到35周龄。对照组(n=10)包括未治疗的动物。认为在连续两个时间点血糖高于200mg／dL的鼠患上糖尿病。数据表达为在35周的研究中非糖尿病的百分比。利用log-rank试验评估这两个治疗组的结果是否有显著区别。在不同时间点，经NBI-6024(A16，19)治疗后患糖尿病的NOD鼠的百分比用方块表示，对照组患糖尿病的鼠的百分比用圆圈表示。
图12显示了代表性的肽类似物对NOD鼠糖尿病发病率的影响。使用20mg／kg的NBI-6024(A16，19)或NBI-6201(对照肽，神经降压肽)每周一次地对四周龄的NOD母鼠(n=13-15)进行皮下治疗，持续12周，此后每隔一周进行治疗直到35周龄。另外的对照组(n=8)包括未治疗的动物。认为在连续两个时间点血糖高于200mg／dL的鼠患上糖尿病。数据表达为在35周的研究中非糖尿病的百分比。利用log-rank试验评估这两个治疗组的结果是否有显著区别。在不同时间点，经NBI-6024(A16，19)治疗后患糖尿病的NOD鼠的百分比用方块表示，经神经降压肽治疗后患糖尿病的百分比用三角形表示，对照组患糖尿病的百分比用圆圈表示。
图13A-13D显示了在残基12(图13A)、残基13(图13B)、残基15(图13C)或残基16(图13D)处有丙氨酸取代、包括B链残基9-23的代表性肽类似物的免疫原性。在检测淋巴结细胞对如图示中不同浓度的肽类似物或天然胰岛素B链(9-23)肽的增殖反应之前，用可溶形式的肽类似物对NOD鼠进行2-4次皮下注射。结束培养期后使用液体闪烁计数器测定在细胞中掺入的放射性胸苷的数量(以三个培养孔中的每分钟平均数(CPM)来作图)，以检测增殖反应。
图14A-14F显示六种不同的肽类似物在NOD鼠中的免疫原性。有两个丙氨酸取代的肽类似物(A12，13；A12，15；A12，16；A13，15；A13，16和A15，16，如图示)注射到NOD鼠中，使用不同浓度的免疫肽作为刺激剂，10天后其淋巴结细胞用于增殖测定。结束培养期后使用液体闪烁计数器测定在细胞中掺入的放射性胸苷的数量，以检测增殖反应(以三个培养孔中的每分钟平均数(CPM)来作图)。
图15A-15D显示了胰岛素B链(9-23)的代表性双取代的肽类似物的免疫原性。测定下列肽诱发NOD鼠中的免疫反应的能力：A12，19(图15A)；A13，19(图15B)；A15，19(图15C)；A16，19(图15D)。以每分钟外排的淋巴结细胞计数表示的增殖反应是对免疫类似物和对天然胰岛素B链(9-23)肽的免疫应答。
图16显示了一系列三取代的肽引起NOD鼠的T细胞增殖反应的能力。用含下列取代组合的代表性肽类似物分别对小鼠进行免疫：A12，13，19；A12，15，19；A12，16，19；A13，15，19；或A13，16，19；A15，16，19。然后在增殖测定中使用了淋巴结细胞，图中显示了对不同浓度的每一个免疫肽的反应。
图17A和17B显示了双取代的肽(A16，19)引发免疫反应的能力。在第1，6和12天用20mg／kg的可溶性NBI-6024对五只NOD母鼠进行皮下免疫。在第15天，将鼠处死，取出腹股沟的淋巴结细胞并在有不同浓度(0-50μM)的NBI-6024(图17A)或胰岛素B链(9-23)肽(图17B)的情况下进行培养。利用H3-胸苷的掺入测定T细胞增殖程度。以三份培养物的平均CPM±SEM表示反应。
图18的直方图显示了有或没有佐剂时，由A16，19(NBI-6024)肽诱导的免疫细胞产生的细胞因子的比较。单独使用NBI-6024或与CFA乳化后免疫各组NOD鼠。在NBI-6024的浓度为25μM时，扣除其本底值后，测定如图示的细胞因子IL-2和IL-4并表示为pg／ml。
发明详述
在阐述本发明之前，对于它的理解和提供文中所用某些术语的定义是有益的。
“胰岛素B链”指一条30个氨基酸的多肽，它是组成胰岛素的两条二硫键连接的多肽中的一条。在SEQ ID NO：1中提供了人胰岛素B链的序列，并在图1和SEQ ID NO：2中提供了人B链的残基9-23的序列。
胰岛素B链的“肽类似物”包括从人胰岛素B链的残基9-23(SEQID NO：2)衍生的至少15个氨基酸残基，并且类似物和天然B链之间在氨基酸序列方面至少有一个不同。在肽类似物的氨基酸序列中，在残基12，13，15和／或16处至少有一个不同。另外，可以取代残基19，并且还可以进行其它的变化。相对于天然的胰岛素B链(9-23)序列来说，优选的肽类似物在残基9-23中包括1到4个取代，虽然更大数量的取代(例如5或6)是可能的。也可以包括胰岛素B链衍生的额外残基，达到天然B链的30个残基的全长，优选达到肽类似物总共25个残基，更优选达到总共16或18个残基。在优选的一种实施方案中，肽类似物中还包括胰岛素B链的残基24。不是从胰岛素B链衍生的序列可以，但没有必要出现在肽类似物的氨基端和／或羧基端。例如可以使用这样的序列来促进肽类似物的合成、纯化或溶解。
除非另外说明，所谓的氨基酸指L-型。在天然肽序列中的一个L-型氨基酸可以变更为在蛋白质中常见的20种L-氨基酸中的任何一个，相应的D-氨基酸中的任何一个、稀有氨基酸如4-羟基脯氨酸或羟基赖氨酸，或非蛋白质氨基酸如β-丙氨酸或高丝氨酸。本发明的范围还包括含有已改变的氨基酸的类似物，这些氨基酸是通过下列方法改变的：化学方法如甲基化(如α-甲基缬氨酸)；通过一种烷基胺如乙基胺、乙醇胺或乙二胺对氨基酸的羧基端进行酰胺化；和／或酰化或甲基化一个氨基酸的侧链功能基团(如酰化赖氨酸的ε氨基)改变类似物的氨基酸。
“残基12”、“残基13”、“残基15”、“残基16”和“残基19”(也分别称为12位、13位、15位、16位和19位)指如图1所示的胰岛素B链的氨基酸12、13、15、16和19。更明确地说，这些残基的编号系统与天然的人蛋白质内的氨基酸位置有关，与肽类似物的长度或类似物中氨基酸的位置无关。在残基12、13、15或16处有丙氨酸取代的肽类似物分别被命名为A12、A13、A15和A16类似物。胰岛素B链的肽类似物
如上所述，本发明提供了一些肽类似物，它们至少包括人胰岛素B链的残基9-23并包括将12位上天然存在的L-缬氨酸、13位上天然存在的L-谷氨酸、15位上天然存在的L-亮氨酸和／或16位的L-酪氨酸变更为另一个氨基酸的一个变化。在一种实施方案中，肽类似物包括胰岛素B链12、13、15、16和／或19位上一到三个L-氨基酸的额外变化。优选的肽类似物包含两到三个变化，其中取代的残基之一是在19位上。
胰岛素B链衍生的肽类似物部分的典型长度是15-30个残基，优选15-18个残基，更优选15-16个残基。特别优选的肽类似物含有胰岛素B链衍生的15个氨基酸。
上已提及，包括在上述位置上的任何氨基酸变更的肽类似物均属于本发明的范围。优选的肽类似物含有非保守性的取代(如变成在电荷、极性、疏水性和／或体积上有差异的氨基酸)。特别优选的肽类似物包括一个或多个残基变为丙氨酸。
肽类似物可以通过包括自动合成在内的标准化学方法合成。一般地说，可以通过固相肽合成方法制备肽类似物，该方法涉及将受保护的每个氨基酸残基偶联到树脂支持物上，优选4-甲基-二苯甲基胺树脂，经二环己基羰二亚胺激活以产生带C末端酰胺的肽。或者可以使用一种氯甲基树脂(Merrifield树脂)以产生带C末端游离羧酸的肽。可以如下所述保护侧链官能团：苄基保护丝氨酸和苏氨酸；环己基保护谷氨酸和天冬氨酸；对甲苯磺酰基保护组氨酸和精氨酸；2-氯苄氧羰基保护赖氨酸和2-溴苄氧羰基保护酪氨酸。偶联后，被添加的氨基酸的α氨基上的保护基团叔丁氧基羰基可以经三氯乙酸处理后，再用二异丙基乙胺中和而除去。下一个受保护的残基再被偶联到游离氨基上，从而延伸肽链。在连接上最后一个残基后，使用氟化氢处理受保护的肽-树脂以便肽从树脂上脱离，并对侧链官能团脱保护。利用已知的方法，通过凝胶过滤、HPLC、分配色谱或离子交换层析对粗产品进行进一步纯化。
本发明的肽类似物(a)不会刺激对天然胰岛素B链(9-23)肽(SEQID No：2)有特异性的NOD鼠T细胞克隆，或者其对这些克隆的刺激程度应低于天然肽；(b)不应刺激患者产生胰岛素B链(9-23)特异性的人T细胞；(c)在NOD鼠中具免疫原性；(d)应降低NOD鼠糖尿病的发病率和(e)可以抑制对天然胰岛素B链(9-23)肽(SEQ ID No：2)特异性的T细胞克隆的反应。因此可以通过检测T细胞增殖、在NOD鼠中的免疫原性和对NOD鼠糖尿病发病率的影响的检测法来对侯选肽类似物治疗糖尿病的能力进行筛选。下面将详细讨论用于评估侯选肽类似物的某些代表性的检测。那些满足上述标准的类似物是有用的治疗剂。
首先可以测试侯选肽类似物刺激天然胰岛素B链(9-23)肽(SEQID NO：2)(来自克隆细胞系或分离自患者)特异性的T细胞的能力。利用其中天然B链(9-23)反应性T细胞系或分离自患者的T细胞作为靶细胞的直接增殖测试来进行这样的试验。通常，使用熟知的技术，可以由取自注射了B链(9-23)的大鼠的淋巴结建立T细胞系。可分离淋巴结细胞并用B链(9-23)和IL-2培养5到8天。收集存活细胞，用B链(9-23)和扩散的脾细胞作为生长因子的来源进行第二轮刺激。以这种方式5到6次传代后，测定每一个细胞系的增殖潜力。使用不同浓度的肽类似物和扩散的自体脾细胞培养与B链(9-23)反应的T细胞系3天，以进行增殖测定。三天后，加入0．5-1．0μCi的[3H]-胸苷达12-16小时。然后收集培养物并测定掺入数量。根据三份培养物计算平均CPM和平均值的标准误差。如其结果小于可比浓度的B链(9-23)的平均反应的三个标准偏差，则认为这些肽类似物是没有刺激性的。当其浓度低于或等于20-50μM时，不刺激增殖的肽类似物可适用于进一步的筛选。
进一步测试不刺激B链(9-23)特异性的T细胞、并优选在体外抑制这样的T细胞反应的侯选多肽在NOD鼠中的免疫原性。简短地说，在10-15天的时间内，用100-400μg溶于甘露糖醇乙酸盐缓冲液中的侯选肽对各组NOD鼠通过皮下免疫三次。最后一次免疫后，使用淋巴结细胞和／或脾细胞进行增殖检测，检测中，用不同浓度的免疫肽与细胞一起培养3-4天。使用含氚胸苷进行最后18个小时的培养。然后可以收集细胞并在闪烁计数仪中计数，增殖反应可表达为CPM±SEM。认为肽浓度为25μM时，诱导至少高于背景(无抗原)两倍以上增殖的侯选肽具免疫原性。或者，如果经完全弗氏佐剂免疫NOD小鼠后侯选肽类似物能诱发增殖反应，则认为它具免疫原性。外排的淋巴结细胞或脾细胞，在有免疫类似物存在下培养时，在25μM的肽浓度下应该诱导比背景(无抗原)至少高两倍的增殖。
进一步测试能抑制B链(9-23)诱导的增殖的侯选肽降低NOD鼠糖尿病发病率的能力。简短地说，肽可以可溶形式或与例如不完全弗氏佐剂(IFA)乳化后对NOD鼠进行用药。通常一周约400μg肽的药量是足够的。然后通过每周监测血糖水平以检查治疗小鼠以及未治疗或对照小鼠糖尿病的发生率。通常认为在连续两次的测试中血糖值为200mg／dl或更高是发生糖尿病的征兆。在最多大约25周的监测时间内，肽类似物应导致NOD鼠发生糖尿病百分比的统计学上显著的降低。
如上所述，肽类似物还可以在体外抑制B链(9-23)特异性的人T细胞的反应。通过测试侯选肽类似物抑制天然B链(9-23)(SEQ IDNO：2)诱导的T细胞增殖的能力的竞争性检测来衡量这样的抑制作用。在这种检测中，抗原呈递细胞首先扩散，然后与竞争的肽类似物和天然B链(9-23)肽一起培养。随后将T细胞加入到培养物中。培养物中含有不同浓度的侯选肽类似物，总共可培养4天。培养期结束后，每一个培养物经例如1μCi的[3H]-胸苷脉冲额外的12-18小时。然后可以在玻璃纤维滤器上收集培养物并如上计数。利用三份培养物测定的数据可计算平均CPM和平均值的标准误差。优选在浓度为20-50μM时降低增殖至少25％的肽类似物。
糖尿病的治疗和预防
如上所述，本发明提供了将治疗有效量的本文所述的胰岛素B链的肽类似物给患者用药以治疗和预防Ⅰ型糖尿病的方法。可以通过此领域接受的、为临床确诊糖尿病建立的标准来确定适合这种治疗的糖尿病患者。这样的标准包括但不限于在一次静脉内葡糖耐受试验(IVGTT)后出现低的(少于对照的十分之一或第一个百分位)第一阶段的胰岛素分泌或持续出现胰岛抗原如胰岛素、GAD65和／或ICA512的高滴度抗体。
一般可以通过此领域已接受的任何预测性标准来鉴别可从预防性治疗获益的临床没有确诊的患者。根据以下标准可以预言糖尿病症状不明显的患者将来(1-5年)将发展为糖尿病：ⅰ)家族史-直系亲属自动列于高危组，除非他们有保护性的HLA等位基因；ⅱ)遗传补偿-如存在或缺乏与糖尿病高危险性相关的一种HLA等位基因(如DR3／4；DQ8)；ⅲ)在他们的血液中存在或缺乏针对任何或所有以下抗原的高滴度的自体抗体：胰岛素、GAD65和／或ICA512；和ⅳ)静脉葡糖耐受试验(IVGTT)：第一阶段低胰岛素分泌，通常定义为低于正常对照的十分之一或第一个百分位，一般在发展成为Ⅰ型糖尿病的1-5年前。通常可以考虑上述标准中的几个。例如，对患糖尿病个体的直系亲属5年内发展成为糖尿病的可能性做如下估计：有上述全部3种自体抗体的亲属为100％；有两种抗体的亲属为44％；有一种抗体的亲属为15％；没有抗体的亲属为0．5％。在Ⅰ型糖尿病患者的50个直系亲属中(跟踪至糖尿病的发作)，49／50表现出一种或多种上述的自体抗体。
利用几种不同的方法来确定糖尿病的有效治疗。满足下列标准的任何一种，或此领域已接受的其它标准可验证有效的治疗。标准包括但不限于推迟明显高血糖的发生、高血糖症发作频率的降低和／或患者血液中C肽正常水平的延长。
本发明的肽类似物可以单独用药，或作为药物组合物用药。简短地说，本发明的药物组合物可以包括与一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的一种或多种本文所述的肽类似物。这样的组合物可以包括如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水和类似的缓冲液、如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇的糖类、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)和防腐剂。另外，本发明的药物组合物还可以包括额外的一种或多种活性组分，如持续送递系统或其它的免疫增强剂。
本发明的组合物还可以以标明的用药方式制定配方，方式包括如经口、鼻、静脉、颅内、腹膜内、皮下或肌内用药。在本发明的其它实施方案中，所述的组合物可以作为持续释放植入物的一部分用药。在其它的实施方案中，利用合适的赋形剂以保证冷干剂和／或重新水化后的稳定，本发明的组合物可以作为冷干剂来配制。
本发明的药物组合物可以以适合所治疗(或预防)疾病的方式进行用药。根据如患者的病情、患者疾病的类型和严重性等因素决定用药的量和频率。在本发明特别优选的实施方案中，肽类似物的用药剂量的范围可以从0．1到100mg／kg，虽然通过临床试验可以确定合适的剂量。通过如上所述的症状明显的糖尿病发生的延迟和为保持血糖量正常持续使用胰岛素的降低来监测对患者治疗的有效性。
以下的实施例用于例证，而非限制。
                      实施例1
                      肽的制备
此实施例阐述了代表性肽类似物的合成。
通过固相法在一种肽合成仪(Beckman 990型)上合成肽。使用一种对甲基二苯甲基胺树脂(MBHA树脂)制备带酰胺化羧基端的肽；对于带游离羧基端的肽，使用一种与适当保护的氨基酸偶联的Merrifield树脂。从Bachem Fine Chemicals(Torrance，CA)购得这两种树脂。除非特意说明，合成中使用的衍生化氨基酸(Bachem FineChemicals)均为L-构型，并且N-α-氨基官能无一例外地使用叔丁氧羰基予以保护。如下所述保护侧链官能团：苄基保护丝氨酸和苏氨酸；环己基保护谷氨酸和天冬氨酸；对甲苯磺酰基保护组氨酸和精氨酸；2-氯苄氧羰基保护赖氨酸和2-溴苄氧羰基保护酪氨酸。根据Ling等人(美国科学院学报81：4302，1984)的方法，使用二环己基羰二亚胺将羧基端的氨基酸偶联到MBHA树脂上，随后的氨基酸与二环己基羰二亚胺偶联。在连接上最后一个氨基酸后，除去叔丁氧羰基保护基团，肽-树脂结合物用14ml氢氟酸(HF)、1．4ml苯甲醚和0．28ml甲基乙基硫醚的混合物(对每克树脂结合物的用量)在-20℃处理0．5小时，然后在0℃处理0．5小时。在0℃和真空下除去氢氟酸，用二乙醚洗涤所得肽和树脂的混合物两次，然后用氯仿和二乙醚轮流洗涤两次。肽经2M的乙酸抽提五次，并将抽提物冷冻干燥。冷干后的产物首先在30％乙酸中展开的Sephadex G-25 fine(Pharmacia-LKB，Piscataway，NJ)柱上纯化以除去截短的片段和无机盐(Ling等，1984)。肽接着经CM-32羧甲基纤维素阳离子交换层析法纯化(Ling等，1984)。利用分配层析在Sephadex G-25 fine上完成最后的纯化(Ling等，1984)。或者通过制备型HPLC在Biotage KP-100梯度HPLC系统上可以纯化粗肽。合成产物通过氨基酸分析、质谱分析和反相HPLC进行鉴定。
              实施例2
            长期T细胞系
此实施例阐述了胰岛素特异性的长期NOD T细胞系的制备。
当存在作为抗原呈递细胞和细胞因子的扩散性NOD脾细胞时，经25μg／ml猪胰岛素或扩散的NOD胰岛细胞的体外刺激，通过培养分离自胰岛渗入群体的淋巴细胞以建立胰岛素特异性的NOD T细胞系。为获得渗入的淋巴细胞进行以下操作(参见Wegmann等，欧洲免疫学杂志24：1853，1994)：用胶原酶消化NOD鼠的胰腺并手工分离各个胰岛。然后通过胰蛋白酶温和消化胰岛获得渗入的淋巴细胞。当存在NOD脾细胞、猪胰岛素和淋巴因子时进行系列刺激以增殖胰岛素特异性的T细胞系或克隆。当存在抗原呈递细胞和25μg／ml猪胰岛素时有限稀释B链(9-23)特异性的T细胞系而获得这些克隆。有限稀释后带有正在生长的细胞群的那些孔在合适的培养基中得以扩张，一轮生长过后，通过评估增殖反应来试验其对胰岛素的B链(9-23)肽的反应性。
                      实施例3
    肽类似物对胰岛素特异性NOD T细胞克隆增殖的影响
此实施例阐述了代表性的肽类似物对T细胞增殖的影响。
如实施例2所述，从渗入的胰岛中分离胰岛素B链(9-23)(SEQ IDNO：2)特异性的鼠(NOD)T细胞克隆。如实施例1所述制备含单丙氨酸取代的肽类似物。然后利用在96孔平底微量滴定板中进行的检测评价每一个类似物对T细胞增殖的影响(参见Daniel等，欧洲免疫学杂志，25：1056，1995)。简单地说，当存在50μg／ml的胰岛素B链9-23肽或下文中列出的任何丙氨酸取代的肽时，培养三份25000个T细胞克隆和一百万个扩散的NOD脾细胞。在7％CO2气氛中温育滴定板共72小时，在最后的6-8小时用1μCi／孔的含氚胸苷脉冲。在玻璃纤维滤器上收集细胞并在液体闪烁计数器中计数相关的放射性。结果用三份小孔中每分钟平均数量来表示。
当存在下列丙氨酸取代的类似物时：A12、A13、A15、A16、A17和A18，从五个独立的T细胞克隆中获得的数据显示没有增殖或增殖明显减少(相对于胰岛素B链的9-23天然肽；SEQ ID NO：2)。在下面的表1和表2中给出这些数据。
                表1胰岛素特异性的NOD T细胞克隆的反应(cpm)
    T细胞克隆
修饰的位置 天然残基 取代  PD6-4．3  PD12-2．40
 9  S  A  12861  42234
 10  H  A  12507  1409
 11  L  A  14148  2594
 12  V  A  8292  671
 13  E  A  142  519
 14  A 无
 15  L  A  161  1422
 16  Y  A  98  539
 17  L  A  553  19321
 18  V  A  234  44785
 19  C  A  7678  34212
 20  G  A  2440  38685
 21  E  A  91  39087
 22  R  A  6555  51722
 23  G  A  14304  75441
无抗原 163  682
天然9-23  10463  32221
                    表2胰岛素特异性的鼠NOD T细胞克隆的反应(cpm)
修饰的位置 天然残基 取代     T细胞克隆
 PD12-4．4  PD12-4．29  PD12-4．34
 9  S  A  1000  18422  259
 10  H  A  823  15484  356
 11  L  A  474  18416  190
 12  V  A  1129  15041  194
 13  E  A  373  891  179
 14  A 无
 15  L  A  675  809  191
 16  Y  A  779  636  202
 17  L  A  332  1460  4360
 18  V  A  225  1193  721
 19  C  A  4295  6054  689
 20  G  A  1323  13736  466
 21  E  A  7900  4904  773
 22  R  A  1313  12635  1555
 23  G  A  3228  18422  791
无抗原 350  789  231
天然9-23  10000  14820  3614
表3显示了四种不同的NOD衍生T细胞克隆对双丙氨酸取代的肽类似物A16，A19(NBI-6024；16Y＞A／19C＞A)的反应。当存在50μM的天然B链(9-23)肽或NBI-6024时培养NOD T细胞克隆。表3中的数据代表了三份样品的均值±均值的标准误差。在表3中，S．I．(刺激指数)=肽存在时的增殖(cpm)／仅在培养基中的增殖(cpm)。这些数据显示了细胞与天然B链(9-23)肽一起培养时有明显的反应，而在存在NBI-6024时只在培养基上(背景)不增殖或增殖很少。
                    表3胰岛素B链(9-23)特异性的鼠T细胞克隆对50μM的B链
    (9-23)或类似物A16，19(NBI-6024)的增殖反应
 T细胞克隆 实验序号 仅含培养基 胰岛素B链(9-23) NBI-6024(A16，19)
平均cpm±sem  S．I． 平均cpm±sem  S．I．
 PD12-2．35  1  688±227  120，886±7，171  175．7  841±88  1．22
 2  493±20  100，521±1，581  203．89  452±179  0．91
 PD12-2．40  1  170±8  16，730±3，835  98．4  272±34  1．16
 2  1．834±638  176，359±36，306  96．16  1．863±451  1．01
 PD12-4．1  1  215±17  28，593±4，664  132．99  566±30  2．63
 PD12-4．9  1  9，111±1，889  45，541±5，222  4．99  12，313±1，372  1．35
 2  7，202±2，773  65，624±4，979  9．1  6，171±725  0．85
                     实施例4
              T细胞增殖拮抗的检测
此实施例阐述了利用代表性肽类似物抑制B链(9-23)特异性的小鼠T细胞克隆对胰岛素B链(9-23)肽的反应
如实施例1所述制备在残基12、13、15或16处含有丙氨酸取代的B链(9-23)的肽类似物或在16和19位上的双取代肽(A16，19；NBI-6024)。通过评价肽类似物抑制天然B链(9-23)(SEQ ID NO：2)诱导的T细胞增殖的能力检测T细胞拮抗。在这种检测中，抗原呈递细胞首先扩散，然后与竞争性的肽类似物和天然B链(9-23)肽一起培养。再将T细胞加入到培养物中。培养物中含有不同浓度的侯选肽类似物，总共培养4天。培养结束后，每一个培养物再经1μCi的[3H]-胸苷脉冲12-18小时。然后在玻璃纤维滤器上收集培养物并如上所述计数。根据重复三次的培养物得到的数据计算平均CPM和均值的标准误差。如图2所示，结果表明在残基12、13或16处含有丙氨酸取代的肽类似物能减少病原性的、胰岛素B链(9-23)T细胞的反应。
表4和图3显示了双取代的肽抑制胰岛素依赖性的T细胞增殖的能力。在表4中，对照肽-NBI-5096是一种无关的得自髓鞘碱性蛋白的肽。按如下计算抑制的百分比：(1-试验cpm／胰岛素肽cpm)×100％。
                      表4
     肽类似物对两种鼠NOD T细胞克隆的胰岛素
            B链(9-23)肽反应的抑制
克隆 条件 CPM±SEM 抑制％
PD12-2．35 仅有培养基 213±17
 B(9-23)5μM  7，840±528
 B(9-23)5μM+10μM NBI-6024  4，441±626  43．0
 B(9-23)5μM+50μM NBI-6024  1，389±218  82．0
 B(9-23)5μM+10μM NBI-5096  10，089±1，113  N／A
 B(9-23)5μM+50μM NBI-5096  10，125±887  N／A
 PD12-2．40 仅有培养基 305±13
 B(9-23)5μM  9，149±1，062
 B(9-23)5μM+10μM NBI-6024  6，379±1，485  30．0
 B(9-23)5μM+50μM NBI-6024  4，305±941  52．9
 B(9-23)5μM+10μM NBI-5096  12，336±1，556  N／A
 B(9-23)5μM+50μM NBI-5096  17，988±584  N／A
  N／A=不适用，因为没有发现抑制
NBI-6024阻断B链(9-23)诱导的对NOD衍生T克隆的刺激表明在天然胰岛素B链(9-23)肽的16和19位上的改变不改变类似物被病原性T细胞识别的能力。并且这些结果显示类似物还以足够的亲和力与MHC结合，从而允许被胰岛素B链(9-23)特异性的T细胞识别。
                       实施例5
      肽类似物对糖尿病患者的T细胞系和克隆增殖的影响
此实施例阐述了代表性肽类似物缺乏对糖尿病患者的T细胞系和克隆的刺激。
如实施例1所述制备在残基13、15、16或17处含有丙氨酸取代的B链(9-23)的肽类似物或双取代的丙氨酸类似物A16，19(NBI-6024)。患者的血液经密度梯度分离而由血液中分离出淋巴细胞，从而制备糖尿病患者的T细胞系。在含有胰岛素B链(9-23)肽(10μM)和加入5-10％自体血清的重组人类IL-2和扩散的自体外周血淋巴细胞的培养基中培养所分离的淋巴细胞。四或五天后收集细胞并重复2或3次。
在存在50，000-200，000个扩散的自体PBLs和不同浓度的胰岛素B链(9-23)肽或肽类似物时，培养25，000-100，000个T细胞，从而测量T细胞系对天然B链(9-23)肽(SEQ ID NO：2)或对肽类似物的增殖反应，均培养三份。培养4-5天后，包括最后18小时经放射性胸苷标记，收集细胞并在液体闪烁计数仪中测量相关的放射性。每个所试验的肽类似物的结果表示为每分钟的平均计数。
图4-7中所示的结果表明肽类似物不刺激根据天然胰岛素B链(9-23)肽(SEQ ID NO：2)而增殖的T细胞系和克隆。表5归纳了这些和其他患者的实验结果。
                      表5
    患者PBLs对天然胰岛素肽或类似物NBI-6024的增殖反应
患者编号 患者ID     刺激指数*
胰岛素B(9-23)[50μM] NBI-6024[50μM]
    1     100     9．9     0．9
    2     200     5．3     1．2
    3     400     7．8     1．0
    4     500     2．1     0．9
    5     600     5．8     1．6
    6     700     3．2     1．5
    7     900     2．6     0．9
    8     1100     3．7     0．8
*刺激指数=抗原存在时的CPM／仅有培养基时(无抗原)的CPM
这些结果清楚地表明对胰岛素B链(9-23)肽有应答的糖尿病患者的细胞并不响应改变了的肽配体-16和19位上有取代的NBI-6024。我们还确定APL NBI-6024以相似的亲和力结合DQ8抗原。因此NBI-6024缺乏对糖尿病患者T细胞的刺激并不是由于肽与呈递MHC分子不相容，而更可能是由于被B链(9-23)特异性的T细胞识别方面的变化。
    实施例6
 NOD鼠糖尿病发生率的减少
此实施例阐述了代表性肽类似物预防NOD鼠发生糖尿病的能力。
大约3月龄的NOD鼠开始自发地形成糖尿病(Makino等，糖尿病临床和实验方面的现代课题，Sakamoto等编辑，p25-32(Elsevier，Amsterdam，1985))。在疾病出现以前，甚至在1月龄时便开始的细胞渗入到达胰腺的T细胞。一周一次地用残基12、13或16处含有丙氨酸取代的B链(9-23)的可溶性肽类似物对NOD鼠进行皮下给药。在一次治疗中，十只动物施用400μg的每种肽。9次治疗以后，每周使用血糖计测量血糖水平以评价每个治疗组中鼠患上糖尿病的鼠的百分比。认为在连续两次的观测中血糖读数高于200mg／dl是糖尿病明显的征兆。
如图8中所示，使用每种丙氨酸取代的类似物治疗导致了糖尿病发生率的明显减少。在图9中还给出了A13取代类似物的数据。
在另一个实验中，每周用B链(9-23)、A13取代类似物或神经降压肽(作为对照)对NOD鼠进行皮下给药。在一次治疗中，十只动物施用400μg的每种肽。13次治疗以后，如上所述评价在每个治疗组中小鼠患上糖尿病的百分比。如图10所示，B链(9-23)肽降低了糖尿病的发生率。对于A13取代类似物则降低得更加显著。
为测定双取代肽A16，19(NBI-6024)控制NOD鼠发生糖尿病的能力，将肽对幼龄动物进行用药。因此，使用20mg／kg(400μg／鼠)的NBI-6024对母鼠(n=9，大约4周龄)进行皮下治疗，持续12周后，每隔一周用药一次，直到35周。然后，从9-10周开始，每周监测鼠的高血糖，测定血糖水平。作为对照，留出10只母鼠的一组未经治疗。在图11中显示了该实验的结果。从中可知，与未经治疗组(p＜0．004)相比较，经NBI-6024治疗后明显地降低糖尿病的发生率达大约60-70％。
证实了这些发现之后，可以进行第二个实验。实验中，使用NBI-6024或非相关肽，神经降压肽，上述的NBI-6201来治疗动物(n=13-15)。留出另外一组(n=8)未经治疗。如图12所示，与经神经降压肽治疗或未经治疗的组相比较，用20mg／kg的改变了的肽NBI-6024降低了糖尿病的发生率。
这些结果表明围绕胰岛素B链(9-23)肽设计的改变了的肽配体NBI-6024能为有自发形成糖尿病危险的动物提供保护。可能是识别其它胰腺抗原的T细胞存在于这些动物中，但它们似乎也受胰岛素APL的调节。用药的时间与自身反应性的淋巴细胞开始渗入胰腺并启动破坏过程的时间大约相同。这些结果为用APL早期干预有益于人们推迟或预防发生Ⅰ型糖尿病提供了希望。
                 实施例7
         代表性肽类似物的免疫原性
此实施例阐述了代表性肽类似物在NOD鼠中的免疫原性。
在10-15天的时间内，各组3-4只NOD鼠经100-400μg溶于甘露糖醇乙酸盐缓冲液的肽类似物通过皮下免疫三次。最后一次免疫之后，使用淋巴结细胞和／或脾细胞进行增殖检测，检测中，不同浓度的免疫肽与细胞一起培养3-4天。最后18小时的培养物包括含氚胸苷。收集细胞并在闪烁计数仪中计数，反应表示为CPM±SEM。图13-16中所示结果显示了这些代表性肽类似物有与鼠MHC分子结合并为相应的T细胞所识别的能力。
然后测定双取代肽NBI-6024(A16，19)诱导NOD鼠品系的细胞免疫反应的能力。使用作为水悬浮液的10mg／kg NBI-6024或作为对照在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化后免疫两只NOD母鼠。在第8天，最后一次注射后的三天，将鼠处死，取出脾和腹股沟淋巴结细胞并予以收集，制备单细胞悬浮液。在有不同浓度(0-25μM)NBI-6024的条件下培养细胞。在体外，通过[3H]-胸苷的掺入来测量这些淋巴样细胞响应NBI-6024而增殖的能力。
在表6中给出了这些结果，其中反应表达为三份培养物的平均CPM±SEM。从CFA中的类似物免疫过的小鼠中分离出的淋巴结细胞以剂量依赖性方式显示出对免疫类似物攻击的强烈增殖反应(表6)。这些结果说明了天然胰岛素B链(9-23)序列上16和19位的变更没有影响肽与NOD疾病相关MHC单元型分子结合的能力，并且更重要的是，不妨碍被T细胞识别。
      表6
   经CFA中的NBI-6024免疫的NOD鼠的淋巴结细胞对
        NBI-6024的增殖反应
    NBI-6024(μM) 增殖反应(CPM±SEM)
    0     2，445±137
    1     140，061±7，289
    5     187，711±2，548
    25     218，149±4，462
另外，从施用的可溶性肽分离的脾和腹股沟淋巴结细胞在体外受NBI-6024攻击时，显示了对APL强烈的增殖反应(表7以及图17A和17B)。印象更加深刻的发现是从可溶性肽免疫过的鼠所得到的NBI-6024衍生淋巴细胞对于胰岛素B链(9-23)也有反应。在CFA-乳化的肽中并没有发现这种交叉反应的特点。对于控制糖尿病，可溶性肽引发交叉反应的这种能力也许是我们所希望的，因为这样可以有助于动员保护性的NBI-6024特异性的T细胞作用于病原性靶组织。
                         表7经可溶性NBI-6024免疫的NOD鼠的T细胞对NBI-6024或天然胰岛素
                 B链(9-23)的增殖反应
NBI-6024诱导的T细胞系 肽浓度[μM]     CPM±SEMNBI-6024     CPM±SEM胰岛素B(9-23)
    鼠#1   0    19，130±2，191   19，130±2191
  1    48，319±1，918   16，870±4469
  5   160，673±2，269   21，292±3216
  25  268，005±11，198   33，317±3619
    鼠#2   0      21，588±2326   21，588±2326
  1      54，519±5666   17，262±602
  5     126，123±13851   19，648±2169
  25     202，707±8125   30，612±3557
    鼠#3   0      24，006±2803   24，006±2803
  1      64，239±9493   25，825±3841
  5     140，836±11778   58，567±2737
  25     240，278±15015  113，366±515
为测定经可溶性NBI-6024用药后产生的T细胞的类型，在开始培养48小时后取出免疫淋巴样细胞的培养物上清液，并利用常规ELISA技术测量各种细胞因子的水平。令人吃惊的是，经可溶性NBI-6024免疫的小鼠的T细胞的细胞因子生产分布产生Th2细胞因子、白细胞介素-4(图18)和白细胞介素-5(表8)，但没有Th1衍生的白细胞介素-2。在表8中，数值表示为三次实验的均值±SEM，单位是pg／ml。作为对照，与CFA乳化的NBI-6024在体外刺激时确实诱导了预期的免疫T细胞产生Th1-细胞因子分布(IL-2)。
                   表8
  与NBI-6024一起培养的可溶性NBI-6024诱导的T细胞
              的细胞因子反应
NBI-6024[mM] 细胞因子(pg/ml)
IL-2 IL-4 IL-5
0 ＜15pg/ml 134±0 1，814±332
1 ＜15pg/ml 684±92 9，999±503
5 ＜15pg/ml 1，653±51 23，496±684
25 ＜15pg/ml 2，102±85 28，062±141
可溶性NBI-6024皮下给药而诱导Th2样细胞的能力是人们所希望的一个特点，因为这样的细胞与糖尿病和其它的器官特异性的自身免疫疾病的恢复有关(Sarvetnick，实验医学杂志，184：1597-1600，1996；Shaw等，1997；Balasa等，实验医学杂志，186：385-391，1997)。这些Th2衍生的细胞因子有强烈的抗炎活性，这些活性可以抑制能介导疾病的前炎性、细胞因子分泌性、自身反应性的Th1细胞的产生。
由上文可知，虽然为阐述本发明而描述了它的某些具体实施方案，但可以不违背发明主旨和范围对本发明作出各种修改。因此，除非所附权利要求书中加以限定，本发明不受限制。
                        序列表<110>Neurocrine Biosciences，Inc。<120>使用胰岛素的肽类似物治疗糖尿病的方法<130>690068．448PC<140>PCT<141>1999-02-23<160>2<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>30<212>PRT<213>智人<220><223>人胰岛素B链<400>1Phe Val Asn Gln His Leu Cys G1y Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                   10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr20                   25                  30<210> 2<211> 15<212> PRT<213>智人<220><223>人胰岛素B链的残基9-23<400>2Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly1                5                   10                  15

Claims (27)

1．一种含有人胰岛素B链的残基9-23的肽类似物，其中该肽类似物由于在1到4个氨基酸位置处的取代而与天然的人胰岛素B链残基9-23在序列方面有不同，并且其中至少一个取代发生在选自残基12、13、15和16的一个残基处。
2．权利要求1的肽类似物，其中所述肽类似物的序列与天然的人胰岛素B链有两个氨基酸残基不同。
3．权利要求1的肽类似物，其中所述肽类似物的序列与天然的人胰岛素B链有三个氨基酸残基不同。
4．权利要求1的肽类似物，其中一个氨基酸取代发生在残基19处。
5．权利要求1的肽类似物，其中至少一个氨基酸取代是非保守性的。
6．权利要求1的肽类似物，其中残基12被取代。
7．权利要求6的肽类似物，其中残基12是一个丙氨酸残基。
8．权利要求1的肽类似物，其中残基13被取代。
9．权利要求8的肽类似物，其中残基13是一个丙氨酸残基。
10．权利要求1的肽类似物，其中残基15被取代。
11．权利要求10的肽类似物，其中残基15是一个丙氨酸残基。
12．权利要求1的肽类似物，其中残基16被取代。
13．权利要求12的肽类似物，其中残基16是一个丙氨酸残基。
14．权利要求6-13中任何一项的肽类似物，其中残基19被取代。
15．权利要求14的肽类似物，其中残基19是一个丙氨酸残基。
16．权利要求1的肽类似物，还包含人胰岛素B链的残基24。
17．权利要求1的肽类似物，其中该肽类似物含有不超过人胰岛素B链中的18个残基。
18．权利要求1的肽类似物，其中该肽类似物含有不超过人胰岛素B链中的16个残基。
19．权利要求1的肽类似物，其中该肽类似物含有不超过人胰岛素B链中的15个残基。
20．一种基本上包含人胰岛素B链的残基9-23的肽类似物，其中该肽类似物由于在1到4个氨基酸位置处的取代而与天然的人胰岛素B链残基9-23在序列方面有不同，并且其中至少一个取代发生在选自残基12、13、15和16的一个残基处。
21．一种基本上包含人胰岛素B链的残基9-24的肽类似物，其中该肽类似物由于在1到4个氨基酸位置处的取代而与天然的人胰岛素B链残基9-23在序列方面有不同，并且其中至少一个取代发生在选自残基12、13、15和16的一个残基处。
22．一种药物组合物，包含与生理上可接受的载体或稀释剂组合的权利要求1-19中任何一项所述的肽类似物。
23．一种抑制糖尿病发展的方法，包括将治疗有效量的权利要求22所述药物组合物对患者给药。
24．一种治疗糖尿病的方法，包括将治疗有效量的权利要求22所述药物组合物对患者给药。
25．一种含有人胰岛素B链的残基9-23的肽类似物，其中该肽类似物由于残基16和19处的取代而与天然的人胰岛素B链残基9-23在序列方面有不同。
26．一种药物组合物，包含与生理上可接受的载体或稀释剂组合的权利要求25所述肽类似物。
27．一种抑制糖尿病发展的方法，包括将治疗有效量的权利要求26所述药物组合物对患者给药。
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