CN1282750C - Wssv的fq－pcr诊断试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
已用于WSSV诊断的FQ-PCRe有耗时较长，存在非特异扩增产物或引物二聚体导致的假阳性结果缺陷。TaqMan PCR有更高的灵敏性和高精确性，但尚未应用于WSSV的诊断。本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒和方法，试剂盒中所装的即检测方法中所用反应体系中有2×TaqMan Buffer液、特异性引物-1、特异性引物-2、TaqMan探针等等；PCR仪中的DNA操作过程是先作93℃下预变性2分钟；再作93℃下变性5秒钟、60℃下退火延伸30秒钟、60℃下单点荧光检测的循环40次。本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒和方法，配备了所有无法从市场上购得所需的各种试剂；达到了高灵敏度、高重复性、高特异性的指标，另外还有所需待测样本数量要求低和检测所需时间短的特点。
Description
技术领域 本发明涉及的是一种WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒及检测方法，属国际专利分类C12Q：包含酶或微生物的测定或检验方法及其所用的组合物或试纸领域。
背景技术 WSSV即白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus)是迄今为止危害最为严重的一种对虾病毒，绝大多数养殖的对虾品种包括中国对虾(Penaeus orientalis)、日本对虾(Penaeus japonicus)、斑节对虾(Penaeus mondon)、长毛对虾(Penaeus penicillatus)、南美白对虾(Penaeus vannamei)等主要养殖品种，都是该病毒的感染宿主。中国专利ZL03114366.0介绍了一种基于PCR技术的基因诊断试剂盒及检测方法，PCR技术即聚酶链式反应(polymerase chain reaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。用PCR技术检测WSSV，首先是提取样品中的病毒DNA作为模板，然后把模板加入到PCR反应液中，用PCR仪大量扩增病毒DNA片断，最后通过凝胶电泳检查扩增产物，以判断样品中是否有待检病毒存在。PCR方法具有高度灵敏的优点，但一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭还是强致癌物质，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，造成检测准确性略低，而且这一方法不能定量。随后人们发明了荧光定量PCR(简称FQ-PCR)这一技术，FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。如《实时定量SYBR Green PCR在检测定量WSV中的应用(Detection and Quantification ofInfectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus and White Spot Virus in Shrimp UsingReal-Time Quantitative PCR and SYBR Green Chemistry)》(载于美国微生物学会《临床微生物学》第39卷第8期第2835-2845页)一文介绍了一种FQ-PCR。它是基于GeneAmp 5700序列检测系统结合SYBR Green化学的用于检测并定量IHHNV病毒(一种单链DNA病毒)及WSV(白斑病毒，一种感染虾体的双链DNA病毒)的快速高灵敏的实时PCR。但该方法需利用GeneAmp 9600热循环装置和GeneAmp 5700序列检测系统来完成，反应系统中有SYBR Green Master混合液，和左、右两端的引物，反应过程：先是50℃ 2分钟和95℃ 10分钟，接下来是95℃ 10秒和60℃ 1分钟循环40次。可见这种方法存在如下缺陷：耗时较长，仅扩增就需约1小时，而且该方法是一种基于荧光染料的非探针技术，存在非特异扩增产物或引物二聚体导致的假阳性结果。另一种FQ-PCR即TaqMan PCR，是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记水解探针来实现其定量功能的。而且由于荧光水解探针的应用，标记在水解探针上的荧光基团可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，使TaqMan PCR不仅具有比普通PCR更高的灵敏性，还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR和SYBR Green PCR的许多缺点。但TaqMan PCR目前尚未应用于WSSV的诊断。
发明内容 针对上述不足，本发明所要解决的技术问题就是建立一种更快捷、更高特异性和灵敏性的诊断WSSV的反应体系，并提供利用这一反应体系的试剂盒以及以这一试剂盒进行WSSV诊断的检测方法，即提出一种WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒及检测方法。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，有试剂容器，其中有包装下列试剂的试剂容器：
TaqMan Buffer液；
特异性引物-1；
特异性引物-2；
特异性TaqMan探针；
其中，
特异性引物-1的序列为：5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’；
特异性引物-2的序列为：5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’；
特异性TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCTCC-TAMARA-3’。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，还有包装已知病毒拷贝浓度的标准参照品的试剂容器，已知病毒拷贝浓度的标准参照品用于对待测样本中的WSSV DNA浓度进行定量计算。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，还有包装DNA提取剂或DNA提取剂和样本稀释用的生理盐水的试剂容器，DNA提取剂和样本稀释用的生理盐水用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板，其中所说的DNA提取剂为含有0.9％NaCl和0.1％二巯基乙醇的溶液。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，还有包装无RNA酶水和/或Taq酶的试剂容器，无RNA酶水和Taq酶用于参加反应。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，以上所说的各种试剂分别装在一个试剂容器内。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，有一PCR反应液试剂容器，内装：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l
的混合液，在混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针＝125∶5∶5∶3。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，所述反应液试剂容器中所装的混合液还包括无RNA酶水；
混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水＝125∶5∶5∶3∶42。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，所称的标准参照品的包装容器有4-6件，其中所包装的标准参照品的病毒拷贝数浓度各不相同，且各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml中的一个。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊检测方法，首先是制备待测样本中的WSSV DNA模板，然后将模板和各标准参照品同时置于各自的反应体系中并同时置入PCR仪进行DNA扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果，其中
进入PCR仪的待测样本中的WSSV DNA模板反应体系的试剂及材料有：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，12.5μl；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l，0.3μl；
无RNA酶水，4.2μl；
Taq酶，0.4μl；
待测样本中的WSSV DNA模板，2μl。
进入PCR仪的标准参照品反应体系的材料及试剂有：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，12.5μl；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l，0.3μl；
无RNA酶水，4.2μl；
Taq酶，0.4μl；
标准参照品，2μl。
一起置入PCR仪中的标准参照品反应体系为4-6个，其中标准参照品的病毒拷贝数浓度各不相同，且各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml中的一个。
在所述方法中，所用的
特异性引物-1的序列为：5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’；
特异性引物-2的序列为：5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’；
特异性TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCTCC-TAMARA-3’。
在PCR仪中的操作过程是：
先作预变性：93℃ 2分钟；
再作变性：93℃ 5秒钟和退火延伸：60℃ 30秒钟的循环40次；
每个循环中退火延伸结束时60℃下作一次单点荧光检测。
对结果的定性判断标准：Ct值≥40为阴性，Ct值＜40为阳性；
对结果的定量判断依据：设立横坐标为病毒拷贝数浓度，纵坐标为Ct值的直角坐标系，先将各标准参照品的已知起始病毒拷贝数浓度及其所测得的Ct值在坐标系上作一点，再将以4-6个标准参照品所得的4-6个点作成平滑的曲线为标准曲线，最后根据获得的待测样品的Ct值，从标准曲线上查得该待测样本的起始病毒拷贝数浓度。上述结果由荧光定量仪器自动计算。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，所说的反应体系按以下步骤准备
将TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，12.5μl；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l，0.3μl；
无RNA酶水，4.2μl等为单元的同一倍数的各试剂混合，或直接吸取含有相同混合比例的混合液，
所准备的反应体系总量＝(待测样本的个数+所采用的标准参照品的个数)×上述单元试剂量的和，为保证有足够的量，弥补器壁挂附损失，准备时可适当将各试剂的吸取量扩大同一个比例：K。
即所准备的反应体系总量＝K(待测样本的个数+所采用的标准参照品的个数)×上述单元试剂量的和。
混匀后再加入Taq酶，所加入的量为以0.4μl为单元的与上述混合液的同一倍数的量，即Taq酶的加入量＝K(待测样本的个数+所采用的标准参照品的个数)×0.4μl。再混匀。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断检测方法，制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法是：先取0.1-50mg待测样本，然后加入DNA提取液50μl混匀，接着在100℃下水浴或干浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测样本中的WSSV DNA模板。待测样本包括虾体、虾饵料、虾塘底泥、虾塘中生活的其他生物，如蟹等。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，在制备待测样本中的WSSV DNA模板时，为降低待测样本中的蛋白浓度可先在待测样本中加入待测样本重量4倍以下的生理盐水制成待测样本匀浆，并在1,000-1,500转/分钟下离心1分钟，然后取上清50μl加DNA提取液50μl混匀，接着在100℃下水浴或干浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测样本中的WSSV DNA模板。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，配备了所有无法从市场上购得的本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断检测方法所用的各种试剂。本发明提供的WSSV的FQ-PCR
表1
| M(病毒拷贝数/ml) | S | CV(％) |
| 109 | 0.23 | 1.60 |
| 107 | 0.20 | 0.87 |
| 104 | 0.47 | 1.39 |
| 实验及计算方法：取某一浓度[如第一行的109(病毒拷贝数/ml)]的被测样本，再分为四份，并按本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断检测方法，平行测得四个浓度为：M1、M2、M3、M4求得Ma＝(M1+M2+M3+M4)/4(病毒拷贝数/ml)；S＝[(M1-Ma)2+(M2-Ma)2+(M3-Ma)2+(M4-Ma)2]1/2/4；CV＝(S/Ma)×100％ | ||
特异现象；4、检测所需样本数量：0.1-50mg范围内对检测结果无显著差异；5、检测所需时间：模板制作25分钟，PCR检测25分钟。
附图说明 图1为本发明中试剂盒一实施例的俯视剖视图；
图2为图1中A-A剖视图。
具体实施方式 1、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，有4支贴有标明浓度的安瓿瓶，其中分别装有：
序列为5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’的特异性引物-1、
序列为5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’的特异性引物-2；
序列为5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCT CC-TAMARA-3’的特异性TaqMan探针。使用时由操作人员按要求配制成所需浓度。
2、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，除实施例1所有内容外还有1支贴有标明浓度的安瓿瓶，内装标准参照品。使用时由操作人员按要求配制出4-6份浓度各异的标准参照品。
3、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，除实施例2内容外还有1支安瓿瓶，内装DNA提取剂，即含有0.9％NaCl和0.1％二巯基乙醇的溶液，用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板。
4、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，除实施例2内容外还有2支安瓿瓶，分别装有DNA提取剂，即含有0.9％NaCl和0.1％二巯基乙醇的溶液，和生理盐水，用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板。
5、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，除实施例2内容外还有2支安瓿瓶，分别装有无RNA酶水和Taq酶，用于参加反应。
6、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，有一有盖玻璃管，内装：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l
的混合液0.3ml，在混合液中各试剂的体积组分比是：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针＝125∶5∶5∶3。
7、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，有一有盖塑料管，内装：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l；
无RNA酶水
的混合液0.4ml，混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水＝125∶5∶5∶3∶42。
8、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其式样如图1所示，盒体为纸盒1，盒内有一以纸折成的衬板2，在该衬板上有8个孔，其中：一个孔内是一有盖塑料管3，内装：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l；
无RNA酶水
的混合液0.4ml，混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水＝125∶5∶5∶3∶42。
一个孔内是1支有盖塑料管4，内装Taq酶8.5μl。
一个孔内是1支有盖塑料管5，内装DNA提取剂，即含有0.9％NaCl和0.1％二巯基乙醇的溶液0.5ml。
一个孔内是1有盖塑料管6，内装生理盐水2.5ml。
另4个孔内各有1支有盖塑料管7，内装病毒拷贝数浓度各为104/ml、105/ml、106/ml、107/ml的标准参照品各5μl。
可用于对待测样本6只一批做两批检测用。
9、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，盒内有一泡沫塑料衬板，在该衬板上有10个槽，一个槽内是有盖玻璃瓶，内装：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l；
无RNA酶水
的混合液0.6ml，混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水＝125∶5∶5∶3∶42。
一个槽内是1支有盖玻璃瓶，内装Taq酶13.5μl。
一个槽内是1支有盖玻璃瓶，内装DNA提取剂，即含有0.9％NaCl和0.1％二巯基乙醇的溶液1.2ml。
一个槽内是1支有盖玻璃瓶，内装生理盐水5ml。
另6个槽内各有1支有盖玻璃瓶，内各装病毒拷贝数浓度各为104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml的标准参照品5μl。
可用于对待测样本10只一批做两批检测用。
10、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，一次检测6份待测虾样。
首先是分别制备该6份待测样本中的WSSV DNA模板，准备好4份病毒拷贝数浓度各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml的标准参照品，
然后将：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，125μl；
序列为5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’的特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，5μl；
序列为5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’的特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，5μl；
序列为5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCT CC-TAMARA-3’的特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/L，3μl；
无RNA酶水，42μl，注到一个容器内混匀，
又取Taq酶4μl注到该容器内混匀，
再后从该容器内分别吸取混合液18.4μl注入到10只PCR反应管中，为保证足够使用，在配制混合液时可按同比例适当增加各试剂的量，
最后将6份模板和4份标准参照品各取2μl同时分别注入每只PCR反应管中，在每分钟2,000转离心1分钟后同时置入PCR仪进行DNA扩增，其中离心的作用是使模板或标准参照品与PCR反应管中的试剂混匀。扩增操作过程是：
先作：93℃下预变性2分钟；
再作：93℃下变性5秒钟、60℃下退火延伸30秒钟、60℃下单点荧光检测一次的循环40次。
11、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，一次检测10份待测蟹样，
首先是分别制备该10份待测样本中的WSSV DNA模板，准备好6份病毒拷贝数浓度各为105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml的标准参照品，
然后从如实施例9所提供的混合液中提取306μl注入一容器中，其中包含：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，212.5μl；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，8.5μl；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，8.5μl；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/L，5.1μl；
无RNA酶水，71.4μl；
又向该容器中注入Taq酶6.8μl混均，
再后从该容器内分别吸取混合液18.4μl注入到16只PCR反应管中，
最后将10份模板和6份标准参照品各取2μl同时分别注入到每只PCR反应管中，在每分钟2,000转离心1分钟后同时置入PCR仪进行DNA扩增，其中离心的作用是使模板或标准参照品与PCR反应管中的试剂混匀。扩增操作过程是：
先作：93℃下预变性2分钟；
再作：93℃下变性5秒钟、60℃下退火延伸30秒钟、60℃下单点荧光检测一次的循环40次。
12、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法：先取0.1mg虾样，加入DNA提取液25μl混匀，接着在100℃下干浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测虾样本中的WSSV DNA模板。
13、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法：先取1mg虾塘底泥样，加入DNA提取液50μl混匀，接着在100℃下水浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测虾塘底泥样本中的WSSVDNA模板。
14、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法：先取10mg虾塘内所获之蟹样，再加入20μl生理盐水制成蟹匀浆，并在1,500转/分钟下离心1分钟，然后取上清50μl加入DNA提取液50μ1混匀，接着在100℃下干浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测蟹样本中的WSSV DNA模板。
15、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法，介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法：先取50mg虾样，再加入200μl生理盐水制成虾匀浆，并在1,500转/分钟下离心1分钟，然后取上清50μl加DNA提取液50μl混匀，接着在100℃下水浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测虾样本中的WSSV DNA模板。
Claims (10)
1、一种WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，有试剂容器，其特征是其中有包装下列试剂的试剂容器：
TaqMan Buffer液；
特异性引物-1；
特异性引物-2；
特异性TaqMan探针；
其中，
特异性引物-1的序列为：5’-CCA GAG ATG GGA GTAACA CGT-3’；
特异性引物-2的序列为：5’-CTC CTC TGTTGC GAATAC TTC TAAAT-3’；
特异性TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCTCC-TAMARA-3’。
2、如权利要求1所述的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其特征是还有包装已知病毒拷贝浓度的标准参照品的试剂容器，已知病毒拷贝浓度的标准参照品用于对待测样本中的WSSV DNA浓度进行定量计算。
3、如权利要求1或2所述的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其特征是还有包装DNA提取剂或DNA提取剂和样本稀释用的生理盐水的试剂容器，DNA提取剂和样本稀释用的生理盐水用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板，其中所说的DNA提取剂为含有0.9％NaCl和0.1％二巯基乙醇的溶液。
4、如权利要求1或2所述的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其特征是还有包装无RNA酶水和/或Taq酶的试剂容器，无RNA酶水和Taq酶用于参加反应。
5、如权利要求1或2所述的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其特征是有一PCR反应液试剂容器，内装：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/l
的混合液，在混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针＝125∶5∶5∶3。
6、如权利要求5所述的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其特征是所述反应液试剂容器中所装的混合液还包括无RNA酶水；
混合液中各试剂的体积组分比为：
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水＝125∶5∶5∶3∶42。
7、如权利要求2所述的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒，其特征是所称的标准参照品的包装容器有4-6件，其中所包装的标准参照品的病毒拷贝数浓度各不相同，且各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml中的一个。
8、一种WSSV的FQ-PCR检测方法，首先是制备待测样本中的WSSV DNA模板，然后将模板和各标准参照品同时置于各自的反应体系中并同时置入PCR仪进行DNA扩增，扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果，其特征是其中
进入PCR仪的待测样本中的WSSV DNA模板反应体系的试剂及材料有：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，12.5μl；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/L，0.3μl；
无RNA酶水，4.2μl；
Taq酶，0.4μl；
待测样本中的WSSV DNA模板，2μl；
进入PCR仪的标准参照品反应体系的材料及试剂有：
TaqMan Buffer液，浓度为2倍稀释，12.5μl；
特异性引物-1，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性引物-2，浓度为0.5μmol/l，0.5μl；
特异性TaqMan探针，浓度为0.3-0.5μmol/μl，0.3μl；
无RNA酶水，4.2μl；
Taq酶，0.4μl；
标准参照品，2μl；
一起置入PCR仪中的标准参照品反应体系为4-6个，其中标准参照品的病毒拷贝数浓度各不相同，且各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml中的一个；
其中，所用的
特异性引物-1的序列为：5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’；
特异性引物-2的序列为：5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’；
特异性TaqMan探针的序列为：5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCTCC-TAMARA-3’；
在PCR仪中的操作过程是：
先作预变性：93℃ 2分钟；
再作变性：93℃ 5秒钟和退火延伸：60℃ 30秒钟的循环40次；
每个循环中退火延伸结束时60℃下作一次单点荧光检测；
对结果的定性判断标准：Ct值≥40为阴性，Ct值＜40为阳性；
对结果的定量判断依据：设立横坐标为病毒拷贝数浓度，纵坐标为Ct值的直角坐标系，先将各标准参照品的已知起始病毒拷贝数浓度及其所测得的Ct值在坐标系上作一点，再将以4-6个标准参照品所得的4-6个点作成平滑的曲线为标准曲线，最后根据获得的待测样品的Ct值，从标准曲线上查得该待测样本的起始病毒拷贝数浓度。
9、如权利要求8所述的WSSV的FQ-PCR检测方法，其特征是制备待测样本中的WSSVDNA模板的方法是：先取0.1-50mg待测样本，然后加入DNA提取液50μl混匀，接着在100℃下水浴或干浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测样本中的WSSV DNA模板。
10、如权利要求8或9所述的WSSV的FQ-PCR检测方法，其特征是在制备待测样本中的WSSV DNA模板时，为降低待测样本中的蛋白浓度可先在待测样本中加入待测样本重量4倍以下的生理盐水制成待测样本匀浆，并在1,000——1,500转/分钟下离心1分钟，然后取上清50μl加DNA提取液50μl混匀，接着在100℃下水浴或干浴10分钟，最后在13,000转/分钟下离心10分钟，所得上清即为待测样本中的WSSV DNA模板。
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