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CN1283121A - 用于预防和治疗接种的hiv－1tat或其衍生物 - Google Patents

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CN1283121A
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seq
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Advanced Health Research Institute
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Abstract

本发明涉及作为活性物质的Tat,用于抗HIV感染、感染HIV个体的AIDS发展和肿瘤及其他综合征和症状的发展的预防和/或治疗疫苗。Tat可以是重组蛋白或肽或者DNA的生物活性形式。更具体地讲,本发明涉及以HIV－1Tat为免疫原的疫苗,作为DNA和/或重组蛋白或肽接种,单独或者与其他基因或病毒基因产物(Nef,Rev,Gag)或其部分组合,或者与各种免疫调节剂细胞因子(IL－12、IL－15)或者与编码免疫调节剂细胞因子或其部分的基因组合。将Tat、Nef、Rev、Gag和免疫调节剂细胞因子作为重组蛋白、肽或融合蛋白的混合物(Tat/Nef、Tat/Rev、Tat/Gag、Tat/IL－12、Tat/IL－15)或者作为质粒DNA施用。

Description

用于预防和治疗接种的HIV-1 TAT或其衍生物
技术领域
本发明涉及抗HIV、抗AIDS和抗与HIV感染有关的肿瘤和综合征的预防性和/或治疗性疫苗，所述疫苗单独用HIV Tat野生型或突变蛋白质、肽或DNA或者与其他病毒产物(Nef，Rev，Gag)的蛋白质、肽或DNA或者促进抗病毒免疫反应的细胞因子结合作为免疫原。
本发明还涉及通过自身树突细胞用Tat或其衍生物进行的免疫、粘膜免疫或者通过用抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体共刺激扩展的外周血细胞的来自体内(ex-vivo)免疫，还涉及用红细胞或纳米颗粒(nanoparticles)送递上述免疫原。
背景技术
AIDS(获得性免疫缺陷性综合征)是由HIV(人免疫缺陷性病毒)引起的，其特征是免疫缺陷、肿瘤如卡波济肉瘤(KS)和B细胞淋巴瘤、机遇性感染和中枢神经系统疾病。由于AIDS在世界范围内广泛传播而且死亡率高，因此，公共健康的一个最重要的目的就是开发抗HIV或AIDS的预防性和/或治疗性疫苗。过去和目前的大部分治疗方法均使用病毒被膜或其亚单位作为免疫原，但是由于病毒被膜的高度变异性使得治疗结果不能令人满意(参考文献162，112-贯穿于本说明书始终，在括号中提到了各种参考文献，从而对与本发明有关的现有技术进行了更详细的描述。在说明书结尾，权利要求书之前，可以找到每篇文献的全部参考资料)。因此，作为另一种灭菌免疫，普遍的看法是它足以阻断感染的发展和疾病的发作。此外，用HIV的DNA区作为免疫原可以产生免疫保护性反应(参考文献91，17)。由于公开的实验数据，发明人相信，有必要生产一种利用env以外的病毒产物的疫苗。特别是，用作免疫原的病毒蛋白在HIV分离株中必须很保守，能够诱发有效的体液和细胞免疫反应，而且必须对病毒有致命的功能。所述产物必须在非人灵长类(因为与种系发生上更远的动物相比，其免疫系统与人的更相近)模型中进行试验，其中病毒感染后可发展成AIDS。
HIV-1 Tat蛋白质具有作为用于疫苗的良好免疫原的所有特征：该蛋白质是保守的，免疫原性的并在病毒感染早期是必不可少的。此外，Tat不仅在病毒复制、感染传播和进展中起关键作用，而且在AIDS-相关肿瘤，例如KS(是最常见的AIDS相关肿瘤)和HIV感染后发展的其他综合征与症状的发作和进展中起关键作用。
Tat是一种86-102个氨基酸的蛋白质，氨基酸的多少取决于病毒株，由两个外显子编码。Tat是在感染后不久产生的，位于核内，然后通过与LTR中存在的“Tat-效应元件”(TAR)相互作用，反式激活所有病毒基因的表达(参见文献25)。Tat在HIV毒力中也起作用(参考文献63、113、60，84)。第一外显子的产物(氨基酸1至72)在不同的病毒分离株中是保守的(参考文献112)并足以引起HIV-1产物的反式激活作用(参考文献25)。它含有4个结构域。酸性结构域(氨基酸1-21)对于Tat与细胞蛋白的相互作用是至关重要的；富含半胱氨酸的区域(氨基酸22-37)代表反式激活结构域。该区域在主要分离株中是最保守的(参考文献108)，用甘氨酸取代22位的半胱氨酸后消除了Tat反式激活HIV-LTR的能力(参考文献166)。核心结构域(氨基酸38-48)也是保守的并对于功能也是很重要的。用苏氨酸取代赖氨酸41使Tat对HIVLTR的反式激活活性失活(参考文献70)；富含精氨酸和赖氨酸的碱性结构域(氨基酸49-57)对于Tat的核定位是必需的，而且与其RNA靶(TAR)特异性结合(参考文献25)。此外，碱性区域使细胞外Tat与肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)结合(参考文献26)。在所述碱性区中的突变可消除所述相互作用。Tat的羧基末端部分对于LTR反式激活作用不是必需的，但含有一个通常存在于细胞外基质蛋白(ECM)中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)，使Tat与整联蛋白受体α5β1e αvβ3结合。这些相互作用介导Tat作用于AIDS-相关肿瘤和免疫、血管以及神经系统(参考文献11、42、170、25)。在T细胞的HIV-1急性感染期，或者tat基因转染于COS-1细胞后，在细胞外环境中，不存在细胞死亡的条件下释放Tat蛋白质(参考文献40、41、25)。由于细胞外Tat存在于被感染个体的血清(参考文献164)和AIDS-KS损伤(参考文献42)中，在体内，也可从感染的细胞中释放Tat。释放后，一部分蛋白质仍是可溶的形式，而一部分与ECM的HSPG结合。通过加入肝素可以以可溶形式回收与HSPG结合的Tat。与肝素的结合归因于Tat碱性区；它防止了细胞外Tat的影响并保护蛋白质不被氧化。我们利用该特性纯化具有高生物活性的Tat(参考文献26)。细胞外Tat可以被细胞内化，可迁移到核内并反式激活病毒基因的表达(参考文献49、98、100、41)。通过Tat的RGD区与α5β1和αvβ3的结合而介导的胞吞作用(参考文献10、42，Ensoli等，未公开的数据)和/或与HSPG结合的碱性区使Tat内化。
Tat还可通过与细胞基因表达的调节有关的间接机制来激活病毒复制和病毒传播，所述细胞基因在细胞存活的控制中、对可作用于病毒复制的炎症细胞因子(IC)的表达起关键作用(参考文献25)。
除了在病毒复制的重要性之外，Tat在AIDS的发病机理中起重要作用。通过激活或阻遏细胞因子例如IL-2(参考文献123、163、31)或者在细胞周期中起关键作用的基因(参考文献145、169、164、173)，Tat能够调节感染的和未感染的细胞的存活和增殖。Tat的抗-或前-细胞程序死亡作用取决于许多因素例如细胞类型、Tat被细胞表达或者加至细胞中的事实及其浓度(参考文献40、41、171)。
Tat是使KS在HIV-1感染的个体中高频率发生和攻击性增强的原因(参考文献43、33)。KS是一种血管源肿瘤并且是HIV-感染个体中最常见的瘤形成。Tat诱导KS细胞和IC激活的内皮细胞迁移、表达Ⅳ型胶原酶、侵入ECM以及增殖，所述机制对于血管生成和肿瘤发病是必需的过程(参考文献40、41、42、2、46)。Tat的所述作用是由IC诱导的，因为它们刺激Tat受体α5β1和αvβ3的表达(参考文献10)。Tat可模拟ECM蛋白例如纤连蛋白和玻连蛋白的作用，RGD区和碱性区对于细胞外Tat作用于KS细胞、血管生成作用和KS的进展均是必不可少的。在AIDS-KS损伤中，细胞外Tat体内结合其受体的能力(参考文献40)支持了Tat与AIDS-相关KS发作和维持有关的观点。此外，tat基因的转基因小鼠根据所述转基因的表达水平而发展成KS或其他表型(参考文献160、34)。
据认为，通过涉及bcl-2和细胞因子表达增加的机制(参考文献122)，Tat在常见于血清阳性个体和tat-转基因小鼠中的超增殖现象和B淋巴瘤的发病机理中起作用(参考文献157)。其他证据证实Tat在癌形成中可能发挥作用(参考文献72)。
Tat还可激活病毒启动子例如疱疹病毒的和在AIDS个体复活的其他病毒的启动子的表达，加速机遇性感染的发作和进展(参考文献25)。
Tat似乎还能对中枢神经系统的神经元或者对血脑屏障有直接(通过碱性和RGD区)的神经毒性作用，通过诱导具有毒性作用的IC有间接神经毒性作用(参考文献25)。就针对Tat的免疫反应而言，大量研究表明抗Tat抗体在体内控制疾病的发展过程中起保护作用(参考文献130、135、136、149、127)。此外，在体外，抗-Tat抗体不仅抑制Tat的内化作用、Tat的跨细胞激活作用和病毒感染(参考文献41、127)，而且还抑制小鼠中KS细胞的增殖和Tat诱导的KS细胞迁移以及KS样损伤的形成(参考文献40、41、42)。最后，我们的初步结果表明在AIDS-KS个体中没有抗-Tat抗体，这说明所述个体不能阻断细胞外Tat的活性。
在感染初期，抗Tat细胞介导的反应的发展对于控制感染本身是至关重要的(参考文献161、133、59)，而且在特异性抗-Tat CTL的存在与疾病的进展之间存在负相关(参考文献156)。所述结果是在对SIVmac接种的猕猴的研究中得到的(参考文献91、158)。此外，在将Tat作为质粒或者蛋白质接种的不同种小鼠中所得的最新数据表明，可以诱导针对所述蛋白质的体液和细胞反应(参考文献61)。但是，在数种小鼠间已观察到变异性，而在非人灵长类中用相同的免疫原没有得到那样的结果(参考文献124)。在小鼠中完成的疫苗试验结果在非人灵长类模型中没有重现性是经常的，这可能是由于这两个种之间的免疫系统不同，用相同的免疫原产生不同的免疫反应，正如用HIV Env蛋白质所表明的。因此，用于人的候选疫苗必须在非人灵长类中进行试验，而不能仅在较低等生物中进行试验。
发明人认为其他病毒蛋白或其部分可与Tat结合而提高抗HIV的特异性免疫反应，因此在针对肿瘤和其他疾病以及HIV感染相关症状的发作的接种中也是有益的。所述产物是HIV的Nef、Rev和Gag蛋白质。
Nef是另一种对疾病发展至关重要的病毒调节蛋白(参考文献3、48、58)。Nef在感染后早期产生并释放在细胞外环境中(Ensoli,未公开的数据)。在SIVmac/猕猴系统中，Nef的存在与大量病毒复制和进展为AIDS有关(参考文献71)。Nef比Tat的可变性高(参考文献112)。Nef是一种免疫原性蛋白质(参考文献53、32、35、151)并且能够诱导CTL(参考文献16、36)。特别是已鉴定了一个Nef免疫显性区(区域73-144)，在大多数HIV感染的患者中，由CTLs识别该区域。
Rev是一种在感染期间早期产生的病毒调节蛋白(参考文献51、119)并被释放于细胞外环境中(Ensoli等，未公开的数据)。Rev对于HIV复制和疾病的发展是必不可少的，由两个外显子编码，与Tat-编码区部分重叠。Rev是核蛋白(参考文献44)，对于编码晚期蛋白质的病毒信使RNA的表达是必需的(参考文献97)。Rev在HIV-1的各种病毒分离株间是高度保守的(参考文献111)而且是免疫原性的。事实上，在人的自然感染过程中(参考文献131)和小鼠接种后(参考文献61)，Rev诱导特异性抗体的产生，所述特异性抗体抗所述蛋白质的两个功能结构域(参考文献120)。在感染个体血清中的低水平抗-Rev抗体似乎与AIDS的发展有关(参考文献131)。Rev可在人和猴中诱导CTL(参考文献156、158)，并且已有报导，在感染过程早期，特异性抗-Rev CTL反应与疾病的发展成负相关(参考文献156、158)。
另一个病毒靶是gag基因，它是在感染过程晚期被表达的，并编码一组壳体高免疫原性结构蛋白(参考文献18、147)。在感染的无症状期，抗-Gag抗体滴度高且稳定，当感染发展到成熟的AIDS时达到很低的水平，同时CD4+淋巴细胞减少且外周血中存在病毒(参考文献174、73)。在人和灵长类中，Gag蛋白质在感染过程早期诱导CTL活性(参考文献103、168)，其存在与初期病毒血症的控制和疾病的发展显著相关(参考文献175、6、134、167、92)。最后，p17和p24蛋白质含有保持于不同HIV-1和HIV-2分离株中并由CTL识别的免疫显性表位(参考文献89、19、114、155、115)。
发明人认为，在抗-Tat疫苗的制剂中，可将细胞因子或其部分例如IL-12和IL-15或者其他免疫调节细胞因子例如IFNα或IFNβ或者其他提高Tat免疫原性作用的蛋白质用作佐剂。IL-12是一种由抗原呈递细胞(APC)例如B和树突细胞产生的强免疫调节细胞因子(参考文献154)。IL-12在HIV感染后早期产生并具有诱导NK细胞和T淋巴细胞产生IFNγ的前炎症作用，IFNγ激活吞噬细胞并促进Th1淋巴细胞的诱导作用。IL-12在针对细菌、真菌、病毒引起的大量感染的抗性中起主要作用，而且表现高抗肿瘤活性。一些证据表明诱导免疫抑制的病毒例如HIV和麻疹病毒也可通过抑制IL-12产生的机制发挥作用(参考文献57、50、144)。
IL-15是由非淋巴组织、激活的单核细胞/巨噬细胞和树突细胞(DC)表达的一种多效细胞因子(参考文献125、66)。IL-15在NK活性的调节、T淋巴细胞的增殖和CTL活性中起重要作用(参考文献67、24)。在不存在IL-2和功能CD4+T淋巴细胞的条件下，IL-15诱导抗HIV抗原的CTLs的表达(参考文献68、1)。此外，与IL-2类似，IL-15诱导具有细胞毒性的淋巴细胞(“淋巴因子激活的杀伤细胞”，LAK)的增加并刺激血清阳性患者的PBMCs中IFNγ的产生(参考文献93)。IL-15激活单核细胞产生趋化因子，在炎症过程的发作中起作用(参考文献8)。
最新的研究已表明，用包被有抗-CD3e抗-CD28单克隆抗体的顺磁珠共刺激CD4+淋巴细胞决定HIV感染个体的淋巴细胞的对数和多克隆增加(参考文献82)，而不会激活病毒复制和传播。所述抗病毒活性是负调节CCR5(HIV-1亲单核细胞株的共受体(参考文献23))的表达和用抗CD3和抗CD28单克隆抗体诱导的高水平趋化因子(较低程度上)的结果(参考文献132)。发明人认为，在不存在病毒复制/传播的条件下，可以增加HIV感染个体的自身淋巴细胞，这样可以得到一种有效的来自体内免疫(描述于在实施例中)，这对于开发抗Tat疫苗是非常有益的。
在以产生有效抗病毒和抗肿瘤疫苗为目的的不同系统中，本发明人认为在诱导针对Tat的免疫反应中，树突细胞的利用是关键。这是因为：这些细胞在呈递抗原时最有效，而且在不存在佐剂的条件下是唯一能刺激原初淋巴细胞的细胞(参考文献150)。树突细胞的使用代替了数种佐剂的功能，所述佐剂可诱导非特异性免疫反应(天然免疫)，在存在抗原的条件下，所述非特异性免疫反应反过来产生强的初级特异性反应。
由于HIV感染的传播主要发生在粘膜水平(成人的生殖器和直肠粘膜，新生儿的口腔粘膜)，本发明人认为在粘膜水平诱导保护性免疫是主要目的。最近，许多研究表明可以诱导粘膜免疫，局部的和全身性的均可。具体地讲，已表明在诱导有效的粘膜免疫反应方面，鼻和口途径是最有效的，甚至可以在远端，例如生殖器粘膜(参考文献138、118)中。具体地讲，本发明人认为使用经修饰而表达上述病毒抗原的格氏链球菌(S.Gordonii)和乳杆菌属(Lactobacillus)细菌可能是一种在猴和人中，在粘膜水平诱导或加强特异性免疫反应的有效策略。事实上，这些细菌能够在小鼠口腔和阴道粘膜中移生，并诱导局部和全身的抗在重组细菌表面上表达的异源抗原的特异性抗体反应(参考文献116、104、106、121、117、139、105、107)。最后，这些细菌作为活载体发挥作用，并可诱导对免疫系统的延长的刺激作用。此外，本发明人认为可以用非复制型和非致病性重组病毒载体，例如单纯性疱疹病毒1型(HSV-1)(参考文献99)表达用于全身(皮内)和粘膜(口腔、阴道和鼻途径)免疫的病毒蛋白。事实上，这些载体可以容纳较大的外源序列(参考文献52、64)，例如数个HIV基因(调节、辅助和结构基因)。此外，疱疹载体还可以经口、鼻或阴道途径给药(参考文献176、75)。
本发明人认为可将Tat(蛋白质或DNA)单独地或与上述其他免疫原结合地利用新的送递系统例如红细胞或纳米颗粒进行接种。具体地讲，本发明人认为可以送递与自身红细胞的膜结合的抗原(参考文献95、96)。由于这些红细胞仅在120天后，通过巨噬细胞、专职抗原呈递细胞从血液中除去，因此，可将该特征用于疫苗。最后，另一种送递方法是使用可以携带蛋白质和DNA的纳米颗粒(参考文献27、172)。纳米球体(nanospheres)是具有多种化学组成的聚合胶体颗粒，从10至1000nm不等。可将不同的物质(寡核苷酸、药物、蛋白质、肽、DNA)负载在其表面上或吸附在颗粒中，然后送递到它们将被缓慢释放的胞质或细胞核中。这样可以使用很少量的待送递物质。
基于上述结果，本发明人认为在存在或不存在佐剂的条件下，用Tat，单独或者与其他病毒产物或者免疫调节剂细胞因子结合或其部分进行免疫，可以阻断在接种后暴露的个体中和感染的个体中的病毒复制，将感染保持在流产期(abortive phase)，这样更容易通过免疫系统控制。因此，本发明人认为以Tat为基础的疫苗应该能够诱导体液和细胞免疫反应，从而足以阻断或降低病毒的复制或传播，由此能够控制病毒复制并阻断生产性感染、疾病的发展以及肿瘤和其他AIDS-相关综合征和症状的发作。因此，可以将抗Tat疫苗用于预防和治疗目的。事实上，抗Tat体液反应可以中和细胞外Tat的作用，降低和限制感染，而细胞诱导的抗Tat及抗包封在疫苗制剂中的其他病毒蛋白质的反应可以破坏病毒感染的细胞，从而控制感染。这样在没有因病毒复制引起的不可逆损伤的情况下，给免疫系统一段必要的时间以发展出针对感染病毒的所有病毒组分的完全的反应。
已描述过用Tat作为免疫原(WO 95/31999)。但是，该文献公开了使用没有生物学活性的蛋白质；此外，在同一专利申请中，没有给出有关“天然”Tat蛋白质的生物活性的证据。
另外，对于使用有生物活性的Tat蛋白质有强烈的技术偏见，即认为会提高感染个体中的病毒复制和/或在血清阴性或血清阳性个体中产生免疫抑制(A.Tonelli：Aids,un vaccino per sperare.“LaRepubblica”,pag.10,24 Oct.1998)。
正如上述所表明的，尽管做了努力，但是迄今为止仍没有开发出以Tat为基础的抗HIV疫苗。
本发明综述
本发明的目的之一是用作疫苗的Tat蛋白质或Tat肽或Tat DNA，Tat必须是生物活性形式。
本发明另一目的是可用于人的蛋白质或肽疫苗，所述疫苗用于预防或治疗AIDS、AIDS-相关肿瘤和HIV-相关综合征和症状，所述疫苗由按所述表达和纯化的重组野生型Tat蛋白质或其突变体(Seq.1-5)或者野生型或突变Tat肽(Seq.1-7)组成，单独施用或者与T辅助破伤风类毒素表位或者其他T辅助表位结合施用。
本发明的另一目的是上述疫苗，与重组HIV Nef,Rev和/或Gag蛋白质或Nef,Rev和Gag肽组合，作为Tat/Nef,Tat/Rev,Tat/Gag融合蛋白或这些蛋白质的部分施用。
本发明的另一目的是上述疫苗，与免疫调节剂细胞因子重组蛋白如IL-12、IL-15或者其他分子或其部分组合，能够提高抗病毒免疫反应，或者由Tat/IL-12，Tat/IL-15或者Tat/其他融合蛋白或其部分组成的疫苗，能够提高抗病毒免疫反应。
本发明的另一目的是施用于人的DNA疫苗，用于预防或治疗AIDS、AIDS-相关肿瘤和HIV相关综合征和症状，所述疫苗由编码野生型Tat或其突变体(Seq.1-5)的载体，或其部分组成，插入在表达质粒载体pCVO或其他载体中。
本发明的另一目的是DNA疫苗，如在4中描述的，与HIV rev,nef或gag基因或其部分组合，插入在pCVO载体中，或者是作为共表达tat/rev,tat/nef,tat/gag基因或其部分的载体施用的DNA疫苗。
本发明的另一目的是上述DNA疫苗，与编码IL-12和IL-15的DNA或编码免疫调节剂细胞因子或其部分的其他基因组合，插入在pCVO或其他载体中，或者作为共表达Tat/IL-12、Tat/IL-15或Tat/其他分子的载体或其部分施用的DNA疫苗，能够提高抗病毒免疫反应。
本发明的另一目的是作为蛋白质、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，按上述单独或组合用于通过来自体内处理免疫接种自体树突细胞。
本发明的另一目的是作为蛋白质、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，按上述单独或组合，用于粘膜免疫接种(鼻、口、阴道或直肠)。
本发明的另一目的是作为蛋白质、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，按上述单独或组合，用于来自体内免疫接种来自感染个体的外周血细胞，所述血细胞通过用与顺磁珠偶联的抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激来增加(expand)，然后再回输给宿主。
本发明的另一目的是上述作为蛋白质、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，与病毒复制抑制剂组合。
本发明的另一目的是已描述过的抗Tat疫苗，与提高免疫反应的佐剂组合。
本发明的另一目的是抗Tat疫苗，按上述单独或组合，通过特定的送递系统，例如纳米颗粒、疱疹载体、红细胞、细菌或者可以施用上述疫苗所有组合的任何送递系统施用。
从本发明的详细描述中，可以发现其他目的。
附图简述
图1A.通过将细胞因子激活的内皮细胞与抗整联蛋白抗体预保温，摄入10ng/ml罗丹明化(rhodaminated)Tat蛋白质的抑制作用。
图1A.A组，与缓冲液预保温，与BSA保温的细胞。
图1A.B组，与缓冲液预保温，与Tat保温的细胞。
图1A.C组，与单克隆抗体CDw49e和CD29预保温，与Tat保温的细胞。
图1A.D组，与单克隆抗体CD51和CD61预保温，与Tat保温的细胞。
图1A.E组，与抗人Ⅷ因子抗体(对照抗体)预保温，与Tat保温的细胞。
图1B.通过cat试验监测的，纯化Tat-cys22(Tat22)蛋白质与野生型Tat蛋白质的反式激活活性竞争的能力。
图2A.在用Tat蛋白质接种的猴中，抗Tat特异性IgG的生产，用免疫酶检测(ELISA)确定。用两个皮下(sub-cute)接种重悬在250μl自体血清或250μl RIBI中的10或100μg重组Tat蛋白质的猴子得到的结果。
图2B.在用Tat蛋白质接种的猴中，抗Tat特异性IgG的生产，用免疫酶检测(ELISA)确定。对照猴子(M3)的结果。
图3.在用图2A和图2B所述的100(M1)和10(M2)μg重组Tat蛋白质接种的猴子血浆中，抗Tat抗体的滴度。
图4A.由图2A和图2B所述的100(M1)和10(M2)μg重组Tat蛋白质注射的猴子的抗Tat IgG识别的Tat表位图谱。表示出对测试两次的每种肽稀释1∶50的血浆的平均结果。
图4B.根据图4A的图谱。列出了血浆中的抗体滴度，表示为在检测仍是阳性的最高稀释度的倒数。
图5.用Tat蛋白质接种的猴子中，特异性抗Tat体液IgM反应的分析，通过ELISA确定的。
图6.用Tat蛋白质接种的猴子中，特异性抗Tat IgG生产的分析，用ELISA检测。
图7.存在图6所述RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)的条件下，用重组Tat(10μg)接种的猴子血浆中，抗Tat抗体的滴度。
图8A.由按图6所述接种的猴子的抗Tat IgG识别的Tat表位。结果指1∶50稀释的样品并且是两个孔的平均值。
图8B.根据图8A的Tat表位。结果指图8A所示的血浆滴度并表示为在检测仍为阳性的最高血浆稀释度的倒数。
图9.Tat特异性CTL的分析。
图10.用皮肤试验分析对Tat的延迟超敏反应。
图11A.在用Tat DNA接种的猴中，对Tat的体液IgG反应。所列的结果得自用200(M1)和500(M2)μg pCV-Tat质粒接种的两个猴子。
图11B.在用Tat DNA接种的猴中，对Tat的体液IgG反应。结果来自对照猴(M3)。
图12.在用200μg pCV-Tat皮内(i.d.)接种的猴子M2的血浆中，抗Tat抗体的滴度。
图13.分析用1mg pCV-Tat接种的3只猴子(M9-M11)和用1mg对照载体pCV-0接种的1只对照猴子(M12)中，抗Tat IgG的生产。
图14.Macaca fascicularis的PBMC对用在顺磁珠上的抗CD3和抗CD28单克隆抗体(抗-CD3/28珠)共刺激的增殖反应动力学。
图15A.用抗-CD3/28珠共刺激对Macaca fascicularis PBMC的抗病毒作用。猴MK 193。
图15B.用抗-CD3/28珠共刺激对Macaca fascicularis PBMC的抗病毒作用。猴MK D91。
图15C.用抗-CD3/28珠共刺激对Macaca fascicularis PBMC的抗病毒作用。猴MK 9301。
图15D.用抗-CD3/28珠共刺激对Macaca fascicularis PBMC的抗病毒作用。猴MK 9401。
图16A.从猴外周血得到的树突细胞(DC)的功能特征。在同种异型混合的白细胞培养物(AMLR)的4天掺入3H-胸苷。
图16B.从猴外周血得到的树突细胞的功能特征。用来自另一猴的T淋巴细胞攻击按图16A报导所得的APCs，例如DC和Mφ。
本发明的详细描述
本发明涉及以Tat作为活性物质用于预防和/或治疗HIV感染、HIV感染个体的AIDS发展和肿瘤及其他综合征和症状的发展的疫苗。Tat或者野生型Tat呈其活性形式，或者更正确地说，是作为重组蛋白质或肽或者DNA的生物活性形式(如下文解释的)。更具体地讲，本发明涉及以作为免疫原的HIV-1Tat为基础的疫苗，作为DNA和/或重组蛋白质或肽接种，单独使用或者与其他基因或病毒基因产物(Nef,Rev,Gag)或其部分组合，或者与各种免疫调节剂细胞因子(IL-12，IL-15)或者与编码免疫调节剂细胞因子的基因或其部分组合。将Tat、Nef、Rev、Gag和免疫调节剂细胞因子作为重组蛋白、肽或融合蛋白的混合物(Tat/Nef、Tat/Rev、Tat/Gag、Tat/IL-12、Tat/IL-15)或者作为质粒DNA施用。
在本发明描述中，认为野生型Tat”和“活性形式的Tat”与“生物活性Tat”是同义词。
根据本发明，“生物活性Tat”指皮摩尔至纳摩尔浓度(从10ng/ml或更低至1μg/ml，优选0．1ng/ml至100ng/ml)的蛋白质能够：
(ⅰ)进入并定位在活化的内皮细胞或树突细胞的核中，如在实施例1A中所测量的；
(ⅱ)激活卡波济肉瘤(KS)细胞的增殖、迁移和侵入和细胞因子激活的内皮细胞蛋白(参考文献40，2)；
(ⅲ)当加入到感染细胞中时激活病毒复制，这是a)通过加入外源蛋白质后，HLM-1细胞中Tat-缺陷型原病毒的获救(参考文献41)；b)通过反式激活HIV-1启动子-报道基因质粒转染的细胞中的HIV-1基因表达(参考文献41)而度量的；
(ⅳ)在存在血管生成因子或炎症细胞因子的条件下，在小鼠中诱导KS样损伤的发展(参考文献42)。
本发明人认为作为生物活性Tat，必须应具备(ⅰ)或(ⅱ)之一，优选，应具备这两点，更优选应具备(ⅰ)或(ⅱ)或者同时具备这两点以及(ⅲ)a)和/或(ⅲ)b)。当具备(ⅰ)至(ⅳ)点时，可以得到最好的结果。Tat蛋白质或者具有这些特征的Tat片段能够体内诱导细胞毒性和抗病毒免疫反应。事实上，具有上述特征的生物活性Tat能够结合特异性的细胞表面受体并经这些受体而被摄入。Tat摄入对于诱导细胞毒性反应是必需的。
以前或正在进行的研究，与基于Tat的疫苗的发展有关，尚未利用具有上述特征的生物活性Tat蛋白质。
在实施例1中描述了获得并处理本发明生物活性Tat的方法。
还描述了利用自体树突细胞的免疫接种方法，所述树突细胞单独用重组Tat蛋白质或其肽，或者用重组蛋白质或肽的混合物(Tat、Nef、Rev、Gag)或者用Tat蛋白质与一种或多种免疫调节剂细胞因子，或其部分进行来自体内处理，或者用仅含tat基因或还含有编码Nef，Gag或Rev的病毒基因，或者tat和编码免疫调节剂细胞因子或其部分的基因的真核载体转导所述树突细胞。
还描述了在粘膜水平诱导免疫反应的方法。将Tat或其肽，单独或者与病毒蛋白和/或细胞因子组合，在粘膜水平接种以提高并诱导局部免疫反应。还可用HIV-1Tat蛋白质或其亚单位来自体内免疫接种从感染个体外周血分离的CD4+和CD8+淋巴细胞。然后通过用抗CD3和CD28的单克隆抗体共刺激来体外扩增Tat抗原特异性细胞，然后再回输。最后，还描述了在实施例中鉴定的Tat突变体用作免疫原，作为Tat野生型的替代物的用途。Tat突变体是ⅰ)在半胱氨酸区(cys22)和ⅱ)在核心区(lys41)，ⅲ)在RGD序列缺失的突变体；ⅳ)在赖氨酸41和RGD缺失的双突变体。在治疗接种的情况下，利用Tat突变或Tat肽(野生型或突变的蛋白质)的另一种方法是同时用病毒复制抑制剂和免疫原。
在此，“病毒复制抑制剂”指目前已知的所有分子，或者此后将发现的能够减少或阻断HIV复制的分子(反转录酶的核苷和非核苷抑制剂，蛋白酶抑制剂，反义RNA，以及一般能够阻断HIV基因表达的所有分子)。如前所述，描述了不同的免疫接种方法，所述方法将Tat蛋白质、肽和Tat DNA与其他病毒基因或蛋白质，或其部分，或者免疫调节剂细胞因子或者编码免疫调节剂细胞因子的基因，或其部分组合。“其部分”指上述基因或蛋白质的片段，其诱导完整基因或蛋白质的相同免疫原性作用的效力已被说明。此外，由于佐剂在疫苗方案中的效力是已知的，因此，本发明涉及已知佐剂和此后将发现的佐剂的使用，所述佐剂与Tat(蛋白质或DNA)以及与Tat和其他基因或病毒或细胞蛋白质的组合一起施用。同样，假定Tat(蛋白质或DNA)以及Tat与其他基因或病毒或细胞蛋白质的组合的不同送递系统在诱导针对Tat的全身和局部免疫反应(粘膜免疫)方面的效力。
本发明人的结果(未公开过)表明只有生物活性形式的Tat蛋白质能够结合特异性的细胞受体并进入细胞。该特征是辅助细胞，而且更一般的是免疫细胞的免疫反应的基础，根据本发明人的结果，它在诱导比失活蛋白质所能够引发的免疫反应强很多的免疫反应方面是非常重要的。结果，与一些科学家建议的用失活Tat作为免疫原不同，本发明人利用生物活性形式的HIV-1Tat或其突变体诱导很强的抗HIV免疫反应，能够预防感染或者疾病的发展并可以在HIV-1感染的个体中进行有效的治疗。根据本发明人的观点，通过全身(肌内、皮内、皮下等)或局部(粘膜)途径可以送递疫苗。当用细菌(见下文)作为送递系统时，后一种途径是优选的。可按如下方法生产疫苗。按照实施例1所述制备Tat，将Tat冻干并储存。在使用时，可将其重悬在生物学可接受的流体，例如血清、血浆或其他级分中。
本发明还包括含前述Tat的表达载体或Tat突变体的表达载体，或其部分的转化细胞以及经培养表达Tat蛋白质的细胞，分离所述Tat蛋白质加以利用。
所有具有与上述类似的或高于上述活性的Tat变体(包括所有HIV株型和亚型)均包括在本发明中。
下面借助说明性而非限制性的具体实施例来描述本发明，其中将参考附图。附图的详细描述
图1A．通过将细胞因子激活的内皮细胞与抗整联蛋白抗体预保温，摄入10 ng/ml罗丹明化Tat蛋白质的抑制作用。将按照表2A注所述处理的细胞因子激活的人脐静脉(HUVE)细胞在含缓冲液或抗体的无血清培养其中预保温，然后在37℃，与10ng/ml罗丹明化Tat或者罗丹明化BSA保温15分钟。
A组，与缓冲液预保温，与BSA保温的细胞。
B组，与缓冲液预保温，与Tat保温的细胞。
C组，与单克隆抗体CDw49e(抗-α5)和CD29(抗-β1)预保温，与Tat保温的细胞。
D组，与单克隆抗体CD51(抗-αv)和CD61(抗-β3)预保温，与Tat保温的细胞。
E组，与抗人Ⅷ因子抗体(对照抗体)预保温，与Tat保温的细胞。
图1B．通过cat试验监测的，纯化Tat-cys22(Tat22)蛋白质与野生型Tat蛋白质的反式激活活性竞争的能力。将含HIV-1 LTR-CAT报导基因(参考文献148)的H3T1细胞与野生型Tat蛋白质(100ng)单独保温，或者在有摩尔过量Tat-cys22蛋白质(1μg)的条件下保温。在转染后48小时，按所述(参考文献41)，通过确定胞质提取物(相当于200μg蛋白质)中的cat活性来确定Tat的HIV-1 LTR反式激活活性和Tat-cys22蛋白质与野生型Tat竞争的能力。标明了在14C-氯霉素乙酰化作用中的百分比(％)。
图2．在用Tat蛋白质接种的猴中，抗Tat特异性IgG的生产，用免疫酶检测(ELISA)确定。(A)表示用两个皮下接种重悬在250μl自体血清和250μl RIBI中的10或100μg重组Tat蛋白质的猴子得到的结果；(B)表示对照猴子(M3)的结果。在0时和2、5、10、15、22、27、32和37周后，对猴接种。用10μg Tat蛋白质接种的猴子M2，在41周时评估抗Tat抗体，对猴子M3进行同样的试验。
通过按下述制备和表征的ELISA评估接种动物血浆中是否存在抗Tat抗体。将Tat蛋白质在PVC-96孔平板(在0．05 M 200μl碳酸盐缓冲液pH9．6中，100ng/孔)中于4℃吸附12小时。用含吐温20(0．05％)不含Ca++和Mg++的PBS 1x(PBS-A)洗涤3次后，加入用200μl碳酸盐缓冲液1∶50稀释的血浆(双份)，然后在37℃将平板保温90分钟。然后用PBS-A lx/吐温0．05％洗涤孔，然后加入100μl与辣根过氧化物酶结合的二级抗体(用PBS-A 1x/吐温0.1％/BSA 1％以1∶1000稀释)，在室温保温90分钟。将孔洗涤5次后，在室温，30-45分钟内，加入100μl底物(ABTS 1mM，Amersham)。用分光光度计(405nm)读数。每个ELISA包括1∶200-1∶6400稀释的抗Tat兔多克隆血清(阳性对照)，和以1∶50稀释的预免疫血浆(阴性对照)。将截断值计算为在所有用预免疫血浆的试验中得到的阴性猴血浆的光嘧啶(O.D.)的平均值+3个标准偏差(S.D.)。所列的结果是两个孔的平均值。＞2，7表明光密度值不按比例。
图3.在用图2所述的100(M1)和10(M2)μg重组Tat蛋白质接种的猴子血浆中，抗Tat抗体的滴度。
按图2所述完成ELisa，检测的血浆(一式两份)从1∶50至1∶25.600按比例稀释。
纵坐标上的值表示在检测仍为阳性的最高血浆稀释度的倒数。计算每个稀释度的截断值，然后与来自所有试验所有猴的预免疫血浆的平均O.D.+3S.D.相对应。
图4.由图2所述的100(M1)和10(M2)μg重组Tat蛋白质注射的猴子的抗Tat IgG识别的Tat表位图谱。为了制作表位图谱，用对应于Tat氨基酸(aa)1-20、21-40、36-50、46-60、52-72、56-70、65-80、73-86的8个合成肽完成ELisa。在4℃，将各100μl的每种肽(10μg/ml，在PBS-A/0.1％BSA中)经12小时吸附到PVC 96孔平板上。然后洗涤平板并与100μl PBS-A/3％BSA在37℃保温2小时。保温后，用PBS-A/0.05％吐温20洗涤平板，然后将用PBS-A和3％BSA稀释的50μl血浆加到各孔中。然后按图2所述继续ELisa。在初次免疫接种后37周得到血浆。计算各肽和各血浆稀释度的截断值，与所有试验中预免疫血浆的平均O．D．+3 S.D.相对应。(A)表示一式两份各待测肽的1∶50稀释的血浆的平均值；(B)表示(A)中所示血浆的抗体滴度，表示为在检测仍是阳性的最高稀释度的倒数。
图5．分析用Tat蛋白质接种的猴子中，特异性抗Tat IgM反应并通过ELISA确定。给3只猴子(M1-3)皮下接种10μg重悬在250μl自体血清和250μl RIBI中的重组Tat蛋白；给3只猴子(M4-6)皮下接种10μg重悬在250μl自体血清和250μl Alum中的重组Tat蛋白；2只对照猴子用RIBI(250μl和250μl自体血清)(M7)或用Alum(250μl和250μl自体血清)(M8)皮下接种。在0时和2、6、11和15周后给猴子接种。在2、6、11和15周研究是否存在抗体。ELISA方法描述于图2中。在这种情况下，以1∶100稀释度检测(一式两份)动物血浆，用与辣根过氧化物酶结合的IgM山羊抗猴血清(以1∶1000稀释的)作为二级抗体。
将截断值计算为预免疫血浆的O.D.值的平均值(+2S.D.)。结果是两个孔的O.D.值(在405nm)的平均值减去截断值(ΔO.D.405)。
图6.用Tat接种的猴子中，特异性抗Tat IgG生产的分析，用ELISA检测。给3只猴子(M1-3)接种10μg重悬在250μl自体血清和250μlRIBI中的重组Tat蛋白；给3只猴子(M4-6)接种10μg重悬在250μl自体血清和250μl Alum中的重组Tat蛋白；2只对照猴子用RIBI(250μl和250μl自体血清)(M7)或用Alum(250μl和250μl自体血清)(M8)接种。在0时和2、6、11、15、21、28和32周后给猴子接种。在36周，用16μg重悬在200μl ISCOMs和300μl PBS中的Tat蛋白质给猴子M1至M6接种。在40和44周评估抗体。在图2中描述了ELISA方法和截断值的确定方法。所列的结果指1∶50稀释的样品。＞2，7表示O.D.值不按比例。
图7.存在图6所述RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)的条件下，用重组Tat(10μg)接种的猴子血浆中，抗Tat抗体的滴度。以检测仍为阳性的最高血清稀释度的倒数列出了每个血浆的结果。
图8.存在图6所述RIBI(M1-M3)或Alum(M4-M6)的条件下，由用重组Tat蛋白质(10μg)接种的猴子的抗Tat IgG识别的Tat表位。在初次免疫接种后21周获得血浆。在图4中描述了ELisa方法和截断值的确定。(A)中的结果指1∶50稀释的样品并且是两个孔的平均值。(B)中的结果指(A)所示的血浆滴度并表示为在检测仍为阳性的最高血浆稀释度的倒数。
图9.Tat特异性CTL的分析。按表5所述完成检测。所列的是按图6所述，皮下注射10μg Tat和RIBI的猴子M1在第36周的实例。方块(对照)对应于与未脉冲的BLCL靶细胞一起保温的细胞；菱形对应于与用Tat(1μg／250.000细胞)脉冲的BLCL靶细胞一起保温的细胞。
图10.用皮肤试验分析对Tat的延迟超敏反应。将重悬在150μl含0.1％BSA的PBS中的Tat蛋白质(5，1和0.2μg)或者其中重悬Tat的缓冲液皮内(i.d.)接种于动物背部刮过的区域。在0时和24、48和72小时后给该区域拍照。对照猴子仅接种缓冲液。所列的是猴子M2(15周)的实例，按图6所述，该猴子用10μg Tat和RIBI接种。在皮肤试验后48小时，对Tat的阳性反应明显。
图11.在用200μg重悬在150μl PBS-A中的pCV-Tat质粒皮内接种的1只猴子(M1)中，对Tat的体液IgG反应，在靠近腋淋巴结的两个位点接种；给1只猴子(M2)注射500μg重悬在250μl PBS-A中的pCV-Tat，在背部的两个位点进行肌肉内注射；对照猴子(M3)不接种Tat DNA，但接受用Tat的重复皮肤试验作为特异性的对照。在0时和5、10、15、22、27、32和37周后，用pCV-Tat给猴子注射。最后，在42周后，用重悬在200μl ISCOMs和300μl PBS中的重组Tat蛋白质(16μg)给猴子加强接种。在2、5、10、15、22、27、32、37、42、48和58周评估抗体。按图2所述用ELisa分析血浆中(1∶50)的抗Tat抗体反应。结果是两个孔的平均OD值。(A)表示得自用200(M1)和500(M2)μgpCV-Tat质粒接种的两个猴子的结果。(B)表示对照猴子(M3)的结果。
图12.在用200μg pCV-Tat皮内(i.d.)接种的猴子M2的血浆中，抗Tat抗体的滴度。图2中描述了ELisa。将纵坐标上的结果表示为在检测仍为阳性的最高稀释度的倒数。
图13.分析用1mg pCV-Tat接种的3只猴子(M9-M11)和用1mg对照载体pCV-O接种的1只对照猴子(M12)中，抗Tat IgG的生产。将DNA重悬在1毫升PBS-A中，然后在背部的两个位点进行肌肉内注射。在0时和6、11、15、21、28和32周给猴子接种。在第36周，用16μg重悬在200μl ISCOMs和300μlPBS中的重组Tat蛋白质给猴子M9-M11加强接种。在2、6、11、15、21、28、32、36、40和44周评估是否存在抗Tat抗体。在图2中描述了ELisa和截断值的确定。
图14.Macaca fascicularis的PBMC对用在顺磁珠上的抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体(抗-CD3/28珠)共刺激的增殖反应动力学。用免疫磁测定法耗尽PBMC的CD8阳性亚种群。此后，将半数耗尽抗-CD8的淋巴细胞用PHA和IL-2(40U/ml)刺激，从第3天开始；让剩余的部分粘附在抗-CD3/28-包被珠抗体上，由此得到CD8-耗尽的及CD3/28阳性淋巴细胞种群。从培养第10天开始，将IL-2(40U/ml)加至该细胞级分中。每2-3天计数细胞并确定其存活力。将珠：细胞比例保持稳定。记录不同时间点的细胞数。
图15.用抗-CD3/28珠共刺激对Macaca fascicularis PBMC的抗病毒作用。按实施例7所述刺激通过图14中所述方法得到的4只猴子(图15A至15B)的CD8-耗尽的和CD8-耗尽的CD3+/CD28+淋巴细胞。在0天，将两种级分用0.1 M.O.I.SIVmac251/63M体外感染。用PHA和IL-2(自第3天加入)，用抗-CD3/28珠(而不加入外源IL-2)进行刺激。按实施例7所述，通过感染后第6和12天确定细胞上清液中p27水平(ng/ml)来评估病毒生产。(亮灰色PHA+IL-2，深灰色在PBMC CD8-/CD3+/CD28+上的抗-CD3/28珠)。
图16.从猴外周血得到的树突细胞(DC)的功能特征。(A)在同种异型混合的白细胞培养物(AMLR)的4天掺入3H-胸苷，与在Percoll梯度上分离并粘附在塑料上后，从Macaca fascicularis PBMC得到的DC和巨噬细胞(Mφ)抗体呈递功能(APC，确定为诱导同种异型T细胞的增殖)相比。除去未粘附的细胞，通过每3天加入GMCSF(200ng/ml)和IL-3(200单位/ml)诱导粘附细胞成熟成DC。除去一半培养基(RPMI，10％FCS)，然后每3天用新鲜培养基代替。6-7天后，观察细胞因子-诱导的细胞的形态学改变，要求典型的DC表型(丧失粘附，成簇，伸出)，再通过确定典型的膜标记物来确定(数据未给出)。单核细胞不用细胞因子诱导，在相同的培养基中培养所述单核细胞，每3天替换培养基。细胞保持单核细胞-巨噬细胞特征，例如粘附。在第7天，用通过Ficoll和Percoll梯度和粘附纯化的来自人血供体的T-淋巴细胞攻击这两种细胞种群，然后冷冻。用48孔平板完成细胞增殖试验。用5000 DC或Mφ(T∶APC比率=100∶1)刺激50万T-淋巴细胞。培养4天，然后将固定份数的细胞悬浮液转移到96孔平板中，一式三份。加入1μCi 3H-胸苷，经16小时，用β计数器确定掺入前体的每分钟计数(cpm)。
(B)按上述有关人供体的报导，用来自另一猴的T淋巴细胞攻击按图16A报导所得的APCs，例如DC和Mφ。与Mφ相比，呈递抗原的能力较高是DC的典型特征。将APCs以比例浓度加至T淋巴细胞中以便评估不同T∶APCs(DC或Mφ)比例得到的增殖反应。
下列实施例是说明性的，而不是为了限制本发明的范围。实施例1.表达、纯化并表征野生型Tat蛋白质(ⅢB分离物)、突变的Tat蛋白质和野生型Tat肽
过去由于易于氧化、聚集和失活，因此在纯化和保持Tat蛋白质的生物学活性方面遇到了许多困难。这是由于存在大量可形成分子内-和分子间键，并由此改变了天然蛋白质的构象的半胱氨酸残基(参考文献159、41)。已经将Dr.J.F.DeLamarter和B.Allet(Glaxo Institute forMolecular Biology S.A.,Ginevra,Svizzera)提供的、已克隆在pL-syn载体中的cDNA或tat基因(Sep.1.实施例2)于在大肠杆菌中表达该蛋白质。
为了达到用Tat有效免疫以便用于疫苗的目的，本发明人认为最重要的是得到在“本发明详细描述”部分所述的生物活性Tat蛋白质。因此，在本实施例和下文实施例1B、2和3中所述的生产和纯化Tat的方法描述了得到生物活性Tat蛋白质所必需的过程和控制，生物活性Tat蛋白质是一种有效的免疫原以免受HIV感染、AIDS或者HIV-相关疾病的发展。
用于得到活性蛋白质的第一种方法是以高压液相色谱和液体及离子交换色谱的连续步骤(参考文献15、41)为基础。用这些方法得到的蛋白质纯度高于95％，而且是活性蛋白质(参考文献41、42)。
但是由于蛋白质的氧化作用，每批之间没有良好的重现性，而蛋白质的氧化作用是商业Tat制备中的主要问题。由于我们观察到Tat蛋白质的碱性区对肝素有强亲和性而且肝素可防止其氧化，因此，我们用肝素亲和色谱并定义了一种新的Tat纯化方法，如Chang等(参考文献26)所述。用Ultrasonic Liquid Processor(Model XL2020，Heat SystemInc)，放电3次，每次20秒，在40毫升溶解缓冲液(磷酸氢二钠20mM，pH7.8；2.5％甘油；PMSF 0.2mM；DTT 5mM；甘露糖醇50mM；抗坏血酸10mM；氯化钠500mM)中，对表达Tat的大肠杆菌细胞(10gr重)进行声处理。将溶解产物以12000g离心30分钟，然后将上清液与2毫升用溶解缓冲液预洗涤的肝素sepharose树脂在室温一起保温1小时。将树脂负载到玻璃柱上，然后用溶解缓冲液洗涤直到在洗涤介质中检测不到蛋白质。用含2M氯化钠的溶解缓冲液洗脱结合的物质，然后以1毫升收集洗脱液。通过凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱蛋白质的均匀性。在-70℃将纯化的蛋白质冻干保藏，在使用前重悬在脱气缓冲液中。
通过在HLM-1细胞中的病毒感染“获救”试验来评估根据上述方法得到的纯化Tat蛋白质的生物活性，所述HLM-1细胞衍生于Hela-CD4+细胞，含有tat基因缺陷型的原病毒，是按Sadaie等所述得到的(参考文献140)。Ensoli等(参考文献41)所述的病毒感染“获救”试验是指通过加入外源Tat蛋白质(2μg/ml)在HLM-1细胞(2×105)中补足Tat表达的缺陷，然后通过确定在用试剂盒加入外源Tat蛋白质48小时后，培养基中释放的p24抗原来评估病毒复制。Chang等(参考文献26)描述的“获救”试验的结果表明用本方法纯化的Tat蛋白质具有活性，而且与以前描述的方法(参考文献40、41、42)相比，该纯化方法就Tat的纯度和生物活性而言，更好、更容易且更便宜。
将上述纯化的不同重组Tat制品在存在弗氏佐剂的条件下，按照标准方法(参考文献4)给小鼠和兔接种。在表1中列出免疫接种诱导的抗体反应的结果。表1分析用重组Tat蛋白质免疫的小鼠和兔血清中的抗Tat特异性抗体反应抗Tat抗体             OD-ELISA／Tat              Western印迹1∶500     1∶1000    1∶2000兔        0.651      0.400      0.175             +小鼠      0.502      0.240      0.150             +
用在大肠杆菌中生产的重组Tat蛋白质按照标准免疫方法(参考文献4)免疫接种小鼠和兔。使用3个稀释度(1∶500-1∶2000)用ELISA分析免疫动物的血清中是否存在抗Tat抗体。所述结果是2个兔和3只小鼠在405nm读数的平均值。此外，用重组Tat蛋白质(100ng)通过Western印迹检测血清。
表1中的结果表明我们制备的重组Tat能够在这两种动物中诱导抗体反应，正如用使用了重组Tat蛋白质的ELISA和Western印迹所检测的。所述抗体能够抑制Tat的内化和生物活性(参考文献40、41、42)。用pL-syn载体和Tat蛋白质的纯化方法表达并纯化实施例2所述Tat突变体。按上述对野生型Tat蛋白质的描述，通过HLM-1细胞中的病毒感染“获救”试验、KS细胞和小鼠体内增殖试验测量突变和活化Tat蛋白质的生物活性。此外，在存在野生型Tat(系列浓度)的条件下，检测突变Tat蛋白质以证明对病毒复制的阴性反式显性(transdominant)作用。用pL-syn载体和纯化方法表达并纯化以下类型的融合蛋白：Tat(野生型或其突变体)/IL-12或者Tat(野生型或其突变体)/IL-15或其部分或者Tat(野生型或其突变体)/其他分子(或其部分)，单独或与其他病毒产物组合时，能够提高对Tat的免疫反应。利用实施例2和3中所述的序列和引物制备融合重组分子。或者，用合成肽作为免疫原，所述合成肽对应于Tat或者与Tat组合的其他病毒产物或者细胞因子的区域。Tat的肽序列是：Pep.1.MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTPep.2.ACTNCYCKKCCFHCQVCFITPep.3.QVCFITKALGISYGRKPep.4.SYGRKKRRQRRRPPQPep.5.RPPQGSQTHQVSLSKQPep.6.HQVSLSKQPTSQSRGDPep.7.PTSQSRGDPTGPKE
Tat突变体肽含有实施例2所述的突变Tat蛋白质的相同氨基酸取代。将所述肽与代表破伤风类毒素的通用T辅助表位的肽或者代表T辅助表位的其他肽组合使用(参考文献77)。
实施例1A·由整联蛋白受体介导通过激活的内皮细胞摄入皮摩尔浓度(10至100ng/ml)的生物活性Tat
当用炎症细胞因子体外激活正常内皮细胞时，它们变得对细胞外的Tat作用有反应性，而且这是由于α5β1和αvβ3整联蛋白的诱导(参考文献9、10)。同样，炎症细胞因子(IC)或bFGF体内提高整联蛋白在内皮细胞上的表达，这样当将生物活性Tat同时或在bFGF后接种给小鼠时，可以产生协同的KS-促进作用(参考文献42)。另外，IC-激活的内皮细胞获得APC功能。
在本实施例中，表明用IC激活的内皮细胞能够更有效地摄入罗丹明化生物活性Tat，而且是由整联蛋白受体介导的。
由于很难观察低浓度的冷Tat的内化作用，因此，用罗丹明(rhodamin)标记所述蛋白质(参考文献98)。在与未标记的Tat相同的浓度范围内，罗丹明化Tat仍有KS细胞增殖的激活作用，这表明标记方法不影响其生物学功能。按下列方法完成Tat摄入试验：按所述使人脐静脉(HUVE)细胞生长并用IC处理5天(参考文献9、46)。然后将细胞胰蛋白酶化处理，以0.5×105细胞／孔铺在8孔玻片(Nunc Inc.,Naperville,IL)上，然后在含15％胎牛血清(FBS)的培养基中，存在IC的条件下保温18小时。加入无血清培养基(SF,RPMI,1％BSA,0.1％抗生素，两性霉素)，然后在4℃，将玻片预保温2小时。将含系列稀释的罗丹明化Tat的新鲜培养基加至细胞中，然后在37℃，将细胞保温所标明的时间。阴性对照是在与Tat相同的缓冲液中的罗丹明化BSA。将细胞用冰冷丙酮-甲醇(1：：1)固定，然后用荧光显微镜肉眼观察Tat的摄入和定位。通过将样品的荧光与阴性对照进行比较来评估结果，将结果根据摄入量记录为0至++++，不预先告知样品标号。
为了研究活化内皮细胞摄入Tat的途径，使用浓度大不相同的外源Tat，例如前述用于诱导HUVE或KS细胞生长(10-50ng/ml)或者通过将蛋白质加至携带HIV-1启动子或原病毒的细胞中引发HIV-1反式激活(0.5-1ug/ml)所需的浓度，利用活化HUVE细胞完成试验。
在这些试验中，为了与摄入抑制试验相一致(见下文)，在4℃将细胞与不含胎牛血清的培养基预保温2小时。所述预保温不会影响随后罗丹明化Tat的摄入。
用罗丹明化Tat，蛋白质向活化HUVE细胞核或核仁的摄入和易位是从与低至10ng/ml的罗丹明化Tat一起保温15分钟内开始的。细胞内Tat的摄入密度是剂量依赖性和时间依赖性的。罗丹明化BSA或缓冲液没有信号，因此，将其常规用作阴性对照。
为了确定活化HUVE细胞的Tat摄入是否由发现在KS细胞上表达的相同整联蛋白介导，通过将IC激活的内皮细胞与冷Tat(竞争者)，这些受体的生理学配体例如纤连蛋白(FN)或玻连蛋白(VN)预保温，或者将细胞与抗α5β1和αvβ3受体RGD结合区的单克隆抗体预保温来完成抑制试验。简要说明试验过程。铺在8孔玻片上后，将HUVE细胞与含15％FBS的培养基保温18小时，然后与含未标记的Tat(冷竞争者)(表1A)、FN、VN(表1B)或者抗FN或VN受体(分别为α5β1和αvβ3)RGD结合序列的单克隆抗体或者抗人Ⅷ因子的单克隆抗体(对照抗体)(图1A)的SF培养基在4℃保温2小时。然后将细胞与罗丹明化Tat保温标明的时间。对照由用SF培养基在4℃单独处理2小时的细胞组成，然后与罗丹明化BSA一起保温。将细胞固定、肉眼观察、照相，然后按上述说明记录分数。表1A通过将细胞与1μg/ml未标记的Tat预保温，细胞因子激活的HUVE摄入100ng/ml和1μg/ml罗丹明化Tat的抑制作用a
预保温 罗丹明化Tat Tat的摄入
无血清培养基 100ng/ml +++
lμg/ml未标记的Tat 100ng/ml +/-
无血清培养基 1μg/ml ++++
lμg/ml未标记的Tat 1μg/ml +/-
a按前述培养HUVE细胞(参考文献40)。按前述(参考文献9、46)从人T-嗜淋巴细胞病毒Ⅱ型(HTLV-Ⅱ)转化的CD4+T细胞或植物凝集素-刺激的T细胞得到IC，然后用上清液(1∶8)激活HUVE细胞5天(传代8-14天)。该上清液含有白介素-1α(IL-1α)和-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和-β(TNF-β)和干扰素-γ(IFN-γ)(参考文献9)。
基本上按所述(参考文献98)在赖氨酸残基处将Tat蛋白质罗丹明化。简而言之，通过加入2.5μl 1M Na2CO3，将50μg重组Tat(2mg/ml)调至pH9.0。加入2.5μl在二甲亚砜(DMSO)中的1mg/ml TRITC，使反应在4℃进行8小时。通过加入2.5μl 0.5 M NH4Cl将未反应的TRITC猝灭，用1M HCl使pH降至7.0，将罗丹明化Tat对50mM Tris-HCl，pH7.0，1mM二硫苏糖醇(DTT)透析两次以除去猝灭的TRITC。用以相同方式罗丹明化的BSA或PBS用作阴性对照。按所述检测罗丹明化Tat的AIDS-KS细胞生长活性以确保保持生物活性(参考文献40)。
将HUVE细胞与无血清培养基或者无血清培养基中的1μg/ml未标记Tat预保温2小时，与100ng/ml或1μg/ml罗丹明化Tat保温60分钟，然后通过荧光显微镜肉眼观察Tat摄入。将阴性对照(+/-摄入)与无血清培养基预保温，然后与罗丹明化BSA保温。表1B通过将细胞与过量FN或VN预保温对细胞因子激活的HUVE摄入10ng/ml罗丹明化Tat的抑制作用a
预保温 罗丹明化Tat的摄入
无血清培养基 ++++
100ng/ml FN +/-
100ng/ml VN +/-
a将HUVE细胞与无血清培养基或在无血清培养基中的FN或VN预保温2小时，然后与10ng/ml罗丹明化Tat保温60分钟，然后通过荧光显微镜肉眼观察Tat摄入。将阴性对照(+/-摄入)与无血清培养基预保温，然后与罗丹明化BSA保温。
通过冷Tat(表1A)、FN或VN(表1B)或者用抗FN受体α5β1和VN受体αvβ3(图1A)的RGD结合区的单克隆抗体预处理细胞来抑制Tat的摄入。将细胞中的荧光强度降低至用阴性对照可见的水平，将细胞与抗人Ⅷ因子的单克隆抗体(作为阴性对照)预保温未观察到抑制作用，这表明抑制作用是特异性的(图1A)。
通过将细胞与抗α5β1受体和αvβ3受体RGD结合区的单克隆抗体预保温来抑制100ng/ml Tat的摄入和核定位。但是，在这两种情况下，抑制作用均是不完全的。这些结果表明皮摩尔浓度Tat的摄入是由与细胞粘附Tat中有关的相同的整联蛋白介导的(参考文献10)。但是，在较高浓度的细胞外Tat(例如≥100ng/ml)下，非整联蛋白介导的途径引起一些蛋白质的摄入。
与这些结果相反，淋巴细胞和上皮细胞对碘化Tat的摄入是线性的，并且是培养基中Tat浓度的函数，而且不受或很少受过量冷Tat的竞争，这说明没有受体介入(参考文献98)。但是，在该研究中，培养基中Tat的浓度范围为约1-100μg/ml(参考文献98)，远高于观察对其生物活性敏感的细胞(例如活化的初级内皮细胞)摄入Tat所需的浓度。另外，Tat的碘化影响其结构和细胞对其的摄入，但是那些作者没有列出碘化Tat的生物活性结果。
这些未公开的结果表明Tat的摄入至少是通过两个依赖于该蛋白质浓度的途径。在低(10-100ng/ml)Tat浓度，Tat的摄入是由α5β3受体和αvβ3受体通过与该蛋白质的RGD序列相互作用而介导的，而在较高的细胞外Tat浓度，不依赖整联蛋白的途径更重要。整联蛋白介导的IC激活内皮细胞对皮摩尔浓度Tat的摄入表明具有完全活性的蛋白质能够进入抗原呈递细胞，例如活化的内皮细胞和树突细胞，引发免疫反应。
实施例2．构建并表征突变的tat基因
我们利用位点特异性诱变或通过缺失在不同的Tat区产生了19个突变体。通过测序控制每个突变DNA的序列。将tat突变基因的cDNAs克隆在在实施例3中描述的pCVO载体的PstI位点。按Ensoli等(参考文献41)所述，用HIV-1 LTR-CAT质粒将每个突变体共转染在COS-1细胞或Jurkat T细胞系中，在所述质粒中，CAT报导基因受HIV-1 LTR的驱动。这些未公开的试验结果列在表2中。
表2
Tat突变体对HIV-1 LTR-CAT反式激活作用的影响和对Tat野生型活性的阻断作用(负反式显性)
突变体              反式激活活性a        反式显性活性b
                                               (％抑制)
             平均值(倍)  (最小-最大值)          平均值
CYS22          0.09      (0.021-0.22)             21
THR23          0.36      (0.16-1)
THR23A         0.30      (0.16-0.78)
ASN24          0.34      (0.34-0.82)
ASN24A         0.42      (0.45-0.95)
TYR26          0.14      (0.08-0.19)
LYS28/29       0.52      (0.19-1.04)
CYS30          0.30      (0.045-0.65)
CYS31          0.60      (0.27-1.09)
PHE32          0.31      (0.077-0.097)
LYS33          0.04      (0.0027-0.068)           46
GLU35          0.31      (0.19-0.43)
PHE38          0.05      (0.043-.057)             98
LYS41          0.04      (0.025-0.061)            97
TYR47          0.58      (0.31-0.8)
57A            0.35      (0.26-0.44)
TAT-RGD        0.94      (0.73-1.15)
TAT-KGE        1.11      (0.67-1.49)
TAT野生型        1               1
a所述结果是以野生型Tat诱导的CAT活性值(倍=1)的激活增加给出的。b将结果表示为野生型Tat活性的抑制百分比(％)。
从表2所列的结果可以看出，对于大部分突变体来说，HIV-1 LTR的反式激活作用降低或消失，例外是RGD突变体，该突变体的活性与野生型Tat的相似。我们选择了4个具有最低(几乎为零)反式激活活性的突变体(eys22，lys33，phe38，lys41)，然后确定对野生型Tat的反式激活作用的负反式显性作用。至此，在存在HIV-1 LTR-CAT载体的条件下，用含Tat突变体和pCV-Tat载体(10∶1)的各载体共转染COS-1细胞。如表2所示，lys41和tyr47突变体几乎完全抑制了Tat活性，而lys33和cys22突变体部分抑制Tat活性。但是，cys22重组蛋白质(下列实施例3中所述的)在反式激活HIV-1 LTR-CAT中，与野生型Tat蛋白质竞争(图1B)。选择半胱氨酸区的突变体(cys22)、核心区的突变体(lys41)、缺失RGD序列的突变体(RGDΔ)和含lys41突变并缺失RGD序列的双突变体(lys41-RGDΔ)。
下文给出用于接种的tat插入片段和突变体的序列。描述通过1)取代一个碱基以得到氨基酸取代和2)缺失一个碱基以达到缺失相应氨基酸而得到一系列tat突变体。通过定点诱变得到取代和缺失。将下文给出的野生型tat基因和tat基因突变体的序列插入在上述pCVO质粒载体中。
Seq.1是HIV-1 tat基因序列，来自BH-10克隆和其衍生的蛋白质。Seq.2是cys22突变体序列(和其衍生的蛋白质)，在从5’末端开始的第66位上，用鸟嘌呤(G)核苷酸取代Timine(T)核苷酸。在衍生的氨基酸序列中，该取代引起在氨基末端第22位上用甘氨酸(用单字母密码G表示)取代半胱氨酸(用单字母密码C表示)。Seq.3是lys41突变体序列(和其衍生的蛋白质)，在从5’末端开始的第123位上用胞嘧啶(C)核苷酸取代Timine(T)核苷酸。该取代在衍生的氨基酸序列中引起用苏氨酸(单字母密码T)取代距氨基末端第41位上的赖氨酸(单字母密码K)。Seq.4是RGD突变体(和其衍生的蛋白质)的序列，从野生型tat基因的5’末端开始，缺失核苷酸序列CGAGGGGAC，从核苷酸232至核苷酸240。这样缺失了从氨基末端78-80位的氨基酸精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(单字母密码RGD)。Seq.5是双突变体lys41-RGDΔ(和其衍生的蛋白质)的序列，来源于上述突变体的组合。
野生型tat核苷酸序列(Seq.1)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
氨基酸序列
NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALG
ISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
Cys22突变体的核苷酸序列(Seq.2)
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCA
GCCTAAAACTGCGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCA
AGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG
AGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTAT
CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAAT
AG3’
氨基酸序列
NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKA
LGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
Lys41核苷酸序列(Seq.3)
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCA
GCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCA
AGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG
AGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTAT
CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAAT
AG3’
氨基酸序列
    NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALG
    ISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
    RGDΔ突变体的核苷酸序列(Seq.4)
    5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCA
    GCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCA
    AGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG
    AGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTAT
    CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
    氨基酸序列
    NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALG
    ISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH
    Lys41-RGDΔ突变体的核苷酸序列(Seq.5)
    5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCA
    GCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCA
    AGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG
    AGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTAT
    CAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
    氨基酸序列
    NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALG
    ISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH
实施例3．构建并表征DNA免疫原
将用于接种动物的DNA分子插入6.4kb pCVO质粒载体(参考文献5)。该质粒含有两个SV40复制起点，腺病毒的主要晚期启动子(AdMLP)和腺病毒和小鼠免疫球蛋白基因的剪接序列，小鼠二氢叶酸-还原酶(dhfr)和SV40聚腺苷酸化信号的cDNA。PstI限制酶位点位于AdMLP的3’，并代表所需的外源基因被克隆的位点。HIV-1的tat基因cDNA(261个碱基对)(seq·1，实施例2)衍生于HIV-1 BH10克隆(参考文献126)并编码86个氨基酸长的蛋白质。通过将tat cDNA克隆到pCVO PstI位点，得到pCV-Tat载体(参考文献5)，由AdMLP驱动。选择该载体是基于相对于其他真核启动子例如Ensoli等(参考文献41)说明的巨细胞病毒(CMV)的立即早期区域启动子而言，AdMLP可诱导较高水平的Tat表达和释放，结果列于表3。
表3．Tat在用pCV-Tat和CMV-Tat转染的COS-1细胞中的表达、亚细胞定位、释放和活性a
载体     Tat表达     Tatb含量     Tat活性
阳性细胞 核c          胞质(％) 总量    胞内    胞外(％)    (％) 胞内d    胞外e(倍)    (cpm)
pCV-TatCMV-Tat对照 5-10    ++    ++3-5     ++    +0       -     - 25       63，5    36，514，6    92，2    7，80        0        0  50    2.47872    2.2541     1.400
a通过用30μg pCV-Tat，CMV-Tat或对照DNA电穿孔转染COS-1细胞(5×106)。转染后48小时，通过用抗Tat单克隆抗体(给出的值是阳性细胞的百分比平均值)的免疫组织化学和通过核和胞质Tat定位来评估Tat的表达。通过对细胞提取物(500μl)上和培养基(4毫升)中的放射性免疫沉淀，以及随后的沉淀Tat带的光密度读数(GelscanXL；Pharmacia)来分析细胞内-和细胞外Tat的存在。对用Tat表达载体或对照载体和LTR-CAT HIV-1质粒共转染的COS-1细胞提取物测量细胞内Tat活性；在用表达Tat的质粒或对照质粒转染的细胞的培养基(1∶2和1∶4稀释的)中测量细胞外Tat对AIDS-KS细胞增殖(用3H-胸苷掺入试验确定的)的活性。所述结果是5个独立试验的平均值。
b免疫沉淀Tat蛋白质带的光密度分析。将数值用任意标度表示，总的检测的最小值(细胞内和细胞外Tat)是10。
c-负；+，Tat阳性细胞的50％；++，Tat阳性细胞的50-100％。
d与对照载体保温20分钟后的CAT活性，其活性值为1。
e用3[H]-胸苷掺入试验测量AIDS-KS细胞生长(标准偏差，SD：12％)。用对照DNA转染的细胞上清液3[H]-胸苷掺入值为1，400cpm(SD：11.5％)。得自活化T淋巴细胞(阳性对照)的培养基的3[H]-胸苷掺入值为2，400cpm(SD：10％)。
表3表示在pCV-Tat转染细胞中，与CMV-Tat转染的细胞相比，Tat阳性细胞的百分比和总Tat含量更高，释放的Tat量更高，而且与总的和胞质的Tat含量有关，因此，细胞外Tat对AIDS-KS细胞生长的生物活性更高。所述结果表明，pCV-Tat载体编码生物活性蛋白，诱导高水平的tat基因表达并且从细胞中释放的Tat量高于CMV-Tat载体。
还可用pCVO载体表达HIV-1 nef，rev和gag基因以及编码IL-12和IL-15细胞因子的基因。利用与所述基因5’区前15个核苷酸(正向引物)(Seq.P1、P3、P5、P7、P9)或与3’区后15个核苷酸(反向引物)(Seq.P2、P4、P6、P8、P10)互补的特异性引物，通过聚合酶链反应技术(PCR)扩增nef(618个碱基对，NL43株)(参考文献112)，rev(348个碱基对，NL43株)(参考文献95)和gag基因(1500个碱基对，NL43株)(参考文献95)的cDNAs或者IL-12(参考文献165)或者IL-15基因(参考文献56)的cDNAs。此外，每个引物，不论正向反向均含有PstI限制酶的序列以便可以将扩增的产物克隆到pCVO载体中。克隆后，通过DNA测序控制插入基因的序列。还可将pCVO载体用于共表达Tat与HIV-1的其他病毒基因(rev、nef或gag)或者IL-12或IL-15细胞因子编码基因。至此，用正向引物(包括PstI限制酶的序列(Seq.P11))和与tat基因的后15个核苷酸互补的反向引物(Seq.P12)通过PCR扩增261个碱基对的HIV-1tat基因的cDNA(Seq.1，实施例2)。用正向引物和反向引物扩增病毒基因(nef、rev或gag)或编码IL-12或IL-15细胞因子的基因，可以让所述基因在tat基因框架内，所述正向引物也包括与tat 3’区互补的15个碱基的序列(Seq．P13、P14、P15、P16、P17)，反向引物包括PstI限制酶序列(Seq．P2、P4、P6、P8、P10)。此后，完成第三个PCR反应，其中用tat基因和所需基因的扩增产物为DNA模板。正向引物为用于扩增tat的引物(Seq.P11)，反向引物为用于扩增所需基因的引物(Seq.P2、P4、P6、P8、P10)。将扩增的tat/所需基因用琼脂糖凝胶纯化，用PstI消化并克隆在pCVO中。克隆后，通过DNA测序控制插入基因的序列，而用上述转染方法确定蛋白质的表达(参考文献41)。
上述引物的序列如下：Seq.P1. 正向引物 Rev：5’ATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P2. 反向引物 Rev：5’CTATTCTTTAGTTCC3’Seq.P3. 正向引物 Nef：5’ATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P4. 反向引物 Nef：5’TCAGCAGTCCTTGTA3’Seq.P5. 正向引物 Gag：5’ATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P6. 反向引物 Gag：5’TTATTGTGACGAGGG3’Seq.P7. 正向引物 IL-12：5’ATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P8. 反向引物 IL-12：5’TTAGGAAGCATTCAG3’Seq.P9. 正向引物 IL-15：5’ATGAGAATTTCGAAA3’Seq.P10.反向引物 IL-15：5’TCAAGAAGTGTTGAT3’Seq.P11.正向引物 Tat：5’ATGGAGCCAGTAGAT3’Seq.P12.反向引物 Tat：5’CTATTCCTTCGGGCC3’Seq.P13.正向引物 Tat/Rev：5’GGCCCGAAGGAAATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P14.正向引物 Tat/Nef：5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P15.正向引物 Tat/Gag：5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P16.正向引物 Tat/IL-1 2：5’GGCCCGAAGGAAATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P17.正向引物 Tat/IL-15：5’GGCCCGAAGGAAATGAGAATTTCGAAA3’
实施例4．用抗Tat蛋白质疫苗接种健康Macaca fascicularis：评估安全性、耐受性、抗病毒攻击的特异性免疫反应和保护效力
用cynomolgus猴(Macaca fascicularis)的试验模型评估重组Tat蛋白质疫苗抗病毒攻击的耐受性、安全性以及引发特异性免疫反应(体液和细胞的)的能力和保护作用，所述重组Tat蛋白是用所述方法生产的并通过肝素亲和柱纯化的。为了诱导广泛的免疫反应，我们使用了已在大量模型中检测过的磷酸铝(Alum)，而且只有它允许用于人。在颗粒佐剂中，我们使用RIBI(属于乳化剂类型或者由单磷酰基类脂A、二霉菌酸海藻糖(dimycolic trehasole)和卡介苗细菌壁的骨架组成)(参考文献7、109)。
在第一个预试验中，我们评估耐受性、安全性和引发特异性免疫反应(体液和细胞的)的能力。因此，按下列方案接种3只猴子：用重悬在250μl自体血清和250μl RIBI中的重组Tat蛋白(100μg)接种猴子1(M1)，通过皮下途径在一个位点接种；用重悬在250μl自体血清和250μlRIBI中的重组Tat蛋白(10μg)接种猴子2(M2)，通过皮下途径在一个位点接种；猴子3(M3)是不接种的对照猴子。在第一次接种前42和35天，从所有猴子身上取10毫升血以便确定基础参数。将血清和血浆样品在-20℃或-80℃冷冻，以后用于重悬蛋白质接种物。在0时和2、5、10、15、22、27、32和37周后给猴子1和2接种。对猴子M1在37周时中断接种，对猴子M2在41周时中断接种。将动物杀死以研究在数种器官和组织(脾和淋巴结)中的免疫参数，例如评估是否存在对Tat的增殖反应以及抗Tat的CAF和CTL活性。CAF活性是CD8+淋巴细胞介导的抗病毒活性，既不是MHC限制的，也不是细胞溶解的。在接种免疫原的同样天数，从每只动物身上取10毫升血以进行实验室检测(化学物理分析、电解质、白细胞、血小板计数和血红蛋白定量分析)，评估免疫学参数，例如是否存在特异性免疫球蛋白(IgM，IgG，IgA)，Th1型(IL-2，IFNγ)和Th2型细胞因子(IL-4，IL-10)的水平，趋化因子(RANTES，MIP-1α和MIP-1β)的生产，淋巴细胞表型(CD4、CD8、CD3、CD14、CD20、CD25、CD56、HLA-DR、CD45RA)，对Tat的增殖反应，是否存在细胞毒活性(CTL)，是否存在抗病毒活性(CAF)以及是否存在由PBMC和自体血清介导的总抗病毒活性(TAA)。此外，为了评估体内是否存在细胞介导的免疫反应，对所有接种的和对照猴子进行对Tat的皮肤试验。
试验结果如下。化学-物理、血液和行为参数没有改变。在接种的和对照猴子中，在接种位点未检测到炎症和新血管形成的迹象。这些结果表明动物能够很好地耐受Tat蛋白质，而且在施用的剂量并以所用的接种途径没有毒性。在猴子M1和M2中，在第一次接种后5周，检测到Tat特异性的IgG型抗体。在37周，在这两只猴子中，以最大1∶6400稀释的血浆中均可检测到抗Tat IgG，在41周，在最大1∶12800稀释的血浆中，在M2中也可检测到抗Tat IgG。结果列于图2和3中。在对照猴子M3中，检测到滴度很低的抗Tat抗体，可能是由于重复接种少量Tat而引发的，给该猴子注射少量Tat是为了对照皮肤检测反应的特异性。在猴子M1和M2中，抗Tat抗体主要是抗Tat的氨基末端区(氨基酸1-20)，滴度为1∶3200(图4)。在用10μg Tat接种的猴子M2中，还检测到了抗Tat的36-50氨基酸和46-60氨基酸的抗体，滴度分别为1∶50和1∶100(图4)。通过以前所述的体外检测方法确定猴子血清中和Tat的能力，所述体外检测方法(参考文献41)测量加入外源Tat蛋白后，在HLM-1细胞中，HIV-1复制获救的抑制作用。这些检测表明在首次接种后27周，来自猴子M1和M2的血浆阻断由外源Tat诱导的病毒复制，正如通过定量分析培养上清液中p24抗原所确定的。相反，来自相同猴子的预免疫血浆不能阻断Tat活性(表4)。
表4
猴子血浆对细胞外Tat诱导的病毒复制获救的中和活性a
    样品     抑制作用(％)
 Tat(30ng/ml)+预免疫M1     0
 Tat(30ng/ml)+预免疫M2     0
 Tat(39ng/ml)+免疫M1     79.12
 Tat(30ng/ml)+免疫M2     100
a确定HLM-1细胞(HeLa-CD4+细胞，含整合拷贝的tat基因缺陷的HIV-1原病毒)中的血浆中和活性。将HLM-1细胞以6×105细胞/孔接种在24孔平板中，然后在37℃保温16小时。用含0．1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS将细胞洗涤两次，然后存在重组Tat蛋白和等体积血浆[在0时取的(预免疫血浆)或在27周取的(免疫血浆)]的情况下，用新鲜培养基(0.3ml)培养48小时。阴性对照细胞是仅用不含Tat集池的预免疫血浆、用集池的免疫血浆或者用含0.1％(BSA)的PBS(PBS+0.1％BSA)处理的细胞。在所有对照样品中，对病毒复制的获救没有影响。对每种血浆一式两份进行检测。用市售p24抗原捕获ELISA试剂盒(NEN-Dupont)，通过定量分析P24 Gag抗原来检测是否存在由细胞释放的病毒。将结果表示为与预免疫血浆(0％抑制作用)相比，免疫血浆的病毒获救的抑制百分比[在两个孔中测量每种血浆的p24(pg/ml)平均值]。用重悬在250μl自体血清和250μl RIBI中的重组Tat蛋白(分别为100μg和10μg)接种猴子M1和M2，并通过皮下途径在一个位点注射。
结果表明在用重组Tat蛋白接种的猴子中，在22周存在对Tat的增殖反应(表5)，在每次用10μg重组Tat蛋白加强的猴子M2中，更高。
表5
对Tat的增殖反应a
 猴子  刺激                  初次接种后周数
 15  22  27  32  37
 M1  PHATat  15.31.20.8  13.94.72.4  19.92.11.1  40.63.81.3  3.220.6
 M2  PHATat  8.120.9  11.63.83  17.11.71.4  16.811.2  1.70.60.6
 M3  PHATat  5.17.22.1  19.96.21.4  18.25.51.3  6.62.80.7  8.15.60.9
a将通过Ficoll密度梯度分离的PBMCs以2×105细胞/孔的浓度，一式三份铺在平底96孔平板上，在用10％胎牛血清(FCS)补充的RPMI-1640中培养，然后用给猴子接种的Tat(1或5μg/ml)、PHA(4μg/ml)或破伤风类毒素(TT)进行刺激。在RPMI，10％FCS培养基中培养未刺激的对照。在第5天，按前述(参考文献39、22)，通过3[H]-胸苷掺入测量细胞增殖的增加。将结果表示为刺激指数并按下列方法计算：检测样品的平均值(cpm)/对照平均值(cpm)。数值大于2.5认为是阳性。皮下用重悬在250μl自体血清和250μl RIBI中的100μg或10μg重组Tat免疫接种猴子M1和M2。M3代表对比猴。如表6所示，在用重组Tat免疫的猴子M1和M2中未检测到细胞毒性活性。
表6
分析对Tat的细胞毒性活性(CTL)a
猴子 周数                       靶∶效应物比  CTL活性
    1∶50     1∶25  1∶12.5  1∶6.25  1∶3.125 介质
   M1    41     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND
   M2    41*     0       0     0     0     O     0     -
   M3    41     0     O     0     0     0     0     -
a将通过Ficoll密度离心分离的PBMCs以1×107细胞/ml的浓度重悬在用10％热失活FCS补充的RPMI 1640中，接种在24孔平板(500μl/孔)上，存在lμg Tat的条件下，在37℃培养12小时。1天后，将不与Tat培养的细胞以1500rpm离心，然后重悬在50微升用10％FCS补充的RPMI 1640中，在37℃与1微克Tat培养3小时，洗涤，重悬在500微升新鲜培养基中，然后加至含前述刺激的PBMCs的孔中。第2天，将细胞用1毫升含IL-2(2IU/ml)的培养基稀释，然后培养14天。用接种前从各猴子分离的自体B淋巴细胞作为靶细胞(BLCL)。为了达到该目的，将在第35天通过Ficoll密度离心分离的PBMCs以3×105细胞/孔的浓度接种在96孔平板中，然后在存在50％从以前所述的生产狒狒属病毒(Papiovirus)的细胞系(参考文献28)收集的培养基的条件下，培养2或3周。将对各动物获得的10个B细胞系扩增并冷冻。为了检测毒性，使用以时间分辨荧光为基础的Delfia细胞毒性试验(Wallac，Turku，Finland)(参考文献12、13、14)。为了达到该目的，将BLCL以1×106细胞/200微升用10％FCS补充的、含4微克Tat的RPMI 1640的浓度在37℃培养12小时。作为对照，将另一份自体BLCL与不含Tat的相同培养基一起保温。按制造商的说明，将BLCL洗涤并重悬在1毫升用10％FCS补充的、含5微升荧光增强配体的RPMI 1640中，然后在37℃保温15分钟。洗涤5次后，将BLCL以5×104细胞/ml的浓度重悬，然后迅速离心以收集上清液用于测量背景水平。将PBMCs(效应物)以2.5×104细胞/100微升的浓度一式两份接种在含IL-2的培养基中，然后在96孔平板中迅速稀释。将5×103个靶细胞/100微升(与或不与Tat培养)加至各孔中。靶：效应物的比例为1∶50、1∶25、1∶12.5、1∶6.25、1∶3.125。在37℃，将PBMCs和靶细胞(Tat-脉冲的或未脉冲的)与下列物质保温2小时：ⅰ)20微升5％Triton以测量最大释放，ⅱ)100微升生长培养基以检测自发释放，ⅲ)200微升靶细胞上清液以检测背景水平。在保温期结束时，将平板离心，将20微升各上清液转移到新平板中，然后在存在200微升试剂盒中所含的Europium溶液的条件下保温。保温20分钟后，用时间分辨荧光读数器(Victor,Wallac,Turku,Finland)测量荧光。按下列公式测量特异性CTL活性：％特异性释放=[(样品检测平均值-背景)-(自发释放-背景)]/[(最大释放-背景)-(自发释放-背景)]×100。对于大部分检测的效应物：靶比例，当Tat特异性释放大于4％时，认为检测是阳性。4％是在以前对照试验基础上建立的任意值。ND，未确定。用重悬在250微升自体血清和250微升RIBI中的10微克重组Tat皮下免疫接种猴子M2。M3代表对照猴子。
ND：未做。
*杀死M2后，从外周淋巴结分离PBMCs。此外，在22、27和37周的结果表明，存在CD8+T淋巴细胞(CAF)介导的可溶性抗病毒活性，该活性是按猴子CD8+T淋巴细胞上清液抑制嵌合病毒SHIV 89.6P在CEMx174细胞中急性感染或者控制在OM-10-1细胞中HIV-1慢性感染重激活作用的能力测量的(表7)。与对照动物相比，通常在接种猴子中可观察到CAF活性。
表7
分析是否存在CD8+T淋巴细胞介导的可溶性抗病毒活性(CAF)a
    猴子ID     初次接种后的周数     ％病毒复制抑制作用
  急性感染   慢性感染
    M1     22     89.5     ND
    27     62     61.7
    37     ND     ND
    M2     22     44     ND
    27     54     27
    37     48     53
    M3     22     24     ND
    27     37     22
    37     75     23
a用Ficoll密度梯度从用100μg(M1)和10μg(M2)重组Tat蛋白质接种的猴子和未接种但用Tat重复皮肤试验的对照猴子(M3)中分离PBMC。按照制造商的说明，用抗CD8磁珠(Dynabeads，Dynal，Norway)从PBMC中分离CD8+T淋巴细胞富集的培养物。用抗特异性细胞标记(CD3、CD4、CD8)的系列抗体，通过FACS分析控制培养物的纯度。以5×105个细胞/500微升/孔，将CD8+富集的培养物接种(一式两份)在48孔平板中，预先用抗CD3单克隆抗体(2．5μg/ml，BioSource International，Camarillo，CA)在4℃包被12小时，然后在含10％胎牛血清和IL-2(20U/ml)的RPMI 1640中生长。每3天收集250微升培养基，收集2周，并用等量新鲜培养基代替。将细胞上清液离心，过量(0．45μm)，然后于-80℃储存。除第一点外，将得自所由时间点的细胞上清液集池，按照其在两个系统中(分别为急性和慢性感染)抑制病毒复制的能力检测抗病毒活性是否存在。对于急性感染系统，使用CEM×174细胞系，该细胞系衍生于与人T细胞系CEM融合的人B细胞系721.174(参考文献143)。在含有或不含按上述制备的200微升CD8+上清液的聚丙烯试管中将细胞(2×105)在37℃培养2小时。将细胞用新鲜培养基洗涤3次，以2×104个细胞/孔接种在96孔平板上，然后以200微升与(处理的细胞)或者不与(未处理的细胞)不同体积(50微升、5微升和0.5微升)的培养上清液保温，所述上清液得自用疫苗注射的猴子或对照猴子的CD8+T淋巴细胞。感染后，每3天收集培养上清液等分样，然后用预先加入接种和对照猴子的CD8+培养上清液的等体积完全培养基代替。表中所列的结果对应于在感染后7天，并表示为与未处理细胞相比，用接种猴子的CD8+培养上清液处理的细胞病毒复制抑制作用百分比(％)。按所述(参考文献54)测量在各时间点收集的细胞上清液的RT值或者通过ELISA的p27 Gag值来确定病毒复制。对于慢性感染系统，使用OM-10-1细胞系(参考文献20、21)，该细胞系为用HIV-1慢性感染的人T淋巴细胞系。在存在抗TNFβ抗体(40μg/ml)条件下，将细胞以5×104细胞/200微升/孔的浓度接种(一式两份)在96孔平板中，有或没有不同体积(50微升、5微升和0．5微升)的接种或对照猴子的CD8+T淋巴细胞上清液。用PMA(10-7M)激活细胞进行增殖。24小时后，收集培养基以便通过测量RT或者用ELISA测量p24 Gag水平来确定病毒复制。将结果表示为与未处理细胞相比，在处理细胞中重激活感染的抑制％。在表中列出的急性和慢性感染的结果指用来自CD8+细胞培养物的5微升上清液处理的细胞。ND：未作。用皮肤试验分析延迟的超敏(DTH)表明接种的(M1和M2)和对照(M3)猴子都是阴性(表8)。
表8
对Tat的皮肤试验a
初次接种后的周数     猴子
M1               M2                   M3
    10 - -      -
    15 - -      -
    22 - -      -
    27 - -      -
    32 - -      -
    37 - -      -
a将在150μl PBS-0．1％BSA或仅缓冲液中的Tat(1和5微克)在第一次接种后10、15、22、27、32和37周，通过皮内途径接种在预先刮过的接种和对照(反应特异性的对照)猴子的背部。用在250微升自体血清和250微升RIBI中的重组Tat蛋白(分别为100微克和10微克)接种猴子M1和M2，通过皮下注射在一个位点。猴子M3是未接种的对照猴子。在48-72小时后出现的结红斑表明有延迟的超敏反应(DTH)：++，Φ≥5mm；+，Φ≥1-4mm，+／-红斑，未变硬；-，Φ＜1mm。
该预试验的结果表明按我们所述的方法生产和纯化的Tat重组蛋白质在皮下给药的100和10微克剂量下没有毒性。另外，Tat蛋白质引发具有抗病毒活性的特异性和广泛的免疫反应，包括体液和细胞介导的。在用10微克重组蛋白接种的猴子M2中观察到更强的特异性的抗Tat免疫反应。此外，在接种的猴子中，RIBI佐剂没有任何明显的毒性迹象。基于这些结果，设计第二个预试验以确定用10微克Tat与RIBI或Alum佐剂组合的免疫效果。按下列方案在皮下一个位点给猴子注射。猴子M1-3：在250微升自体血清和250微升RIBI中的10微克重组Tat蛋白。猴子4-6：在250微升自体血清和250微升Alum中的10微克重组Tat蛋白。猴子M7：250微升RIBI和250微升自体血清(对照猴子)。猴子M8：250微升Alum和250微升自体血清(对照猴子)。在第一次免疫接种前9天，从每个猴子取10毫升血以便完成前述预试验中的检测并确定每个动物的基础参数。在0时和2、6、11、15、21、28和32周后，给猴子接种。在36周，用200微升ISCOM(免疫刺激复合物)和300微升PBS中的重组Tat蛋白(16微克)给猴子M1-6最后加强接种。ISCOM是由quilA皂角苷、胆固醇和磷脂组成的佐剂，它可以提高体液和细胞介导的免疫反应(参考文献109、90)。在相同的时间点，仅给猴子M7和M8注射佐剂。在每次接种时和40、44和50周时，从动物中取10毫升血以分析前述预试验中的临床和免疫学参数。此外，收集尿样和阴道棉拭以分析是否存在Tat特异性分泌的IgA。为了评估Tat免疫对感染的保护作用，用含HIV-1 tat基因的嵌合“猿/人免疫缺陷型病毒”(SHIV)，株89.6P攻击接种和对照猴子，所述株在Macaca fascicularis中生长并滴定(参考文献128、129、69)。攻击后，监测(第一个月每两周，接下来的3个月每四周，然后每8周监测6-12个月)动物的病毒学参数，例如血浆p27抗原血症和血浆和细胞的病毒负载。为了确定已发生感染，还通过用于检测抗HIV-2抗体的市售试剂盒检测抗SIV抗体，该试剂盆也识别抗SIV抗体(Elavia Ac-Ab-Ak Ⅱ试剂盒，Diagnostic Pasteur,Paris,France)。
现在，第二个预试验的结果如下。化学-物理、血液学和行为学参数没有变化。在接种位点，猴子没有任何炎症或新血管形成迹象。观察到特异性抗体反应(IgM,IgG)。在15周，抗Tat抗体(IgG)滴度达到很高的水平，为1∶6400-1∶25600(图5-7)。所述抗体主要与Tat的氨基末端区(氨基酸1-20)反应，在22周，滴度为1∶1600-1∶3200(图8)。此外，还检测到抗Tat的氨基酸46-60的抗体，滴度为1∶100-1∶200(图8)。按前面第一个预试验中所述，通过检测与系列量外源Tat保温的HLM-1细胞中的病毒获救的抑制作用来检测猴子血浆中和Tat活性的能力。这些试验的结果表明在15周，来自猴子M1-6的免疫血浆(1∶2稀释的)阻断30ng/ml外源Tat诱导的病毒复制，正如通过测量释放到培养基中的p24抗原所确定的。相反，猴子M1-6的预免疫血浆或来自对照猴子(M7，M8)的血浆不能阻断Tat活性(表9)。此外，在21周取出的猴子M1-6的免疫血浆(1∶2稀释)阻断60ng/ml、120ng/ml、240ng/ml和500ng/ml外源Tat诱导的病毒复制。具体地讲，这些血浆将很高剂量细胞外Tat(240ng/ml和500ng/ml)诱导的病毒复制降低了10倍(表9)。
表9
免疫血浆对细胞外Tat诱导的病毒复制获救的中和活性a
样品 抑制(％)
Tat(30ng/ml)+预免疫     M1     0
 Tat(30 ng/ml)+预免疫   M2     0
 Tat(30ng/ml)+预免疫    M3     0
 Tat(30 ng/ml)+预免疫   M4     0
 Tat(30ng/ml)+预免疫    M5     0
 Tat(30 ng/ml)+预免疫   M6     0
 Tat(30 ng/ml)+免疫   M1(周15)     89.8
 Tat(30 ng/ml)+免疫   M2(周15)     78.7
 Tat(30 ng/ml)+免疫   M3(周15)     100
 Tat(30ng/ml)+免疫    M4(周15)     100
 Tat(30 ng/ml)+免疫   M5(周15)     70.8
 Tat(30 ng/ml)+免疫   M6(周15)     94.2
 Tat(60 ng/ml)+预免疫    M1     0
 Tat(60ng/ml)+预免疫     M2     0
 Tat(60 ng/ml)+预免疫    M3     0
 Tat(60 ng/ml)+预免疫    M4     0
 Tat(60 ng/ml)+预免疫    M5     0
 Tat(60 ng/ml)+预免疫    M6     0
 Tat(60ng/ml)+免疫     M1(周 21)     96.3
 Tat(60 ng/ml)+免疫    M2(周 21)     100
 Tat(60 ng/ml)+免疫    M3(周 21)     100
 Tat(60 ng/ml)+免疫    M4(周 21)     98.7
 Tat(60 ng/ml)+免疫    M5(周 21)     99
 Tat(60 ng/ml)+免疫    M6(周 21)     98.8
 Tat(120 ng/ml)+池预免疫    M1-6     0
 Tat(120 ng/ml)+免疫   M1(周 21)     59.2
 Tat(120 ng/ml)+免疫   M2(周 21)     90.4
 Tat(120 ng/ml)+免疫   M3(周 21)     96.8
 Tat(120 ng/ml)+免疫   M4(周 21)     98.3
 Tat(120 ng/ml)+免疫   M5(周 21)     100
 Tat(120 ng/ml)+免疫   M6(周 21)     97.8
 Tat(240 ng/ml)+池预免疫    M1-6     0
 Tat(240 ng/ml)+免疫   M1(周 21)     26.1
 Tat(240 ng/ml)+免疫   M2(周 21)     49.4
 Tat(240 ng/ml)+免疫   M3(周 21)     70.3
 Tat(240 ng/ml)+免疫   M4(周 21)     91.2
 Tat(240 ng/ml)+免疫   M5(周 21)     94.5
 Tat(240 ng/ml)+免疫   M6(周 21)     86
 Tat(500 ng/ml)+池预免疫    M1-6     0
样品 抑制(％)
Tab(500ng／ml)+免疫　M1(周　21) 32．7
Tab(500ng／ml)+免疫　M2(周　21) 38．9
Tab(500ng／ml)+免疫　M3(周　21) 57．5
Tab(500ng／ml)+免疫　M4(周　21) 89．4
Tab(500ng／ml)+免疫　M5(周　21) 72
Tab(500ng／ml)+免疫　M6(周　21) 71．8
a按表4注，在HLM-1细胞中确定抗Tat血浆中和Tat活性的能力。将重组Tat蛋白(30ng/ml、60ng/ml、120ng/ml、240ng/ml和500ng/ml)单独或与等体积猴预免疫血浆一起或在15周或21周加入(免疫血浆)。用在250微升自体血清和250微升RIBI中的10微克Tat接种猴子M1-3；用在250微升自体血清和250微升Alum中的10微克Tat接种猴子M4-6；给两个对照猴子注射RIBI(250微升和250微升自体血清)(M7)或Alum(250微升和250微升自体血清)(M8)。按表4注表示结果。
在用嵌合病毒SHIV 89.6P感染的CEM×174细胞中检测猴子血浆中和急性感染过程中细胞释放的细胞外Tat活性的能力。在感染后第7天，在50％用SHIV感染的且与预免疫猴子M1-6血浆一起培养的对照细胞中观察到病毒复制。相反，在存在44周从猴子M1-6取的免疫血浆的条件下生长的感染细胞中没有检测到病毒复制(表10)。
表10
免疫血浆对病毒感染传播的中和活性a
    样品     p27(pg／ml)
    SHIV+预免疫M1     Neg
    SHIV+预免疫M2     Neg
    SHIV+预免疫M3     1.080
    SHIV+预免疫M4     0.602
    SHIV+预免疫M5     1.169
    SHIV+预免疫M6     Neg
    SHIV+免疫M1     Neg
    SHIV+免疫M2     Neg
    SHIV+免疫M3     Neg
    SHIV+免疫M4     Neg
    SHIV+免疫M5     Neg
    SHIV+免疫M6     Neg
a在37℃，用在含10％FCS的RPMI 1640中的嵌合SHIV 89.6P病毒(5×10-5TCID50/细胞)，将96孔平板中的CEM×174细胞(3×104细胞/150微升)感染2小时。将细胞用RPMI1640洗涤两次，然后重悬在150微升完全培养基中，所述培养基中含有5％猴子预免疫血浆或者用重组Tat(10微克)和RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接种的动物的免疫血浆(44周)。将动物血浆在56℃预加热30分钟，然后用ELISA分析以控制抗Tat抗体滴度。将每种血清一式两份进行检测。在感染后第3、5和7天，收集120微升培养基，然后用含5％来自猴子M1-6的预免疫或免疫血浆的等体积新鲜培养基代替。通过用ELISA(Coulter International,Miami.FL)检测培养基中的病毒Gag p27来确定血浆中和在急性感染过程中释放的细胞外Tat并控制感染的体外传播的能力。表示为p27值的结果(pg/ml)相当于在感染后7天，每种血清两个孔的平均值。
此外，从11周开始观察到对Tat的增殖反应(表11)。
表11
对Tat的增殖反应a
猴子 刺激     从首次接种开始的周数
    0  11     15   21     28     32  36     40  44     50
    M1  PHATTTat  16.9611.691.12  10.501.961.55   15.273.010.52   33.81.21.7   7.21.20.8   51.51.30.8  64.30.930.6   36.051.40.7   2410.059.27    65.77.24.7
   M2  PHATTTat  31.271.121.08  25.751.83.65   21.280.576.22   87.11.714.14   25.71.153.5   561.61.8  38.24.954.1   40.31.21.9   29.031.517.67    262.913.2
   M3  PHATTTat  22.4211.431.65  7.890.952.69   16.881.7118.82   36.31.2523.51   148.51.212.03   421.10.9  78.911.3   2710.5   53.711.8123.85   NDNDND
   M4  PHATTTat  3.882.851.29  20.774.493.01   15.229.073.24   83.76.97.9   18.615.810.1   353.72.6  38.23.81.5   45.253.9   57.4719.7733.61    15.86.64.7
   M5  PHATTTat  6.252.311.80  5.741.070.66   16.744.841.76   72.23.93.6   7.450.92.22   410.830.8  56.51.41.14   32.91.241.3   33.8510.221.33    121.951.4
   M6  PHATTTat  11.964.141.37  17.941.711.06   2.770.130.11   29.41.72.95   7.310.349.3   251.31.13  8.31.81.3   6.851.11   18.012.495.8    5.20.90.3
   M7  PHATTTat  21.650.971.78  20.300.800.68   37.930.880.73   17.611   17.90.60.42   751.040.9  12.90.60.5   34.80.40.8   41.811.111.07  27.51.10 4
   M8  PHATTTat  26.511.201.12  67.0910.780.00   16.380.200.21   14.91.61.03   17.20.620.57   28.20.80.6  18.951.20.5   20.60.90.9   28.611.111.04     13.62.11
a按表5注释分离外周血淋巴细胞，用PHA(4微克/ml)、破伤风类毒素(TT)(10微克/ml)和Tat(5微克/ml)激活并检测。用在250微升自体血清和250微升RIBI中的10微克重组Tat蛋白接种猴子M1-3；用在250微升自体血清和250微升Alum中的10微克重组Tat接种猴子M4-6；给两个对照猴子接种RIBI(250微升和250微升自体血清)(M7)或Alum(250微升和250微升自体血清)(M8)。ND，未做。
在用Tat蛋白质和RIBI接种的猴子(M1)中以及用Tat蛋白与Alum接种的猴子(M4和M5)中检测到强细胞毒性T细胞反应(CTL)，而在用Tat和Alum免疫的猴子(M6)中观察到弱CTL反应(图9和表12)。
表12
CTL反应分析a
猴子     周     靶∶效应物比 CTL活性
    1∶50     1∶25     1∶12.5     1∶6.25     1∶3.125     平均值
    M1     28      5.9     4.7     4.1     7.9     5.3     5.5     +
    36      ND     14.4     8.8     4.9     6.7     8.7     +
    M2     28      ND     ND     ND      ND      ND      ND     ND
    36      ND     ND     ND      ND      ND      ND     ND
    M3     28      0     0     0       0      0      0     -
    36     ND     0     0.6       0.5      2.0      0.7     -
    M4     28      0     0     1.1       1.1      2.6      0.9     -
    36     ND   2.7     8.3       15      1.9      6.9     +
    M5     28     4.9   3.9     4.7       5.5      1.7      4.1     +
    36     0   1     0       0      0      0.2     -
    M6     28     0   2.6     1.1       7.2      7.2      3.6    +/-
    36    ND   0     0       0      0      0    -
    M7     36    0   0     0       0      0      0    -
    M8     36    0   0     0       0      0      0    -
a按表6所述完成检测。用在250微升自体血清和250微升RIBI中的10微克重组Tat接种猴子M1-3；用在250微升自体血清和250微升Alum中的10微克重组Tat接种猴子M4-6；给两个对照猴子接种RIBI(250微升和250微升自体血清)(M7)和Alum(250微升和250微升自体血清)(M8)。ND，未做。
在44周，确定存在着总抗病毒活性(TAA)。将TAA测量为用重组Tat蛋白接种的猴子的PBMC(存在自体血清的条件下培养的)抗SHIV 89.6P感染的能力(表13)。
表13
分析总抗病毒活性(TAA)的存在a
    猴子ID                 感染后天数
    7     17
    最小感染剂量(TCID50/细胞)     最小感染剂量(TCID50/细胞)
    M1     10-2     10-2
    M2     10-4     10-4
    M3     10-3     10-3
    M4     10-2     10-2
    M5     10-2     10-2
    M6     10-3     10-3
    M7     10-3     10-3
    M8     10-4     10-3
a在44周，从用重组Tat蛋白(10微克)与RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接种的猴子中以及从用RIBI(M7)或Alum(M8)接种的对照猴子中收集PBMC。用Ficoll梯度纯化并以5×105/200微升/孔一式三份接种在48孔平板中的PBMC生长在含10％FCS和5％在56℃预先加热30分钟的自体血浆的RPMI1640中，存在抗CD3单克隆抗体(5ng/ml)和IL-2(2U/ml)的条件下，在37℃生长48-72小时。在37℃，将细胞用系列稀释的嵌合病毒SHIV 89．6P(10-2、10-3、10-4、10-5TCID50/细胞)感染2小时，用PBS-A洗涤3次，然后以5×105细胞/ml/孔重悬在50％条件培养基和50％新鲜培养基中。在感染后第3、7、10、14和17天，按份收集培养基，然后用等体积新鲜培养基代替。用p27 Gag ELISA(Coulter International,Miami,FL)确定细胞上清液中的病毒复制。将结果表示为在感染后第7和17天，能够感染猴子淋巴细胞的SHIV(TCID50/细胞)最小感染剂量。
结果表明存在由CD8+T淋巴细胞(CAF)介导的可溶性抗病毒活性(表14)。与对照动物相比，在接种的猴子中观察到CAF活性的总增加。
表14
分析由CD8+T淋巴细胞(CAF)介导的可溶性抗病毒活性的存在a
    猴子ID     首次接种后周数           ％病毒复制的抑制
    急性感染     慢性感染
    M1     0     8     30
    32     53     53
    M2     0     36     0
    32     60     27
    M3     0     0     37
    32     55     29
    M4     0     45     0
    32     85     66
    M5     0     41     0
    32     ND     ND
    M6     0     49     18
    32     34     41．4
    M7     0     39     39
    32     71     44
    M8     0     37     0
    32     76     26．8
a分析是否存在由来自用重组Tat蛋白(10微克)与RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接种的猴子和来自用RIBI(M7)或Alum(M8)接种的对照猴子的CD8+T淋巴细胞(CAF)介导的可溶性抗病毒活性。对用SHIV 89．6P感染的CEM×174细胞检测急性感染。按表7所述完成检测，结果为感染后7天的结果。用U1细胞系(参考文献47)检测慢性感染系统上存在的CAF，U1细胞系是用HIV-1慢性感染的幼单核细胞人细胞系。将以1×104细胞/200微升/孔接种在96孔平板中的U1细胞与PMA(10-8M)一起保温以诱导HIV-1感染的再激活，加入或不加入不同体积(50微升、5微升、0．5微升)来自接种和对照猴子的CD8+T淋巴细胞的培养上清液。PMA处理后3天，用RT检测或p24 Gag ELISA确定培养基中HIV-1的存在。将结果表示为与未处理细胞相比，在用CD8+T细胞上清液处理的细胞中HIV-1复制的抑制％。急性和慢性感染的抑制结果指用5微升CD8+上清液处理的细胞。
还要确定在用Tat和RIBI(M1-3)或Tat与Alum(M4-6)接种的猴子和对照猴子M7和M8的PBMC中，细胞因子(γIFN、IL-4、TNFα)与RANTES趋化因子的生产(表15)。
表15
细胞因子和趋化因子生产的分析
猴子     对照     PHA     TT
  γIFN     IL-4     TNFα RANTES   γIFN   IL-4  TNFα     RANTES   γIFN  IL-4  TNFα  RANTES
 M1     -/-     -/-     -/-     -/-  988/1096    -/-    948/-     1788/2564     -/-    -/3.8   -/-  Nd/Nd
 M2     -/-     -/-     126/-     -/-  325/280   -/-    244/172     292/284   86/66     -/-  -/-  Nd/Nd
 M3    Nd/Nd    Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd   Nd/Nd   Nd/Nd    Nd/Nd      Nd/Nd   Nd/Nd   Nd/Nd   Nd/Nd   Nd/Nd
 M4     -/-     -/-      -/-     -/-  426/66    -/-     98/-     -/284    -/-    -/-   -/224   Nd/Nd
 M5     -/-     -/-     48/-     -/-  279/303    -/-     416/-     536/608    -/-    -/-   -/-   Nd/Nd
 M6     -/-     -/-     -/-     246/-  255/137    -/-     -/-     1124/268    -/-    -/-   -/266   Nd/Nd
 M7     -/-     -/-    -/-      -/-  150/169    -/-     40/-     1228/976    -/-     -/4   -/nd   Nd/Nd
 M8     -/-     -/-    -/-      -/-    0/0   20/32     60/-     2160/1588    -/-     -/-   -/nd    Nd/Nd
猴子     Tat (1μg)     Tat(5μg)
    γIFN     IL-4     TNFα  RANTES     γIFN     IL-4     TNFα  RANTES
   M1      -/-     -/-      -/-     -/-     -/-     -/-     16/-     -/-
   M2      -/-     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-
   M3     Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd     Nd/Nd
   M4     -/-     -/-     378/430     -/-     -/-     -/-     344/352     -/-
   M5     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-     -/-
   M6     -/-     -/5     -/-     -/-     -/78     -/-     150/-     -/-
   M7     -/40     -/3.3     84/-     -/-     -/-     -/3.2     -/-     -/-
   M8     -/-     -/4.8     -/-     -/-     -/-     -/10     -/-     726/528
a分析来自用10微克Tat与RIBI(M1-3)或者Alum(M4-6)接种的猴子PBMC中，培养48和96小时(48/96)后，细胞因子和趋化因子的生产。将对照猴子(M7和M8)分别用RIBI或Alum佐剂接种。将在44周取出并用Ficoll梯度纯化的PBMC以1×106细胞/ml/孔接种在24孔平板中，然后在含10％FCS的RPMI 1640中生长。将PBMC不刺激(对照)以评估细胞因子和趋化因子的自发释放，或者用PHA(2微克/ml)、破伤风类毒素(TT,5微克/ml)或者Tat(1或5微克/ml)刺激。刺激后48和96小时收集培养上清液等份以便确定细胞因子和趋化因子的存在，用市售BioSource International(Camarillo,CA,USA)ELISA试剂盒检测细胞因子生产，用R&D Systems(Abdigdon,Oxon,UK)试剂盒评估RANTES生产。将结果分别按培养48和96小时pg/ml表示(48/96)。截断值(pg/ml)为：γIFN,31.2；IL-4,3.12；TNFα,15.6；RANTES,6.25。(-)，所述数值低于相应的截断值。Nd：未做。
此外，在15周，用重组蛋白接种的5只猴子(M2-6)对Tat的皮肤检测有阳性反应，有强延迟超敏反应(表16和图19)。在猴子4和5中，皮肤检测反应甚至比以后周中的都强(表16)。
表16
对Tat的皮肤检测a
猴子                           首次接种后周数
    11     15     21     28     32     36     44
    M1     -     -     -     -     -     -     -
    M2     -     +     +     +/-     +/-     +     +/-
    M3     +/-     +     +/-     +/-     -     -     -
    M4     -     +     ++     ++     ++     ++     ++
    M5     +/-     +     ++     +     ++     ++     +
    M6     -     +     +/-     +/-     -     -     -
    M7     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND
    M8     ND     ND     ND     ND     ND     ND     ND
a将在150微升PBS-0.1％BSA中的Tat(1和5微克)或者仅缓冲液通过皮内途径接种于接种猴子背部刮过的区域。在第一次免疫接种后第11、15、21、28、32、36和44周，不给对照动物接种(ND，未做)。用在250微升自体血清和250微升RIBI中的10微克重组Tat蛋白接种猴子M1-3；用在250微升自体血清和250微升Alum中的10微克重组Tat蛋白接种猴子M4-6；给两个对照猴子接种RIBI(250微升和250微升自体血清)(M7)或Alum(250微升和250微升自体血清)(MB)。在48-72小时后红斑结的存在表明有延迟的超敏反应(DTH)：++，Φ≥5mm；+，Φ≥1-4mm；+/+，红斑不变硬；-，Φ＜1mm。
攻击后结果表明4/6(67％)的接种猴子可以抵御10 MID50SHIV 89.6P的感染，正如通过病毒检测结果所表明的(表17)。具体地讲，在猴子M1、M2、M4和M6的血浆中未检测到p27 Gag抗原，在来自这些猴子的淋巴细胞中通过PCR未发现原病毒DNA，胞病毒血症是阴性。通过检测细胞中的原病毒DNA和阳性胞病毒血症，血浆中存在p27 Gag抗原表明，猴子M3和M5受到感染(表17)。以相同的病毒学检测为基础，两个对照(M7和M8)的结果是都受到感染。为了进一步控制用于攻击的病毒剂量的感染性，将另一只首次用于试验的猴子(M13)加到对照动物中并用2.85MID50SHIV 89.6P(相应于比方法中用于攻击动物的剂量低3.5倍的病毒剂量)感染。以所有病毒学检测为基础，猴子M13的结果是受到感染。为了证明动物与病毒接触，按照本实施例已描述过的方法分析抗SIV抗原的抗体的存在，该抗原由嵌合SHIV 89.6P病毒编码(Gag,Pol,RT,Nef)。病毒学参数是阴性的猴子(M1、M2、M4和M6)中，抗SIV抗体的存在证明这些动物与病毒接触并说明在这些猴子中已发生SHIV的顿挫型感染。按照下列方法，将低抗SIV抗体滴度的猴子用于体外特异性抗病毒IgG(IVAP)生产(参考文献177、178)的研究。将PBMC(2×106/孔)接种在24孔平板中，然后用PWM(2μg/ml，Sigma,St.Louis,USA)刺激。7天后，收集保温(37℃，存在5％CO2和95％温度)培养上清液以通过用于检测HIV-1和HIV-2抗体的ELISA市售试剂盒(Abbott，HIV-1/HIV-2 EIAThird Generation Plus)检测抗HIV抗体生产。对于抗HIV Env抗体的生产，所有被攻击猴子的结果均是阳性，因为HIV-1 Env存在于SHIV89.6P。
表17
病毒学参数的分析
猴子     用SHIV89.6P攻击后的天数
                       15                          30                         60
    p27a(pg/ml)     DNA PCR(拷贝/μg)b 胞病毒血症c   抗-SIVIgGd   p27(pg/ml)   DNA PCR(拷贝/μg)   胞病毒血症   抗-SIVIgG   p27(pg/ml)   DNA PCR(拷贝/μg) 胞病毒血症   抗-SIVIgG
    M1     ＜20     ＜1     Neg     1∶2     ＜20     ＜1     Neg     1∶2    ＜2     ＜1     Neg     1∶2
    M2     ＜20     ＜1     Neg     1∶2     ＜20     ＜1     Neg     1∶2    ＜20     ＜1     Neg     1∶2
    M3     73.3     855     707.3     Neg     26.22     959     74.95     Neg     ＜20     71     ＜1     1∶10
    M4     ＜20     ＜1     Neg     1∶2     ＜20     ＜1     Neg     1∶2     ＜20     ＜1     Neg     1∶2
    M5     964     1147     ＞2818.3     Neg     20.8     ＞106     78     1∶2    ＜20     65     44.6     1∶10
    M6     ＜20     ＜1     Neg     1∶8     ＜20     ＜1     Neg     1∶8    ＜20     ＜1     Neg     1∶6
    M7     287.8     838     707.9     ＞1∶50     65.2     858     354.8  ＞1∶50    ＜20     439     11.2     1∶6400
    M8     106.7     376     707.9     1∶2     ＜20     311     44.6     1∶5   ＜20     56     2.8     1∶6400
    M13     1876     +/     +e      ND     ＜20     +/     ND     1∶1600   ＜20     43     ND     1∶3200
分析攻击用10微克重组Tat蛋白与RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接种的猴子后的病毒学参数。对照猴子(M7和M8)分别用RIBI或Alum接种。猴子M13是用2.85 MID50SHIV 89.6P感染的首次用于试验的猴子。
a用p27 Gag ELISA(Innogenetics，Belgium)评估血浆抗原血症并将其表示为p27值(pg/ml)。对Neg,其值低于相应的截断值(18pg/ml)。
b用QIAamp血液试剂盒(Angiogen Gmbh and Qiagen Inc.,Hilden,Germany)通过全血纯化DNA。按以前所述(参考文献141)，通过PCR扩增β珠蛋白基因来控制DNA的质量。通过半定量PCR扩增SIV gag分析原病毒DNA的存在。按所述(参考文献153)所述，用引物SG1096Ngag(相当于SIVmac251基因组上的核苷酸1096-1119：5’TTAGGCTACGACCCGGCGGAAAGA3’)和SG1592CgagD(在SIVmac 251基因组上的核苷酸1569-1592作图：5’ATAGGGGGTGCAGCCTTCTGACAG3’)对1微克细胞DNA进行PCR，扩增SHIVgag基因的496个碱基对片段。为了定量分析原病毒DNA的拷贝数，用质粒pCMRII-Δgag(含SlVmac251 gag基因中100个碱基对的缺失)为模板DNA和上述扩增396个碱基对DNA片段的引物制备每个试验中的标准曲线。用电泳分析PCR产物，然后用光密度分析(Ultrascan LX EnhancerLaser，LKB，Bormma，Sweden)定量分析。通过线性回归分析(Statgraphics,Manugistics,Inc.Cambridge,MA)确定OD值与Δgag质粒分子数量之间的关系。OD值在高达1000个分子时仍呈线性(相关系数=0.954±0.026)。将每个样品的OD值插到标准曲线中确定SHIV原病毒DNA拷贝数/微克细胞DNA。检测的灵敏度是1拷贝原病毒/μg DNA。
c用共培养试验确定胞病毒血症。为了达到该目的，将1×104CEM×174细胞在存在系列稀释(共12个稀释度，1×106-3.9×103细胞/孔)的研究中的CD-8耗尽PBMC的条件下，培养在96孔平板中。在感染后第3、7和10天，取出150微升以用ELISA(Innogenetics,Belgium)检测p27 Gag的存在并用等体积新鲜培养基代替。用Reed和Muench公式分析结果以确定每1百万总细胞生产性感染PBMC的数量。
d用Elavia Ac-Ab-Ak Ⅱ试剂盒(Diagnostic Pasteur,Paris,France)，按照制造商的说明，一式两份检测系列稀释的动物血浆中抗SHIV抗体的存在。列出血浆值高于截断值的最高稀释度。
e完成病毒分离，对于猴子M13没有胞病毒血症。为了达到该目的，将用Ficoll纯化的不同剂量SHIV 89.6P感染的猴子的PBMC(3×106)与CEM×174细胞(1×106)在1毫升含10％FCS的培养基中培养。24小时后，以1×106/ml稀释细胞，然后将细胞培养3天。然后收集2毫升培养基，并以3×105/ml将细胞再接种在7毫升培养基中。弃去过量的细胞。将该过程每周重复2次，重复4周。用p27 Gag ELISA(Innogenetics,Belgium)然后用RT检测确定病毒的存在。当3个连续样品中两个检测(p27和RT)均为阳性时，认为病毒分离是阳性(+)。
相反，认为病毒分离是阴性(-)。
f对猴子M13进行定性DNA-PCR。
如表18中所示，病毒学数据与CD4淋巴细胞的绝对数量重叠，在感染的猴子(M3、M5、M7、M8)中CD4淋巴细胞的数量显著降低，而病毒阴性动物(M1、M2、M4、M6)中则高且稳定。
表18
CD4+和CD8+淋巴细胞的FACS分析a
猴子                                   用SHIV896P攻击后的天数
    0     15     30     60
    ％(细胞，ul)     ％(细胞，ul)     ％(细胞，ul)     ％(细胞，ul)
CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+
M1  32.1(1490) 53(2460) 0.6  ND  ND ND  30.8(2420) 57.3(4500) 0.54  30.6(2460) 57.9(4670) 0.53
M2  27.7(1550) 45.3(2530) 0.6  ND ND  ND  35.5(2120) 43.7(2610) 0.81  29.6(2000) 42.4(2870) 0.7
M3  33(1120) 39.3(1340) 0.84 ND ND ND  3.1(190) 75.6(4660) 0.04  6.2(240) 70(2750) 0.09
M4 16.6(670) 68.3(2740) 0.24  ND  ND ND  17.25(2050) 68.7(8180) 0.25  15.5(1520) 75(7350) 0.21
M5  36.3(2770) 43.9(3350) 0.83 ND  ND  ND  1.1(90) 82.3(1300) 0.01  4.1(480) 75.5(8730) 0.05
M6  35.3(1210) 43.4(1490) 0.81 ND  ND  ND  35.9(1240) 45.5(1570) 0.79  37.8(3700) 43.7(4280) 0.86
M7  36.1(1610) 31.3(1400) 1.15  ND ND  ND  7.4(480) 66.1(4260) 0.11 13.7(860) 56.7(3550) 0.24
M8  25.7(850) 51.3(171O) 0.5  ND  ND ND  3.3(210) 76.2(4840) 0.04  8.1(590) 64.9(4670) 0.13
M13 40.5(2590) 39.7(2544) 1.01  38.4(434) 33.6(380) 1.14  35.1(1721) 32.2(1479) 1.16  3.1(111) 62.3(2225) 0.05
aFACS分析用10微克重组Tat蛋白与RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接种的猴子的CD4+和CD8+淋巴细胞。对照猴子(M7和M8)分别仅用RIBI或Alum佐剂接种。猴子M13是用2.85 MID50SHIV 89.6P感染的首次用于试验的动物。用荧光激活的细胞分类术(FACS)按所述(参考文献137)，利用标记的单克隆抗体(抗CD4-FITC,BioSource；抗CD8-PerCp,Becton-Dickinson)完成分析。ND，未做。
攻击前的结果表明Tat作为免疫原，以及RIBI和Alum作为佐剂(或者在最后一次加强免疫中用作佐剂的ISCOM)可以被动物很好地耐受，而且是无毒的，这证明了在第一个预试验中用Tat免疫得到的安全性和耐受性结果。此外，这些数据证明了第一个预试验的观察结果，支持重组Tat蛋白引发体外和体内具有抗病毒作用的Tat特异性的强体液和细胞反应的其它证据。攻击后结果(4/6保护的猴子)证实了体外结果的预期并表明抗Tat疫苗诱导抗感染的保护作用并因此可以抵御疾病。对两只接种的和感染的猴子的观察将证明接种对疾病进展的影响。实施例5．在Macaca fascicularis中接种抗Tat DNA疫苗：分析安全性、耐受性、特异性免疫反应和抗病毒攻击的保护效力
建议直接接种含tat基因的cDNA的质粒pCV-Tat的DNA，用质粒pCVO作为对照DNA。按照标准方法(参考文献110)和“European Agencyfor the evaluation of medical products；Human Medicine EvaluationUnit”(Technical Report Series No.17 January 1997)确立的方法在大肠杆菌(DH5菌株)中扩增将施用给动物的质粒DNAs，将所述DNA用两次CsCl梯度纯化并对100体积PBS透析48-72小时。然后通过限制酶消化检查DNA。通过利用磷酸钙技术(参考文献110)，将5-10微克DNA转染到H3T1细胞(1×106)中以及48小时后，通过CAT活性分析(参考文献55)来检查质粒DNA的功能，所述H3T1细胞含有整合拷贝的报道质粒HIV-1 LTR-CAT。用cynomolgus猴子(Macaca fascicularis)评估用pCV-Tat质粒DNA免疫接种后，耐受性、安全性、引发特异性免疫反应(体液和细胞的)的能力和抗病毒攻击保护作用的效力。在第一个预试验中，按照下列方案免疫接种3只猴子：在靠近腋淋巴结的背部2个位点，用200微克在300μl PBS中的pCV-Tat皮内接种猴子M1(150μl/位点)；在背部的2个位点，用500微克在500μl PBS中的pCV-Tat肌肉内接种猴子M2(250μl/位点)。在肌肉内接种前第1或5天，将含0．5％布比卡因和0．1％对羟基苯甲酸甲酯的250μl生理溶液注射在预先标记的2个位点，在所述位点已接种过质粒DNA。这样做是为了提高DNA在肌肉中的摄入和表达(参考文献37、45)。猴子M3不接种并将其用作对照动物。但是，从10周开始，用6微克(5+1微克)Tat皮内接种该猴子作为皮肤试验的对照。在第一次接种前42和35天，从所有猴子身上各取10毫升血以分析基础参数。在0时和5、10、15、22、27、32和37周后，给猴子接种。最后，在第42周，用在200微升ISCOM和300微升PBS中的重组Tat蛋白(16微克)给动物进行最后一次加强接种。按实施例4所述，每天观察动物的临床参数。此外，按实施例4所述，在接种的同一天取10毫升血。用10 MID50SHIV 89.6P攻击猴子后，确定接种的保护作用，在65周静脉内途径注射攻击。按实施例4所述完成攻击后观察，并继续观察。该试验的结果如下。在2只接种的猴子和对照猴子中，临床、血液学和行为学参数没有变化。在注射部位没有发现炎症迹象和新血管生成。这些结果表明pCV-Tat DNA能够被动物很好地耐受，而且在试验所用的剂量和接种途径下没有毒性。用200微克DNA皮内接种的猴子M1自32周产生Tat特异性IgG抗体(图11)。抗体滴度(从32周至58周)为1∶100至1∶800(图12)。在37周，表位图谱分析(按图4注释完成的)表明这些抗体抗Tat的特异性区域，所述区域为氨基酸1-20、氨基酸46-60和氨基酸65-80，滴度分别为1∶200，1∶100和1∶50(数据未给出)。在500微克DNA经肌肉内接种的猴子M2中，在整个研究期间，几乎检测不到抗Tat抗体(1∶50滴度，未列出)。所述结果示于图11中。按实施例4所述，在与外源Tat蛋白保温的HLM1细胞中，通过检测病毒复制获救的抑制作用来检测用200微克DNA经皮内途径接种的猴子M1的血浆中和Tat活性的能力。该检测表明在37周得到的以1∶2稀释的猴子M1血浆可以降低30ng/ml外源Tat诱导的病毒复制。相反，在0时得到的同一猴子的血浆(预免疫)不能阻断细胞外Tat(表19)。
表19
血浆对细胞外Tat诱导的病毒感染获救的中和活性a
样品                     抑制作用Tat+M1预免疫                 0Tat+M1免疫                   51
a在与0时(预免疫)或37周(免疫)从猴子M1得到的等体积血浆预保温的HLM1细胞中，通过加入30ng/ml重组Tat蛋白，确定抗Tat抗体中和Tat活性的能力，所述猴子M1用200微克pCV-Tat质粒DNA经皮内途径接种。按表4所述完成检测并表示结果。
表20中的结果表明在经皮内用200微克DNA免疫接种的猴子M1中，在42周存在对Tat的增殖反应，而在猴子M2中，未检测到这种细胞反应。
表20
对Tat的增殖反应a
猴子 刺激     首次接种后的周数
    15     22     27     32     37     42     48     58
    M1 pHATTTat     32,90,80,9     452,71,7     89,31,51,2   40,51,31,1   3,10,61,1   13,395,9     ND1,21   13,11,61
    M2 PHATTTat    11,70,90,8     18,51,81,4     21,80,80,9   32,21,11,1   1,111,1   6,21,51,3     71,11,1   18,911
    M3 PHATTTat     5,17,22,1     19,96,21,4    18,25,52,2   6,62,80,7   8,15,61,5   77,836,82,8     ND10,8   2,12,10,9
a分离PBMC，用PHA(4μg/ml)、破伤风类毒素(TT)和Tat(1或5μg/ml)刺激，然后按表5所述检测。将猴子用200微克pCV-Tat(M1)经皮内途径或者用500微克pCV-Tat(M2)经肌肉内途径接种。不给猴子M3接种，但自10周开始，用6微克(5+1微克)Tat皮内接种作为皮肤试验的对照。ND：未做。
在42和48周，在猴子M1中检测抗Tat细胞毒性活性(CTL)，在48周，检测猴子M2中的抗Tat细胞毒性活性。此外，在48周，对自10周用6微克Tat接种作为皮肤试验对照的猴子M3中观察阳性CTL反应(表21)。
表21
Tat特异性细胞毒性活性(CTL)的分析a
猴子 周数                       靶∶效应物比   CTL活性
1∶50  1∶25  1∶12,5  1∶6,25  1∶3,125  介质
  M1     42  27,4  27,8  17,1   9,8     3,9   17,2     +
    48  ND  ND  21,3     0     11,7     11     +
  M2     42  1,2  5,9  2,4     1      0    2,1     -
    48  ND  ND   ND   57     25,1    41     +
  M3     42   0   0    0   1,2       0    0,6     -
    48  ND  12,4   4,2    0       0     0     +
a按表6所述完成检测。用200微克(M1)pCV-Tat经皮内或用500微克(M2)pCV-Tat经肌肉内接种猴子。不给猴子(M3)接种，但自10周开始，用6微克(5+1微克)Tat皮内接种作为皮肤试验的对照。ND：未做。
列于表22中的结果表明在52周，在用200和500微克DNA接种的两只猴子中均存在总抗病毒活性(TAA)。
表22
总抗病毒活性(TAA)的分析a
猴子 感染后天数
7 17
最小感染剂量　(TCID50／细胞) 最小感染剂量　　(TCID50／细胞)
M1 10-4 10-4
M2 10-4 10-4
M3 10-3 10-3
a按表13所述完成检测。用200微克(M1) pCV-Tat经皮内或用500微克pCV-Tat经肌肉内接种猴子。不给猴子(M3)接种，但自10周开始，用6微克(5+1微克)Tat皮内接种作为皮肤试验的对照。从首次免疫接种后第52周收集PBMc，用SHIV 89．6P(10-2、10-4、10-6、10-8TCID50/细胞)感染PBMc。将结果表示为仍能感染细胞的最小SHIV(TCID50/细胞)感染剂量。
表23中所列的结果表明在22和27周，在两只接种的猴子中均存在由CD8+T淋巴细胞介导的可溶性抗病毒活性(CAF)。该活性在对照猴子中较低。
表23
分析CD8+细胞介导的可溶性抗病毒活性(CAF)a
 猴子  首次接种后的周数       ％病毒复制的抑制
 急性感染  慢性感染
 M1  22  62  27
 27  56  25
 M2  22  74  ND
 27  28  ND
 M3  22  24  ND
 27  37  22
a分析衍生于用200微克(M1)和500微克(M2)pCV-Tat接种的猴子和猴子M3的CD8+T淋巴细胞产生的可溶性抗病毒活性(CAF)是否存在。按表7所述，在用SHIV 89.6P感染的CEM×174细胞中和用HIV-1慢性感染的OM-10-1细胞中对急性和慢性感染进行抗病毒活性检测。将结果表示为与未处理的细胞相比，用CD8+T淋巴细胞上清液处理的细胞中病毒复制的抑制作用百分比(％)。在表中所列的急性和慢性感染的结果是用5微升CD8+培养上清液处理的样品的。ND，未做。
表24中所列的结果表明用200微克DNA经皮内途径接种的猴子M1在22周对Tat的皮肤试验为阳性。
表24
对Tat的皮肤试验a
接种后周数                  猴子
    M1     M2     M3
    10     -     -     -
    15     -     -     -
    22     +     -     -
    27     -     -     -
    32     -     -     -
    37     -     -     -
    42     -     -     -
    48     -     -     -
    52     -     -     -
    58     -     -     -
a从首次免疫接种后第10、15、22、27、32、37、42、48、52和58周，将在150微升PBS-0.1％BSA中的Tat(1和5微克)或仅缓冲液(对照)经皮内接种在接种动物和对照猴子(有关反应特异性的对照)的预先thrichotomized的上背部区域。用200微克质粒pCV-Tat的DNA经皮内接种猴子M1，而用500微克同样质粒经肌肉内接种猴子M2。不给猴子M3(对照)接种，但自10周开始，用6微克(5+1微克)Tat皮内接种作为皮肤试验的对照。48至72小时后，出现红斑结，表明存在延迟类型的超敏反应(DTH)：++，Φ≥5mm；+，Φ≥1-4mm，±红斑，未变硬；-，Φ＜1mm。
这些结果表明质粒pCVTat(pCVTat-DNA)在给定的剂量经皮内和肌肉内均能被很好地耐受并是安全的。此外，这些结果表明用pCVTat-DNA免疫接种可诱导具有抗病毒作用的体液(尽管低于用重组Tat蛋白诱导的)和细胞抗Tat免疫反应。有关攻击后(在首次免疫接种后第65周完成的)的保护性效力、病毒学参数，包括抗原血症和胞病毒血症的测量以及PBMCs中原病毒DNA(DNA-PCR)拷贝数的确定表明用Tat-DNA经肌肉内免疫的猴子M2在用10 MID50 SHIV-89.6P攻击后受到保护，而用较小剂量Tat-DNA(200微克)皮内免疫接种的猕猴M1受到感染，这表明就用DNA免疫接种而言，肌肉内途径比皮内接种更有效。对照猴子M3也对感染产生抗性。但是，如前所述，与其它试验方法中的对照不同，该猴子接受了有关Tat的重复皮肤试验以对照试验的特异性(表24)，而抗Tat抗体，尽管滴度较低(1∶100)，但自免疫开始后32周仍可检测到(数据未给出)。此外，在该猴子中，对Tat的增殖反应是对抗原的一种弱而散发的反应性(表20)。最后，猴子M3存在特异性抗Tat CTLs(表21)。尽管是初步的，但这些数据表明皮内重复注射6微克Tat就使动物免疫并产生免受攻击的保护作用。因此，认为猴子M3是用Tat蛋白皮内接种的并照此研究。
表25
病毒学参数的分析
猴子     用SHIV89.6P攻击后的天数
       15       30        60
 p27a(pg/ml)  DNA PCR(拷贝/μg)b  胞病毒血症c  抗-SIVlgGd  P27(pg/ml) DNA PCR(拷贝/μg)b  胞病毒血症c  抗-SIVIgG  p27(pg，m1)  DNA PCR(拷贝/μg)b  胞病毒毒血症c  抗-SlVIgG
  M1   1796   1278   >2818.3   1∶10   68.6   1048   353.9   1∶50   <20   8   21.3   1∶800
  M2   <20   <1   Neg   1∶10   <20   <1   Neg   1∶50   <20   <1   Neg   1∶10
  M3   <20   <1   Neg   >1∶50   <20   <1   Neg   >1∶50   <20   <1   Neg   1∶100
猴子M1已用200微克pCVTat皮内免疫接种，猴子M2已用500微克pCVTat肌肉内免疫接种。猕猴M3用6微克Tat蛋白皮内重复注射数次以便对照皮肤试验的特异性。因此，从攻击后开始，认为猴子M3是接种的猴子。按表17注释评估病毒学参数。
用FACS评估CD4和CD8淋巴细胞的百分比和绝对数量证实了病毒学数据，在感染的猴子中，在第一次感染后分析(30天)时CD4淋巴细胞显著减少(约4倍)，而且此后(60天)也是如此(表26)。
表26
CD4和CD8亚组的FACS分析
猴子     用SHIV89.6P病毒攻击后的天数
    0     15     30     60
    ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)
    CD4+     CD8+ CD4+/CD8+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+     CD4+     CD8+ CD4+/CD8+     CD4+     CD8+ CD4+/CD8+
 M1  27.5(940) 40.7(1390)     0.68  ND  ND     ND  8.1(250) 56.5(1780)     0.14  9.5(360) 69.7(2650)     0.14
 M2  22.2(490) 36.8(810)     0.6  ND  ND     ND  16.4(580) 42.4(1500)     0.39  10.9(940 ) 52.7(4560)     0.21
 M3  28.7(1170) 41.1(1680)     0.7  ND  ND     ND  19.5(970) 48.7(2430)     0.4  17.9(900) 52.2(2620)     0.34
按表18注的说明完成分析。猴子M1已用200微克pCVTat质粒DNA皮内接种，猴子M2用500微克pCVTat-DNA肌肉内接种。猕猴M3用6微克Tat蛋白皮内接种。
以这些结果为基础设计第二个试验，其中在3只猴子(M9-M11)中评估用pCVTat-DNA免疫的效果，与接受pCVO-DNA的对照猴子(M12)进行比较。在背部的2个位点肌肉内给所有猴子接种共1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12)。在接种前1或5天，将250微升含0．5％布比卡因和0．1％对羟基苯甲酸甲酯的盐水溶液接种到两个标记位点，所述位点已连续注射过质粒。在0时和第6、11、15、21、28和32周接种猕猴。在36周，用重悬在200微升ISCOM和300微升PBS中的重组Tat蛋白(16微克)进行最后的加强接种。按实施例4所述，每天对照动物的临床参数。此外，按实施例4所述，在初次免疫接种前9天和每个免疫接种时，取10毫升血。为了评估接种的保护作用，从免疫开始第50周静脉内注射10 MID50SHIV-89.6P攻击猴子。按实施例4所述进行攻击后观察并完成观察。
该试验的结果如下。在接种的和对照猴子中，就行为、临床参数和血液化学而言，没有改变。在注射位点未检测到炎症或血管新形成的迹象。这些结果证实肌肉内注射1mg质粒pCVTat DNA能够被很好地耐受且无毒。自15周检测到抗Tat IgG(图13)，滴度为1∶50至1∶100(数据未列出)。此外，在一只猴子(M11)中，早在2周就检测到对Tat的增殖反应(表27)。
表27
对Tat的增殖反应a
猴子 刺激                         首次接种后的周数
 2  6  11  15  21  28  32  36  40  44  50
 M9  PHATat  8.92.90.4  9.21.70.5  17.10.90.6  58.211.5  181.81.6  47.10.70.9  43.41.11  3.10.80.7  72.611.1  64.677  72.71.9
 M10  PHATat  8.52.41  180.30.3  19.80.80.7  NDNDND  10.11.11.1  2.20.60.5  14.711  15.20.90.9  4.40.60.7  8.46.44.2  NDNDND
 M11  Tat  25.74.25.1  43.31.90.8  1.31.6  12.10.90.7  27.81.11.1  3.43.61.1  21.31.21.2  14.10.80.7  15.90.30.7  25.81.8  NDNDND
 M12  PHATat  28.73.23.2  30.91.61.4  410.90.8  50.75.21.3  30.81.61  7.61.61.6  431.31  22.61.10.8  34.611  19.90.71.6  55.13.11.3
a按表5所述分离PBMC，用PHA(4μg/ml)或破伤风类毒素(TT，10μg/ml)或Tat(1和5μg/ml)刺激，然后检测。用1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)肌肉内给猴子注射。ND，未确定的。
在免疫后32周检测抗Tat CTLs(表28)
表28
抗Tat细胞毒性活性(CTLs)的分析a
猴子 周数 靶∶效应物比     CTL活性
  1∶50   1∶25   1∶12,5    1∶6,25    1∶3,125   介质
  M9     32     0     0     0     0     0     0     -
    50    4,2     0     0     0     0,9     1     -
 M10     32     0     0     9,9     2,7     0     2,5     -
    50     3,5     0     2,3     0     0     1,1     -
 M11     32     0     10,5     8,9     3,5     0,9     4,7     +
    50     0     0     0     3,8     0,3     0,8     -
 M12     32     0     0     0     0     0     0     -
    50     0     0     0     0     0     0     -
a按表6所述完成检测。用1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)肌肉内给猴子注射。
通过以前所述的检测总抗病毒活性(TAA)存在的检测方法，在44周，从猴子M11得到的PBMCs对系列稀释的嵌合SHIV-89.6P病毒的体外感染产生抗性。事实上，将TAA评估为来自用pCVTat-DNA接种的猴子的、在存在自体血清条件下生长的PBMCs抵御系列病毒稀释物感染的能力(表29)。
表29
总抗病毒活性(TAA)的分析
猴子               感染后天数
    7     17
    最小感染剂量(TCID50/细胞)     最小感染剂量(TCID50/细胞)
M9     10-2     ＞10-2**
M10     10-3     10-2
M11     ＞10-2*     ＞10-2*
M12     10-2     ＞10-2**
a按表13所述完成检测。用1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)肌肉内给猕猴注射。从第一次免疫第44周，取PBMCs，然后体外用10-2、10-3、10-4、10-5TCID50SHIV-89.6P感染。将结果表示为仍能感染细胞的SHIV(TCID50/细胞)最小感染剂量。*在检测所用的最高SHIV浓度(10-2TCID50/细胞)没有培养物受到感染。**在感染后17天，培养物变成阴性。
表30中所列的结果表明在接种的猴子和用空载体(pCVO)注射的对照猴子(M12)中，存在由CD8+T淋巴细胞介导的可溶性抗病毒活性(CAF)。
表30
分析由CD8+T淋巴细胞介导的可溶性抗病毒活性(CAF)a
  猴子   首次接种后的周数          ％病毒复制的抑制
  急性感染   慢性感染
 M9     0     21     14.6
    36     77     2.6
 M10     0     40     13.8
    36     67     25
 M11     0     49     19
    36     42     14
 M12     0     65     23
    36     62     14
a分析由CD8+T淋巴细胞介导的可溶性抗病毒活性(CAF)的存在。从用1mg pCVTat接种的3只猴子(M9-M11)和用1mg pCVO接种的对照猴子(M12)得到PBMs。按表14所述，在用SHIV-89.6P感染的CEM×174细胞中完成急性感染试验。按表14所述，在用HIV-1慢性感染的U1细胞中完成慢性感染试验。将结果表示为存在或不存在(对照)5微升CD8+T细胞上清液条件下培养的细胞中病毒复制的抑制作用百分比(％)。
在44周，用来自接种和对照猴子的PBMCs评估细胞因子(γIFN,IL-4,TNFα)和趋化因子RANTES的生产(表31)。
表31
分析细胞因子和RANTES的生产a
猴子     对照     PHA     TT
γIFN  IL-4   TNFα  RANTES     γIFN  IL-4  TNFα  RANTES γIFN  IL-4  TNFα  RANTES
 M9  -/-    -3.5     -/-     -/-  312/204   -/-  250/- 536/2288   -/-   -/-   -/-  nd/nd
 M10  nd/nd   nd/nd  nd/nd  nd/nd  nd/nd  Nd/nd  nd/nd   nd/nd  nd/nd  nd/nd  nd/nd  nd/nd
 M11  -/-    -/-   -/-     -/-  420/183   -/-  388/- 4336/3124    -/-   -/-   -/nd  nd/nd
 M12  -/-   -3.2   -/-     -/-  430/932  -/-  -/- 1936/2576     -/-    -/-  218/nd  nd/nd
猴子     Tat(1μg)     Tat 5μg)
   γIFN  IL-4     TNFα  RANTES  γIFN     IL-4     TNFα     RANTES
 M9     -/-    -/-     -/-     -/-    -/-     -/-     -/-     -/-
 M10    nd/nd   nd/nd    nd/nd     nd/nd   nd/nd     nd/nd     nd/nd     nd/nd
 M11     -/-    -/4     -/-   544/368    -/-     -/3.5     -/-     2124/-
 M12     -/-    -/-     -/-     -/-    -/-     -/-     -/-     -/-
a按表15所述完成检测。用1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)给猴子进行肌肉内注射。在第一次免疫后第44周，取PBMCs。将结果表示为分别在48和96小时(48/96)检测的细胞因子和RANTES(pg/ml)。(-)，数值低于截断值。截断值(pg/ml)是：γIFN：31.2；IL-4：3.12；TNF-α：15.6；RANTES：62.5。ND未做。
结果表明在11周，在一只猴子(M9)中存在对Tat皮肤试验的弱反应性(表32)。
表32
对Tat的皮肤试验a
首次接种后的周数
猴子 11 15 21 28 32 36 44
M9 +/- - - - - - -
M10 - - - - - - -
M11 - - - - - - -
M12 ND ND ND ND ND ND ND
a从首次免疫接种后第11、15、21、28、32、36和44周，将在150微升PBS-A，0.1％BSA中的Tat(1和5微克)或仅缓冲液(对照)经皮内接种在接种动物(但对照猴子除外)预先thrichotomized的上背部区域。用1mg pCV Tat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)肌肉内给猕猴注射。48至72小时后，出现红斑结，表明存在延迟类型的超敏性(DTH)：++，Φ≥5mm；+，Φ1-4mm，±红斑，未变硬；-，Φ＜1mm。
攻击后的结果表明所有接种动物均受到保护，免于10MID50SHIV-89.6P的感染，正如均为阴性的病毒学试验(血浆抗原血症、原病毒DNA拷贝数的确定、胞病毒血症)所表明的(表33)。此外，在猴子M11中存在着SIV抗体表明与病毒接触或顿挫型感染。相反，在剩余的猴子中未检测到，因此我们决定完成体外抗体生产检测(IVAP)以及对SIV抗原的淋巴增殖反应。这些试验正在进行，而且初步的数据表明在所有DNA接种的猴子中存在抗HIV Env抗体。用较高剂量的病毒接种猕猴，既然甚至对照动物M12也对感染产生抗性。该猴子已用空载体pCVO接种。文献上的最新数据已表明由特定DNA序列(在细菌中比在真核细胞中更常见，而且，与LPS和甘露糖类似)所起的佐剂作用，代表了有关天然免疫的强刺激(参考文献179)。因此，可以想象，在猴子M12中观察到的保护作用可能是由于这些细菌序列的非特异性抗病毒免疫的诱导作用，例如IFNα，IFNβ，IL-12和IL-18的生产，已知发挥免疫调节剂和抗病毒功能。通过在该猕猴中在没有抗Tat特异性体液和细胞免疫的条件下存在TAA(表29)和CAF(表30)抗病毒活性，有力地说明了这一点。事实上，这些检测还测量了非抗原特异性抗病毒活性。首次用于试验的猴子M13，用比猕猴M12低3．5倍的病毒剂量接种，产生感染。这些结果证实接种猴子M12的10MID50攻击剂量是感染性的(表33)。以该结果为基础，本发明人计划使用pCVO载体或其部分作为佐剂。
表33
病毒学参数的分析
猴子     用SHIV89.6P病毒攻击后的天数
    15     30     60
  p27a(pg/ml) DNA PCR(拷贝/μg)b 胞病毒血症c  抗-sIVIgG4     p27(pg/ml) DNA PCR(拷贝/μg) 胞病毒血症 抗-sIVIgG     p27(pg/ml) DNA PCR(拷贝/μg) 胞病毒血症 抗-sIVIgG
    M9 ＜20     ＜1     Neg     Neg     ＜20     ＜1     Neg     Neg     ＜20     ＜1     Neg     Neg
    M10 ＜20     ＜1     Neg     Neg     ＜20     ＜1     Neg     Neg    ＜20     ＜1     Neg     Neg
    M11 ＜20     ＜1     Neg     1∶2     ＜20     ＜1     Neg     1∶2     ＜20     ＜1     Neg     Neg
    M12 ＜20     ＜1     Neg     Neg     ＜20     ＜1     Neg     Neg     ＜20     ＜1     Neg     Neg
    M13  1876     +/     +e     ND     ＜20     +/     ND  1∶1600    ＜20     43     ND  1∶3200
a，b，c，d按表17所述完成检测。用1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)肌肉内给猕猴注射。猴子M13是首次用于试验的动物，用2.85 MID50SHIV 89.6P感染。e完成代替胞病毒血症的病毒分离并且结果为阳性。
fDNA PCR是非定量性的，结果为阳性。
CD4和CD8亚组的FACS分析(表34)证实了病毒学数据。
事实上，仅首次用于试验的猴子M13在攻击后15天和60天观察到CD4淋巴细胞百分比和绝对数量的显著降低，正如通过血浆抗原血症、原病毒DNA和病毒分离阳性所表明的，产生感染(表33)。
表34
CD4和CD8淋巴细胞的FACS分析
猴子     用SHIV89.6P攻击后的天数
    0     15     30     60
    ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)
 CD4+  CD8+  CD4+/CD8+ CD4+ CD8+  CD4+/CD8+ CD4+  CD8+  CD4+/CD8+  CD4+  CD8+  CD4+/CD8+
  M9   21.5(1500)  37.6(2630)     0.57  ND  ND     ND  26.4(1340)  51.6(2610)    0.51  30.6(2000)  45.5(2980)     0.67
 M10   39.5(1050)  36.3(960)     1.1  ND  ND     ND  34.8(1730)  41.8(2080)    0.83  31.6(3760)  52.2(6200)     0.61
 M11   35.8(1080)  37.7(1140)     0.95  ND  ND     ND  28.7(1330)  36.7(1710)    0.78  24.5(890)  48.7(1770)     0.5
 M12   30.9(1860)  46(2760)     0.67  ND  ND     ND  26.7(1300)  49.6(2420)    0.54  23.7(2620)   52.1(5760)     0.45
 M13   40.5(2590)  39.7(2544)     1.01  38.4(434)  33.6(380)     1.14  35.1(1721)  32.2(1479)    1.16  3.1(111)  62.3(2225)     0.05
a按表18所述完成检测。用1mg pCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，对照)肌肉内给猕猴注射。猴子M13是首次用于试验的动物，用2.85 MID50SHIV 89.6P感染。
这些结果表明用pCVTat质粒免疫接种能够被很好地耐受而且无毒，并证实了在第一个预研究中获得的DNA接种的安全性和耐受性。另外，这些数据提供了证据，表明pCVTat-DNA质粒诱导具有抗病毒作用的特异性体液(尽管比Tat蛋白诱导的弱)和细胞免疫反应，部分原因可能是由于在pCVO载体中存在的特定DNA序列可能起佐剂的作用。
评估免疫方法，所述方法包括将编码其它HIV-1的DNA与在实施例3中描述的细胞因子基因组合。在这些试验中，将使用含HIV的tat，rev和nef基因的SHIV(参考文献146、85、142、65、94、129)。
利用可提高免疫效力的其它送递系统，例如脂质体、纳米颗粒、红细胞、基因枪送递给动物接种pCVO和pCVTat质粒，或者利用在预言实施例9和10中所述的疱疹载体送递Tat DNA。
实施例6．治疗疫苗
以Tat-蛋白质和Tat DNA为基础，设计接种方法以评估在已感染个体中抗Tat疫苗的安全性和毒性。对用减少剂量的SHIV 89.6P感染的猴子和有免疫缺陷性疾病(AIDS)的猴子完成试验。用于感染的病毒储备液得自14天前感染的cynomolgus猴子的脾和淋巴结。将用机械分离纯化的淋巴细胞分成两份(各1，5×106细胞/ml)。用免疫磁珠(Dynal,Norway)耗尽一份的CD8+T细胞。将两份培养物用PHA(1μg/ml)刺激3天，然后在存在50U/ml IL-2的条件下，以1×106细胞/ml浓度接种。通过在3天后收集的培养基中反转录酶(RT)的存在来检测病毒复制。检测前，将上清液澄清，然后以100，000rpm在+4℃超离心11分钟(BeckmanTL-100超离心机)，溶解颗粒。将30微升悬浮液加到反应混合物(TRISHCl 1M,pH8；MgCl2,0.5M；KCl,1M；Poly Al mg/ml；oligo-dT 12-18100μg/ml；DTT 0.02 M；1.23[H]-甲基胸苷三磷酸1mCi/ml)中，然后在37℃保温60分钟。通过加入500微升焦磷酸钠0．1M pH5和600微升三氯乙酸(TCA)20％来停止反应，然后将样品滴到0．45μm滤纸(Millipore)上，接着在加入5ml闪烁混合物(Filter Count,Packard)后用β计数器读数。
将含20，000cpm的培养基离心并用10％人血清AB补充。将病毒通过在30，000rpm(4℃，90分钟)超离心浓缩，重悬在含10％人血清(AB类)的RPMI 1640中，然后以小份储存在液氮中。在人细胞系CEM×174和C8166(3×103TCID50/细胞)上体外滴定病毒储备液，在cynomolgus猴子上体内滴定病毒储备液(3．17×105. 69MID50/ml)。
在按上述制备的静脉内感染SHIV89．6P的7只猴子身上完成第一个预试验。按下列方法，每只猴子接受用2％人血清(AB,Rh-)补充的盐水水缓冲液稀释的1毫升SHIV。一只猴子(IM1)用1∶500病毒稀释物接种；两只猴子(IM2，IM3)接受1∶5，000稀释物；两只猴子(IM4，IM5)用1∶50，000接种；猴子IM6接受1∶500，000稀释物；最后一只猴子(IM7)接种1∶5，000，000稀释物。在用SHIV感染前7天从每只猴子身上取血以确定基础参数。将血清和血浆样品在-20℃或-80℃冷冻，然后用于重悬蛋白质接种物。在0时，用SHIV 89.6P给所有猴子接种。给猴子每天做检查。此外，在0天以及2和4周后，从猴子身上取血，然后用10毫升血进行血-化学确定(化学临床分析、电解质、白细胞和血小板计数、血红蛋白)和病毒学和免疫学分析(即血浆p27 Ag确定以及血浆和细胞中的病毒负载)。在感染后4周，感染6只猴子(IM1-6)。接受最低病毒稀释物(1∶5，000，000)的猴子IM7是SHIV阴性(表35)。
表35
在用系列病毒稀释物感染的猴子中，检测SHIV 89.6P的存在
猴子 SHIV 89.6P稀释度                         感染后周数
    0     2     4
病毒分离a     p27(pg/ml)b 病毒分离     p27(pg/ml)b 病毒分离     p27(pg/ml)b
IM1  1∶500  ND     ND     + ＞450     +     47
IM2  1∶5.000  ND     ND     + ＞450     +     161.8
IM3  1∶5.000  ND     ND     + ＞450     +     6.67
IM4  1∶50.000  ND     ND     + ＜20     +     ＞450
IM5  1∶50.000  ND     ND     + ＞450     +     166.7
IM6  1∶500.000  ND     ND     + ＞450     +     0
IM7  1∶5.000.000  ND     ND     -     0     -     0
按表17注所述完成a病毒分离和b血浆p27 Ag(pg/ml)。按文中所述用病毒储备液的系列稀释物静脉内接种猴子。
在感染后第7周，按照下列方法给表现出严重免疫缺陷性症状的所有动物接种Tat蛋白质和质粒pCVTat的DNA。猴子IM1、IM3、IM5和IM6接受Tat蛋白质(20微克)，将Tat蛋白质溶解在250微升用0.1％BSA和20％自体血浆补充的PBS-A中，然后加到250μl Alum佐剂中。将蛋白质接种物皮下接种在猴子上背部的一个位点，将重浮在1ml PBS-A中的质粒pCVTat(1mg)肌肉内注射在背部的不同位点。用250微升Alum和250微升PBS-A，0.1％BSA 20％自体血浆给猴子IM2和IM4(对照)皮下注射在上背部的一个位点，用重悬在1ml PBS-A中的pCV-0(1mg)肌肉内注射在与前一个位点不同的上背部位点。不给未感染的猴子IM7接种。接种日程安排为在相当于SHIV感染后7周的0时和1、4、5、10、11、13、14、17、18周进行接种。为了评估所述接种对疾病进展的影响，每天检查每只猕猴是否存在疾病或有疾病的迹象，在0时和3、8、12、16和21周后，取10毫升血以进行实验室检测(化学-临床分析、电解质、白细胞和血小板计数、血红蛋白)、评估免疫学状态(是否存在特异性免疫球蛋白、测量Th1和Th2细胞因子、趋化因子产生)、通过FACS分析表征淋巴细胞(CD4、CD8、CD28、CD40、CD86、CD20、CD2、CD26和CD20)，而且最后评估病毒学参数(如前所述，通过半定量PCR检测原病毒DNA，通过竞争性RT-PCR的血浆病毒负载，通过ELISA检测血浆p27 Gag抗原以及抗SHIV Ab的存在)。在免疫学、病毒学和临床结果的基础上进行其它加强接种。
在最后一次接种后，每月监测并在出现临床变化时监测。每次将PBMC、血清、血浆和尿样冷冻以便将来进行前述的监测。
描述了已可以从该试验中获得的在免疫后8周得到的结果。在两个接种的无症状和对照猴子中，在接种位点没有炎症和新血管形成的迹象或者一般的疾病症状。在已有症状的猴子中，没有临床状态变化的证据。此外，未检测到病毒复制的激活作用。综合考虑这些结果表明在用生物活性Tat蛋白质或DNA接种的猴子中，没有毒性或增加的病毒复制(表36)。
表36
病毒学参数的分析
猴子                           自开始接种后的周数
 0  3  8
p27(pg/ml) DNAPCR(拷贝/μg) p27(pg/ml) DNAPCR(拷贝/μg) p27 DNAPCR(拷贝/μg)
 IM1  12.3  68  17.3  52  141  41
 IM3  0  61  0  48  0  71
 IM5  97.1  20  21.7  15  23.6  95
 IM6  0  43  0  55  0  24
 IM2  21.2  ND  36.6  53  27.4  78
 IM4  81  195  22  288  15.4  135
 IM7  ND  ND  ND  ND  0  &#621
按表17所述完成检测。给猴子IM1、IM3、IM5和IM6皮下注射Tat蛋白质(20微克)和Alum佐剂以及肌肉内注射pCVTat(1mg)。给猴子IM2和IM4(感染对照)皮下注射Alum佐剂以及肌肉内注射pCVO(1mg)。IM7是未感染的首次用于试验的猴子。FACS分析表明在接种后，CD4+和CD8+T淋巴细胞没有变化(表37)。
表37
CD4+和CD8+淋巴细胞的FACS分析
猴子     时0     自开始接种的周数
    0     3     8
       ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)     ％(细胞/μl)
  CD4+   CD8+  CD4/CD8   CD4+    CD8+ CD4/CD8  CD4  CD8  CD4/CD8     CD4     CD8  CD4/CD8
 IM1   25.39(1264)   36.8(1831)     0.69     3.3(101)     64.16(1963)    0.05     2.32(52)  63.34(431)     0.04     3.41(96)     55.41(1559)     0.06
 IM3   19.26(869)   26.45(1193)     0.73     2.84(74)     58.22(1526)    0.05     3.21(92)  58.16(1663)     0.05     3.18(91)     50.12(1434)     0.06
 IM5   24.75(580)   58.04(1361)     0.42     2.28(38)     57.3(946)    0.04     2.89(48)  55.6(917)     0.05     2.15(60)     54.3(1527)     0.04
 IM6   40.46(2590)   39.74(2544)     1.01     3.12(111)     62.3(2225)    0.05     2.75(138)  65.40(3290)     0.04     2.3(73)     52.18(1659)     0.04
 IM2    42(1787)   34.7(1476)     1.21     2.41(68)     58.12(1632)    0.03     2.7(121)  57.6(2580)     0.05     1.89(66)     50.6(1763)     0.04
 IM4    30.72(1589)    27.76(1680)     1.10     2.12(113)     61.13(3248)    0.03    1.92(90)  60.3(2828)     0.03     3.12(164)     53.12(2790)     006
 IM7    17.02(871)    55.8(2857)     0.30     ND     ND     ND     20.26(770)  51.40(1957)     0.39     24.1(868)     50.43(1842)     0.48
按表18注释完成FACS分析。给猴子IM1、IM3、IM5和IM6皮下注射Tat蛋白质(20微克)和Alum佐剂以及肌肉内注射pCVTat(1mg)。给猴子IM2和IM4(感染对照)皮下注射Alum佐剂以及肌肉内注射pCVO(1mg)。IM7是未感染的首次用于试验的猴子。
这些数据证实在所用的剂量和接种途径，Tat蛋白质和pCVTat质粒在接种的猴子中均能很好地被耐受且没有任何毒性作用，此外，它们既没有增加感染动物中的病毒复制，也没有使CD4 T细胞减少。实施例7．用抗CD3/28包被的珠共刺激来自SIV感染猴子的纯化CD4+淋巴细胞导致细胞数量对数级增加，而没有显著的病毒复制和传播
用抗CD8免疫磁珠(Dynal，Oslo；Dynabeads M-450 CD8)耗尽外周血单核细胞中的CD8+细胞种群。通过FACS分析评估纯化程度，如果纯度高于95％，就认为是可接受的。在存在PHA(2μg/ml)和IL-2(40U/ml)或预先用抗CD3(克隆FN18，BioSource)和CD28(克隆9.3)抗原的两种单克隆抗体包被的免疫磁珠(抗CD3/28珠)的条件下，使CD8耗尽的细胞(命名为CD8-PBMC)生长。为了提高抗CD3/28珠与靶细胞的结合，在一旋转轮处理仪(rotating wheel disposal)上进行保温。然后，用磁铁选择结合的细胞(命名为CD8-CD3+D28+)并接种在培养基中。一周三次，将细胞浓度调整到开始的水平，在标明的地方加入IL-2；此外，就用抗CD3/28珠刺激的细胞而言，初步的结果表明连续的刺激方案与在每个时间点调整的恒定控制的珠：细胞比在诱导增殖反应中是非常有效的。我们以前的研究已表明不存在外源IL-2时，CD8-CD3+CD28+细胞种群比用抗CD3/28珠刺激的CD8-PBMC增殖的更好。此外，加入外源IL-2(40U/ml，每周3次)可以显著提高就细胞数量和作用过程而言的增殖动力学(图14)。
为了评估这种刺激作用的抗病毒活性，在0天，用0.1 M.O.I.SIV感染来自4只未感染猴子的CD8-CD3+CD28+纯化的细胞，然后在连续刺激的条件下培养。用PHA和IL-2刺激的CD8-PBMC是对照试验。用市售ELISA(Coulter,Hialeah,FL)检测培养上清液中的p27 Gag抗原来跟踪病毒感染。在感染后第6和12天测量p27 Gag抗原水平(ng/ml)。如图15所示，在两个刺激方案中，感染存在显著的差异。事实上，在感染后第6天，在CD3／28珠刺激的培养物中的p27抗原比用PHA加IL-2刺激的培养物中的p27抗原少40％至87％，在第12天，在4只猴子中的2只，这种差异增大。这表明，病毒感染的敏感性降低。在两种刺激方案中，仅在一种情况(MK9401)下观察到病毒繁殖。
本文所描述的结果表明Macaca fascicularis是一个很好的通过抗CD3/28珠共刺激来自体内扩增淋巴细胞亚种群的模型，没有病毒复制。这代表了我们建议的治疗疫苗的基本原理，该基本原理是以感染HIV的个体中，自体抗病毒特异性淋巴细胞的增加和再输注为基础。
实施例8．将树突细胞用于免疫接种
树突细胞(DC)和巨噬细胞在较低的程度上能够有效地将抗原呈递给T淋巴细胞，然后在该细胞亚组中诱导增殖或特异性细胞毒性活性的获得。这些细胞被命名为“抗原呈递细胞”(APCs)并可引发免疫反应。因此，DC可用于来自体内免疫接种方法。出于该原因，通过在GM-CSF和IL-2刺激7天后，体外培养粘附的细胞，从Macaca fascicularis的外周血中分离DC前体。或者，将CD34+细胞用免疫磁珠纯化，然后在体外与GM-CSF和TNF-α一起培养14天。为了证明分离了DC，完成形态学分析和表型表征(FACS分析和免疫组织化学)。功能分析是以DC诱导同种异体淋巴细胞增殖的特有能力为基础。
所得的结果完全证实了DC纯化和功能表征的效力。详细地讲，为了分离DC前体，将通过Ficoll密度梯度离心得到的PBMCs再在Percoll不连续梯度(50％和42．5％)上成层。以500g离心30分钟后，在两个梯度间的细胞级分主要由单核细胞组成(正如用FACS分析所证实的，数据未列出)。将这些细胞保持在4℃以避免细胞与塑料管粘附，然后将细胞收集、洗涤、计数并在37℃接种在培养基中。此后，通过4次温和的洗涤洗掉未粘附的细胞。为了诱导分化成DC，将用GM-CSF(200ng/ml,Leucomax,Sandoz,Milan,Italy)和IL-4(200U/ml,Pepro Tech,London,England)补充的完全培养基加至粘附细胞中。作为对照，加入不含细胞因子的完全培养基以诱导巨噬细胞谱系中单核细胞的正常分化。一周两次，一半的上清液用与0天所用相同的新鲜培养基代替。通过典型的形态学改变，如成簇、失去粘附和细胞分株的发育来检测用细胞因子处理的孔中DC的成熟。通过EDTA处理(PBS-A中0.5mM)来脱附在没有细胞因子条件下生长的单核细胞/巨噬细胞粘附细胞，洗涤两次、计数并根据所完成的试验，以不同浓度重悬在新鲜培养基中。对于同种异体混合的白细胞反应(AMLR)，用固定量的同种异体T淋巴细胞检测得到的APCs(DC或巨噬细胞)，APC通过Ficoll和Percoll梯度和粘附来纯化，然后冷冻。在48孔平板中，用0.5×106T淋巴细胞和APCs的系列稀释物完成AMLR。培养4天时，将固定量的细胞悬浮液一式三份接种在96孔平板中。将1μCi3H-胸苷加到各孔中，然后将平板在37℃保温16小时。在保温结束时，用β计数器测量通过细胞掺入的3H-胸苷的量，并以每分钟计数(cpm)表示。结果表明所得的DC是有效的APC，正如与巨噬细胞刺激相比，在同种异体人淋巴细胞中有较高的增殖诱导作用，以及在所用的所有浓度，在猴子中诱导T淋巴细胞增殖的能力所表明的(图16B)。
为了用于接种，将DC以1×105细胞/100μl浓度重悬于用5％自体血清、10mM Hepes缓冲液、100U/ml青霉素-链霉素、0.5 mg/ml两性霉素B和0.03％谷氨酰胺补充的RPMI 1640中，然后在37℃，存在Tat蛋白质或Tat肽或Tat、Rev、Nef、Gag和/或细胞因子的组合的条件下保温2小时。然后，将所述处理的DC从第一次注射开始2-4周内静脉内接种2次或更多次。或者，将DC用含tat基因的载体单独或者与上述其它载体一起转导，然后静脉内注射。
预言实施例9
将把所述的免疫原用于诱导和/或加强粘膜水平的特异性免疫反应。一种方法是基于利用“工程”细菌(格氏链球菌和乳杆菌属)表达上述病毒抗原。这些细菌在小鼠的口腔和阴道粘膜移生并诱导局部和全身的抗体反应，所述抗体反应是针对在重组细菌表面上表达的异源抗原(参考文献116、104、106、121、117、139、105、107)。这些细菌可作为疫苗的活载体并有助于延长免疫系统的刺激作用。此外，我们将评估在细菌表面共表达病毒抗原和与免疫反应有关的分子，例如大肠杆菌温度敏感型毒素的B亚单位或细胞因子的可能性。将按照以前的描述(参考文献116)完成格氏链球菌重组菌株的制备。简而言之，(ⅰ)重组DNA分子的染色体整合；(ⅱ)与强染色体启动子的转录融合；(ⅲ)与编码M6蛋白质(一种链球菌表面蛋白)的基因的转录融合。将用格氏链球菌的重组菌株在猴子的阴道粘膜形成菌落。已经表明在一次接种后，表达HIV-1 gp120的V3区和HPV-16的E7蛋白的格氏链球菌的重组菌株在小鼠阴道粘膜形成永久菌落，诱导局部和全身的抗原特异性抗体反应。全身反应普遍由IgG2a抗体组成，表明产生Th1型反应(参考文献105，106)。我们将选择人阴道的乳杆菌属菌株，它们能够在猴子的阴道粘膜形成菌落。因此，将使用一个成熟的遗传系统，该系统可以在乳杆菌属表面上表达异源抗原(Rush,1997)。这种方法是基于：(ⅰ)将遗传融合物(emm6/异源基因)克隆到携带接合转座子Tn916同源物的插入载体中；(ⅱ)将所述载体转化到作为中间宿主的细菌菌株(枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis))中；(ⅲ)重组转座子从枯草芽孢杆菌接合移动至乳杆菌属中。将用乳杆菌属的重组菌株在猴子的阴道粘膜形成菌落。
用特殊的吸附滤纸(参考文献38、105、106)获得阴道样品。通过将阴道样品铺在选择性平板上来评估菌落化，并通过对阴道swap进行免疫荧光分析来监测HIV抗原的体内表达(参考文献105)。利用已经标准化的方法(参考文献38)，将阴道swaps用于：(ⅰ)在阴道接种的情况下进行Papanicolau试验；(ⅱ)在细胞中是否存在疫苗抗原；(ⅲ)通过细胞荧光测定分析对细胞的表型进行表征(CD1、CD2、CD4、CD5、CD8、CD11c、CD14、CD20、CD28、CD40、CD25、HLA-DR)；(ⅳ)评估细胞因子生产(IL-2、IFNγ、TNFα、IL-4、IL-10、IL-15、半定量RT-PCR)，用ELisa监测确定在粘液中是否存在细胞因子和β趋化因子；(ⅴ)用ELisa确定粘液中的总的和特异性免疫球蛋白(IgA和IgG)的剂量[Di Fabio et al.,Vaccine15：1(1997)]。最后一次接种免疫原一个月后，将猴子通过静脉内或者粘膜途径用SHIV 89.6P感染。按实施例4所述完成对猴子的跟踪观察。取血样以完成常规的实验室检测，按实施例4所述评估免疫学参数，包括体液的和细胞的。本发明人相信可利用该方法经阴道途径成功地诱导猴子的特异性免疫。或者，按上述通过施用蛋白免疫原，在存在佐剂例如大肠杆菌的热敏感性毒素和霍乱毒素的条件下直接通过粘膜途径或者利用其它细菌和非细菌送递系统例如细胞转染剂和脂质体或者通过能够诱导最有效及保护性免疫反应的其它途径的接种(参考文献83、81、62)诱导粘膜免疫。
此外，本发明人相信，表达上述病毒蛋白的重组疱疹载体是诱导有效粘膜免疫反应的优秀系统。将利用来自单纯性疱疹病毒1型(HSV-1)的重组病毒载体表达病毒蛋白用于诱导全身(通过皮肤免疫，皮内)和粘膜(通过口腔、阴道或鼻途径)反应。将利用非致病性、非复制性疱疹载体(参考文献99)，这是由于它们包含大外源序列而不会干扰感染效力的能力(参考文献52、64)。因此，将构建能够含一个以上HIV基因(辅助、调节和结构基因)的载体。可通过口腔、阴道或鼻疫苗以诱导粘膜免疫。可将疱疹载体用于这些接种方法，因为HSV-1可通过粘膜途径直接施用(参考文献176、75)。利用有利于外源序列插入到病毒基因组中的两步法构建重组病毒。第一步需要利用标准同源重组方法，插入含克隆在Pacl限制位点的报道基因(β-半乳糖苷酶，LacZ)的表达盒，所述报道基因不存在于HSV-1基因组中，将该基因插入在想要的HSV-1靶序列侧以中断HSV-1基因。用“x-gal染色：用蓝色表型通过噬菌斑的形成筛选重组病毒。用Pacl消化病毒DNA释放标记基因并产生两个大病毒DNA片段，不能生产感染性病毒颗粒。第二步是共转染消化的病毒DNA和用以产生缺失的相同的质粒，其中用想要的基因代替报道基因。在“x-gal染色”后，通过筛选白色表型的噬菌斑来鉴定重组病毒。这种重组将消除Pacl位点，可以利用该方法在HSV-1基因组的不同座位插入许多基因(参考文献74)。通过杂交含单个基因的不同载体，我们可以产生所有的不同的遗传组合。通过用不同的标记、表型筛选和在感受态细胞上选择性生长可以分离含所有想要基因的载体。通过改变DNA转染和病毒重组可产生全部组合。
构建表达单基因tat、rev、nef或gag的载体用作基础载体，这是在基因4-/22-/27-/41含突变的载体，与其它HSV-1非复制型载体相比，因毒性更低并能更强地表达外源基因而更好。使用组成型启动子，例如来自HCMV(人巨细胞病毒立即早期启动子)或ICPO lep(感染细胞蛋白立即早期启动子)和莫洛尼鼠类白血病病毒LTR的启动子以诱导上述基因的表达。将构建表达不同组合的HIV蛋白的非复制型HSV-1载体。通过遗传杂交在前点所述含单基因的载体可产生含多种不同基因的那些病毒。产生双、三和四载体。将载体经皮内或通过粘膜(口腔、阴道或鼻)途径给猴子接种，要特别注意后一种施用方式(参考文献176、101、102)。接种方案是在不同的时间点多次接种，这必须根据免疫原或免疫原的组合来确定。在免疫接种过程中，监测动物，按实施例4所述评估血液化学和免疫学参数。用已经标准化的方法，获得阴道样品，按本实施例前述研究所述样品。
预言实施例10
送递系统
将用新的送递系统例如红细胞或纳米颗粒接种Tat(蛋白质和/或DNA)或其组合(按上述)。利用红细胞的送递系统是基于送递接合在自体红细胞上的抗原的可能性。事实上，在其存活期间(在人体中存活约120)结束时，通过巨噬细胞从循环中除去红细胞，已知红细胞有专业抗原呈递细胞的功能。可将该特性用于疫苗方案。因此，用特定的技术(参考文献95、96)将抗原与红细胞结合，使其保留抗原的免疫原性(参考文献29、30)。通过这种方法，在不明显改变其特性和生命期的条件下，可将红细胞生物素化(参考文献95)。由巨噬细胞对老红细胞进行的吞噬作用将引发免疫反应。携带抗原的红细胞的抗体调理作用将有助于从循环中除去抗原。这种方法的主要优点是：1)诱导体液和细胞免疫反应仅需少量抗原，2)由于在外周中持续存在由红细胞携带的抗原，因此，可以长时间持续免疫，3)由该系统本身提供的佐剂功能。
事实上，在动物研究中已经表明，施用结合在自体红细胞膜上的抗原可诱导与施用弗氏佐剂和相同抗原所得免疫反应(参考文献29)类似或更高的免疫反应。这些特性对于开发抗HIV疫苗非常有用，尤其是当需要提高抗原的免疫原性和抗原的利用度而且当需要少量免疫时。另外，当接种方法中不包括佐剂时，可使用这种方法。事实上，用小鼠模型已经表明通过自体红细胞施用的抗原诱导与施用弗氏佐剂和相同抗原所得免疫反应相比类似或更高的免疫反应，而弗氏佐剂是已知的市售的最有效的佐剂(参考文献29)，尽管由于严重的副作用而不允许用于人的研究。因此，将用非人灵长类分析单独携或与前述其它免疫原组合携带Tat蛋白质的红细胞的佐剂作用。将这些数据与存在Alum、RIBI或ISCOM时施用Tat蛋白质得到的数据进行比较。
纳米颗粒的利用代表了另一种送递方案。功能性纳米颗粒代表了一种用于运输和释放蛋白质和DNA的重要系统(参考文献27、172)。纳米球是由不同化学成分组成的胶体聚合颗粒，直径在10-1000nm的大范围内。它可将不同类型的物质吸附在纳米球表面或内部(寡核苷酸、药物、蛋白质、肽、DNA)，然后带到胞质或细胞核中，在那里将携带的物质缓慢释放出来。另外，由于纳米球的特征，只需送递少量的免疫原。纳米颗粒是一种很好的送递系统，特别是对于在细胞外环境中不太稳定的分析或者当送递针对具体的靶细胞时。
本发明人相信，可用纳米球送递上述病毒抗原。可以制备和表征3种用于送递和控释DNA(纳米球1和2型)和蛋白质(纳米球3型)的纳米球。
为了送递DNA，可以用两种纳米球(纳米球1和2型)。第一种纳米球(纳米球1型)有三层结构，外层是聚氧乙二醇(poly-oxy-ethylen-glicole)(PEG)。以秘密系统研究为基础的最新报道(参考文献180、78)表明PEG可使纳米球不被肝巨噬细胞(Kupfer cell)发现。相反，更内层是由具有表面活性特征的含季铵基团的单体和由甲基-甲基丙烯酸酯(methyl-metacrylate)为单体制成的内核制成，所述含季铵基团的单体通过离子交换机制可逆地吸附DNA。在存在表面活性试剂混合物的条件下，通过在有关聚合vinlic或vinilidenic单体的微乳液中聚合得到这些纳米球。因此这些试剂能够聚合单体。其中，一种含有与寡核苷酸相互作用的季铵基团，另一种含有长链PEG。
第二种DNA送递系统是由具有水凝胶特征的功能纳和微球(纳米球2型)制成。应在存在DNA的条件下制备这些纳米球以便将DNA捕获在该送递系统内。需要纳米球核-壳以送递蛋白质(纳米球3型)。这种纳米球是由聚甲基甲基丙烯酸酯的内核和丙烯酸与甲基-甲基丙烯酸酯水溶性统计共聚物的外壳组成，已知所述共聚物与蛋白质有高度的亲和性(参考文献79、80)。这种共聚物是市售的(EUDRAGIT)并可以以两种共聚用单体的不同百分比得到。制备这种第二类型纳米球的制备方法包括在分散液中聚合。合成方法包括在存在具有空间稳定功能的EUDRAGIT的条件下，游离基聚合vinilic或vinilidenic单体。纳米球成核后，EUDRAGIT排列在所述颗粒的外部。因此，改变游离基引发剂的浓度、单体与EUDRAGIT之间的比例以及反应时间，就可以得到具有不同形态和化学特征的各种纳米球样品。
因此，可以评估用纳米颗粒仅送递Tat蛋白或Tat DNA或者送递Tat蛋白或DNA与上述免疫原(蛋白质或者DNA)的组合是否可诱导抗HIV的免疫反应。具体地讲，对体液或细胞介导的免疫反应进行评估并与在猴子模型中用非送递免疫原得到的数据进行比较。
本发明人相信，从这些研究中得到的资料可用于开发抗HIV疫苗。另外，可将从本试验方法得到的资料用于其它疫苗研究，特别是有关低免疫原性重组蛋白质或肽的疫苗研究。开发仅一次施用的疫苗的可能性对于疫苗的效力和降低疫苗开发成本是非常有利的。
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         序列表&#60110&#62ISTTTUTO SUPERIORE DI SANITA’&#60120&#62单独或组合用于预防和治疗AIDS、肿瘤和相关
综合征的接种的HIV-1Tat或其衍生物&#60130&#621354PTWO&#60140&#62RM97A000743&#60141&#621997-12-01&#60160&#6234&#60170&#62Patentln Ver.2.0&#60210&#621&#60211&#62261&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#621atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcccaatc ccgaggggac 240ccgacaggcc cgaaggaata g                            261&#60210&#622&#60211&6283&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#622Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln1         5          10           15Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His20           25           30Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys35          40             45Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val50           55           60Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly65           70            75            80Pro Lys Glu&#60210&#623&#60211&#62260&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#623atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcggtaccaa ttgctattgt aaaaagtgtt gctttcattg ccaagtttgt ttcataacaa 120aagccttagg catctcctat ggcaggaaga agcggagaca gcgacgaaga cctcctcaag 180gcagtcagac tcatcaagtt tctctatcaa agcagcccac ctcccaatcc cgaggggacc 240cgacaggccc gaaggaatag                              260&#60210&#624&#60211&#62261&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#624atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aacgccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcccaatc ccgaggggac 240ccgacaggcc cgaaggaata g                            261&#60210&#625&#60211&#62252&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#625atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagceca cctcccaatc cccgacaggc 240ccgaaggaat ag                                  252&#60210&#626&#60211&#62252&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#626atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aacgccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcccaatc cccgacaggc 240ccgaaggaat ag                                  252&#60210&#627&#60211&#6286&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#627Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1         5           10          15Gln Pro Lys Thr Ala Gly Thr Ash Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20          25           30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35           40            45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50          55             60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65           70            75                    80Pro Thr Gly Pro Lys Glu
85&#60210&#628&#60211&#6286&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#628Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1         5           10          15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20           25          30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Thr Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35          40            45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50           55           60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65           70          75            80Pro Thr Gly Pro Lys Glu85&#60210&#629&#60211&#6283&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#629Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1         5           10          15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20           25          30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35          40             45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50          55            60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Pro Thr Gly65           70            75           80Pro Lys Glu&#60210&#6210&#60211&#6283&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6210Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1         5           10          15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20           25          30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Thr Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35          40         45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50         55            60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Pro Thr Gly65             70          75           80Pro Lys Glu&#60210&#6211&#60211&#6220&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6211Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1         5           10          15Gln Pro Lys Thr20&#60210&#6212&#60211&#6220&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6212Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val1         5          10           15Cys Phe Ile Thr20&#60210&#6213&#60211&#6216&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6213Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1         5            10          15&#60210&#6214&#60211&#6215&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6214Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln1         5          10           15&#60210&#6215&#60211&#6216&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6215Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln1         5           10           15&#60210&#6216&#60211&#6216&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6216His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp1         5            10          15&#60210&#6217&#60211&#6214&#60212&#62PRT&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6217Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Glu1         5           10&#60210&#6218&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6218atggcaggaa gaagc                          15&#60210&#6219&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6219ctattctta gttcc                          15&#60210&#6220&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6220atgggtggca agtgg                       15&#60210&#622l&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6221tcagcagtcc ttgta                         15&#60210&#6222&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6222atgggtgcga gagcg                           15&#60210&#6223&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6223ttattgtgac gaggg                           15&#60210&#6224&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6224atgtggcccc ctggg                         15&#60210&#6225&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6225ttaggaagca ttcag                           15&#60210&#6226&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6226atgagatt cgaaa                         15&#60210&#6227&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6227tcaagaagtgttgat                        15&#60210&#6228&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6228atggagccag tagat                       15&#60210&#6229&#60211&#6215&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6229ctattccttc gggcc                            15&#60210&#6230&#60211&#6227&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#60&#6230ggcccgaagg aaatggcagg aagaagc                   27&#60210&#6231&#60211&#6227&#60212&#62DN&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6231ggcccgaagg aaatgggtgg caagtgg                   27&#60210&#6232&#60211&#6227&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6232ggcccgaagg aaatgggtgc gagagcg                   27&#60210&#6233&#60211&#6227&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6233ggcccgaagg aaatgtggcc ccctggg                   27&#60210&#6234&#60211&#6227&#60212&#62DNA&#60213&#62Aids-相关的反转录病毒&#60400&#6234ggcccgaagg aaatgagaat ttcgaaa                  27

Claims (61)

1．用作疫苗的具有生物活性的分离的Tat蛋白质，其片段和/或突变体和/或Tat DNA，所述Tat以皮摩尔至纳摩尔浓度能够：(ⅰ)进入并定位在活化的内皮细胞或树突细胞的核中；和/或(ⅱ)激活卡波济肉瘤(KS)细胞的增殖、迁移和侵入和细胞因子激活的内皮细胞蛋白。
2．根据权利要求1的具有生物活性的分离的Tat蛋白质，其片段和/或突变体和/或DNA Tat，还能够：(ⅲ)当加入到感染细胞中时激活病毒复制，这是a)通过加入外源蛋白质后，HLM-1细胞中Tat-缺陷型原病毒的获救；和/或b)通过反式激活HIV-1启动子-报道基因质粒转染的细胞中的HIV-1基因表达而度量的。
3．根据权利要求2的具有生物活性的分离的Tat蛋白质，其片段和/或突变体和/或Tat DNA，还能够：(ⅳ)在存在血管生成因子或炎症细胞因子的条件下，在小鼠中诱导KS样损伤的发展。
4．根据权利要求1-3的具有生物活性的分离的Tat蛋白质，其片段和/或突变体和/或Tat DNA，其量在10ng/ml或更少至1μg /ml的范围内。
5．用于预防和/或治疗AIDS、肿瘤、与HIV感染有关的综合征和症状的根据权利要求1-4的具有生物活性的分离的Tat蛋白质，其片段和/或突变体和/或Tat DNA。
6．预防和/或治疗AIDS、肿瘤、与HIV感染有关的综合征和症状的蛋白质或肽或DNA疫苗，它含有权利要求1-4中定义的有生物活性的Tak和/或其突变体和/或蛋白质或肽部分或者DNA。
7．根据权利要求6的疫苗，其中Tat具有下列核苷酸序列(Seq.1)：5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
以及任何HIV型和亚型的任何其他Tat变体。
8．根据权利要求6的疫苗，其中Tat具有下列氨基酸序列：NH2-EPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKAISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
以及任何HIV型和亚型的任何其他Tat变体。
9．根据权利要求6的疫苗，其中突变体在具有下列核苷酸序列或其部分的突变体中进行选择：
cys22突变体的核苷酸序列(Seq.2)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
lys41的核苷酸序列(Seq.3)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
RGDΔ突变体的核苷酸序列(Seq.4)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
lys41-RGDΔ突变体的核苷酸序列(Seq.5)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
10．根据权利要求6的疫苗，其中突变体在具有下列氨基酸序列或其部分的突变体中进行选择：
cys22突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
lys41的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
RGDΔ突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH
lys41-RGDΔ突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH
11．根据权利要求6的疫苗，其中Tat部分在下列肽序列中进行选择Pep.1.MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTPep.2.ACTNCYCKKCCFHCQVCFITPep.3.QVCFITKALGISYGRKPep.4.SYGRKKRRQRRRPPQPep.5.RPPQGSQTHQVSLSKQPep.6.HQVSLSKQPTSQSRGDPep.7.PTSQSRGDPTGPKE
12．权利要求6-11的疫苗，它含有与破伤风类毒素的T辅助通用表位或任何T辅助肽结合的蛋白质或肽。
13．权利要求6-12的疫苗，它与HIV Nef,Rev或Gag或其部分的重组蛋白质或肽组合。
14．权利要求6的疫苗，它含有融合蛋白Tat(野生型或其突变体)/Nef,Tat(野生型或其突变体)/Rev,Tat(野生型或其突变体)/Gag或其部分。
15．权利要求6-14的疫苗，它与重组免疫调节剂细胞因子或其他分子或其部分组合，提高抗病毒免疫反应。
16．权利要求15的疫苗，其中细胞因子是IL-12和/或IL-15或IFNα或IFNβ。
17．权利要求6的疫苗，它含有融合蛋白Tat(野生型或其突变体)/免疫调节剂细胞因子，Tat(野生型或其突变体)/IL-12，Tat(野生型或其突变体)/IL-15，Tat(野生型或其突变体)/其他分子，或其部分，提高抗病毒免疫反应。
18．权利要求6、7、9的DNA疫苗，它含有编码Tat野生型或其突变体或其部分的DNA，所述DNA插入在表达载体中。
19．权利要求6、7、9的DNA疫苗，它与包括HIV rev，nef和gag基因或其部分的表达载体组合。
20．权利要求18或19的DNA疫苗，其中所述载体是共表达tat(野生型或其突变体)/rev，tat(野生型或其突变体)/nef，tat(野生型或其突变体)/gag或其部分的质粒。
21．权利要求6、7、9的DNA疫苗，它与插入在表达载体中的DNA分子组合，所述DNA分子编码免疫调节剂细胞因子或其他免疫调节剂分子或其部分，提高抗病毒免疫反应。
22．权利要求21的DNA疫苗，其中细胞因子是IL-12和/或IL-15。
23．权利要求21或22的DNA疫苗，其中所述载体是共表达tat(野生型或其突变体)/IL-12，tat(野生型或其突变体)/IL-15，tat(野生型或其突变体)/其他分子或其部分的质粒，能够提高抗病毒免疫反应。
24．权利要求18-23的疫苗，其中所述载体是pCVO。
25．前述权利要求中的疫苗，它包括按照前述权利要求处理的和/或未处理的自体树突细胞。
26．前述权利要求的疫苗，它包括能够提高抗病毒免疫反应的佐剂。
27．权利要求26的疫苗，其中所述佐剂选自Alum,ISCOM,RIBI和相关混合物。
28．前述权利要求的疫苗，它含有送递系统。
29．权利要求28的疫苗，其中送递系统选自纳米颗粒、疱疹载体、红细胞、细菌和其组合。
30．权利要求29的疫苗，其中所述细菌选自格氏链球菌和乳杆菌属。
31．权利要求29和30的疫苗，其中细菌被修饰过以表达病毒抗原。
32．前述权利要求的疫苗，用于免疫来自感染个体的外周血细胞，通过用包被有抗-CD3和抗-CD28抗体的磁珠共刺激来扩展。
33．前述权利要求的治疗疫苗，它与病毒复制抑制剂组合。
34．权利要求6-33的疫苗，其中将活性物质送递到粘膜。
35．权利要求34的疫苗，其中经鼻、口、阴道和/或直肠施用所述活性物质。
36．权利要求6-33的疫苗，其中经全身或局部途径施用所述活性物质。
37．权利要求36的疫苗，其中通过肌内、皮下或皮内途径施用所述活性物质。
38．权利要求37的疫苗，其中以1-6μg的量皮内施用所述活性物质，不加佐剂。
39．权利要求34-38的疫苗，其中用生物学可接受的流体携带所述活性物质。
40．权利要求34-39的疫苗，它还含有可药用载体和赋形剂以使该物质的活性达到最大。
41．权利要求34-40的疫苗，它含有预防和/或治疗量的权利要求1的Tat作为活性物质。
42．生物活性Tat核苷酸序列(Seq.1)：5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
43．生物活性Tat氨基酸序列NH2-EPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKAISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
44．具有选自下列的核苷酸序列的生物活性Tat突变体蛋白质：
cys22突变体的核苷酸序列(Seq.2)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
lys41突变体的核苷酸序列(Seq.3)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
RGDΔ突变体的核苷酸序列(Seq.4)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
lys41-RGDΔ突变体的核苷酸序列(Seq.5)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’
45．生物活性Tat突变体氨基酸序列，它选自：
cys22突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
lys41突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
RGDΔ突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH
lys41-RGDΔ突变体的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH
46．具有选自下列的肽序列的生物活性Tat突变体：Pep.1.MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTPep.2.ACTNCYCKKCCFHCQVCFITPep.3.QVCFITKALGISYGRKPep.4.SYGRKKRRQRRRPPQPep.5.RPPQGSQTHQVSLSKQPep.6.HQVSLSKQPTSQSRGDPep.7.PTSQSRGDPTGPKE
47．表达载体，它含有选自权利要求42和44中所列序列或其部分的DNA序列。
48．表达载体pCVO，它包括选自权利要求42-44中所列序列或其部分的DNA序列。
49．权利要求48的表达载体pCVO，它含有编码选自tat,rev,nef,gag,IL-12，IL-15和其组合的基因的DNA序列。
50．包括权利要求47-49的载体的转化细胞。
51．用权利要求42-46的Tat蛋白质或其肽或突变体或者与Rev，Nef和Gag蛋白质和/或细胞因子的组合处理的树突细胞。
52．用含有tat基因的表达载体转导的权利要求51的树突细胞。
53．生成生物活性Tat蛋白质或其突变体或其重组形式或其部分的方法，该方法包括培养权利要求50的细胞，并且分离并纯化由此得到的蛋白质或其部分。
54．制备权利要求49的pCVO载体的方法，其中用选自下列的引物通过PCR技术扩增相应的cDNA：Seq.P1. 正向引物 Rev：5’ATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P2. 反向引物 Rev：5’CTATTCTTTAGTTCC3’Seq.P3. 正向引物 Nef： 5’ATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P4. 反向引物 Nef：5’TCAGCAGTCCTTGTA3’Seq.P5. 正向引物 Gag：5’ATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P6. 反向引物 Gag：5’TTATTGTGACGAGGG3’Seq.P7. 正向引物 IL-12：5’ATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P8. 反向引物 IL-12：5’TTAGGAAGCATTCAG3’Seq.P9. 正向引物 IL-15：5’ATGAGAATTTCGAAA3’Seq.P10.反向引物 IL-15：5’TCAAGAAGTGTTGAT3’Seq.P11.正向引物 Tat：5’ATGGAGCCAGTAGAT3’Seq.P12.反向引物 Tat：5’CTATTCCTTCGGGCC3’
  Seq.P13.正向引物    Tat/Rev：5’GGCCCGAAGGAAATGGCA
  GGAAGAAGC3’
  Seq.P14.正向引物    Tat/Nef：5’GGCCCGAAGGAAATGGGT
  GGCAAGTGG3’
  Seq.P15.正向引物    Tat/Gag：5’GGCCCGAAGGAAATGGGT
  GCGAGAGCG3’
  Seq.P16.正向引物    Tat/IL-12：5’GGCCCGAAGGAAATGTGGC
  CCCCTGGG3’
  Seq.P17.正向引物    Tat/IL-15：5’GGCCCGAAGGAAATGAGAAT
  TTCGAAA3’
55．选自下列的引物：
  Seq.P1.正向引物    Rev：5’ATGGCAGGAAGAAGC3’
  Seq.P2.反向引物    Rev：5’CTATTCTTTAGTTCC3’
  Seq.P3.正向引物    Nef：5’ATGGGTGGCAAGTGG3’
  Seq.P4.反向引物    Nef：5’TCAGCAGTCCTTGTA3’
  Seq.P5.正向引物    Gag：5’ATGGGTGCGAGAGCG3’
  Seq.P6.反向引物    Gag：5’TTATTGTGACGAGGG3’
  Seq.P7.正向引物    IL-12：5’ATGTGGCCCCCTGGG3’
  Seq.P8.反向引物    IL-12：5’TTAGGAAGCATTCAG3’
  Seq.P9.正向引物    IL-15：5’ATGAGAATTTCGAAA3’
  Seq.P10 反向引物   IL-15：5’TCAAGAAGTGTTGAT3’
  Seq.P11 正向引物   Tat：5’ATGGAGCCAGTAGAT3’
  Seq.P12 反向引物   Tat：5’CTATTCCTTCGGGCC3’
  Seq.P13.正向引物   Tat/Rev：5’GGCCCGAAGGAAATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P14.正向引物Tat/Nef：5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P15.正向引物Tat/Gag：5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P16.正向引物Tat/IL-12：5’GGCCCGAAGGAAATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P17.正向引物Tat/IL-15：5’GGCCCGAAGGAAATGAGAATTTCGAAA3’.
56．制备权利要求6-41的疫苗的方法，其中Tat呈其非氧化形式。
57．制备权利要求6-41的疫苗的方法，其中将冻干形式的Tat重悬在用于施用的生物学可接受的流体中。
58．活性形式的Tat蛋白质野生型和/或其突变体和/或蛋白质或肽相关部分或编码这些蛋白质或其部分或肽的DNA在制备预防和/或治疗AIDS、肿瘤和HIV感染相关综合征和症状的蛋白质或肽或DNA疫苗中的用途。
59．Alum,ISCOM、RIBI和其他佐剂单独或组合用于制备权利要求6的疫苗的用途。
60．用单克隆抗体抗-CD3和抗-CD28包被的顺磁珠用于制备权利要求6的疫苗的用途。
61．用于治疗AIDS、肿瘤、与HIV感染有关的综合征和症状的治疗方法，其特征在于施用预防或治疗量的权利要求1-5的生物活性Tat。
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