CN1290518C - 一种蜂胶有效成份提取方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蜂胶中有效成份的提取方法，及这种有效成份的用途。更为确切讲，本发明涉及提取蜂胶中水溶性成份的方法和所提出的蜂胶中水溶性成份的用途。本发明的方法是将蜂胶用水进行提取。本发明的用途是指用本发明的方法所得到的蜂胶中水溶性提取物在制备冠状动脉舒张药物中的应用，和在制备植物雌激素类药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种蜂胶中有效成份的提取方法，及这种有效成份的用途。更为确切讲，本发明涉及提取蜂胶中水溶性成份的方法和所提出的蜂胶中水溶性成份的用途。
背景技术
蜂胶是蜜蜂采集植物的树脂分泌物与蜂蜡，经咀嚼调制而成的一种树脂状物质。蜂胶中成份极为复杂，近年来国内外对蜂胶的化学组成，生物作用，药理作用有很多的研究报告。研究发现蜂胶具有抗菌，抗病毒，抗溃疡，抗炎，局部麻醉，降血压，增强免疫力等作用。对于蜂胶中有效成份，现有技术中集中于酒精和乙醚等有机溶液进行提取，或者用易溶于水的高浓度有机溶液进行提取。如中国发明专利97111643.1中公开的内容。该专利采用丙酮，或乙酸，或乙醇，或甲醇，或异丙醇，或者用前述溶剂的混合物提取蜂胶中的有效成份3-[4-3，5羟基-(3-双甲基-2丁烯基)苯基]-2-丙烯酸，用于防腐、生发及抗癌。现有技术中对蜂胶用非有机溶液进行提取未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种从蜂胶中提取水溶性成份方法；本发明的第二个目的是公开用本发明的方法从蜂胶中提取的水溶性成份的用途。
本发明的方法是将蜂胶用水进行提取。
本发明更为具体的优选方法是将蜂胶粉碎，再用水进行提取，提取液经离心或充分沉淀后取其上清液，再将上清液冻干。
本发明的用途是指用本发明的方法所得到的蜂胶中水溶性提取物在制备冠状动脉舒张药物中的应用，和在制备植物雌激素类药物中的应用。
本发明的提取方法极为简单，提取成本低。经本发明方法处理后的蜂胶提取物组成简单。采用本发明的方法处理后还可以继续用现有技术提取蜂胶中的其它有效成份，因此能充分利用蜂胶资源。此外，本发明的提取物可用于制备冠状动脉舒张药物，这一点现有技术中未见报道。本发明的提取物用于制备植物雌激素类药物中的应用，为雌激素类药物的生产提供了新的途径和原料来源。
附图说明
图1为蜂胶提取物中黄酮类物质的薄层扫描结果。
图2为本发明的蜂胶提取物浓度对冠状动脉的直接舒张作用曲线。
图3为本发明的蜂胶提取物浓度对氯化钾预收缩的冠状动脉抑制作用曲线。
图4为一氧化氮合成酶抑制剂，祛除冠状动脉内皮，甲烯蓝，心得安和吲哚美辛对本发明的蜂胶提取物直接舒张作用影响曲线。
图5为一氧化氮合成酶抑制剂，祛除冠状动脉内皮，甲烯蓝，心得安和吲哚美辛对本发明的蜂胶提取物对氯化钾预收缩的冠状动脉的抑制作用的影响曲线。
图6为本发明的蜂胶提取物对猪冠状动脉氯化钾收缩曲线的影响。
图7为本发明的蜂胶提取物对猪冠状动脉氯化钙收缩曲线的影响。
具体实施方式
以下详细解说本发明的方法，和相关用途的试验结果。
一、蜂胶提取方法
取新鲜蜂胶，粉碎后置于蒸馏水(W/W＝1∶20)于室温下搅拌48小时；过滤；滤渣加水反复提取、过滤；合并滤液，在15,000rpm条件下离心60分钟；
合并上清液；经冻干处理后得水溶性蜂胶成份。
经测定，所提取的水溶性蜂胶含三种黄酮成分，参见附图1。图1是蜂胶水提物中黄酮在可见光波长下薄层扫描的结果，所用显色剂为5％的三氯化铁-乙醇溶液。
二、本发明的蜂胶提取物用途研究
实验方法及条件：
从生猪屠宰厂取刚宰杀的猪心并立即将猪心置于0℃的生理盐水中，然后立即运至实验室。在室温下将猪左前降支冠状动脉从心肌中剪出并置于通有95％氧气和5％的二氧化碳的Krebs液中，温度保持在37℃。仔细剪除附着于冠脉上的脂肪及其其他组织。然后切割为长度为4-5mm长的冠状动脉环。立即将动脉环用两平行的不锈钢的挂钩水平置于10ml玻璃浴管中，浴管中含有Krebs液，其组成为(mM)NaCl 118，KCl 4.7，NaH2PO4 1.2，MgCl2 1.2，NaHCO3 15.4，CaCl2 2.5和葡萄糖11.5，并持续通入95％O2和5％CO2的混合气体，温度在整个实验过程保持在37℃。前负荷给予2g。血管产生张力通过压力感受器(JH-2)用BL-410E生物实验系记录于计算机。
1、蜂胶水提物对冠状动脉的直接作用
将猪冠状动脉环在浴管中孵育90分钟后，再将蜂胶水提物按0.316-100ug/ml不同浓度依次加入浴管，同时用等量的生理盐水在另一同样条件的浴管加入另一组猪冠状动脉环，作为空白对比实验。观察实验结果，结果显示蜂胶水提取物能剂量依赖的舒张冠状动脉EC50＝(75.35±1.24)ug/ml(n＝8)。显示蜂胶水提取物能直接舒张冠状动脉，其最大舒张率达到56.33％，参见附图2。图中NS为生理盐水组，WEP为蜂胶水提物组。
2、蜂胶水提物对氯化钾预收缩的冠状动脉的作用
将猪冠状动脉环在浴管中孵育90分钟后，加入KCl(40mM)预收缩冠状动脉，15分钟后将蜂胶水提物按0.316-100ug/ml的不同浓度依次加入浴管，同时用等量的生理盐水在另一同样条件的浴管加入另一组猪冠状动脉环，作为空白对比实验。观察实验结果，结果显示蜂胶水提物能剂量依赖的舒张冠状动脉IC50＝(65.11±1.72)ug/ml(n＝8)。显示蜂胶能有效抑制因氯化钾引起的收缩作用，其最大舒张率达到64.77％，参见附图3。图中NS为生理盐水组，WEP为蜂胶水提物组。
3、一氧化氮合成酶抑制剂，祛除冠状动脉内皮，甲烯蓝，心得安和吲哚美辛对蜂胶水提物舒张作用的影响
制备好冠状动脉并在切为血管环之前用棉签轻轻擦去血管内皮，以测定蜂胶水提物对其的舒张作用。
对未祛除冠状动脉内皮的冠状动脉血管环用缓激肽来测试其功能，经测试认为内皮功能良好的血管环作为进行一氧化氮合成酶抑制剂、甲烯蓝、心得安和吲哚美辛对蜂胶水提物舒张作用的影响的实验。
将一氧化氮合成酶抑制剂(10-4M)，甲烯蓝(10-5M)，心得安(10-5M)和吲哚美辛(10-5M)分别在加入蜂胶水提物(100ug/ml)之前15分钟，或者在氯化钾(40mM)加入之前15分钟加入浴管，加入氯化钾的实验组在加入氯化钾15分钟后，再将蜂胶水提物(100ug/ml)也加入浴管。测试结果表明，一氧化氮合成酶抑制剂，祛除内皮和甲烯蓝均能显著减低蜂胶水提物对冠状动脉的直接舒张作用，或对蜂胶水提物对氯化钾预收缩的冠脉的舒张作用有明显的抑制作用(所有P值均小于0.05)；而心得安和吲哚美辛则无此作用(所有P值均大于0.05)，参见附图4和图5。
在附图5和图6中：L-NNA为一氧化氮合成酶抑制剂实验组；MB为甲烯蓝实验组；Prop为心得安实验组；Indo为吲哚美辛实验组；Denu为祛除冠状动脉内皮实验组。
4、蜂胶水提物对氯化钾浓度依赖性收缩曲线的抑制作用
将冠状动脉血管环在浴管中孵育90分钟后依次将氯化钾按4-100mM的浓度加入，得到氯化钾剂量依赖性收缩曲线，然后充分冲洗以至张力恢复到初始状态，然后将蜂胶水提物(100ug/ml)加入浴管，20分钟后再重新将氯化钾按4-100mM浓度依次加入。为与实验结果进行比较，另设空白对照实验组，即用等量生理盐水在等同条件下加入另一组冠状血动脉环。结果显示蜂胶水提物能显著抑制氯化钾的抑制曲线。氯化钾曲线的EC50值为(16.07±1.42)mM(n＝8，control)，蜂胶水提物(100ug/ml)抑制后的氯化钾曲线的EC50值为(93.12±1.21)mM(n＝8，p＜0.05vs.control)，参见附图6。
附图7中：KCl为氯化钾收缩曲线；KCl+WEP为先后加入蜂胶和氯化钾的收缩曲线；NS为空白对照的曲线。
6、蜂胶水提物对氯化钙浓度依赖性收缩曲线的抑制作用
冠状动脉环置于无钙Krebs液中，其中含有0.1mM的EGTA，经孵育90分钟后加入氯化钾(80mM)，在15分钟后依次加入按10-5-10-2M的氯化钙，得到氯化钙剂量依赖性收缩曲线，然后再充分冲洗受试冠状血管环，以至其张力恢复到初始状态，再将蜂胶水提物(100ug/ml)加入浴管，20分钟后再将氯化钙按10-5～10-2M的浓度重新依次加入。为与实验结果进行比较，为与实验结果进行比较，另设空白对照实验组，即用等量生理盐水在等同条件下加入另一组冠状血动脉环。实验结果显示蜂胶水提物能显著抑制氯化钙的抑制曲线。氯化钙抑制曲线的EC50值为(3.76±0.58)×10-3M(n＝8，control)，蜂胶水提物(100ug/ml)抑制后的氯化钾曲线的EC50值为(7.98±1.24)×10-3M(n＝8，p＜0.05vs.control)，参附图7。
附图7中：Calcium为氯化钙收缩曲线；Calcium+WEP为先后加入蜂胶和氯化钾的收缩曲线；NS为空白对照的曲线。
由于本发明的蜂胶提取物对冠状动脉良好的舒张作用，因此本发明的蜂胶提取物显现了可以作为治疗冠心病的药物的良好前景。所以蜂胶水提物的应用前景是广泛的，特别是对冠心病的治疗用途上其价值是巨大的。另外妇女在绝经期后冠心病的发病显著上升，而雌激素的替代疗法能明显降低其发病率，但却使妇女的乳腺肿瘤发病率提高。现有技术中采用的植物雌激素却能避免这一不良影响。本发明从蜂胶提取物提取出的蜂胶水溶性黄酮类物质，此类物质同样是具有雌激素样作用的物质，因此本发明为植物雌激素类药物的制备提供了新的生产途径和一类新的原料。
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1.蜂胶用水进行提取的提取物在制备冠状动脉舒张药物中的应用。
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