CN1288249C

CN1288249C - 微生物混合发酵制备木糖醇的方法

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Publication number: CN1288249C
Application number: CN 200410031949
Authority: CN
Inventors: 江宁; 贺鹏; 沈安; 卢大军
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2006-12-06
Anticipated expiration: 2024-03-31
Also published as: CN1676611A

Abstract

本发明属于微生物混合发酵制备木糖醇，具体的讲，涉及以葡萄糖为原料，先分别培养一株酿酒酵母FX-6201CGMCC 0283.1，和一株弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2，然后混合发酵，用乙醇抽提发酵液，提取固体物质得木糖醇结晶，再通过过滤，干燥，获得木糖醇晶体的一种制备方法。

Description

微生物混合发酵制备木糖醇的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵，具体的讲，涉及一株酿酒酵母FX-6201CGMCC0283.1，和一株弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2混合发酵制备木糖醇的方法。

背景技术

木糖醇是五碳多元醇，天然存在于草莓、葛苣等水果和蔬菜中。由于它的甜度高并有代谢不依赖胰岛素、抗龋齿等特性，是糖尿病。牙病患者理想的蔗糖代用品。木糖醇的制备可以有三条途径：(1)直接从植物中提取；(2)化学法或生物法用木糖催化加氢；(3)利用微生物的方法。

由于木糖醇在植物中天然存在的含量太低，直接提取很不经济。目前工业上主要用木糖催化加氢的方法制备(Wisnik，J.et al.：Ind.Eng.Chem.Prod.Res.Dev.，3：232-236，1974)，但是这种方法工艺复杂，成本很高，生物法加氢近年也取得不少进展(Leathers，T.D.：FEMSYeast Research，3：133-140，2003；江宁等：ZL01110778.2，2004)，但用木糖为原料毕竟比葡萄糖价格高。利用微生物直接发酵葡萄糖制备木糖醇是经济上很理想的方法，但是迄今在自然界还没有发现能直接发酵葡萄糖得到木糖醇的微生物。Hiroshi，O.等人曾用三种微生物分步发酵从葡萄糖制备了木糖醇(Appl.Microbiol.，18：1031-1035，1969)，证明了微生物发酵从葡萄糖制木糖醇的可能性，但是三菌分步发酵过程十分复杂，没有实用价值。近年，Harkki，A.M.等人用重组DNA的方法构建了工程菌，能直接发酵葡萄糖得到木糖醇，并申请了国际专利(WO 94/10325，1994)，但转化率只有3-4％，距离应用仍很遥远。

发明内容

本发明的目的在于提供一种切实可行的双菌发酵的方法制备木糖醇，具体地讲，本发明提供了一种用一株酿酒酵母FX-6201CGMCC 0283.1，和一株弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2混合发酵制备木糖醇的方法。

我们通过微生物利用葡萄糖发酵，优化选育了一株酵母菌(Saccharomyces sp.)FX-6021和一株细菌(Acetobacter suboxydans)MF-21，它们已于1996年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京，中关村；邮政编码：100080)进行了保藏，保藏号分别为CGMCC 0283.1和CGMCC 0283.2。将两个菌株分别培养后进行混合发酵，可以直接从葡萄糖得到木糖醇。将酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces sp.)FX-6021 CGMCC 0283.1在含高浓度葡萄糖的营养培养基中，于24-32℃培养3-5天，酵母培养基的成分是：葡萄糖10-70％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.1％，CaCO₃ 0.05％，pH4-8。然后与在含碳酸钙培养基，即碳酸钙0.1-5％，葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.1％，pH 5-9，中与24-37℃培养了6-36小时的细菌弱氧化醋杆菌(Acetobacter suboxydans)MF-21 CGMCC 0283.2混合，继续于24-34℃发酵16-120小时，检测培养基中的葡萄糖全部转化为木糖醇后，将发酵液离心除去菌体，上清液用活性炭脱色，减压蒸干，用热乙醇抽提后冷却结晶，即得到木糖醇晶体。本发明所述培养基的“成分％”，都是指其成分的重量对水体积的百分比。

因而，本发明所提供的一种制备木糖醇的方法，其特征在于，以葡萄糖为原料，先分别培养酿酒酵母FX-6201CGMCC 0283.1，和弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC 0283.2；将上述培养液混合后，继续混合发酵，发酵达到终点，用乙醇抽提发酵液，提取固体物质得木糖醇结晶，过滤，干燥，获得木糖醇晶体的方法。

本发明的方法的主要过程为：

(1)将酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖的营养培养基中培养；

(2)将细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中培养；

(3)将两种培养物混合后进行发酵，得到木糖醇。

在本发明的方法中，所用的葡萄糖为淀粉酸水解制备得到的或酶法制备得到的。所用的培养基中葡萄糖的含量是在10％-70％范围内，优选20％-50％。所用的含葡萄糖的培养基pH为4-8，优选pH为5。酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养温度为24-32℃，优选30℃。酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养时间为3-5天，优选4天。所用的含碳酸钙的培养基含碳酸钙为0.1％-5％，优选1-2.5％。所用的含碳酸钙的培养基pH为5-9，优选pH为7。细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中的培养温度为24-37℃，优选30℃。细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中培养时间为6-36小时，优选10-24小时。混合发酵的温度为24-37℃，优选30℃。混合发酵的时间为16-120小时，优选40-80小时。

本发明与现有技术所不同的是：

1.本发明的制备方法以葡萄糖为主要原料，葡萄糖价格低廉，故用本发明制备木糖醇的成本比以木糖为原料的化学法要低。

2.本发明用二菌混合一步发酵，整个工艺比三菌分步发酵简单，并可用普通的发酵设备。

3.本发明所选育的菌种，其利用葡萄糖产木糖醇的转化率比已报道的重组工程菌高得多。

因此，本发明具有原料便宜、成本低廉、工艺简单、设备通用、转化率高等特点，适合于工业应用。

具体实施方式

为了便于理解和实施本发明，以下通过几个具体实施例予以进一步的说明。

实施例1：

(1)将酿酒酵母菌FX 6021 CGMCC 0283.1接入装有10ml酵母培养基A的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养96hr。酵母培养基A的成分是：葡萄糖(淀粉酸水解制备)30％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.1％，CaCl₂ 0.05％，pH 5.0。

(2)将弱氧化醋杆菌MF-21 CGMCC 0283.2接入装有10ml细菌培养基的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养24hr。细菌培养基的成分是：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.1％，CaCO₃ 2％，pH 6.8。

(3)将(1)、(2)中的发酵液于无菌条件下混合后，继续在摇床上以30℃、220rpm培养50hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓度为25g/L。

(4)将发酵液离心(Beckman GS-15R，8000rpm，10min，20℃)得上清液19ml，加入0.38g活性炭，调pH＝5.0，煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖醇晶体0.41g。

实施例2：

(1)将酵母菌FX 6021接入装有10ml酵母培养基(如实施例1(1))的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养96hr。

(2)将细菌MF-21接入装有10ml细菌培养基(如实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养24hr。

(3)取(2)中发酵液3ml于无菌条件下转入装有20ml细菌培养基

(如实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养8hr。

(4)取(3)中发酵液10ml与发酵液(1)于无菌条件下混合后，继续在摇床上以30℃、220rpm培养60hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓度为31g/L。

(5)将发酵液离心得上清液19ml，加入0.38g活性炭，调pH＝5.0，煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖醇晶体0.47g。

实施例3

(1)将酵母菌FX 6021 CGMCC 0283.1接入装有20ml酵母培养基B的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养100hr。酵母培养基B的成分是：葡萄糖(淀粉酶水解制备)30％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.1％，CaCl₂ 0.05％，pH 5.0。

(2)将细菌MF-21 CGMCC 0283.2接入装有20ml细菌培养基(如实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养20hr。

(3)将(1)、(2)中的发酵液于无菌条件下混合后，继续在摇床上以30℃、220rpm培养55hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓度为26g/L。

(4)将发酵液离心得上清液38.5ml，加入0.77g活性炭，调pH＝5.0，煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖醇晶体0.86g。

实施例4：

(1)将酵母菌FX 6021 CGMCC 0283.1接入装有10ml酵母培养基B(如实施例3(1))的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋转摇床培养96hr。

(2)将细菌MF-21 CGMCC 0283.2接入装有10ml细菌培养基(如实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养24hr。

(3)取(2)中发酵液2ml于无菌条件下转入装有20ml培养基(如实施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋转摇床培养10hr。

(4)取(3)中发酵液10ml与发酵液(1)于无菌条件下混合后，继续在摇床上以30℃、220rpm培养46hr。发酵结束时发酵液中木糖醇浓度为25g/L。

(5)将发酵液离心得上清液19ml，加入0.38g活性炭，调pH＝5.0，煮沸，冷却到室温后抽滤得无色清液。将清液于50℃减压蒸干，用无水热乙醇抽提固体物质，冷却后得木糖醇结晶，过滤，将晶体干燥，得木糖醇晶体0.40gg。

Claims

1.一种用微生物混合发酵制备木糖醇的方法，其特征在于，以葡萄糖为原料，先分别在含葡萄糖的营养培养基中培养酿酒酵母FX-6201CGMCC 0283.1和在含碳酸钙的培养基中培养弱氧化醋杆菌MF-21CGMCC0283.2；将上述两菌培养液混合后继续发酵；发酵达到终点，用乙醇抽提发酵液，提取固体物质得木糖醇结晶，再通过过滤，干燥，获得木糖醇晶体的方法。

2.如权利要求1所述的制备木糖醇方法，其特征在于，所用的葡萄糖为淀粉酸水解制备得到的或酶法制备得到的。

3.如权利要求1所述的方法，其所用的培养基中葡萄糖的含量是以其重量与水体积百分比在10％-70％范围内。

4.如权利要求3所述的方法，其所用的培养基中葡萄糖的含量是以其重量与水体积百分比在20％-50％的范围内。

5.如权利要求1所述的方法，其所用的含葡萄糖的培养基的pH范围为4-8。

6.如权利要求5所述的方法，其所用的含葡萄糖的培养基pH为5。

7.如权利要求1所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养温度范围为24-32℃。

8.如权利要求7所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养温度为30℃。

9.如权利要求1所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养时间为3-5天。

10.如权利要求9所述的方法，其酵母菌FX-6201CGMCC 0283.1在含葡萄糖培养基中的培养时间为4天。

11.如权利要求1所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2所用的含碳酸钙的培养基，其碳酸钙的重量与水体积百分比为0.1％-5％。

12.如权利要求11所述的方法，其含碳酸钙的重量与水体积百分比为1％-2.5％。

13.如权利要求1所述的方法，其所用的含碳酸钙的培养基pH为5-9。

14.如权利要求13所述的方法，其所用的含碳酸钙的培养基pH为7。

15.如权利要求1所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中的培养温度为24-37℃。

16.如权利要求15所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中的培养温度为30℃。

17.如权利要求1所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中培养时间为6-36小时。

18.如权利要求17所述的方法，其细菌MF-21CGMCC 0283.2在含碳酸钙的培养基中的培养时间为10-24小时。

19.如权利要求1所述的方法，其混合发酵的温度为24-37℃。

20.如权利要求19所述的方法，其混合发酵的温度为30℃。

21.如权利要求1所述的方法，其混合发酵的时间为16-120小时。

22.如权利要求21所述的方法，其混合发酵的时间为40-80小时。