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CN1280185A - 生产l－赖氨酸的棒状菌和制备赖氨酸的方法 - Google Patents

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CN1280185A CN00120357A CN00120357A CN1280185A CN 1280185 A CN1280185 A CN 1280185A CN 00120357 A CN00120357 A CN 00120357A CN 00120357 A CN00120357 A CN 00120357A CN 1280185 A CN1280185 A CN 1280185A
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Abstract

本发明涉及棒状菌的生产L－赖氨酸的菌株,其具有扩增的pyc基因(丙酮酸羧化酶基因),在这些菌株中,选自包括dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因),lysC基因(天冬氨酸激酶基因),lysE基因(赖氨酸输送载体基因)和dapB基因(二氢吡啶二羧酸还原酶基因)的组的附加基因,特别是dapA基因得到扩增,尤其是得到超量表达。本发明也涉及制备L－赖氨酸的方法。

Description

生产L-赖氨酸的棒状菌和制备赖氨酸的方法
本发明涉及棒状菌的生产L-赖氨酸的菌株，其具有扩增的pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)，在这些菌株中，选自包括dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，lysE基因(赖氨酸输送载体基因)和dapB基因(二氢吡啶二羧酸还原酶基因)的组的附加基因，特别是dapA基因得到扩增，尤其是得到超量表达，本发明也涉及制备L-赖氨酸的方法。
L-赖氨酸是商业上重要的L-氨基酸，尤其是用作动物营养中的饲料添加剂。近年来需求量一直稳步增加。
L-赖氨酸由棒状菌，尤其是谷氨酸棒杆菌的生产L-赖氨酸的菌株的发酵过程产生。由于这一产物非常重要，人们不断尝试改进其制备过程。对过程的改进可以涉及牵涉发酵技术的手段，搅拌和氧供给，或营养培养基的组成(如发酵期间的糖浓度)，或产物的检测(如经离子交换色谱)，或微生物自身的内在产生特征。
这些微生物的生产能力的特性通过利用诱变，选择以及突变体选择的方法来改善，以给出对抗代谢物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸)具有抗性，氨基酸(例如L-亮氨酸)营养缺陷，并产生L-赖氨酸的菌株。
一些年来重组DNA技术的方法也曾用于通过扩增个体生物合成基因改进谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸生产菌株，并且研究了对L-赖氨酸生产影响。
就此而言，EP-A-0 088 166报道了在赋予对氨乙基半胱氨酸的抗性的DNA片段扩增后生产能力增强。EP-B-0 387 527报道了编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因扩增后生产能力增强。EP-A-0197 335报道了编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因扩增后生产能力增强。EP-A-0 219 027报道了编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因扩增后生产能力增强。Pisabarro等(细菌学杂志175(9)，2743-2749(1993)描述了编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因。
也已经研究了主要代谢基因的扩增对L-赖氨酸生产的影响。就此而言，EP-A-0 219 027报道了编码天冬氨酸氨基转移酶的aspC基因扩增后生产能力增强。EP-A-0 143 195和EP-A-0 358 940报道了编码烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的ppc基因扩增后生产能力增强。DE-B-19831609报道了编码丙酮酸羧化酶的pyc基因扩增后生产能力增强。受丙酮酸羧化酶催化的添补反应与受烯醇丙酮酸磷酸羧化酶催化的反应相比特别重要。这样，Wendisch等(FEMS微生物学通讯，112，269-274(1993))显示关闭ppc基因不削弱菌株MH20-22B的赖氨酸产生。
最后，DE-A-195 48 222描述了由lysE基因编码的L-赖氨酸输送载体的活性增加促进赖氨酸生产。
除这些扩增个体基因的试图之外，也尝试了在棒状菌中同时扩增两个或更多个基因，进而改进L-赖氨酸生产。就此而言，DE-B-38 23451报道了同时扩增大肠杆菌asd基因和dapA基因后，生产能力增加。DE-A39 43 117公开了同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA基因基因后，生产能力增加。EP-A-0 841 395特别报道了同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapB基因基因后，生产能力增加；进一步的改进可以由dapB，lysA，以及ddh基因的额外扩增完成。EP-A-0 854 189描述了同时扩增编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC等位基因和dapA，dapB，lysA和aspC基因后生产能力增强。EP-A-0 857 784特别报道了同时扩增编码反馈抗性酶的lyse等位基因和lysA基因后生产能力增强；进一步的改进可以由ppc基因的额外扩增完成。
由许多现有技术的文献中所描述的方法可以清楚看出，需要开发新的方法并改进用棒状菌生产赖氨酸的现行的方法。
发明人对自己提出的目的是提供新的棒状菌的L-赖氨酸生产菌株和制备L-赖氨酸的方法。
L-赖氨酸是商业上重要的L-氨基酸，尤其是用作动物营养中的饲料添加剂。
当L-赖氨酸或赖氨酸在下文中提及时，应当理解为其不仅包括其本身，而且包括适当的盐，例如赖氨酸盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了棒状菌的L-赖氨酸生产菌株，它们具有扩增的pyc基因(丙酮酸羧化酶基因)，其中选自包括dapA基因(二氢吡啶二羧酸合酶基因)，lysC基因(天冬氨酸激酶基因)，lysE基因(赖氨酸输送载体基因)和dapB基因(二氢吡啶二羧酸还原酶基因)组的附加基因，尤其是dapA基因得到扩增，尤其是得到超量表达。
也已经发现，位于dapB基因上游(5’末端)的新的DNA序列，其携带dapB启动子的-35区，对dapB基因的表达是有利的。其显示在SEQ ID No．1中。
因此，也要求了具有在SEQ ID No．1中显示的核苷酸序列的能够复制的DNA。
本发明也提供了保藏在菌株DSM12868与DSM12867中的SEQID No．5和SEQ ID No．6中显示的dapA启动子的MC20和MA16突变。
本发明也涉及棒状菌的L-赖氨酸生产菌株，其具有扩增过的pyc基因，在这些菌株中，dapA基因和dapB基因得到了同时扩增，尤其是得到超量表达。
本发明也涉及棒状菌的L-赖氨酸生产菌株，其具有扩增过的pyc基因，在这些菌株中，dapA，dapB以及lysE基因得到了同时扩增，尤其是得到超量表达。
在本说明书上下文中，术语“扩增”描述的是利用强启动子或利用编码具有高活性的适当酶的基因，或者可以也可以不组合这两种手段增加基因的拷贝数，来增加由适当DNA编码的一种或多种酶在微生物中的胞内活性。
本发明也提供了利用以上所描述的细菌制备L-赖氨酸的方法。
本发明提供的微生物可以从葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉或纤维素或从甘油和乙醇，尤其是从葡萄糖或蔗糖制备L-赖氨酸。所说的微生物是棒状菌，尤其是棒杆菌属的。在棒杆菌属中，可以特别提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员知道其生产氨基酸的能力。这一物种包括野生型菌株，如谷氨酸棒杆菌ATCC13032，黄色短杆菌ATCC14067，Corynebacterium melassecola ATCC17965和来源于它们的菌株或突变体。棒状菌的生产L-赖氨酸的突变体的例子如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708
乳发酵短杆菌FERM-P 1712
黄色短杆菌FERM-P 6463
黄色短杆菌FERM-P 6464
谷氨酸棒杆菌DSM 5714
谷氨酸棒杆菌DSM 12866
现在发明人发现，除pyc基因之外的lysE基因的扩增表达，或编码反馈抗性天冬氨酸激酶lysC等位基因的额外扩增表达，或dapB基因的额外扩增表达，尤其是，dapA基因的额外扩增表达，分别或同时进一步改进L-赖氨酸的生产。
也已经发现，对给定的pyc基因的表达而言，dapA与dapB基因的同时额外扩增表达进一步地为L-赖氨酸生产带来益处。
最后，发明者也发现，对给定的pyc基因的表达而言，dapA，dapB以及lysE基因的同时额外扩增表达对L-赖氨酸生产格外有利。
扩增(超量表达)是通过增加适当的基因的拷贝数，或突变位于结构基因上游的启动子和调节区，或者核糖体结合位点。掺入结构基因上游的表达盒以相同的方式工作。在经发酵形成L-赖氨酸期间，诱导型启动子额外地使增加表达成为可能。延期mRNA寿命的手段也改善表达。此外，酶活性也通过阻止酶蛋白质的降解，将基因或基因构建体位于可变拷贝数质粒(穿梭载体)中或者在染色体中整合和扩增而得到提高。此外，通过改变培养基的组成和培养技术，获得目标基因的超量表达也是可能的。
本领域技术人员会从下列文献中找到有关说明：Martin等(生物／技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物／技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，EP-0 472 869，US 4，601，893，Schwarzer和POhler(生物／技术9，-84-87(1991))，Reinscheid等(应用和环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利出版物WO 96／15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本Offenlegungsschrift JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998))或者美国细菌学会“普通细菌学方法手册”(华盛顿DC，USA，1981)和公知的遗传学与分子生物学手册。
根据本发明所利用的谷氨酸棒杆菌的基因已被描述，并且可以用已知方法分离，制备或合成。
以下文献特别描述了定点诱变方法：Higuchi等(核酸研究16，7351-7367(1988))，Silver等，Innis，Glefand和Sninsky(编者)手册，题为PCR策略(学术出版社，伦敦，UK，1995)。
从谷氨酸棒杆菌分离目的基因的第一个步骤是为了在例如大肠杆菌中构建这一微生物的基因文库，或者也可以是在谷氨酸棒杆菌中构建该文库。基因文库的构建在一般性的公知的教科书和手册中有记载。可提及的例子是Winnacker的教科书，题为从基因到克隆，基因技术导论(Verlag Chemie，Weinheim，德国，1990)或Sambrook等的手册，题为分子克隆，实验室手册(冷泉港实验室出版社，1989)。Bathe等(分子和普通遗传学，252：255-265(1996))描述了利用粘粒载体SuperCosI(Wahl等美国国家科学院学报84，2160-2164(1987))在大肠杆菌K-12 NM554(Raleigh等，核酸研究16：1563-1575(1988))中构建的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。Brmann等(分子微生物学6(3)，317-326)依次描述了采用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))构建的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。谷氨酸棒杆菌在大肠杆菌中的基因文库也可以采用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC19(Norrander等，基因26：101-106(1983))构建。以相同的方式，也可能使用穿梭载体，如pJC1(Cremer等，分子和普通遗传学220，478-480(1990))或pECS(Eikmanns等，基因102，93-98(1991))，这样的载体在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制。再构和／或重组缺陷菌株是特别合适的宿主，例子是大肠杆菌菌株DH5αmcr，该菌株由Grant等(美国国家科学院院报87，4645-4649(1990))描述过。其它例子是再构缺陷的谷氨酸棒杆菌菌株RM3和RM4，它们由Schffer等(应用和环境微生物学60(2)，756-759(1994))描述过。
然后，通过转化(Hanahan，分子生物学杂志166，557-580(1983))或电穿孔(Tauch等，FEMS微生物学通讯，123：343-347(1994))将基因文库转移到指示菌株中。指示菌株的特征是其具有目的基因突变，这导致可检测的表型，例如营养缺陷型。指示菌株或突变体可由公开的来源或菌株保藏中心(例如耶鲁大学遗传保藏中心(New Haven，Connect-icut，USA))获得，或如果必要特别制备。这样的指示菌株的例子可提及的是需要内消旋二氨基庚二酸的大肠杆菌菌株RDA8(Richaud等，C．R．Acad．Sci．Paris Ser．Ⅲ 293：507-512(1981))，其在dapA基因中携带突变(dapA∷Mu)。
在携带目的基因的重组质粒转化指示菌株和目的基因表达后，就适当的特征而言，指示菌株成为原养型的。如果克隆的DNA片段赋予例如针对抗代谢物S-(2-氨乙基)半胱氨酸之类的抗性，携带重组质粒的指示菌株可以通过在适当地补充营养物的培养基上选择鉴别。
如果目的基因区的核苷酸序列是已知的或由数据库可获得的，则可以用已知方法分离染色体DNA，例如如Eikmanns等(微生物学140，1817-1828(1994))描述的方法。可以采用合适的引物通过聚合酶链反应(PCR)合成目的基因，并克隆进合适的质粒载体中，例如Invitrogen的pCRIITOPO(Groningen，荷兰)。PCR方法的梗概可以从Newton和Graham的题为PCR的书中找到(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
公众可利用的核苷酸序列数据库的例子是欧洲分子生物学实验室的数据库(EMBL，Heidelberg，德国)或生物技术信息国家中心的数据库(NCBI，Bethesda，MD，美国)。
从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离与克隆pyc基因在DE-A-19831609和Koffas等(应用微生物学和生物技术1050，346-352(1988))中有描述。pyc基因的核苷酸序列可以以登记号AF038548或Y09548获得。
从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离与克隆lysE基因在DE-A-19548222中有描述。lysE基因的核苷酸序列可以以登记号X96471获得。
从各种谷氨酸棒杆菌中分离，克隆以及测序dapA基因在下列文献中有描述：Cremer等(分子和普通遗传学220：478-480(1990))，Pisabarro等(细菌学杂志175：2743-2749(1993))和Bonnassie等(核酸研究18：6421(1990))。DE-B-39 43 117报道了借助质粒pJC23扩增dapA基因。dapA基因的核苷酸序列可以以登记号X53993获得。
从Brevibacterium lactofermentum分离，克隆以及测序dapB基因由Pisabarro等(细菌学杂志175：2743-2749(1993))描述过。dapB基因的核苷酸序列可以以登记号X67737获得。
编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因和lysC等位基因分离，克隆以及测序由几个作者报道过。就此而言，Kalinowski等(分子和普通遗传学224：317-324(1990))报道了来源于谷氨酸棒杆菌菌株DM58-1的lysC等位基因。DE-A-3943117报道了谷氨酸棒杆菌菌株MH2OlysC等位基因的克隆。Follettie等(细菌学杂志175：4096-4103(1993))报道了黄色棒杆菌菌株N13的lysC等位基因，其可以在所说的出版物中找到。lysC基因和各种lysC等位基因的核苷酸序列可以以登记号X57226和E06826获得。
然后，可以单独或适当组合将以这一方法获得的基因掺入进质粒载体中，例如pJCl(Cremer等，分子和普通遗传学220，478-480(1990))或pECS(Eikmanns等，基因，102，93-98(1991))，通过转化例如如Thierbach等(应用微生物学和生物技术29，356-362(1988))中描述的，或通过电穿孔，例如如Dunican和Shivnan(生物／技术7，1067-1070(1989))中所描述的转移到所需的棒状菌菌株中，例如菌株MH2O-22B(Schrumpf等，应用微生物学和生物技术37：566-571(1992))，并表达。待选择的菌株可以用两种质粒载体同样好地转化，各质粒载体含有所说基因或目的基因，从而获得除了已知扩增的pyc基因外。有利的同时扩增表达的两种或多种基因，
这些菌株的例子是：
菌株MH20-22B／pJC23／pEC7pyc，其中pyc和dapA基因同时扩增，并被表达，或
菌株MH20-22B／pJC33／pEC7pyc，其中pyc基因和lysC(FBR)等位基因同时扩增，尤其是超量表达，或
菌株MH20-22B／pJ23／pEC7dapBpyc，其中pyc，dapA和dapB基因同时扩增，尤其是超量表达，或
菌株MH20-22B／pJC23／pEC7lysEdapBpyc，其中pyc，dapA，dapB和lysE基因同时扩增，尤其是超量表达。
根据本发明制备的微生物可以培养来连续生产L-赖氨酸，或者通过分批发酵，流加分批方法或重复流加分批方法不连续生产L-赖氨酸。已知培养方法的概述在Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1．Einfhrung in die Bioverfahrenstechnik(生物技术1．生物工程导论)(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(生物反应器和配套设备)(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))中有描述。
所利用的培养基必须适合特定微生物的需要。各种微生物的培养基的描述在美国细菌学学会(华盛顿D．C．，USA，1981)的“普通细菌学方法手册”中找到。可以利用碳源是糖和碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪，例如大豆油，向日葵油，落花生油和椰子脂肪，脂肪酸，例如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇，例如甘油和乙醇，以及有机酸，例如乙酸。这些物质可以单独或混合使用。可以利用氮源是有机含氮化合物，如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽抽提物，玉米浆，大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或混合使用。可以利用的磷源是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的钠盐。培养基也必须含有金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，这对生长必需的。最后，除以上提及的物质之外，可以使用必需的促生长物质如氨基酸和维生素。所说的添加物可以一次或分批添加到培养基中。
培养的pH通过适当使用碱性化合物，如氢氧化钠，氢氧化钾或氨，或酸性化合物，如磷酸或硫酸控制。可以用利用消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯控制。质粒的稳定性可以通过向培养基中添加合适的选择性作用物保持，例如抗生素。需氧条件可以通过向培养基中引入氧或含氧的气体混合物保持，例如空气。培养温度通常是20℃-45℃，优选的是25℃-40℃。继续培养，直到L-赖氨酸的形成达到最大值。这一目标通常在10小时160小时之内达到。
形成的L-赖氨酸的浓度可以借助氨基酸分析仪经离子交换层析和与茚三酮的柱后反应测定，如Spackmann等(分析化学30，1190(1958))描述的。
下列微生物按照布达佩斯条约的条款保藏在德意志微生物保藏中心((DSMZ)，Brunswick，德国)：
大肠杆菌K-12菌株DH5α／pEC7pyc，保藏号DSM12870
大肠杆菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBpyc，保藏号DSM12873
大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC7lysEdapBpyc，保藏号DSM12874
谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715／pJC23，保藏号DSM12869
谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MA16)，保藏号DSM12867
谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，保藏号DSM12868
谷氨酸棒杆菌菌株DM678，保藏号DSM12866
大肠杆菌K-12菌株DH5α／pEC7lysEpyc，保藏号DSM12872
大肠杆菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBlysE，保藏号DSM12875
大肠杆菌K-12菌株DH5α／pEC7lysE，保藏号DSM12871
实施例
本发明借助下列实施例详细说明。实施例1制备编码lysE的DNA
染色体DNA用常规方法从菌株ATCC13032分离(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。聚合酶链反应(PCR)用来扩增携带lysE基因的DNA片段。基于谷氨酸棒杆菌已知的lysE基因序列，选择下列引物寡核苷酸(Vrljic等，分子微生物学22(5)，815-826(1996))(登记号X96471)。LysBam1：5′CTC GAG AGC(GGA TCC)GCG CTG ACT CAC C3′LysBam2：5′GGA GAG TAC GGC(GGA TCC)ACC GTG ACC 3′
所显示的引物是通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成的，用Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)进行PCR。这些引物使扩增携带lysE基因的1．1 kb DNA片段成为可能。所说引物也含有限制性内切核酸酶BamHI的切割位点序列，在以上核苷酸序列中由括弧显示。
借助在0．8％琼脂糖凝胶上的电泳鉴别携带lysE基因的扩增过的约1．1 kb DNA片段，用来源于Qiagen(Hilden,德国)的QIAquick凝胶抽提试剂盒(产品号28704)从凝胶上分离并纯化。
然后借助来源于宝灵格曼海姆(曼海姆，德国)的T4 DNA连接酶将给片段连接至载体pUC18(Norrander等，基因(26)101-106(1983))上。这一过程通过以限制性内切核酸酶SmaⅠ充分切割载体pUC18完成，并且用碱性磷酸酶(宝灵格曼海姆，曼海姆，德国)处理来完成。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆，一种操作方法，Vol．I．IRL-出版社，牛津，华盛顿DC，USA)。通过在LB琼脂(Sambrook等，分子克隆：实验室手册。第二版。冷泉港实验室出版社，冷泉港，N．Y．)上平板接种转化混合物选择携带质粒的细胞，所说的琼脂上补充有氨苄青霉素50 mg／l。从转化子分离质粒DNA，并且通过用限制酶BamHⅠ处理，其后用琼脂糖凝胶电泳检查。该质粒称为pUC18lysE。实施例2 dapB的制备
如实施例1所述，从谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032分离染色体DNA。这样的来源于谷氨酸棒杆菌的dapB基因的序列是已知的(登记号X67737)。然而，所出版的DNA序列仅包括翻译起始位点上游的56 bp，因此翻译起始位点的5’末端上游被附加测序。
测序利用在已知dapB序列(登记号X67737)的区中结合的引物寡核苷酸以质粒pJC25(EP-B 0435 132)进行。所利用的测序引物的序列是：5′GAA CGC CAA CCT TGA TTC C3′
测序用由Sanger等，美国国家科学院院报，(74)5463-5467(1977)描述的链终止方法进行。测序反应是借助AutoRead测序试剂盒(Pharmacia，Freiburg)完成的。对测序产品的电泳分析和检测用Pharmacia(Freiburg，德国)的A．L．F．DNA测序仪完成。
所获得的DNA序列用来选择第二引物，以获得转录起始位点上游的进一步的序列数据。下列引物选择来用于该目的：5′CTT TGC CGC CGT TGG GTT C3′
如上的描述进行测序反应，dapB基因的新上游序列显示在SEQID No．1中。包括dapB基因核苷酸序列的序列显示在SEQ ID No．2中。
聚合酶链反应用来扩增dapB基因。对于这一目的而言，由MWGBiotech合成在dapB基因的已知DNA序列基础上选择的两引物寡核苷酸：P-dap：5′(AAG CTT)AGG TTG TAG GCG TTG AGC 3′dapall：5′TTA ACT TGT TCG GCC ACA GC 3′
5′引物(引物P-dap)含有HindⅢ切割位点，以上序列中由括弧表示。如实施例1进行PCR。以这种方法扩增约1．1 kb DNA片段，其携带dapB基因并含有在末端的限制性内切核酸酶HindⅢ切割位点。从0．8％琼脂糖凝胶(QIAquick凝胶抽提试剂盒，来源于Qiagen，Hilden，德国)纯化所获得的PCR片段，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，荷兰，产品号K4550-01)克隆进克隆载体pCR2．1TOPO。将连接混合物转化进Invitrogen的大肠杆菌菌株TOP10F′，将转化混合物平板接种在含有卡那霉素(50 mg／l)，IPTG(0．16mM)和X-Gal(64 mg／l)的LB培养基上，分离卡那霉素抗性菌落。借助Qiagen的Q1Aprep旋转小量制备试剂盒从转化子分离质粒DNA，通过用限制酶HindⅢ切割和接下来的琼脂糖凝胶电泳检查。扩增过的DNA片段的DNA序列通过测序检查。PCR产物的序列与在SEQ IDNo．1中显示的序列匹配。所获得的质粒称为pCR2．1TOPOdapB。实施例3制备编码pyc的DNA
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032用作染色体DNA的供体。如实施例1的描述从菌株ATCC13032分离染色体DNA。聚合酶链反应用来扩增携带pyc基因的DNA片段。在已知的谷氨酸棒杆菌pyc基因序列(PetersWendisch等，微生物学144，915-927(1998))的基础上选择下列PCR引物寡核苷酸(登记号Y09548)。5-PYC-IN：5′GC(T CTA GA)A GTG TCG CAA CCG TGC TTG A 3′3-PYC-IN：5′GC(T CTA GA)T TGA GCC TTG GTC TCC ATC T 3′
所显示的引物是通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成的，用Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)进行PCR。这些引物使扩增携带pyc基因的3．8 kb DNA片段成为可能。所说引物也含有限制性内切核酸酶XbaⅠ的切割位点序列，在以上核苷酸序列中由括弧显示。
借助在0．8％琼脂糖凝胶上的电泳鉴别携带pyc基因的扩增过的约3．8 kb DNA片段，用常规方法(QIAquick凝胶抽提试剂盒，QuiagenHilden)从凝胶上分离并纯化。
然后借助双重启动子Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，荷兰，产品编号K4600-01)将片段连接到载体pCRⅡ-TOPO上。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)。通过将混合物平板接种在含有卡那霉素(50mg／l)和XGal(64 mg／l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
在DNA分离之后，借助限制切割检测所获得的质粒，并且在琼脂糖凝胶上鉴别。质粒称为pCRⅡ-TOPOpyc，测序克隆插入物的DNA序列，用以对照。由于在pCRⅡ-TOPOpyc中的pyc插入物的测定的序列与基因文库中的匹配，因此其后使用这一质粒。实施例4将dapB克隆进载体pEC7
从质粒pCR2．1TOPOdapB(来源于实施例2)分离携带dapB基因的约1．1 kb DNA片段。为这一目的，质粒pCR2．1TOPOdapB以限制酶HindⅢ消化，分离携带dapB基因的约1．1 kb DNA片段。
将dapB片段插入到载体pEC7中。载体pEC7基于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC5(Eikmanns等，102：93-98(1991))。以下列方式从质粒pEC5上除去不位于多接头上的BamHⅠ切割位点：以限制酶BamHⅠ部分切割质粒pEC5。从琼脂糖凝胶分离约7．2 kb DNA片段，突出端以Klenow聚合酶(宝灵格曼海姆)填平。将所形成的DNA片段连接(T4连接酶，宝灵格曼海姆)。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB琼脂上分离卡那霉素抗性菌落。从转化子分离(Qiagen的QlAprep旋转小量制备试剂盒)质粒DNA，并且用限制酶BamHⅠ与PstⅠ限制切割检查。所形成的质粒称为pEC6。
质粒pEC6以限制酶XhoⅠ充分切割。将携带trp终止子的DNA片段连接到载体DNA片段上(T4连接酶，宝灵格曼海姆)。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB琼脂上分离卡那霉素抗性菌落。从转化子分离(Qiagen的Q1Aprep旋转小量制备试剂盒)质粒DNA，并且用限制酶BamHⅠ与XhoⅠ限制切割检查。所形成的质粒称为pEC7。
所获得的携带dapB的DNA片段连接到载体pEC7上(T4 DNA连接酶，宝灵格曼海姆)，该载体已经以限制酶HindⅢ充分消化，并且用碱性磷酸酶(宝灵格曼海姆)处理。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α，在含有卡那霉素(50mg／l)的LB琼脂上分离卡那霉素抗性菌落。从转化子分离(Qiagen的Q1Aprep旋转小量制备试剂盒)质粒DNA，并且用限制酶HindⅢ限制切割检查。所形成的质粒称为pEC7dapB(图1)。所获得的大肠杆菌菌株称为DH5α／pEC7dapB。实施例5将lysE克隆进载体pEC7
将实施例1中所描述的质粒pUC18lysEneu以限制酶BamHⅠ充分消化，携带lysE基因的1．1 kb BamHⅠ片段用如实施例1的方法分离。载体pEC7以限制酶BamHⅠ同样充分地切割，并用碱性磷酸酶被处理。将BamHⅠ载体片段和BamHⅠlysE片段连接(迅速DNA连接试剂盒，宝灵格曼海姆)，并且转化进大肠杆菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg／l)的LB琼脂上选择携带质粒的转化子。分离质粒DNA(Qiagen的QlAprep旋转小量制备试剂盒)，并且用酶BamHⅠ限制切割检查。所形成的质粒称为pEC7lysE(图2)。通过将质粒pEC7lysE转化进大肠杆菌菌株DH5α获得的菌株称为DH5α/pEC7lysE。实施例6将pyc克隆进载体pEC7
通过以限制酶XbaⅠ切割从质粒pCRII30 TOPOpyc(实施例3)获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032的携带pyc基因的3．8 kb DNA片段。3．8 kbDNA片段由凝胶电泳鉴别，从凝胶上分离并用常规方法纯化，突出端以Klenow聚合酶填充。载体pEC7以限制酶SmaⅠ同样充分地切割，并且用碱性磷酸酶处理。将用Klenow聚合酶处理的SmaⅠ载体片段和XbaⅠ pyc片段连接(T4连接酶，宝灵格曼海姆)，并且转化进大肠杆菌菌株DH5α。在含有氯霉素(10mg／l)的LB琼脂上选择携带质粒的转化子。分离质粒DNA(Q1Aprep旋转小量制备试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)，并且以限制酶SalⅠ限制切割检查。所形成的质粒称为pEC7pyc(图3)。通过将质粒pEC7pyc转化进大肠杆菌菌株DH5α获得的大肠杆菌菌株称为DH5α／pEC7pyc。实施例7制备含有lysE和dapB的质粒
从谷氨酸棒杆菌ATCC13032的含有dapB基因的质粒pCR2．1TOPOdapB分离作为HindⅢ片段的dapB基因。为此，质粒以限制酶HindⅢ充分消化，从0．8％琼脂糖凝胶(Qiagen的Q1Aquick凝胶抽提试剂盒)分离携带dapB的DNA片段。
载体pEC7lysE也以限制酶HindⅢ充分消化，并且利用碱性磷酸酶被处理。将含有dapB的1．1 kb片段连接到所形成的线型载体片段上(T4连接酶，宝灵格曼海姆)，并将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α。在含有氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的转化子。分离质粒DNA(Q1Aprep旋转小量制备试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)，并且以限制酶HindⅢ限制切割检查。
所形成的质粒称为pEC7lysEdapB。这一质粒能够在大肠杆菌和在棒状菌中自我复制，并且赋予在其宿主上对抗生素氯霉素的抗性。
质粒pEC7lysEdapB同时含有dapB基因(其编码二氢吡啶二羧酸还原酶)以及lysE基因(其编码赖氨酸输送物)。
通过用pEC7lysEdapB转化大肠杆菌获得的菌株被保藏。实施例8制备同时含有dapB和pyc的质粒
如实施例6所述，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的携带pyc基因(编码丙酮酸羧化酶)的质粒以限制酶XbaⅠ充分切割，突出端以Klenow聚合酶填充，这使得分离含有丙酮酸羧化酶基因的3．8 kb DNA片段成为可能。
也用限制酶SmaⅠ充分切割质粒pEC7dapB(实施例4)，末端用碱性磷酸酶处理。利用T4 DNA连接酶(宝灵格曼海姆，Mannheiin，德国)将所形成的线型载体片段连接到3．8 kb DNA片段(含有pyc基因)上。这一步骤产生含有棒状菌dapB基因和pyc基因的质粒。在含有氯霉素的LB琼脂上(10mg／l)选择含有质粒的转化子。分离质粒DNA(Q1Aprep旋转小量制备试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)，并且以限制酶SmaⅠ限制切割检查。质粒如图4中所示，称为pEC7dapBpyc。通过将质粒pEC7dapBpyc转化进大肠杆菌DH5α获得的大肠杆菌菌株称为DH5α/pEC7dapBpyc。实施例9制备含有同时编码lysE，dapB和pyc的序列的质粒
如实施例6所述，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的携带pyc基因(编码丙酮酸羧化酶)的质粒pCRⅡ-TOPOpyc以限制酶XbaⅠ充分切割，并以Klenow聚合酶处理，这使得分离含有丙酮酸羧化酶基因的3．8 kbDNA片段成为可能。
也用限制酶SmaⅠ充分切割质粒pEC7dapBlysE，末端用碱性磷酸酶处理。利用T4 DNA连接酶(宝灵格曼海姆，Mannheiin，德国)将所形成的线型载体片段连接到3．8 kb DNA片段(含有pyc基因)上。这一步骤产生含有棒状菌dapB基因和pyc基因的质粒。在含有氯霉素的LB琼脂上(10mg／l)选择含有质粒的转化子。分离质粒DNA(Q1Aprep旋转小量制备试剂盒，Qiagen，Hilden，德国)，并且以限制酶SmaⅠ限制切割证实。质粒如图5中所示，称为pEC7dapBlysEpyc。通过将质粒pEC7dapBlysEpyc转化进大肠杆菌DH5α获得的大肠杆菌菌株称为DH5α/pEC7dapBlysEpyc。实施例10用质粒pJC23和pJC33转化菌株MH20-22B
质粒pJC1能够在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制(Cremer等，分子和普通遗传学220：478-480(1990))。质粒携带谷氨酸棒杆菌菌株MH20-22B的lysC(Fbr)基因的pJC33(Cremer等，应用和环境微生物学57(6)，1746-1752(1991))来源于该质粒。
质粒pJC23也基于载体pJC1，并且携带谷氨酸棒杆菌ATCC13032的dapA基因(Cremer等，分子和普通遗传学220：478-480(1990))(EP-B 0 435 132)。通过电穿孔法(Haynes和Britz，FEMS微生物学通讯(61)329-334(1989))将质粒pJC1，pJC33和pJC23引入菌株MH20-22B。谷氨酸棒杆菌菌株MH20-22B是AEC-抗性赖氨酸生产菌，以保藏号DSM5715保藏。
在含有卡那霉素15mg／l的选择琼脂(LBHIS琼脂(18．5g／l脑-心浸渍液，0．5M山梨醇，5g／l细菌培养用胰蛋白胨，2．5g／l细菌培养用酵母提取物的，5g／lNaCl，18g／l细菌培养用琼脂))上，分离电穿孔法获得的转化子。用常规方法(Peters-Wendisch等，微生物学144，915-927(1998))分离质粒DNA，以合适的限制性内切酶切割，并且检查。所获得的菌株称为MH20-22B／pJCl，MH20-22B／pJC33和MH20-22B／pJC23。实施例11用质粒pEC7pyc，pEC7dapBpyc和pEC7dapBlysEpyc转化
将第二种质粒提供给实施例10中制备的菌株。
将下列质粒用电穿孔法方法引入所描述的菌株MH20-22B／pJCl，MH20-22B／pJC33和MH20-22B／pJC23中：
pEC7pyc(参见实施例6)
pEC7dapBpyc(参见实施例8)
pEC7dapBlysEpyc(参见实施例9)
转化的细菌基于它们所含有的质粒的抗生素抗性选择。在选择琼脂(LBHIS琼脂，含有卡那霉素15mg／l以及氯霉素7．5 mg／l)上分离借助电穿孔法所获得的转化子。分离质粒DNA，以合适的限制性内切酶切割，并且检查。
获得的菌株列表如下：
DSM 5715／pJC1／PEC7pyc
DSM 5715／pJC33／pEC7pyc
DSM 5715／pJC23／pEC7pyc
DSM 5715／pJC23／pEC7dapBpyc
DSM 5715／pJC23／pEC7lysEdapBpyc
实施例12制备L-赖氨酸
将实施例10和11中获得的各种谷氨酸棒杆菌菌株在适于赖氨酸生产的营养培养基上培养，并测定上清液的赖氨酸含量。
其是由以下步骤完成的，首先于33℃在具有合适的抗生素的琼脂平板(脑-心琼脂，含有卡那霉素(25mg／l)，氯霉素(10mg／l))上培养各种菌株24小时。将这些琼脂平板培养物用于接种预培养物(100ml锥形瓶中10ml培养基)。完全培养基CgⅢ用作预培养培养基。加入卡那霉素(25mg／l)和氯霉素(10mg／l)。预培养在摇床上于240rpm下33℃进行24小时。这一预培养物用来接种主培养，以给出初始OD(660nm)0．2。培养基MM用于主培养。
培养基MM：
CSL             5g
MOPS            20g／l
葡萄糖          50g／l(分别加压灭菌)
盐：
硫酸铵          25g／l
磷酸二氢钾      0．1g／l
七水硫酸镁      1．0g／l
二水氯化钙      10mg／l
七水硫酸亚铁    10mg／l一水硫酸锰         5．0mg／l生物素             0．3mg／l(过滤灭菌)硫胺素*HCl       0．2mg／l(过滤灭菌)碳酸钙             25g／l缩写：CSL：玉米浆MOPS：吗啉丙烷磺酸
CSL，MOPS和盐溶液以氨水调整至pH7，并加压灭菌。然后加入无菌底物、维生素溶液和干灭菌的碳酸钙。
培养在具有挡板的100ml锥形瓶中的10ml体积中进行。加入卡那霉素(25mg／l)和氯霉素(10mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
在72小时之后，在660nm的波长下测量OD。所形成的赖氨酸的量借助EppendorfBioTronik(汉堡，德国)的氨基酸分析仪经离子交换层析和与茚三酮的柱后衍生化检测反应测定。葡萄糖含量用SkalarAnalytik GmbH(Erkelenz，德国)的糖分析仪测定。
实验结果如表1所示。
表1
菌    株 基    因 OD(660) 赖氨酸-HClg／l
DSM5715／pJCl／pEC7pyc Pyc 9．3 11．3
DSM5715／pJC33／pEC7pyc pyc，lysC(Fbr) 9．2 11．9
DSM5715／pJC23／pEC7pyc pyc，dapA 9．3 14．4
DSM5715／pJC23／pEC7dapBpyc pyc，dapA，dapB 9．3 16．9
DSM5715／pJC23／pEC7lysEdapBpyc pyc，dapA，dapB，lysE 9．1 17．6
实施例13将aecD基因克隆进载体pUC18
用限制酶Bg1Ⅱ和EcoRV充分消化质粒pSIR21(Rossol，博士论文，Bielefeld大学，1992)，然后分离携带谷氨酸棒杆菌ATCC13032的aecD基因(登录号M89931)(Rossol和Puhler，细菌学杂志，174(9)，2968-2977(1992))的1．4kb DNA片段。根据Sambrook等所述(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社)用T4 DNA连接酶将分离出的DNA片段与已预先用BamHⅠ和SmaⅠ限制性内切酶充分消化的质粒pUC18连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α。在含有氨苄青霉素(100mg／l)的脑-心琼脂平板上选择转化子，分离质粒DNA。所得质粒被称为pUC18∷aecD。实施例14将dapA基因克隆进质粒pSP72
从质粒pJC20(Cremer，J．博士论文，1989，Dusseldorf大学)分离作为SphⅠ-BamHⅠ片段的dapA基因片段。载体pSP72(Promega公司，USA)用酶SphⅠ和BamHⅠ充分切割并用碱性磷酸酶处理。将载体和携带dapA的片段用T4 DNA连接酶连接，并将该DNA转化大肠杆菌菌株XL1 Blue(Bullock，Fernandez和Short，生物技术(5)376-379(1987))。在含100mg／l氨苄青霉素的LB培养基上选择转化子。从转化子分离质粒DNA，该质粒被称为pSP72∷dapA。实施例15dapA启动子的诱变及质粒pSP72∷dapA(MC20)和pSP72∷dapA(MA16)的制备
用Stratagene公司的Quickchange定点诱变试剂盒进行启动子区的诱变。根据已有的dapA序列设计如下引物用于诱变：
对于制备pSP72∷dapA(MC20)：
针对MC20的引物dap1
CCA AAT GAG AGA TGG TAA CCT TGA ACT CTA TGA GCA
针对MC20的引物dap2
GTG CTC ATA GAG TTC AAG GTT ACC ATC TTC CCT CATTTG G
对于制备pSP72∷dapA(MA16)：
针对MA16的引物dap3
CCA AAT GAG GGA AGA AGG TAT AAT TGA ACT CTA TGAGCA
针对MA16的引物dap4
GTG CTC ATA GAG TTC AAT TAT ACC TTC TTC CCT CATTTG G
根据厂商(Stratagene)指导用Quickchange定点诱变试剂盒以质粒pSP72∷dapA(实施例14)为模板进行PCR反应。
将诱变反应物转化大肠杆菌菌株XL1-Blue。在具有100mg／l羧苄青霉素的LB培养基上选择转化子。从转化子中分离质粒DNA，用BstEⅡ切割证实BstEⅡ切割位点的删除，不再具有BstEⅡ切割位点的质粒具有所希望的突变。
将所得质粒转化dapA缺陷型大肠杆菌突变体RDA8。转化反应物涂布在具有100mg／l羧苄青霉素的LB上，以测试dapA突变的互补作用。从转化子中分离DNA，所得质粒称为pSP72∷dapA(MC20)和pSP72∷dapA(MA16)。用反向和通用测序引物经Sanger等，美国科学院院刊(74)5463-5467(1977)所述的链终止反应法测序质粒。测序反应用AutoRead测序试剂盒(Pharmacia，Freiburg)进行。对测序产物的电泳分析和检测用Pharmacia(Freiburg，德国)的A．L．F．DNA测序仪完成。
实施例16质粒pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)的制备(诱变片段的克隆)
用限制性内切酶PvuⅡ和SmaⅠ充分消化质粒pSP72∷dapA(MC20)和pSP72∷dapA(MA16)(实施例15)。1450bp的PvuⅡ-SmaⅠ片段携带具有突变的启动子MC20或MA16的dapA基因，将该片段与StuⅠ酶切的载体pUC18∷aecD(实施例13)经T4 DNA连接酶连接。连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α。在具有100mg／l氨苄青霉素的LB培养基上选择转化子。从转化子中分离质粒DNA。以此方式获得质粒pUC18aecD∷dapA(MC20)和pUC18aecD∷dapA(MA16)。
质粒pUC18aecD∷dapA(MC20)和pUC18aecD∷dapA(MA16)用限制性内切酶EcoRⅠ部分酶切并用SalⅠ酶充分酶切，以获得3．0kb的携带aecD∷dapA(MA16)或aecD∷dapA(MC20)的片段。用T4 DNA连接酶将该片段与经酶切并经碱性磷酸酶处理的载体pK19mobsacB(Schafer等，基因(145)69-73(1994))连接。连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5(Hanahan(1985)，DNA克隆实用方案，第1卷，IRL出版社，Oxford，美国华盛顿特区)。在具有50mg／l卡那霉素的LB培养基上选择转化子。由此获得质粒pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)。
用质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1(Simon，Priefer和Puhler，生物／技术，(1)784-791(1983))。在具有50mg／l卡那霉素的LB培养基上选择转化子。从转化子中分离质粒DNA并检查。获得的菌株称为S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)。实施例17制备谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)和DSM5715aecD∷dapA(MA16)
用接合方法(Schafer等，细菌学杂志(172)1663-1666(1990))将S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和S17-1／pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)(实施例16)中的质粒pK19mobsacBaecD∷dapA(MC20)和pK19mobsacBaecD∷dapA(MA16)转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715中。将接合混合物涂布在具有萘啶酮酸和卡那霉素的脑-心培养基上以选择接合转移子。将所得接合转移子在10ml脑-心培养基中过夜培养，将培养基等份涂布在含有蔗糖的培养基平板上(含10％蔗糖的脑-心琼脂)，以根据对蔗糖的敏感性筛选。分离蔗糖抗性菌落并在含氯霉素和卡那霉素的琼脂平板(含15mg／l卡那霉素的脑-心培养基和含10mg／l氯霉素的脑-心培养基)再检查。
分离具有下述表型的菌落：
蔗糖抗性
卡那霉素敏感性
氯霉素敏感性
经Southern印迹(Sambrook等，分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社)证实dapA片段插入aecD基因中。
实施例18
制备谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)pEC7和DSM5715／pEC7
将实施例6的pyc基因插入载体pEC7中，经电穿孔(Haynes，1989，FEMS微生物通信61：329-334)将质粒pEC7pyc或质粒pEC7导入菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，DSM5715aecD∷dapA(MA16)和DSM5715(实施例17)中，获得谷氨酸棒杆菌DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7和DSM5715／pEC7。在具有25mg／l卡那霉素的脑-心琼脂上选择转化子。从转化子分离质粒DNA并证实。
以此方式获得如下菌株：
DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，
DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，
DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，
DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7和
DSM5715／pEC7。实施例19用实施例18中制得的菌株制备赖氨酸
如实施例12所述，将菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc，DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7，DSM5715aecD∷dapA(MA16)／PEC7和DSM5715／pEC7在培养基CgⅢ(Kase＆Nakayama，农业和生物化学36(9)1611-1621(1972)中预培养，然后在生产培养基MM中培养。48小时后测660nm光密度和所形成的L-赖氨酸浓度。
表2示出结果。
表2
菌株 OD 赖氨酸-HCl(g／l)
 DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7pyc  14．15  13．3
 DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7pyc  13．6  13．4
 DSM5715／pEC7  13．3  11．5
 DSM5715aecD∷dapA(MA16)／pEC7  13．3  12．9
 DSM5715aecD∷dapA(MC20)／pEC7  14．0  12．8
序列表
<110>德古萨-于尔斯股份公司
于利希研究中心有限公司
<120>生产L-赖氨酸的棒状菌和制备赖氨酸的方法
<130>980183 BT
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Ver．2．1
<210>1
<211>795
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>-35信号
<222>(774)．．(779)
<220>
<223>dapB上游的DNA
<400>1
ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60
acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120
tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180
gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240
agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300
tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360
ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420
aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480
ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540
ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600
aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660
taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720
tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780
ttctgaacgg gtacg                                                  795
<210>2
<211>1815
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>-35信号
<222>(774)．．(779)
<220>
<221>-10-信号
<222>(798)．．(803)
<220>
<221>CDS
<222>(851)．．(1594)
<400> 2
ctgcagcaat gagaccgagt aatttcgggg ttgaccagat acaccaatga gaacttggga 60
acgggcttca aaaatactgg tgaagttgat gtcttcaaca atgcctgcac caggatatga 120
tccggtatcg atacctggaa cgacaacctg atcaggatat ccagtgcctt gaatattgac 180
gttgaggaag gaatcaccag ccatctcaac tggaagacct gacgcctgct gaattggatc 240
agtggcccaa tcgacccacc aaccaggttg gccattaccg gcgatatcaa aaacaactcg 300
tgtgaacgtt tcgtgctcgg caacgcggat gccagcgatc gacatatcgg agtcaccaac 360
ttgagcctgc tgcttctgat ccatcgacgg ggaacccaac ggcggcaaag cagtggggga 420
aggggggagt ttggtgcact ctgaaccgag tggtctctga agtggtaggc gacggggcag 480
ctatctgaag gcgtgcgagt tgtggtgacc gggttagcgg tttcagtttc tgtcacaact 540
ggagcaggac tagcagaggt tgtaggcgtt gagccgcttc catcacaagc acttaaaagt 600
aaagaggcgg aaaccacaag cgccaaggaa ctactgcgga acgggcggtg aagggcaact 660
taagtctcat atttcaaaca tagttccacc tgtgtgatta atccctagaa cggaacaaac 720
tgatgaacaa tcgttaacaa cacagaccaa aacggtcagt taggtatgga tatcagcacc 780
ttctgaacgg gtacgtctag actggtgggc gtttgaaaaa ctcttcgccc cacgaaaatg 840
aaggagcata atg gga atc aag gtt ggc gtt ctc gga gcc aaa ggc cgt    889
           Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg
             1               5                  10
gtt ggt caa act att gtg gca gca gtc aat gag tcc gac gat ctg gag   937
Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu
     15                  20                  25
ctt gtt gca gag atc ggc gtc gac gat gat ttg agc ctt ctg gta gac   985
Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Set Leu Leu Val Asp
     30                  35                  40                  45
aac ggc gct gaa gtt gta gtt gac ttc acc act cct aac gct gtg atg   1033
Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met
                 50                  55                  60
ggc aac ctg gag ttc tgc atc aac aac ggc att tct gcg gtt gtt gga   1081
Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Ash Asn Gly Ile Set Ala Val Val Gly
             65                  70                  75
acc acg ggc ttc gat gat gct cgt ttg gag cag gtt cgc gac tgg ctt   1129
Thr Thr Gly Phe ASp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu
         80                  85                  90
gaa gga aaa gac aat gtc ggt gtt ctg atc gca cct aac ttt gct atc   1177
Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Va1 Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile
     95                 100                 105
tct gcg gtg ttg acc atg gtc ttt tcc aag cag gct gcc cgc ttc ttc   1225
Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe
110                 115                 120                 125
gaa tca gct gaa gtt att gag ctg cac cac ccc aac aag ctg gat gca   1273
Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala
                130                 135                 140
cct tca ggc acc gcg atc cac act gct cag ggc att gct gcg gca cgc   1321
Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gin Gly Ile Ala Ala Ala Arg
            145                 150                 155
aaa gaa gca ggc atg gac gca cag cca gat gcg acc gag cag gca ctt   1369
Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu
        160                 165                 170
gag ggt tcc cgt ggc gca agc gta gat gga atc ccg gtt cat gca gtc   1417
Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val
     75                 180                 185
cgc atg tcc ggc atg gtt gct cac gag caa gtt atc ttt ggc acc cag   1465
Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln
190                 195                 200                 205
ggt cag acc ttg acc atc aag cag gac tcc tat gat cgc aac tca ttt   1513
Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe
                210                 215                 220
gca cca ggt gtc ttg gtg ggt gtg cgc aac att gca cag cac cca ggc   1561
Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly
            225                 230                 235
cta gtc gta gga ctt gag cat tac cta ggc ctg taaaggctca tttcagcagc 1614
Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
        240                 245
gggtggaatt ttttaaaagg agcgtttaaa ggctgtggcc gaacaagtta aattgagcgt 1674
ggagttgata gcgtgcagtt cttttactcc acccgctgat gttgagtggt caactgatgt 1734
tgagggcgcg gaagcactcg tcgagtttgc gggtcgtgcc tgctacgaaa cttttgataa 1794
gccgaaccct cgaactgctt c                                           1815
<210>3
<211>248
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>3
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
             20                  25                  30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
         35                  40                  45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
     50                  55                  60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
 65                  70                  75                  80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Asp Trp Leu Glu Gly Lys
                 85                  90                  95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
            100                 105                 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
        115                 120                 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145                 150                 155                 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
                165                 170                 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
            180                 185                 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
    210                 215                 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225                 230                 235             240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
                245
<2l0>4
<211>79
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<223>dapA野生型启动子
<400>4
gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagaaggtaa ccttgaactc 60
tatgagcaca ggtttaaca                                              79
<210>5
<211>79
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列的描述；
    具有MC20突变的
    谷氨酸棒杆菌dapA启动子
<220>
<221>突变
<222>(45)
<400> 5
gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaatgaggg aagatggtaa ccttgaactc 60
tatgagcaca ggtttaaca                                              79
<210>6
<211>80
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>合成序列的描述：
    具有MA16突变的
    谷氨酸棒杆菌dapA启动子
<220>
<221>突变
<222>(35)．．(53)
<400>6
gttaggtttt ttgcggggtt gtttaacccc caaaatgagg gaagaaggta taattgaact 60
ctatgagcac aggtttaaca                                             80附图
有下列附图：图1：pEC7dapB(参见实施例4)图2：pEC7lysE(参见实施例5)图3：pEC7pyc(参见实施例6)图4：pEC7dapBpyc(参见实施例8)图5：pEC7lysEdapBpyc(参见实施例9)
用于附图的缩写定义如下：
Cm：氯霉素抗性基因
dapB：谷氨酸棒杆菌的dapB基因
lysE：谷氨酸棒杆菌的lysE基因
pyc：谷氨酸棒杆菌的pyc基因
OriE：质粒编码的大肠杆菌的复制起点
pBL：质粒pBL1的DNA片段
EcoRⅠ：限制酶EcoRⅠ切割位点
EcoRV：限制酶EcoRV切割位点
HincⅡ：限制酶HincⅡ切割位点
HindⅢ：限制酶HindⅢ切割位点
KpnⅠ：限制酶KpnⅠ切割位点
SalⅠ：限制酶Sa1Ⅰ切割位点
SmaⅠ：限制酶SmaⅠ切割位点
SphⅠ：限制酶SphⅠ切割位点
PvuⅡ：限制酶PvuⅡ切割位点
BamHⅠ：限制酶BamHⅠ切割位点

Claims (22)

1．生产L-赖氨酸的棒状菌，其具有扩增的pyc基因，在这些菌株中，选自包括dapA基因，lysC基因，lysE基因和dapB基因的组的附加基因分别或一起得到扩增，尤其是得到超量表达。
2．如权利要求1中所要求的棒状菌，其中dapA基因及任选地dapB基因得到扩增，尤其是得到超量表达。
3．如权利要求1中所要求的棒状菌，其中dapA基因，dapB基因以及lysE基因得到扩增，尤其是得到超量表达。
4．如权利要求1中所要求的棒状菌，其含有SEQ ID No．5和SEQID No．6中所示的dapA启动子的MC20或MA16突变。
5．如权利要求1中所要求的棒状菌，其中dapB基因得到扩增，尤其是得到超量表达，该基因额外含有SEQ ID No．1中所示的其翻译起始位点上游的5’末端。
6．优选地为重组的DNA，其来源于棒状菌，并且能够在棒状菌中复制，该DNA至少含有额外包含SEQ ID No．1中所示的dapB基因翻译区5’末端上游的核苷酸序列。
7．如权利要求5中所要求的能够复制的DNA，其具有SEQ ID No．1中所示的核苷酸序列。
8．一种通过发酵具有扩增的pyc基因的棒状菌制备L-赖氨酸的方法，其中使用这样的细菌，该细菌中编码选自dapA，lysC，lysE和dapB基因的核苷酸序列分别或一起得到扩增，尤其是得到超量表达。
9．如权利要求8的方法，其中使用这样的细菌，该细菌中dapA基因得到扩增，尤其是得到超量表达，任选地lysC基因也同时得到扩增，尤其是超量表达。
10．如权利要求8的方法，其中使用这样的细菌，该细菌中dapA基因，dapB基因以及lysE基因同时得到扩增，尤其是得到超量表达，
11．如权利要求8的方法，其中使用由一种或多种质粒载体转化的菌株，所说的质粒载体携带有待扩增的一种或多种基因的核苷酸序列。
12．如权利要求8的方法，其中使用由一种或多种质粒载体转化的菌株，所说的质粒载体携带有编码选自pyc，dapA，dapB和／或lysE基因的一种或多种基因的核苷酸序列。
13．如前述一或多项权利要求所要求的方法，其中使用谷氨酸棒杆菌菌种的细菌。
14．如前述一或多项权利要求所要求的通过发酵制备L-赖氨酸的方法，该方法包括以下步骤：
a)发酵L-赖氨酸生产菌，在这些细菌中，所描述的基因得到了扩增，
b)在培养基中或在细菌细胞中富集L-赖氨酸，和
c)分离L-赖氨酸。
15．大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC7lysE，保藏号为DSM12871。
16．大肠杆菌K-12菌株DH5α／pEC7dapBlysE，保藏号为DSM12875。
17．谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715／pJC23，保藏号为DSM12869。
18．谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MA16)，保藏号为DSM12867。
19．谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715aecD∷dapA(MC20)，保藏号为DSM12868。
20．谷氨酸棒杆菌678菌株，保藏号为DSM12866。
21．能够复制的DNA，具有SEQ ID No．5中所示的核苷酸序列MC20。
22．能够复制的DNA，具有SEQ ID No．6中所示的核苷酸序列MA16。
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