CN1276083C

CN1276083C - 用体内产生的ssDNA改变基因表达

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Publication number: CN1276083C
Application number: CNB008158568A
Authority: CN
Inventors: 查尔斯·A·康拉德; 陈印
Original assignee: CytoGenix Inc
Current assignee: CytoGenix Inc
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-04
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2020-10-04
Also published as: WO2001025419A1; AU7855300A; KR20020059608A; CR6613A; MXPA02003422A; CN1399679A; JP2003511025A; CA2386246A1; BR0014814A; IL148946A0; EP1222259A1

Abstract

本发明提供了经过在靶细胞中体内产生单链cDNA(ss-cDNA)改变靶细胞中靶核酸序列表达的方法。靶细胞用含有目的序列，反向串联重复序列，和反向串联重复序列3’端的引物结合位点的序列盒转染。靶细胞对该序列盒的转录产生RNA模板，该模板逆转录产生特定序列的ss-cDNA。逆转录酶/RNAse H的编码基因也可以转染进靶细胞。利用ss-cDNA的茎-环结构可修饰ss-cDNA以去掉所有的侧翼载体序列，该茎-环结构是由于反向串联重复序列使得ss-cDNA进行自身折叠形成双链DNA茎而形成的。双链茎含有一个或多个限制性核酸内切酶识别位点且保留了ssDNA形式的环由目的序列组成，该目的序列可以是任意所需的核苷酸序列。这种设计允许茎环中间体的双链茎被所需的相应限制性核酸内切酶裂解，然后以线性化单链DNA片断的形式释放出环部分，或目的序列。释放的(或裂解的)ssDNA片断含有上述双链茎5′上游或3′下游的最少(如果有的话)序列信息。所得的ssDNA与内源性靶核酸序列结合以改变该序列的表达，其用于如下治疗目的，例如使用核酸的双链或三链结合，定点诱变使基因灭活，经过与特定细胞蛋白质结合和干扰RNA剪接功能使细胞功能被破坏。

Description

用体内产生的ssDNA改变基因表达

本发明涉及用稳定的DNA构建体改变基因表达，该构建体通常称为序列盒，在该序列盒中插入核酸序列用作随后在原核或真核宿主细胞中产生该序列的模板，并涉及在真核宿主细胞内表达不含(或含有最少)侧翼序列的该序列的系统。该构建体或序列盒包括形成茎环中间体茎的反向串联重复序列，其在体内的功能是引起称为目的序列的序列作为单链DNA(ssDNA)序列表达，该ssDNA与靶基因结合或者发生相互作用以改变该基因的表达。本发明的表达系统经过茎环形成及随后的逆转录反应被茎终止或者经过茎环中间体的裂解从ssDNA去掉大多数或者全部相邻的质粒(或其它载体)序列。以该方法产生的ssDNA设计成可与任意内源性核酸序列靶互补和/或结合，从而靶向任意目的基因。

反义基因治疗已成功用于各种应用以下调基因功能。Jain，K.K.，基因治疗手册，New York：Hofgrefe & Huber Publishing(1998)。然而，该疗法至今具有在一定程度上严重降低这类疗法实用性的许多缺陷和局限性，包括反义分子半寿期短，非特异性效应，反义序列作用方式的不确定性，和在动物试验中潜在的毒性作用。例如，反义寡核苷酸(ODN)及其类似物必须静脉内用药，这就产生了细胞吸收和分布方面的问题(Cossum，P.A.，等，给大鼠静脉内用药后¹⁴C-标记的硫代磷酸寡核苷酸ISIS 2105的动向，J.Pharmacol.Exp.Ther.，267，1181-1190(1993)，Sands，H.，等，内部³H-标记的寡核苷酸的生物分布和代谢。II.3′，5′-封闭的寡核苷酸，分子药物学，47，636-646(1995))以及由高血浓度产生的毒性问题(Henry，S.P.，等，一种硫代磷酸寡核苷酸ISIS 2302在试验4-周的CD-1小鼠中的毒性评估，反义核酸药物开发，7，473-481(1997)，Henry，S.P.，等，硫代磷酸寡核苷酸ISIS 1082和ISIS 2105在Sprague-Dawley大鼠中亚急性皮内用药后的毒性情况比较，毒理学，116，77-88(1997))。

至今反义疗法中使用最多的反义ODN类似物是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。然而，硫代磷酸ODN倾向于非特异性结合血清和胞内蛋白质(Crooke，S.T.，等，一些新型寡核苷酸类似物在小鼠中的药物动力学特征，J.Pharmacol.Exp.Ther.，227，923-937(1996)，Gao，W.Y.，等，硫代磷酸寡核苷酸是人DNA聚合酶和RNase H的抑制剂：反义技术的含义，分子药物学，41，223-229(1992))，且在较高浓度时抑制RNase H的活性(Crooke，S.T.，等，大肠杆菌Rnase H的动力学特征：各种反义寡核苷酸-RNA双链的裂解，生化杂志，312，599-608(1995))。硫代磷酸ODN对RNA比DNA具有更低的Tm(每对碱基平均0.5℃)(Crooke，S.T.和B.LeBleu，反义研究和应用，BocaRaton：CRC Press(1993))。这种较低的Tm要求为了有效结合，硫代磷酸ODN一般比磷酸二酯DNA寡核苷酸更长。然而，ODN的长度增加可引起杂交特异性的丧失(Toulme，J.J.，等，反义技术：实用研究，见C.Lichtenstein和W.Nellen(编辑)，纽约：IRL出版，第39-74页(1997))。另外，甲基膦酸酯ODN不能激活RNase H的酶活性(Maher，L.J，等，寡核苷酸指导的三螺旋形成抑制DNA结合蛋白质，科学，245，725-730(1989)，Miller，P.S.，寡聚脱氧核苷酸：基因表达的反义抑制剂，见J.S.Cohen(编辑)，Boca Raton：CRC出版，第79页(1989))且被迅速清除(Chen，T.L.，等，在小鼠中单次静脉内注射后寡聚脱氧核苷酸甲基膦酸酯的动向和代谢，药物代谢动向，18，815-818(1990))。

基因治疗的另一方案是施用对基因和/或基因的转录产物具有催化活性的分子。核酶仅包含RNA分子，它能催化特定mRNA序列的裂解，且由于其催化能力据认为比反义ODN更有效(Woolf，T.M.，裂解或非裂解：核酶和反义，反义研究进展，5，227-232(1995))。核酶已被用作基因表达和病毒复制的抑制剂(Jain，出处同上(1998))。不同于反义ODN，核酶可以是内源性传递的，例如，经过使用病毒载体，或者是外源性传递的。然而，核酶由于在体内被RNases降解而具有有限的稳定性(Jain，出处同上(1998))。

使用体外选择，最近已证实一些小的单链DNAs催化RNA的裂解(Breaker，R.R.，催化性DNA：训练和查找工作，自然生物技术，17，422-423(1999))，从而提供了针对特定基因的靶向活性保证。专利和科技文献描述了许多已显示出具有催化活性的这些短脱氧核酸序列(参见，Breaker，R.R.和G.F.Joyce，化学生物学，1，223-229(1994)；Cuenoud，B.和J.W.Szostak，自然，375，611-613(1995)；Santoro，S.W.和G.F.Joyce，美国科学院院报，94，4262-4266(1997)；Faulhammer和M.Famulok，分子生物学杂志，269，188-203(1997)；Carmi，N，等，美国科学院院报，95，(1998)；Li，Y.和R.R.Breaker，美国科学院院报，96，2746-2751(1999)和美国专利号5,807,718和5,910,408)，包括称为“10-23 DNA酶”和充当，例如铜依赖性DNA连接酶和钙依赖性DNA激酶的其它ssDNA序列。已证实了该序列的催化效力，它在二价镁存在下以10⁹m^-1/分钟^-1裂解mRNA靶，从而提供定向破坏底物分子的机会(参见，例如，R.R.Breaker，出处同上(1999))。尽管本领域似乎认识到了该酶促活性用于治疗目的的潜力，但就目前所知，还没有现存的产生这些靶特异性酶促核酸序列以便在体内产生治疗效果的系统。

因此，没有现存的利用这些酶促核酸序列的有效催化活性的潜在优势改变基因表达的系统。因此，本发明的一个目的是提供一种指导ssDNA合成的DNA构建体，所述的ssDNA含有特异性裂解体内mRNA靶的序列以改变产生该靶mRNA的基因的表达。

由于二级结构折叠可能对ssDNA酶促序列的催化功能是关键的，因此本发明的另一目的是提供方法和DNA构建体，用于在真核细胞内产生ssDNA，该ssDNA包含具有任意目的核苷酸序列的这种DNA酶序列而没有不需要的间插或侧翼核苷酸碱基以便保护ssDNA针对靶核酸的酶促功能，用于改变包含该靶核酸的基因的表达。

本发明的另一目的是提供一种方法和用于该方法的DNA构建体，用于在真核细胞内产生含有DNA酶序列的ssDNA，用于克服使用标准寡核苷酸传递方法进行治疗时遇到的明显问题。

本发明的另一目的是提供一种方法和一种DNA构建体，用于在体内产生用作(但不限于)抑制性核酸的任意核苷酸序列的ssDNA，用于例如与mRNA以反义方式结合以下调感兴趣的基因产物或病毒基因产物，或者，例如，经过结合识别核酸序列的蛋白质结合并抑制特定细胞功能。

本发明的另一目的是提供一种方法和一种DNA构建体，用于产生设计成优先与双链体(天然DNA)结合以形成可干扰正常基因转录和调节的三链体结构的ssDNA。

本发明的另一目的是在真核细胞内产生ssDNA用于破坏一种或多种细胞功能的目的。

本发明还有一个目的是提供一种方法和一种DNA构建体，用于产生一种ssDNA，其中将二级结构设计为能使该ssDNA寡核苷酸结合和/或抑制或激活依赖于蛋白质的催化作用或诸如转录，翻译和DNA复制等核酸蛋白质相互作用的各种细胞功能。

本发明的另一目的是提供一种方法和一种DNA构建体，用于在体内产生ssDNA用于治疗应用的定点诱变或基因敲除。

本发明的另一目的是提供一种方法和一种DNA构建体，用于产生精确限定核苷酸组成的ssDNA，它有助于用于治疗目的的对基因组位点的特异性插入。

本发明还有一个目的是提供一种方法和一种DNA构建体，用于产生互补于任意内源性核酸靶的ssDNA用于改变包括该核酸序列靶的基因的表达。

本发明的另一目的是提供一种方法和用于该方法的DNA表达，用于在体内产生包含表现出针对mRNA靶的催化活性的序列的ssDNA以转染进真核细胞，用于克服以脂转染，直接细胞吸收，和/或显微注射直接施用ssDNA的传递障碍。

本发明的另一目的是在单个或二元质粒表达系统内提供体内产生ssDNA所必需的所有酶促功能，该ssDNA含有针对选定靶mRNA有酶促活性的序列。

本发明的另一目的是提供用于以产生治疗效果的方式传递一种抑制性核酸序列的方法和药学上可接受的组合物，该抑制性核酸包含对靶细胞有酶促活性的序列。

所列的本发明的目的并不打算列出本发明的所有目的。有许多由细胞基因组介导的其它细胞功能为了简洁和实用的目的在这里没有提及，它们容易经过体内产生的ssDNA来调节。例如，核酸外切酶消化ssDNA比双链DNA(dsDNA)容易得多。因此，本发明的另一目的是提供一种ssDNA构建体和体内产生该构建体的方法，该ssDNA构建体不像dsDNA那样在细胞中易被天然核酸外切酶降解。从这一例子可见所提供的本发明的一些目的的罗列是举例性的而并不打算限制本发明的范围。

这些目的通过改变靶细胞中内源性核酸靶序列的表达的方法来提供，该方法包括将由侧翼有反向串联重复序列的目的序列和3′引物结合位点(PBS)组成的序列盒导入靶细胞和从PBS开始逆转该录序列盒的mRNA转录子以便在细胞中释放单链cDNA转录子。目的序列含有的核酸序列产生当逆转录时结合内源性靶核酸序列以改变靶序列表达的核酸序列。

附图中说明了本发明的一些实施方案，其中图1是根据本发明在宿主细胞中产生ss-cDNA的示意图。

图2是图1所示的方法形成的茎-环中间体的示意图。

图3是含有本发明表达系统的第一实施方案中第一成份的pssXA质粒的示意图。为了制备pssXA，将逆转录酶(RT)和MboII基因亚克隆进哺乳动物表达载体pBK-RSV(Stratagene公司)且作为单个多肽进行表达。RT和MboII结构域由富含组氨酸的接头分开。

图4A和4B是含有本发明表达系统的第一实施方案中第二种成份的pssXB质粒的示意图(图4A)，它包括目的序列且含有(1)MoMuLV逆转录酶启动子区域，(2)用于亚克隆目的DNA序列的两个NotI位点，一个PacI位点和一个BamHI位点，和(3)串联反向重复序列IR-L和IR-R和pssXB质粒插入区的序列(图4B)。

图5A是含有本发明表达系统的第二实施方案且包括图5B所示10-23DNA酶序列的pssXC质粒的示意图。

图6A和6B代表含有本发明表达系统的第三实施方案的pssXD质粒(图6A)和pssXD质粒的放大部分(图6B)的示意图。

图7显示了pssXA转染的细胞裂解物中PCR测定RT活性的结果。泳道1和2：用pBK-RSV载体瞬时转染的A549细胞；泳道3和4：用pssXA瞬时转染的A549细胞；泳道5和6：pssXA稳定转染的A549细胞(E10)。PCR扩增前，在37℃下分别进行10分钟(泳道1，3，和5)或30分钟(泳道2，4，和6)逆转录反应。

图8显示了PCR分析检测ssDNA的测定结果。从用pssXB载体，pssXB-I或pssXB-II瞬时转染的E10细胞分离总RNA。PCR扩增前，总RNA在37℃下用S1核酸酶(泳道1和3)或RNase(泳道2，4，和5)预处理30分钟。泳道1和2：pssXB-I；泳道3和4：pssXB-II；泳道5：pssXB载体。

图9显示了用于检测ssDNA的斑点印迹分析的结果。1：用pssXB-I转染的E10细胞；2.用pssXB-II转染的E10细胞；3：E10细胞；4：A549细胞。

图10显示了定量根据本发明构建的能产生抗c-raf激酶的反义序列ssDNA生成型载体的Northern印迹的柱形图。泳道1-3：转染24小时后收获的细胞；泳道4-6：转染48小时后收获的细胞。泳道1：用pssXB载体转染的E10细胞；泳道2和5：用pssXB-1转染的E10细胞；泳道3和6：用pssXB-II转染的E10细胞。

图11显示了在用对照pssXD-I或含有c-raf DNA酶序列的pssXD-II转染的A549细胞中检测ssDNA的斑点印迹分析的结果。在S1核酸酶存在下由于ssDNA酶被S1核酸酶特异性降解而不能产生可检测的信号。

图12显示了测定在用pssXD-II转染的A549细胞中表达的ssDNA是否改变c-rafmRNA水平的定量RT-PCR的结果。泳道1：对照pssXD-I；泳道2：pssXD-II。

图13显示了在用pssXD-I或pssXD-II转染的A549细胞中抑制c-raf蛋白表达的Western印迹结果。泳道I：pssXD-II；泳道2：对照pssXD-I；泳道3：未转染的细胞。

图14显示了经过抑制c-raf基因表达而诱导细胞凋亡的基因组DNA裂解活动的Western印迹结果。泳道1：pssXD-II；泳道2：对照pssXD-I；泳道3：未转染的细胞。

图15显示了经过抑制c-raf基因表达而诱导细胞凋亡的PARP裂解活动的Western印迹结果。泳道1：pssXD-II；泳道2：对照pssXD-I；泳道3：未转染的细胞。

在本发明的说明书中，描述了在酵母，原核细胞，和/或真核细胞中体内产生几乎任意预定或所需核苷酸碱基组成的，含有或不含侧翼核苷酸序列的单链脱氧核糖核酸(ss-cDNA)寡核苷酸的方法和核酸构建体用于改变靶基因的表达。描述了使用生物学合成而不是体外，或者人工合成具有所需核苷酸碱基组成的ss-cDNA的方法和构建体。由于在这些方法中使用了生物学反应，即酶促反应，因此，它们可应用于任何体内系统。

在一个实施方案中，本发明的表达系统含有一种载体，其被设计成可在哺乳动物细胞内产生任意感兴趣的序列，其为ss-cDNA分子，优选不含大多数相邻载体序列的ss-cDNA分子(本文使用的术语“载体”是指用于传递和操作合成的和/或天然存在的核酸序列的质粒或已修饰的病毒或非病毒重组生物学构建体)。该载体系统含有用于在宿主细胞中产生ss-cDNA的所有必需酶促功能和信号指导。转移了本发明载体的宿主细胞由真核启动子起动而产生RNA转录子(图1)，它被用作指导任意所需单链DNA序列(“目的序列”)合成的模板。

更具体地说，本文描述了一种第一表达系统，其中的载体含有两个质粒，它们被共转染进可以是酵母或任何原核或真核细胞的合适的宿主细胞中以便在该细胞中产生感兴趣的ssDNA序列用于改变基因表达。还描述了一种第二表达系统，它含有携带目的序列的单个质粒，该质粒被转染进合适的宿主细胞以便在该细胞中产生感兴趣的ssDNA序列用于改变基因表达。

使用本文所述的表达系统体内产生的ssDNA可以是抑制性核酸。抑制性核酸可以是从mRNA模板合成的ssDNA或者是mRNA模板本身，它可以特异性地结合互补核酸序列。经过与合适的靶核酸序列结合，形成RNA--RNA，DNA--DNA，或RNA--DNA双链体或三链体。更常见的是，这些核酸通常称为“反义”，因为它们通常互补于基因的有义链或编码链，但在细胞中也使用“有义”序列用于治疗目的。因此，本文使用的术语“抑制性核酸”是指“有义”和“反义”核酸两者。

抑制性核酸与靶核酸结合后改变靶核酸的功能。这种改变(通常是一种抑制性效应)由例如，阻断DNA转录，加工或在mRNA上添加poly(A)，DNA复制，翻译，或者启动细胞的抑制性机制(例如启动RNA降解)而产生。因此，抑制性核酸方法包含许多不同的方案来改变基因表达。这些不同类型的抑制性核酸技术在Helene，C.和J.Toulme，生物化学和生物物理学报，1049，第99-125页，(1990)中描述，下文称为“Helene和Toulme”，且以该具体文献作为整体在本文中引用。

简单地说，抑制性核酸治疗方案可分为(1)靶向DNA序列的方案，(2)靶向RNA序列(包括前体-mRNA和mRNA)的方案，(3)靶向蛋白质的方案(有义链方案)，和(4)引起诸如ssDNA酶，包括本文中称为“10-23酶”的靶核酸的裂解或化学修饰的方案。第一种方案包含几种类型。核酸设计成可与双链DNA的大沟结合形成三螺旋或“三链体”结构。或者，抑制性核酸被设计成与复制或转录期间双链DNA打开产生的单链DNA区域结合。更常见的是，抑制性核酸被设计成与mRNA或mRNA前体结合。也可使用抑制性核酸防止前体-mRNA的成熟。抑制性核酸可设计成干扰RNA加工，剪接或翻译。在第二种方案中，抑制性核酸靶向mRNA。在该方案中，抑制性核酸设计成特异性抑制编码蛋白的翻译。使用第二种方案，抑制性核酸用于经过抑制编码关键蛋白质的mRNA翻译来选择性抑制某些细胞功能。该抑制性核酸的例子是互补于c-myc mRNA区域的序列，它在过度表达c-myc原癌基因的人早幼粒细胞白血病细胞系HL60中抑制c-myc蛋白质表达(Wickstrom E.L.，等，美国国家科学院院报，85，第1028-1032页，(1988)和Harel-Bellan，A.，等，实验医学，168，第2309-2318页，(1988))。正如在Helene和Toulme中所述，靶向mRNA的抑制性核酸已显示出通过抑制编码蛋白翻译的几种不同机制起作用。

抑制性核酸也可使用第三种方案，它设计基因的“有义”链或mRNA以捕获或竞争酶或者如Helene和Toulme中所述结合mRNA翻译中涉及的蛋白质。最后，抑制性核酸可用于诱导靶基因或mRNA的化学灭活或裂解。例如，经过诱导细胞内抑制性核酸和靶核酸之间的交联并通过本文所含的方法(即，通过插入本发明的序列盒中的具有酶促活性的序列裂解靶核酸)发生化学灭活。

简单地说，在第一个方面，本发明包含适用于传递进细胞以便在体外或体内产生ssDNA用于改变基因表达的一组遗传元件，含有这组遗传元件的表达系统，和含有这组遗传元件的一种或多种稳定转染的细胞。这组遗传元件被插入一种表达系统中用于传递进细胞且它包括

(A)一种RNA依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)基因，和

(B)一种序列盒，包括(1)一个反向串联重复序列(IR)，(2)位于(a)反向重复序列(IR)之间，(b)IR的3′端，或(c)在IR之间和IR的3′端两者均有的一个或多个目的序列和(3)一个图2所示的位于IR3′端的逆转录酶引物结合位点(PBS)。

尽管不是必需的，该表达系统优选还包括用于体内转录这些成份的功能和信号指导以及用于翻译逆转录酶(RT)基因的功能和信号指导。任选包含在本发明的这组遗传元件中的其它元件可包括通常与RT基因相联的一个或多个RNAse基因，一个限制性核酸内切酶(RE)基因(用于下文所述的目的)，一个用于在真核细胞中表达以便使目的序列所产生的mRNA含有poly(A)尾的下游多聚腺苷酸化信号序列(见图1)，和一个当线性化的ssDNA折叠成相应二级构型时具有酶促活性的DNA序列。在这组遗传元件的一个实施方案中，DNA酶促序列位于目的序列内，不管该目的序列位于反向重复序列(IR)之间还是位于IR的3′端和PBS之间都是如此，但本发明并不局限于此。

在本文所述的表达系统的第一个实施方案中，提供的载体系统含有两种质粒，适用于传递进细胞以便在体内产生ssDNA的上述一组遗传元件包括RNA-依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)基因，另外还含有用组氨酸-脯氨酸接头与限制性核酸内切酶基因连接的RNAse H基因。构建这些基因并插入含有转录和翻译所需控制元件以及多聚腺苷酸化加尾序列的质粒载体中。该质粒在本文中称为“A”质粒，pssXA，如图3所示。构建了第二种质粒，即“B”质粒，在本文所述的实施方案中，它含有序列盒的上述三种元件，即，与逆转录酶(RT)匹配的引物结合序列(PBS)，目的序列(SOI)，和反向重复序列(IR)。在第二种质粒中，以图4所示的质粒pssXB为例，SOI位于反向串联重复序列之间，或者在PBS的5’位置(相对于mRNA转录子)，PBS位于mRNA转录子的最3’端。换句话说，SOI位于(1)IR之间，(2)IR和PBS之间，和/或(3)IR之间和IR与PBS之间两者都有，如下所述，本文描述了两种B质粒，一种(pssXB-I)在IR之间(例如，NotI位点)并含有SOI，另一种(pssXB-II)在IR和PBS之间并含有SOI(例如，克隆在PacI/BamHI位点中的这种)。与质粒A一样，质粒B也包括一组转录控制元件。然而，在本文另一优选的实施方案中，B质粒不包括(或不需要)翻译控制元件，因为从该构建体不产生蛋白质产物。

在本文所述的另一实施方案中，本发明的表达系统含有图5和6所示的单个质粒载体，且分别命名为质粒pssXC和pssXD，其中插入了上述的一组遗传元件。上述B质粒的成份，例如PBS，SOI，和IR，在C质粒中位于RT多聚蛋白的3′非翻译部分。换句话说，当C质粒的RT-RNAse H成份在合适的启动子控制下转录时(在本文所述的实施方案中，使用RSV启动子)，所得的mRNA转录子含有RT-RNAse H多聚蛋白的编码区，且在终止信号处结束翻译时，其它mRNA转录子含有(在该翻译蛋白的3’端)来自B质粒的元件，以及3′下游信号事件的多聚腺苷酸化信号，它保持了相对于RT-RNAse H成份的完整性。

本文所述的具体单个质粒表达系统不含限制性核酸内切酶(RE)基因，因此不会消化由反向重复序列形成的茎环中间体的茎。因此，SOI(包括DNA酶)仅在IR的3′位置插入C或者D质粒中，因为转录子遇到茎环中间体的相对稳定的茎且不能继续从mRNA转录子转录ss-cDNA，使得ss-cDNA产物的成熟前截断而去掉不需要的载体序列。更具体地说，正如在下面说明书中显而易见的，各SOI仅在pssXC和pssXD质粒的PacI/BamHI限制性位点内插入。

从下面对B，C和D质粒的描述显而易见的是，质粒包含用于插入SOI的克隆位点。在本文所述的B质粒的优选实施方案中提供了NotI位点(位于IR之间)和PacI/BamHI(IR的3′端，例如，在IR和PBS之间)位点。本文所述的C和D质粒仅包括用于该目的PacI/BamHI位点。然而，从本说明书受益的本领域的技术人员将认识到可选择这些具体的克隆位点用于本文所述的具体系统且其它的克隆位点对于该目的同样有用。本文所述的含有A质粒的两个质粒载体系统并不打算包括SOI，但本领域的技术人员也将认识到如果使用两个质粒载体系统，本发明的这组遗传元件中的元件，且特别是SOI，可方便地插入任一质粒中。

本文称为序列盒的核酸序列提供了在靶细胞中合成ss-cDNA的模板。它是包括SOI，IR，和PBS的元件。对于本发明的这组遗传元件中的其它元件也是如此，该遗传元件优选受到位于遗传元件上游的合适的广谱或者组织特异性启动子/增强子，例如CMV启动子，或启动子/增强子的组合的调节。对于其它遗传元件的情况也是如此，启动子/增强子可以是组成型或者是诱导型启动子。从本说明书受益的本领域的技术人员将认识到可使用许多其它的真核启动子帮助控制包括SV-40，RSV(非细胞类型特异性)或组织特异性胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的SOI的表达。

用于起动cDNA合成的引物结合位点(PBS)位于3′IR和多聚腺苷酸化信号之间。PBS是互补于真核靶细胞内转移RNA(tRNA)的序列。在本文所述小鼠莫洛尼氏逆转录酶(MoMULV RT)与本发明结合使用的情况中，PBS利用脯氨酸tRNA。与本文所述的本发明目前优选的实施方案结合使用的PBS取自小鼠莫洛尼氏病毒的实际18个核苷酸序列区。Shinnick，T.M.，等，莫洛尼氏鼠类白血病病毒的核苷酸序列，自然，293，543-548(1981)。对于按下述也进行了试验的来自人免疫缺陷病毒的RT基因，所用的PBS取自HIV的核苷酸序列。Y.Li，等，病毒学杂志，66，6587-6600(1992)。简单的说，使用与具体RT匹配的任意PBS用于该目的。PBS被靶细胞内源性引物tRNA专一性识别。各tRNA具有识别mRNA转录子上编码氨基酸的特定序列(即，密码子)的能力，且具有与特定氨基酸共价连接的能力(即，当与特定氨基酸结合时tRNA变成“装载的”)。然而，当与mRNA转录子PBS结合且不与氨基酸共价连接(即，“未装载的”)时，引物tRNA可用于通过RT启动ssDNA合成。例如，在本文所述的实施例中使用的MoMULV RT识别并使用未装载的赖氨酸tRNA，而后者又识别并结合其在PBS中的特有序列。因此，插入本发明的表达系统中的各PBS必须含有被引物tRNA识别的特有序列，且引物tRNA必须是被所用的特定RT识别的引物tRNA。

根据本发明可使用其它逆转录病毒RT/RNAse H基因，优选RT/RNase H基因是受表达在人细胞中的诸如CMV或RSV启动子等合适上游真核启动子/增强子调节的RT/RNase H基因。适用于本发明的RNA-依赖型DNA聚合酶/RT基因包括来自逆转录病毒，乙型肝炎、丙型肝炎病毒株，细菌逆转录子元件，和从各种酵母和细菌种类分离的逆转录子的那些基因。正如在自然界所发现的，这些RNA-依赖型DNA聚合酶在相同编码转录子内通常具有相关RNase H成份。然而，本发明不需要用于特定RT的天然存在的RNase H基因。换句话说，本领域的技术人员从本说明书将认识到RT和RNase H基因的各种组合可剪接在一起用于本发明以实现该功能且对本领域的技术人员而言以所需方式发挥功能的这两种酶系统的改良和/或混合形式是可得到的和/或已知的。本领域的技术人员还将认识到靶细胞本身具有足够的内源性RNase H以实现该功能。同样，本领域的技术人员将认识到靶细胞本身可具有例如，来源于以前的逆转录病毒感染的足够内源性RT活性以实现该功能。

RT/RNase H基因还优选包括下游多聚腺苷酸化信号序列以使得从RT/RNase H基因产生的mRNA包括能使mRNA稳定的3′poly(A)尾。正如本领域的技术人员已知的，可得到多个poly(A)尾且按常规用于产生被表达的真核基因。

本领域的技术人员还将认识到也可使用不是上面所列的许多组织特异性或广谱启动子/增强子，或启动子/增强子的组合以帮助调控RT/RNAse H基因，RE基因(如果使用的话)，和目的序列。尽管不必列出所有可得到的启动子/增强子来例证本发明，如上所述，启动子/增强子可以是组成型或诱导型且可包括这里列出的CMV或RSV(非细胞类型特异性)或GFAP(组织特异性)启动子/增强子和许多其它病毒或哺乳动物启动子。适用于本发明的序列盒的代表性启动子/增强子可包括，但不限于，HSVtk(S.L.McKnight，等，科学，217，第316页(1982))，人β-球蛋白启动子(R.Breathnach，等，生物化学年鉴，50，第349页(1981))，(-肌动蛋白(T.Kawamoto，等，分子细胞生物学，8，第267页(1988))，大鼠生长激素(P.R.Larsen，等，美国国家科学院学报，83，第8283页(1986))，MMTV(A.L.Huang，等，细胞，27，第245页(1981))，腺病毒5 E2(M.J.Imperiale，等，分子细胞生物学，4，第875页，(1984))，SV40(P.Angel，等，细胞，49，第729页(1987))，(-2-巨球蛋白(D.Kunz，等，核酸研究，17，第1121页(1989))，MHC I型基因H-2kb(M.A.Blanar等，EMBOJ.，8，第1139页(1989))，和甲状腺刺激激素(V.K.Chatterjee，等，美国国家科学院院报，86，第9114页(1989))。

细胞中产生的RT使用下文所述的含有SOI的遗传元件作模板合成互补DNA(cDNA)。RT的RNase H活性降解RNA/cDNA杂交体的mRNA模板成份以便在体内产生ss-cDNA。

编码RE的基因(用于两质粒表达系统且不是该系统的必须成份)可以是编码REs的几个基因中的任一个，且优选受诸如上文列出的一个或多个组成型或诱导型广谱和/或组织特异性启动子/增强子控制的那些基因。所试验的具体REs是MboII和FokI，但从本说明书受益的本领域的技术人员将认识到在IR中可包含任意RE(I，II，IIS，或III型)位点。这些酶“剪下”或消化下述茎环中间体的茎以线性化SOI成为单链DNA。

尽管通过位于限制性核酸内切酶基因上游的诸如用于在人细胞中表达的CMV或RSV启动子等合适组成型或诱导型启动子/增强子可调控RE基因的表达，但在质粒pssXA中，RE基因(MboII)与RT-RNAse H多肽连接。RE基因优选还包括下游多聚腺苷酸化信号序列，以便来自RE基因的mRNA转录子具有3′poly(A)尾。

本发明的序列盒还包括反向串联重复序列(IR)。以RNAse H消化mRNA-cDNA异源双链体的mRNA并释放ss-cDNA后，IR以美国专利号6,054,299所述的方式引起ss-cDNA自身折叠以形成茎环结构的茎，该茎结构由双链反向平行的DNA组成，序列盒在细胞中转录后且基因转录产生的RT/RNase H从细胞中的mRNA转录子产生目的ss-cDNA序列后如图2所示。被RE基因产生的RE酶切的一个或多个RE位点(对于那些包含RE基因的质粒的情况)可设计成双链部分，即IR，它形成茎环中间体的茎。转录所产生的ss-cDNA具有茎侧翼的5′和3′编码区(由IR组成)和含有SOI的环。然后茎被许多RE酶中的任意一个酶切(也称为消化或裂解)，该RE酶识别设计进茎中的酶切位点(注意，即使在本发明的载体系统中不包括RE基因，也可将核酸内切酶识别位点设计在茎中)以释放ss-cDNA环(见图1)。不形成任何表观双链体DNA的ss-cDNA环部分不受RE活性的影响，因为REs仅识别双链DNA作为靶底物。

如上所述，本领域的技术人员将认识到如果需要从位于PBS和IR之间的SOI产生ssDNA，由于序列盒的转录在IR形成的茎处终止，因此RE位点不必设计进形成茎环中间体茎的IR中。另一选择是将IR设计成含有真核，原核，或病毒蛋白质的DNA结合位点，它用于竞争性滴定出所选细胞蛋白。根据选择的IR的碱基组成在IR中可包括限制性位点或其它序列特异性元件的组合以便产生线性化的或精确酶切的ssDNA的茎环中间体形式。在IR中一般优选使用合成构建的序列特异性元件，因为天然存在的反向重复序列不可能具有合适排列的限制性位点。

如上所述，含有本发明的这组遗传元件的元件之一的序列盒也包括具有催化活性的DNA序列。由于在序列盒中包含所谓的“DNA酶”(且在本文所述的实施方案中，DNA酶位于目的序列内)，本发明用于当目的序列用作抑制性核酸(反义序列)合成的模板时特别具有优势。因此，本文列出的实施例描述了图5B所示的反义SOI的生产，该SOI包含对mRNA有酶促活性的序列，该序列包括设计成特异性结合被反义ISIS 5132靶向的c-raf mRNA的3′非翻译区的c-raf裂解酶(Monia，B.P.，等，自然医学，2，668-675(1996)，在此将该具体文献以其全文引入本说明书中)。这两种9bp靶特异性结合臂的侧翼是15bp的催化域(Santoro，S.W.和G.F.Joyce，裂解RNA的DNA酶的机制和实用性，生物化学，37，13330-13342(1998)，也将该具体文献以其全文引入本说明书中)。向DNA酶寡核苷酸中加入合适的限制性位点，以便它们可插入NotI位点或者PacI和BamHI位点，所得的质粒分别命名为pssXB-I和pss-XB-II。

本领域的技术人员将认识到本发明并不局限于反义序列，该反义序列不必含有具有催化活性的核酸序列，且抑制性核酸序列也可以是上述任何其它形式的抑制性核酸序列。选择上述SOI用于示范本发明，因为A549肺癌细胞系统中的c-raf激酶已被充分鉴定(Monia，等，出处同上(1996))。Raf蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已显示它充当MAP激酶信号途径内ras蛋白的直接下游效应器用于下游MEK1/MEK2的激活和ERK1和ERK2的随后激活(Daum，G.，等，大鼠激酶的里里外外，生物学科学动态，19，474-480(1994))。已证实许多实体瘤和白血病在ras中含有突变或者MAP激酶信号途径上调。诸如craf相关肿瘤等信号转导途径是肿瘤学治疗的有吸引力的靶子且已证实上述硫代磷酸ODN ISIS 5132是有效的反义抑制剂(Monia，等，出处同上(1996))。另外，已显示出ISIS 5132诱导细胞凋亡(Lau，Q.C.，等，癌基因，16，1899-1902(1998)，也将该具体文献以其全文引入本说明书中)且似乎代表针对该肿瘤的潜在有效治疗。该反义ODN最近已进入I期临床试验(O′Dwyer，P.J.，等，用c-raf-1反义寡核苷酸ISIS 5132(CGP 69846A)治疗的病人中C-raf-1的排除和肿瘤反应，临床癌症研究，5，3977-3982(1999))，且证明可用于治疗c-raf-相关肿瘤。已克隆进质粒用于使用本发明的表达系统表达的其它SOIs包括插入5′和3′互补序列之间的具有10-23 DNA酶序列(Santoro和Joyce，出处同上(1997))的h-ras反义结合序列的第23个密码子的部分序列，插入5′和3′互补序列之间的具有10-23 DNA酶序列的多效营养因子(pleiotropin)反义结合序列的部分序列，和插入5′和3′互补序列之间的具有10-23 DNA酶序列的SIV序列tat反义结合区的部分序列。尽管这些序列中的每一个均包括DNA酶序列，但本领域的技术人员从本说明书中将认识到DNA酶序列不必包括这些，或者任何其它的SOIs。

在本文所述的改变基因表达的方法中使用的具有酶促活性的核酸序列是10-23 DNA酶(Santoro和Joyce，出处同上(1997))。酶序列在两个位置之一或者两个中插入序列盒，例如，(a)IR和内部SOI之间(在NotI位点)或者(b)位于IR的3′和PBS的5′端的第二SOI内部(在PacI/BamHI位点)。在每一种方式中，所得的aptamer对SOI靶具有特异性且因此用于靶向其它DNA序列，mRNA序列，和任何其它合适的底物以抑制或改变DNA或mRNA剪接的机制，或者甚至以特异性方式直接改变细胞基因组。

本领域的技术人员从本说明书将认识到具有酶促活性的任何DNA序列当插入本发明的序列盒时将发挥功能用于所需目的。在文献中已报导了具有酶活性的许多核酸序列，包括：

具有RNAse活性的序列，例如，所谓的“10-23”和“8-17酶”(Santoro，S.W.和G.F.Joyce，出处同上(1997))和其它金属依赖型RNAses(Breaker，R.R.和G.F.Joyce，生物学化学，1，223-229(1994)及Breaker，R.R.和G.F.Joyce，生物学化学，2，655-660(1995))及组氨酸依赖型RNAse(Roth，A.和R.R.Breaker，美国国家科学院院报，95，6027-6031(1998))；

具有DNAse活性的序列，例如铜依赖型DNAse(Carmi，N.，等，化学生物学，3，1039-1046(1996)，Carmi，等，出处同上(1997)；Sen，D.和C.R.Geyer，化学生物学流行观点，2，680-687(1998))和在Faulhammer，D.和M.Famulok(分子生物学杂志，269，18-203(1997))中报导的需要二价金属离子作为辅因子或不依赖于二价金属离子水解底物的DNAses；

具有DNA连接酶活性的序列，例如铜依赖型DNAse(Breaker，R.R.，化学回顾，97，371-390(1997))和锌依赖型E47连接酶(Cuenoud.B.和J.W.Szostak，自然，375，611-613(1995))；

具有DNA激酶活性的序列，例如钙依赖型DNA激酶(Li，Y.和R.R.Breaker，美国国家科学院院报，96，2746-2751(1999))；和

具有RNA激酶活性的序列，例如钙依赖型DNA激酶(Li，Y.，出处同上(1999))。

一般来说，它是来自生理学条件的优选用于本发明序列盒中的那些具有酶促活性的DNA序列。

当含有本发明的这组遗传元件的元件插入载体中用于在靶细胞中表达时，优选该载体含有其它专用的遗传元件以帮助鉴定携带载体和序列盒的细胞和/或增加含有这组遗传元件的序列盒的表达水平。专用的遗传元件包括选择标记基因，以便载体可在原核系统中转化和扩增。例如，最常用的选择标记是赋予细菌(例如，大肠杆菌)对诸如氨苄青霉素，氯霉素，卡那霉素(新霉素)，或四环素的抗生素抗性的基因。还优选载体含有专用的遗传元件用于随后的转染，鉴定和在真核系统中的表达。为了在真核细胞中表达，可使用赋予细胞对抗生素或其它药物的抗性或者改变细胞的表型，例如形态学改变，接触抑制的丧失或生长速率增加的多种选择方案(例如，中国仓鼠卵巢：CHO)。在真核系统中使用的选择标记包括，但不限于，对Zeocin的抗性标记，对G418的抗性，对氨基糖苷类抗生素的抗性，或表型选择标记，例如β-gal或绿色荧光蛋白。

将这些成份插入含有本发明的表达系统的质粒中产生了两种方便的方法用于在产生ssDNA后去掉预定的载体序列。在第一种方法中，从PBS逆转录序列盒，且IR之间的SOI含有ssDNA茎环中间体的环部分，当含有IR的核苷酸配对形成茎环载体的茎时产生该ssDNA茎环中间体，茎含有一个RE位点，且用合适的RE消化后，环作为不含(和/或含有最小的)侧翼序列的线性化单链cDNA释放。在第二种方法中，从PBS逆转录序列盒且包含在序列盒IR的3’端的SOI同样地转录，但在IR的核苷酸配对形成的茎环结构的茎处终止逆转录。在每一种方法中，产生不含(和/或含有最少)侧翼序列的ssDNA。如果需要利用第二种方法产生ssDNA，用形成茎的IR设计序列盒，该茎比根据本发明的第一方面消化茎产生ssDNA时所需要的茎更稳定(例如，可将IR设计成不含RE位点)。经过设计具有形成根据本发明的第一个方面容易变性的茎的IR的序列盒，在从第二SOI(如果它被设计进序列盒)到位于IR之间的SOI上进行逆转录。因此逆转录酶cDNA转录子在茎结构的3’端的这种“成熟前终止”提供了限制体内产生的ss-cDNA含有间插载体序列的第二种方法。作为中间体的茎在稳定性上允许产生第一和第二SOI。

本领域的技术人员从本说明书显而易见的是完整茎环ss-cDNA结构在许多应用上与线性化的ss-cDNA形式功能相似。因此，使用不含限制性核酸内切酶基因和相关调控元件和/或具有缺乏相应的限制性核酸内切酶位点的目的序列的序列盒也是具有优势的。

本领域的技术人员从本发明的优选实施方案的说明中显而易见的是可制备编码具有“修剪的”茎环结构的ss-cDNA的序列盒。设计在SOI侧翼的IR中编码RE位点以便用相应的RE消化茎部分(双链体形成后)以酶切含有dsDNA的茎，酶切方式为去掉部分茎和相连的侧翼序列，且留下使转录子保留上述茎环结构的足够双链体DNA。这种ss-cDNA结构通过保留双链形式的ssDNA“末端”对细胞内核酸酶更具抗性。

本领域的技术人员从本发明优选的实施方案的说明中显而易见的还有茎(双链DNA)可设计成含有一个预定序列(或多个序列)，即，aptamers，它被特异性DNA结合蛋白识别并结合。在其它用途中，该茎结构在细胞中用作竞争剂以滴定出调控特定基因功能的选定蛋白。例如，根据本发明在细胞中产生的ss-cDNA茎环含有诸如腺病毒Ela的选定正转录因子的结合位点。腺病毒Ela与其它癌基因一样通过影响细胞编码的转录因子的活性调控一些腺病毒和细胞基因的表达，导致将正常细胞改变成转化细胞。Jones，等，基因开发，2，267-281(1988)。因此，根据本发明产生的茎环中间体的双链茎设计成具有“结合上”该转录因子的功能，防止该蛋白质结合启动子，且因而抑制特定有害基因的表达。对本领域的技术人员而言，显而易见的是双链茎结构可任选含有多个结合位点，例如，被有效调控特定基因表达的各种转录因子识别的位点。例如，已发现腺病毒Ela通过佛波酯反应元件抑制胶原酶基因的转录，该元件是一种启动子元件，负责以12-O-十四酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)，以许多其它促细胞分裂原，和以ras，mos，src和trk癌基因诱导转录。该机制涉及抑制转录因子家族AP-1的功能。Offringa，等，细胞，62，527-538(1990)。可将编码茎环中间体的“环”部分的所需核苷酸序列插入遗传元件中以实现所需的抑制功能，例如，反义结合，基因的下调，和本文所述的等等功能。

在本领域的技术人员可认识到的另一方面中，本发明用于构建复杂的二级ssDNA结构，该结构在二级结构折叠构象的基础上对cDNA转录子提供生物学反应。该二级结构可改造成用于任意几种功能。例如，目的序列可包括(但不限于)插入单链cDNA转录子的环部分以形成诸如在腺伴随病毒长末端重复或逆转录转座子中发现的那些结构的所谓“三叶草叶”或“坩埚”状结构的序列。在合适情况下，该结构以位点特异性方式整合进宿主基因组中。

由于本发明的序列盒适用于插入多种商业上可获得的传递载体中用于哺乳动物和人类的治疗目的，因此可根据具体靶细胞选择的载体使用多种传递途径。例如，病毒载体常用于转化病人细胞并将DNA导入基因组。在一个间接方法中，携带新遗传信息的病毒载体用于感染从身体取出的靶细胞且然后再将该感染细胞植入体内(即，来自体内)。已报导了可将基因直接体内转移至新生(postnatal)动物体内用于配制包裹在脂质体中的DNA和包埋在含有病毒包膜受体蛋白的蛋白脂质体中的DNA。Nicolau，等，美国国家科学院院报，80，1068-1072(1983)；Kaneda，等，科学，243，375-378(1989)；Mannino，等，生物技术，6，682-690(1988)。也已经描述了用磷酸钙共沉淀的DNA获得的阳性结果。Benvenisty和Reshef，美国国家科学院院报，83，9551-9555(1986)。用于促进含本发明这组遗传元件的表达系统给药的其它系统包括静脉内，肌肉内，和皮下的注射，以及直接肿瘤内和腔内注射。当插入选定的表达系统时，序列盒也有利于通过局部，经粘膜，直肠，口服，或吸入型传递方法给药。

使用本发明的序列盒有利于传递反义，三链体，或任何其它抑制性核酸或目的单链核苷酸序列，可使用已知的消化和连接技术将特定目的序列剪接进序列盒(在反向串联重复序列之间或在PBS与反向串联重复序列之间)。从本说明书受益的本领域的技术人员将认识到用于在真核细胞内表达的上述信号可用本领域已知的方式根据具体目的序列进行修饰。例如，一种可能的修饰是改变启动子以便给需要表达目的序列的系统中的序列盒提供有利的表达特性。有太多可能的启动子和其它信号，且它们也依赖于选择了目的序列的具体靶细胞，因此不可能列出对于具体靶细胞和目的序列优选的所有潜在的增强子，诱导型和组成型启动子系统，和/或poly(A)加尾系统。

在一个特别优选的实施方案中，本发明采用了试剂盒的形式，该试剂盒由质粒组成，该质粒具有克隆进其中的上述RNA-依赖型DNA聚合酶和RE基因以及可便于试剂盒的用户插入特定SOI的多克隆位点(MCS)。插入SOI的克隆位点位于上述IR之间。然后从细胞培养物中纯化所得的质粒，质粒可在该培养物中维持，冻干或者保存用于包装和装运给用户。该试剂盒优选还包括用于克隆SOI进MCS的RE，连接酶和其它酶，以及用于将SOI连接进质粒的合适的缓冲液和质粒图谱。

在本文所述的具体实施方案中，通过用命名为A和B，分别设计和构建成包括上述成份的两个质粒共转染细胞，或者通过单个C或D质粒将SOI传递进宿主细胞。在两种质粒系统中，B质粒编码包括SOI的序列盒，SOI嵌套在包含IR的侧翼序列内或者位于IR与PBS之间，该PBS提供介导由mRNA转变成ssDNA的转录后加工信号。将B质粒的第一基因产物加工成ssDNA以及去掉载体序列和加工信号，特别是RT/RNAse H和RE(如果使用)，所需的活性从A质粒表达。由这些成份的体内转录产物相互作用释放的单链DNA序列以反义和三链体方案自由结合细胞内靶，例如mRNA种类和DNA启动子。

如上所述，本文所述的B质粒包括克隆位点(NotI位点用于本文所述的B质粒)，该位点之间放入任意DNA SOI(如上所述，在本文所述的实施例中，SOI是包括10-23酶序列的c-raf激酶的反义序列，但如上所述，使用本文所述的表达系统体内产生的其它序列包括“填充序列”，或检测序列，端粒重复序列，h-ras，血管生成生长因子多效营养因子(pleiotrophin)的编码区，和tat的编码区(来自SIV))。克隆位点的侧翼是指导从启动子(在本文所述的B质粒中使用CMV启动子)产生的一级mRNA转录子加工成所需单链抑制性核酸的信号，将所需的SOI克隆进B质粒后，将A和B质粒共转染进选定的细胞系用于组成型表达ssDNA。同样，在本文所述的单质粒表达系统中，将SOI克隆进该质粒中并转染进细胞系用于进一步加工。不论上述这组遗传元件中的元件在两个(或更多个)质粒之间如何分布，或者该元件是否都包含在单个质粒中，在单链DNA区(即，SOI，IR，和PBS)转录后都按三步进行加工：

(1)以RT逆转录质粒RNA转录子，在本文所述的实施方案中RT是由A，C，或D质粒表达的RT(在本文所述的实施方案中，RT是MoMuLV RT)，从位于SOI(SOI任选包括具有酶促活性的序列)3’端的引物结合位点开始逆转录，IR，和PBS如图1所示；

(2)以RT多聚蛋白的RNAse H活性或以内源性RNAse H活性对所得异源双链进行RNAse H消化以便单链DNA前体从其RNA互补链上释放；和

(3)经过消化茎环中间体中由含有IR的碱基按Watson-Crick碱基配对形成的茎或者由自身互补性IR形成茎环二级结构使cDNA转录子于成熟前终止来去掉侧翼序列。

本领域的技术人员从本说明书将认识到SOI侧翼的具体克隆位点，具体RT，RE(如果使用的话)，启动子，PBS，和本发明的这组遗传元件中的所有其它元件可根据表达ssDNA的具体SOI和/或系统进行选择。

实施例

除非另有说明，在下面所列的实施例中使用按Seabrook，等(1989)(J.Seabrook，等，分子克隆：实验室手册(第2版)，冷泉港出版(1989)，下文称为“Maniatis，等(1989)”)和Ausubel，等，(1987)(F.M.Ausubel，等，分子生物学流行方法，纽约：John Wiley & Sons(1987))所述的标准技术，这两篇文献以该具体参考文献的整体在此引用。应明白在本发明的方法中也可使用以天然方法和用不同酶产物或系统设计的人工方法产生ssDNA的其它方法，且本文提供的实施例是为了例证的目的而提供的并且不用于限制本说明书或本文描述的本发明的范围。

质粒pcDNA3.1Zeo+从Invitrogen公司(Carlsbad，CA)购买且质粒pBK-RSV来自Statagene(La Jolla，CA)。寡聚脱氧核苷酸(ODN)由Midland检定的试剂公司(Midland，TX)合成。聚合酶链反应(PCR)使用从Boehringer Mannheim公司(Indianapolis，IN)购买的Taq DNA聚合酶在Robo-梯度热循环仪(Stratagene(La Jolla，CA))中进行。限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶从Boehringer Mannheim公司(Indianapolis，IN)获得。使用的ODN在所附的序列表中列出。

所有的ODN在已于70℃下温育了5分钟的分开试管中在1μl(5μg/μl溶于水中)中杂交并且在室温下杂交15分钟。用在15μl总反应体积中的10个单位的酶和合适的反应缓冲液进行标准限制性核酸内切酶消化(EcoRI用作阴性对照)。DNA片断在琼脂糖凝胶上分辩并从其中分离。按Maniatis，等，(1989)所述转化进感受态XL1-Blue MRF细胞(Stratagene)后在氨苄青霉素平板上进行阳性克隆的选择。选择阳性克隆后，使用上述Quiagen质粒分离试剂盒分离质粒DNA。

质粒的构建。描述了4种表达质粒的构建。第一种质粒pssXB(图3)来自pcDNA3.1Zeo(+)(Invitrogen公司)且含有编码本文所用的目的ss-cDNA序列的遗传元件。用限制性核酸内切酶HindIII和NotI分别在位置911和978消化pcDNA3.1Zeo(+)。使合成的单链寡聚脱氧核苷酸ODN-5′-N/M(接头)2-H/N和ODN-3′-N/M(接头)2-H/N退火形成具有相容的HindIII和NotI末端的双链接头区，将其在标准条件下连接进HindIII/NotI双重消化的pcDNA3.1Zeo(+)，该质粒已转化进SureII细胞(Stratagene公司)。ODN在已于70℃下温育了5分钟的Ependorf管中在1μl(5μg/μl溶于水中)中杂交并且在室温下杂交15分钟。选择并测序合适的克隆以确信接头区的正确插入。所得的质粒称为pssXB。pssXB在图4A中显示且它是克隆进目的序列(图4B)的质粒。为了将目的序列克隆到反向串联重复序列之间，使用分别在935和978位置的两个NotI位点(见图4A)。这两个位点包含在反向串联重复序列内。为了在反向串联重复序列和引物结合位点之间插入目的序列，使用分别在位置1004和1021的PacI和BamHI位点。

第二种质粒也是本文所述的两质粒载体系统的一种成份，即pssXA(图3)。这种“A”质粒含有Mo-MuLV-RT(Shinnick，T.M.，等，自然，293，543-548(1981))和限制性核酸内切酶基因且来自pBK-RSV(Stratagene)，也使用XL-1 Blue MRF′作为宿主细胞。表达莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒的小鼠细胞系从美国典型培养物保藏中心获得(#CRL-1858)。病毒RNA按照Chomczymski，P.和N.Sacchi(生物化学年报，162，156-159(1987))所述的方法使用Trizol试剂(GibcobRL)从细胞中分离并使用引物3′-RT-HindIII(5′-CTTGTGCACAAGCTTTGCAGGTCT-3′)逆转录。转录子然后使用TaqPlus长聚合酶系统(Stratagene)经PCR扩增35个循环：94℃ 1分钟，67℃ 1分钟，和72℃ 2.5分钟。用于PCR反应的引物是5′-RT-Sacl(5′-GGGATCAGGAGCTCAGATCATGGGAC-CAATGG-3′)和与逆转录所用的相同的3′-RT-HindIII。这些引物分别包括合适的SacI和HindIII位点。所得的2.4kb产物包括位置2546和4908之间的Mo-MuLV序列。成熟的病毒RT肽由位置2337和4349之间的序列编码(Petropoulos，C.J.，逆转录病毒的分类，蛋白质结构，序列和遗传图谱，见J.M.Coffin，等(编辑)，逆转录病毒，纽约：冷泉港实验室出版，第757-805页(1997))，但氨基末端截短型肽保留了全部活性(Tanese，N.和S.P.Golf，美国科学院院报，85，1777-1781(1988))。由该构建体编码的肽包括部分整合酶基因，它在MoMuLV多蛋白中的RT之后(Petropoulos，出处同上(1997))。

编码限制性核酸内切酶MboII(Bocklage，H.，等，核酸研究，19，1007-1013(1991))的细菌牛摩拉克氏菌(Moraxella bovis)从美国典型培养物保藏中心(ATCC#10900)获得。使用Stratagene DNA提取试剂盒按厂家说明书从牛摩拉克氏菌分离基因组DNA并用作PCR中的模板DNA。使用两个引物，5′-MboII-HindIII(5′-CAATTAAGGAAAGCTTTGAAAAATTATGTC-3′)和3′-MboII-XmaI(5′-TAATGGCCCGGGCATAGTCGGGTAGGG-3′)，从基因组DNA经PCR扩增MboII基因30个循环：94℃，30秒，58℃，1分钟，72℃，1分钟。这些引物设计成分别包括HindIII和XmaI位点。拷贝位置888和2206之间的M.bovis基因组得到的1.2kb产物含有MboII酶的编码区。

用XmaI和NheI消化pBK-RSV载体。使用由两个退火的寡核苷酸5′-Nhe-Sac-接头(5′-CTAGCGGCAAGCGTAGCT-3′)和3′-Nhe-Sac-接头(5′ACGCTTGCCG-3′)形成的接头将NheI末端转变成SacI末端。RT和MboII扩增子通过HindIII位点连接且该构建体随后连接到pBK-RSV的SacI和XmaI位点之间以产生pBK-RSV-RT/MboII。

为了在多聚蛋白的RT和MboII结构域之间插入弹性接头，切除编码MboII基因5′端和部分整合酶基因的位于AseI和BglII位点之间的pBK-RSV-RT/MboII质粒的片断并用含有6-His-接头和经双重消化而缺失的5′-MboII DNA片断的插入序列取代。通过从在3′末端具有17个碱基的互补序列的两个模板，Rep(+)(5′-ATACTATTAATTTTGGCAAATCATAGCGGTTATGCTGACTCAGGTGAATGCCGCGATAATTTTCAGATTGCAATCTTTCATCAATGAATTTCAGTGATGAATTGCCAAGATTGATGTTGC-3′)和Rep(-)(5′-GACGAGATCTCCTCCAGGAATTCTCGAGAATTCGGATCCCCCGCTCCCCACCACCACCACCACCACCCTGCCCCGCGGATGAAAAATTATGTGAGCAACATCAATCTTGGC-3′)以互相引发的DNA合成作用获得插入序列。退火这两个寡核苷酸并用修饰的T7 DNA聚合酶(USB)延长，双链寡核苷酸然后用AseI和BglII消化并插入pBK-RSV载体以产生pssXA(图3)。

在根据本发明构建的单个质粒表达载体系统的第一个实施方案中，将pc3.1DNAZeo(+)-衍生的“B”质粒和pBK-RSV-衍生的“A”质粒融合以便所得的质粒编码本发明的这组遗传元件的所有元件，包括编码ss-cDNA的目的序列，串联反向重复序列，Mo-MuLV-RT基因，和限制性核酸内切酶(MboII)基因。为了产生C质粒，用SacI XmaI消化质粒pssDNA-Express-A以去掉MboII基因。使含有寡核苷酸5′-(接头)2-Hind/Xba(5′-CCGGATCTAGACCGCAAG-CTTCACCGC-3′)和3′-(接头)2-Hind/Xba(5′-GGTGAAGCTTGCGGTCTAGAT-3′)的接头区在70℃退火15分钟并缓慢冷却到室温，在标准条件下消化后连接进质粒。收获阳性克隆并测序以证实接头的位置，然后用Xba和HindIII消化该质粒。用HindIII和Xba消化质粒pssDNA-Express-B并将含有以前所述的反向串联重复序列，多克隆位点，和PBS的相应的300个碱基对的DNA片断克隆进已消化的质粒以产生pssXC(图5A)。进行标准连接反应并转化进Sure II细胞(Stratagene公司)。收获转化的阳性菌落并用限制性分析鉴定阳性克隆。

使用多克隆位点中的BamHI和PacI位点将目的序列克隆进pssXC的多克隆位点(图5B)。合成4个不同的目的序列用于上述这些构建体，使用相似的程序插入4个目的序列中的每一个。通过使配对的寡核苷酸在70℃退火15分钟并冷却到室温，接着在标准条件下连接进质粒而制备每种构建体。转化进SureII细胞后，经过测序各插入序列来选择合适的菌落。

通过按下述方式组合两个质粒pssXA和pssXB来构建用于单质粒表达系统的第二质粒pssXD。用XmaI和BglII消化含有Mo-MuLV逆转录酶(RT)的pssXA，所得的XmaI-BglII片断用通过退火两个寡核苷酸XmaI-BglII-终止子1(5’-CCGGATCTAGACCGCAAGCTTCATTTAAA-3′)和XmaI-BglII-终止子2(GATCTTTAAATGAAGCTTGCGGTCTCGAT-3′)形成的双链DNA衔接头取代。该衔接头含有蛋白质翻译终止密码子和亚克隆位点XbaI和HindIII。所得的质粒命名为pssXD(图6A)。从pssXB和pssXB-II裂解XbaI-HindIII片断，然后克隆进pssXD的XbaI和HindIII之间。这些DNA片断含有：1)RT引物结合位点(PBS)；2)茎环结构；和3)任意控制序列(pssXB)或c-raf DNA酶序列(pssXB-II)。所得的质粒分别命名为pssXD-I和pssXDII。RSV启动子调控单链DNA表达所需的所有元件的基因表达且所有元件转录为单链mRNA分子。内源性tRNA^Pro结合转录子3′末端的PBS，并用作单链DNA合成的引物(Marquet，等，生物化学，77，113-124(1995))。以RT逆转录单链DNA后，当模板mRNA被内源性RNase H或RT的RNase H活性降解时释放ssDNA(Tanase和Goff，美国国家科学院院报，85，1777-1781(1988))。

组织培养试验。使用DOTAP脂质体转染试剂(Boehringer Mannhiem Corp.，Indianapolis，IN)按厂商所附的说明书进行稳定和瞬时转染。所有质粒构建体转染进在补充了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco氏改良型Eagles培养基(DMEM)(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中维持的A549肺癌细胞系(ATCCCCL-185)和HeLa细胞系中。转染24-48小时后通过PCR和斑点印迹分析进行ssDNA的测定。从48-72小时之前转染的细胞分离ssDNA。使用Trizol试剂(Gibco生命技术公司，Gaithersburg，MD)实现sscDNA与总RNA的共同集中(Mitrochnitchenko，O.，等，使用细菌逆转录子在哺乳动物细胞中产生单链DNA，生物学化学杂志，269，2380-2383(1994))。通过对内部片断的PCR测定和通过变性单链凝胶电泳及随后的尼龙印迹和用生物素标记的内部探针探测来测定特异性ss-cDNA种类。

更具体的说，使用Silver，J.，等(能检测单个病毒颗粒的逆转录酶活性的RT-PCR测定，核酸研究，21，3593-3594(1993))建立的RT-PCR测定法经按下述改良来测定逆转录酶活性。用裂解缓冲液(1％ Triton^TM，1mM MgCl₂，100mM NaCl，10mM TRIS-HCl，pH8.0和2nM DTT)裂解pssXA转染的细胞。以18,000g离心30分钟后，收集上清并在-80℃冷冻备用。经过与含有RT活性的裂解产物在37℃下温育10或30分钟而逆转录被用作模板的雀麦草花叶病毒(BMV)RNA。然后使用引物5′-CGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC-3′和5′-TCAACACTGTA-CGGCACCCGCATTC-3′将逆转录产物经PCR扩增40个循环：94℃，20秒，56℃，20秒，和72℃，20秒。用1.5％的琼脂糖凝胶分析RT-PCR产物，如图6所示。

该RT-PCR测定依赖于转染细胞的细胞裂解物中的RT活性以产生BMVRNA底物的cDNA转录子。该病毒的复制周期不涉及DNA中间体，因此排除了不经过在先的逆转录而产生扩增产物的可能性。在用pssXA质粒转染的A549细胞的裂解物(泳道3和4)和显示相对较高表达的E10克隆(泳道5和6)中测定RT活性。也从用对照pBK-RSV质粒(泳道1和2)瞬时转染的A549细胞测定了RT活性。对于瞬时转染，在转染48小时后制备裂解产物。结果表明来自瞬时和稳定转染的(E10)细胞的细胞裂解物都支持产生预期大小为150bp(泳道3-6)的带，而对照裂解产物显示无(泳道1和2)。

为了检测由pssXB-I和pssXB-II质粒在与pssXA共转染进A549细胞(E10)时在哺乳动物细胞中表达的ssDNA，使用T7引物和c-raf DNA酶特异性引物5′-CTAGCTACAACGAGACATGC-3′进行PCR反应。总RNA成份用作模板且用S1核酸酶或RNAse A在37℃下预处理30分钟或不处理。然后PCR扩增预处理的RNA样品30个循环：94℃，45秒，55℃，45秒，和72℃，30秒。用8％的酰胺凝胶分析PCR产物，如图7所示(泳道1和3，S1核酸酶；泳道2， 4，和5，RNAse)。处理的总RNA制品(泳道2和4)和未处理的制品(数据未显示)中都产生预期大小的带。用S1核酸酶，一种高度特异性的ssDNA核酸内切酶处理的对照制品没有扩增产物产生(泳道1和3)。

使用North2South化学发光核酸杂交和检测试剂盒(Pierce)按厂商说明书通过斑点印迹检测ssDNA进一步证实c-raf DNA酶的存在。使用从pssXA/pssXB-I或pssXA/pssXB-II，或pssXA转染的细胞或未转染的细胞分离的2μg总RNA。c-raf特异性的生物素标记的探针序列是5′-GGCCGCACTAATGCATGTCTCGTTGTAGCTA-GCCCAGGCGGGAAGTGC-3′。如图8所示，生物素标记的c-raf特异性寡聚探针仅在pssXB-I orpssXB-II转染的E10细胞分离的RNA制品中检测到信号但在未转染的E10细胞或A549细胞中没有。

为了测定用本发明的pssXA/pssXB载体系统表达的单链c-rafDNA酶在哺乳动物细胞中是否改变c-raf mRNA表达，进行了northern印迹分析。用pssXB-I或者pssXB-II瞬时转染E10细胞系。在24和48小时，收获细胞用于制备总RNA。在变性琼脂糖凝胶上分离15μg总RNA用于Northern印迹分析，转移过夜后，固定膜并用32P标记的c-raf DNA片断和一种管家基因，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)探测。使用来自Boehringer Mannheim的随机引发标记试剂盒，从包括c-raf激酶基因编码区位置571至2028的IMAGE^TMcDNA克隆(ID 645539，Research Genetics)制备c-raf探针。G3PDH也是32P-标记的且用于RNA印迹的标准化。膜用2xSSC，0.1％SDS洗涤15分钟且用O.1xSSC洗涤5分钟。然后将印迹对X-射线胶片曝光或用分子动力学磷成像仪^TM定量。代表性实验的磷成像定量结果在图9中以图形显示。与含有无关序列的pssXB转染的对照相比，pssXB-II将c-raf mRNA水平在24小时降低到81％且在48小时到66％。pssXB-I具有相似的效果，在培养48小时后使c-raf mRNA水平降低35％。还观察到在用表达c-raf DNA酶的pssXA/pssXB载体转染的细胞中与对照相比有明显更多的细胞死亡(大约多三分之一)。仅收获保持贴壁的细胞而不是那些开始“漂浮”的细胞，这样mRNA减少的程度比所测量的34-36％减少更大。

将单个质粒载体系统pssXC转染进HeLa细胞系。如上所述在转染后24-48小时通过PCR和斑点印迹分析进行ssDNA的测定。如上所述也使用Silver，等(出处同上(1993))建立的RT-PCR测定法测定逆转录酶活性。另外测定稳定取代的HeLa细胞系的单菌落分离物(A12和B12)的RT活性。从48-72小时之前转染的细胞分离ss-cDNA。使用Trizol试剂(Gibco生命技术公司，Gaithersburg，MD)进行ss-cDNA与RNA的共同集中。通过对内部片断的基于PCR的测定和通过变性单链凝胶电泳及随后的尼龙印迹并用生物素标记的内部探针探测来测定特异性sscDNA种类。

本实验显示了人组织培养物(HeLa细胞系)已被设计成合成加工的ss-cDNA，产生预期大小的ss-cDNA的质粒转染。正如在上文引用的申请系列号09/397,782中所述，从pssXC体内产生的ssDNA目的序列从反向重复序列之间的位置在消化茎环中间体的茎后产生或者从反向重复序列和引物结合位点之间的位置通过在茎结构3’端成熟前终止逆转录酶cDNA转录子而产生。

使用总RNA成份，通过简单的斑点印迹分析测定细胞内单链c-Faf DNA酶的表达。所用的生物素标记的c-raf特异性寡核苷酸探针由整合DNA技术公司(Coralville，IA)合成，并用于在用对照pssXD-I或含有c-raf DNA酶序列的pssXD-II转染的A549细胞分离的RNA样品中检测信号。用RNase A预处理2μg总RNA以排除与RNA的任何可能的非特异性杂交，且在S1核酸酶存在和不存在的条件下37℃处理30分钟。随后，将样品上样到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotec，Piscataway，NJ)上，并经过紫外照射3分钟固定。使用North2South化学发光核酸杂交和检测试剂盒(Pierce，Rockford，IL)进行杂交和信号检测。图11表明只有用pssXD-II转染的细胞显示阳性信号且在S1核酸酶存在下由于ssDNA酶被S1核酸酶特异性降解，没有观察到可检测的信号。

为了测定A549细胞中表达的单链DNA酶是否改变c-raf mRNA水平，进行定量RT-PCR。通过带有一些修改的Li等(基因治疗，7，321-328(2000))所述的RT-PCR定量c-raf mRNA。简单的说，使用逆转录系统(Promega公司，Madison，WI)逆转录1μg总RNA。所得的cDNA成份用作PCR扩增的模板。使用特异性引物进行40个PCR循环(95℃，30秒，50℃，30秒，和72℃，60秒)。使用的特异性引物序列如下：1)c-raf引物：5′-TCAGAGAAGCTCTGCTAAG-3′和5′-CAATGCACTGGACACCTTA-3′；2)肌动蛋白引物：5′-ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′和5′-GCTTGCTGATCCACATCTGC-3′。肌动蛋白用作管家基因对照。从对照pssXD-I或含有c-rafDNA酶序列的pssXD-II转染的细胞分离的总RNA被逆转录并使用一对c-raf特异性引物进行PCR扩增。肌动蛋白mRNA的PCR扩增用作对照以标准化不同样品间的上样量。如图12所示，与对照(泳道1)相比在用pssXD-II转染的细胞(泳道2)中检测到c-raf mRNA的显著减少(大约70-80％)。

通过Western印迹分析测定用pssXD-I或pssXD-II转染的A549细胞中的c-raf蛋白质水平。30μg细胞提取物在12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳。使用微型跨印迹电泳转移池按照厂商说明书(BioRad实验室，Hercules，CA)将蛋白质电转移到Hybond ECL膜(AmershamPharmacia Biotec，Piscataway，NJ)上。随后将膜在含有25mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl，0.05％ Tween-20，和5％脱脂乳的缓冲液中封闭，然后与第一和HRP-偶联的第二抗体各培养45分钟。抗c-raf的多克隆抗体(抗-raf1)和抗肌动蛋白的单克隆抗体(Ab-1)从Calbiochem-NovaBiochem公司(Sann Diego，CA)购买。抗多聚-ADP核糖聚合酶(PARP)的单克隆抗体(IgG1，C-2-10)从ClontechLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)购买。使用SuperSignal West Pico化学发光底物试剂盒(Pierce，Rockford，IL)观察蛋白质。如图13所示，在pssXD-I转染的对照细胞中c-raf蛋白质的水平(泳道2)相似于未转染的细胞(泳道3)。然而，用表达c-raf DNA酶的pssXD-II转染的细胞(泳道1)与对照相比具有较低的c-raf蛋白水平(大约20-30％)。

为了测定c-raf DNA酶的表达是否诱导A549细胞凋亡，进行了两个标准凋亡试验，即基因组DNA裂解和PARP裂解。使用LM-PCR序列梯试验试剂盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)按厂商说明书测定基因组DNA裂解。简单的说，用T4 DNA连接酶将0.5μg基因组DNA与ClontechLaboratories，Inc.提供的衔接头在15℃连接过夜。衔接头连接的DNA级分用作LM-PCR的模板。进行25个循环的PCR(95℃，1分钟和72℃，3分钟)并在72℃延伸15分钟。将从pssXD-I(对照)或pssXD-II(DNA酶)瞬时转染的细胞分离的基因组DNA连接到特异性衔接头上。随后，使用c-raf引物和特异性引物进行LM-PCR。如图14所示，与用对照质粒pssXD-I转染的细胞(泳道2)，或未转染的细胞(泳道3)相比，在pssXD-II转染的细胞(泳道1)中片断化的基因组DNA显著增加。这些结果表明片断化基因组DNA的增加是由c-rafDNA酶存在下被改变的c-raf基因表达的抑制作用引起的DNA裂解的结果。

使用Western印迹分析进行另一凋亡试验，即PARP裂解试验。与对照(泳道2-3)相比，用pssXD-II转染的细胞(泳道1)全长PARP的量减少(图15)，再次表明c-raf基因表达的抑制可诱导细胞凋亡。在肌动蛋白存在下测定时每个泳道上样相似量的蛋白质(泳道1-3)。

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上述实验证实使用真核RT反应和各种cDNA引发反应的多步反应体外和体内产生ssDNA的方法成功减少体内c-raf激酶的表达。本领域的技术人员将认识到本发明并不限于该具体实施方案。例如可认识到根据具体靶和/或SOI抑制性作用的方式可使用许多核酸序列。同样，SOI可位于两个位置之一或者两个位置均有，例如IR之间和/或PBS与IR的3’端之间。同样地，根据具体靶和/或SOI作用的方式和/或DNA酶序列，SOI可包括或不包括DNA酶序列。从本说明书受益的本领域的技术人员将认识到通过使用本发明的载体系统将合适的SOI转染进真核细胞的方法可产生任意所需的治疗效果。以举例而不是限制的方式，下面的抑制性核酸序列在本领域中是已知的且可用作SOI以按照本发明改变基因表达：

充当用于帕金森氏(Parkinson’s)病治疗的编码若干多巴胺受体之一的一个或多个RNA分子的反义寡核苷酸的序列。该反义寡核苷酸特异性结合这类RNA分子的表达调控序列，从而选择性调控一种或多种多巴胺受体亚类的表达，并减轻与其表达相关的病理学症状；

抑制KSHV病毒颗粒蛋白26表达的序列，包括充当如美国专利号5,856,903所述的用于治疗Karposi′s综合征的反义和/或三链体寡核苷酸的序列。

如美国专利号5,856,903所述用于控制IL-8和/或IL-8受体表达以便控制肿瘤生长，转移和/或肿瘤中血管生成的寡核苷酸；

具有可与巨细胞病毒DNA或RNA的选定序列特异性杂交的核苷酸碱基序列的寡核苷酸，具体地说，靶向编码IE1，IE2，或DNA聚合酶蛋白的巨细胞病毒DNA或RNA的序列。优选具有如美国专利号5,442,049所述的大约5个至大约50个核酸碱基单位的寡核苷酸。

可与来自相应于单纯疱疹病毒1型阅读框UL5，UL8，UL9，UL20，UL27，UL29，UL30，UL42，UL52和IE175之一的基因的RNA或DNA特异性杂交且含有在相同性和数量上足以影响该特异性杂交的核苷酸单位的寡核苷酸。优选可与翻译起始位点，编码区或5′非翻译区特异性杂交的寡核苷酸。寡核苷酸设计成与来自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，巨细胞病毒，人类疱疹病毒6型，Epstein Barr病毒(EBV)或水痘带状疱疹病毒(VZV)之一的DNA，或优选RNA特异性杂交。这类寡核苷酸方便和希望作为在药用上可接受的载体中的药用组合物提供，如美国专利号5,514,577所述。本领域的技术人员将认识到对于单纯疱疹病毒1型所述的特定阅读框可在指定的其它病毒中发现相应物。因此据信单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，巨细胞病毒，人类疱疹病毒6型，Epstein Barr病毒和水痘带状疱疹病毒中的每一种都具有编码相似功能蛋白的许多类似的阅读框。因此，本发明涉及反义寡核苷酸疗法，其中所述寡核苷酸针对任意上述病毒，或事实上针对以后已知的具有一个或多个这类相似阅读框的任何相似病毒。为了方便本发明，所有这类病毒均称为疱疹病毒。

原癌基因，且特别是c-myb基因的反义寡核苷酸，用作抗肿瘤剂和免疫抑制剂，如美国专利号5,098,890所述。

在白介素-1(刺激的细胞中抗ICAM-1基因表达的反义寡核苷酸用作抗炎症剂，对各种炎症性疾病或具有炎症性成分的疾病，例如哮喘，类风湿关节炎，同种异体移植排斥，炎症性肠疾病，各种皮肤病学症状，和牛皮癣具有活性。另外，ICAM-1，VCAM-1，和ELAM-1的抑制剂在由鼻病毒感染引起的感冒，AIDS，卡波西氏(Kaposi’s)肉瘤和一些癌症及其转移的治疗中有效，如美国专利号5,843,738所述。同样，国际申请号PCT/US90/02357公开了编码包括ELAM-1和VCAM-1及VCAM-1b的内皮细胞粘附分子(ELAM)的DNA序列。命名为ISIS 1570和ISIS 2302的寡核苷酸特别期望用作本发明的方法中的目的序列用于减少靶细胞的转移潜力。

如美国专利号5,840,867所述特异性结合宿主细胞中的靶分子，例如蛋白质，且特别是凝血酶的蛋白结合型寡核苷酸(aptamers)。这些非寡核苷酸靶分子可结合核酸(Blackwell，T.K.，等，科学，250，1104-1110(1990)；Blackwell，T.K.，等，科学，250，1149-1152(1990)；Turek，C.和L.Gold，科学，249，505-510(1990)；Joyce，G.F.，基因，82，83-87(1989))，特异性地控制该蛋白质的生物学活性。

尽管参照本文提供的附图和具体实施例进行了描述，但本领域的技术人员将认识到可对本文提供的具体元件作出某些改变而不改变这些元件发挥功能以达到其预定的各自结果的方式。例如，本文所述的序列盒描述为含有三个遗传元件，即目的序列，引物结合位点和串联反向重复序列，当转染进具有在合适启动子控制下的逆转录酶基因的靶细胞中时，产生本文所述的抑制性核酸序列。然而，本领域的技术人员将认识到，例如，所述用作序列盒逆转录酶基因的小鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶基因可用其它逆转录酶基因取代(来自人免疫缺陷病毒的逆转录酶基因是上述的一个这种基因)且使用本文所述的CMV启动子之外的启动子也是有益的。如上所述，形成的茎环中间体可包括或不包括限制性核酸内切酶位点且根据期望从中间体产生的具体目的序列来处理其对变性的敏感性是有益的。所有这些改变和对本领域的技术人员而言显而易见的通过不偏离本发明精神的该说明书的修改可作出的其它改变将落在下面权利要求书的范围内。

表#1

寡聚脱氧核苷酸(ODN’s)名称：5′-N/M(接头)2-H/N5′AGCTTGGTCGGCGGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTCACGATAGAGTGGGAGATGGGCGCGAGAAAGTGCGGCCGCTCTTCAAGGCCGCCGACCTTAATTAAGTCAGCGGGGGATCCTTTTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCT-3′名称：3′-N/M(接头)2-H/N5′GGCCAGGGGTCTCCCGATCCCGGACGAGCCCCCAAAAAGGATCCCCCGCTGACTTAATTAAGGTCGGCGGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTTTCTCGCGCCCATCTCCCACTCTATCGTGAGTGCGGCCGCTCTTCAAGGCCGCCGACCA-3′名称：5′-polyNM-gag接头-(Pleio)-DNa5e-1023-B/P5′-GATGTAAGTCGTTGTAGCTAGCCTCCCCTG-3′名称：3′-polyNM-gag接头-(Pleio)-DNAse-1023-B/P5′-GAT CCA GGG GA GGC TAG CTA CAA CGA CTT ACA TCA T-3′名称：5′-polyNM-gag接头-(hras)-DNAse-1023-B/P5′-GGTGGGCGCCTCGTTGTAGCTAGCCTCGGTGTGGG-3′名称：3′-polyNM-gag接头-(hras)-DNAse-1023-B/P5′-GATCCCCACACCGAGGCTAGCTACAACGAGGCGCCCACCAT-3′名称：5′-polyNM-gag接头-(rafK)-DNAse-1023-B/P5′-AATGCATGTCTCGTTGTAGCTAGCCCAGGCGGGA-3名称：3′-polyNM-gag接头-(rafK)-DNAse-1023-B/P5′-GATCTCCCGCCTGGGCTAGCTACAACGAGACATGCATTAT-3′名称：5′-polyN/M-gag接头-(tat-SIV)-DNAse-1023-B/P5′-AGATGGAGACTCGTTGTAGCTAGCCCCCTTGAGGGCAGATTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAGGA-3′名称：3′-polyN/M-gag接头-(tat-SIV)-DNAse-1023-B/P5′-GATCTCCTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCAATCTGCCCTCAAGGGGGCTAGCTACAACGAGTCTCCATCTAT-3′名称：5′-(接头)2-Hind/Xba5′-CCG GAT CTA GAC CGC AAG CTT CAC CGC-3′名称：3′-(接头)2-Hind/Xb25′-GGT GAA GCT TGC GGT CTA GAT-3′

ODN-PMMV(+)129个碱基(#23)	5′-CTAGGTCGGCGGCCGCGAAGATTGGTGCGCACACACACAACGCGCACCAATCTTCGCGGCCGCCGACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGCC-3′
ODN-PMMV(+)129个碱基(#23)		ODN-PMMV(-)121个碱基(#24)	5′-CTGGGCAGGGGTCTCCCGATCCCGGACGAGCCCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACGGGTCGGCGGCCGCGAAGATTGGTGCGCGTTGTGTGTGTGCGCACCAATCTTCGCGGCCGCCGAC-3′
ODN-Test(+)57个碱基(#38)	5′-GGCCGGAAGATTGGGGCGCCAAAGAGTAACTCTCAAAGGCACGCGCCCCAATCTTCC-3′	ODN-PMMV(-)121个碱基(#24)
ODN-Test(+)57个碱基(#38)		ODN-Test(-)57个碱基(#39)	5′-GGCCGGAAGATTGGGGCGCGTGCCTTTGAGAGTTACTCTTTGGCGCCCCAATCTTCC-3′
ODN-Telo(+)92个碱基(#40)	5′-GGCCGGAAGATTGGGGCGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCGCCCCAATCTTCC-3′	ODN-Test(-)57个碱基(#39)
ODN-Telo(+)92个碱基(#40)		ODN-Telo(-)92个碱基(#41)	5′-GGCCGGAAGATTGGGGCGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACGCCCCAATCTTCC-3′
ODN-XB(+)51个碱基	5′-GGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTAACACCACCACAGTGCGGCCGCTCTTCAA-3′	ODN-Telo(-)92个碱基(#41)
ODN-XB(+)51个碱基	5′-GGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTAACACCACCACAGTGCGGCCGCTCTTCAA-3′	ODN-XB(-)51个碱基	5′-GGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTGTGGTGGTGTTAGTGCGGCCGCTCTTCAA-3′
ODN-RT(+)32个碱基(#13)	5′-GGGATCAGGAGCTCAGATCATGGGACCAATGG-3′	ODN-XB(-)51个碱基	5′-GGCCTTGAAGAGCGGCCGCACTGTGGTGGTGTTAGTGCGGCCGCTCTTCAA-3′
ODN-RT(+)32个碱基(#13)	5′-GGGATCAGGAGCTCAGATCATGGGACCAATGG-3′	ODN-RT(-)24个碱基(#12)	5′-CTTGTGCACAAGCTTTGCAGGTCT-3′
ODN-N＞S(+)18个碱基(#25)	5′-CTAGCGGCAAGCGTAGCT-3′	ODN-RT(-)24个碱基(#12)	5′-CTTGTGCACAAGCTTTGCAGGTCT-3′
ODN-N＞S(+)18个碱基(#25)	5′-CTAGCGGCAAGCGTAGCT-3′	ODN-N＞S(-)10个碱基(#26)	5′-ACGCTTGCCG-3′
ODN-Mbo(+)30个碱基(#16)	5′-CAATTAAGGAAAGCTTTGAAAAATTATGTC-3′	ODN-N＞S(-)10个碱基(#26)	5′-ACGCTTGCCG-3′
ODN-Mbo(+)30个碱基(#16)	5′-CAATTAAGGAAAGCTTTGAAAAATTATGTC-3′	ODN-Mbo(-)27个碱基(#33)	5′-TAATGGCCCGGGCATAGTCGGGTAGGG-3′
ODN-HisPro(+)43个碱基(#36)	5′-AGCTGGATCCCCCGCTCCCCACCACCACCACCACCCTGCCCCT-3′	ODN-Mbo(-)27个碱基(#33)	5′-TAATGGCCCGGGCATAGTCGGGTAGGG-3′
ODN-HisPro(+)43个碱基(#36)	5′-AGCTGGATCCCCCGCTCCCCACCACCACCACCACCCTGCCCCT-3′	ODN-HisPro(-)42个碱基(#37)	5′-AGCAGGGGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGGGAGCGGGGGATCC-3′
ODN-Rep(+)121个碱基	5′-ATATCTATTAATTTTGGCAAATCATAGCGGTTATGCTGACTCAGGTGAATGCCGCGATAATTTTCAGATTGCAATCTTTCATCAATGAATTTCAGTGATGAATTGCCAAGATTGATGTTGC-3′	ODN-HisPro(-)42个碱基(#37)	5′-AGCAGGGGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGGGAGCGGGGGATCC-3′
ODN-Rep(+)121个碱基		ODN-Rep(-)111个碱基	5′-GACGAGATCTCCTCCAGGAATTCTCGAGAATTCGGATCCCCCGCTCCCCACCACCACCACCACCACCCTGCCCCGCGGATGAAAAATTATGTGAGCAACATCAATCTTGGC-3′

1.名称：3′-RT/Mol-HindIII(24-聚体)

序列：5′-CTT GTG CAC AAG CTT TGC AGG TCT-3′

2名称：5′-RT/Mol-Sac I(32-聚体)

序列：5′-GGG ATC AGG AGC TCA GAT CAT GGG ACC AAT GG-3′

3.名称：5′-Mbo II-Hind III(30-聚体)

序列：5′-CAA TTA AGG AAA GCT TTG AAA AAT TAT GTC-3′

4.名称：5′-RT-Not-Mbo-接头(129-聚体)

序列：5′-CTA GGT CGG CGG CCG CGA AGA TTG GTG CGC ACA CACACA ACG CGC ACC AAT CTT CGC GGC CGC CGA CCC GTC AGC GGGGGT CTT TCA TTT GGG GGC TCG TCC GGG ATC GGG AGA CCC CTGCCC AGG GCC

5.名称：3′-RT-Not-Mbo-接头(121-聚体)

序列：5′-CT GGG CAG GGG TCT CCC GAT CCC GGA CGA GCC CCCAAA TGA AAG ACC CCC GCT GAC GGG TCG GCG GCC GCG AAG ATTGGT GCG CGT TGT GTG TGT GCG CAC CAA TCT TCG CGG CCG CCGAC-3′

6.名称：5′-Nhe-Sac-接头(18-聚体)

序列：5′-CTA GCG GCA AGC GTA GCT-3′

7.名称：3′-Nhe-Sac-接头(10-聚体)

序列：5′-ACG CTT GCC G-3′

8.名称：3′-Mbo II-Xba I(27-聚体)

序列：5′-TAA TGG CCC GGG CAT AGT CGG GTA GGG-3′

9.名称：5′-Hind-接头-Histag(43-聚体)

序列：5′-A GCT GGA TCC CCC GCT CCC CAC CAC CAC CAC CACCCT GCC CCT-3′

10.名称：3′-Hind-接头-Histag(42-聚体)

序列：5′-AGC AGG GGC AGG GTG GTG GTG GTG GTG GGG AGCGGG GGA TCC-3’

11.名称：5′-Not-接头-试验1(57-聚体)

序列：5′-G GCC GGA AGA TTG GGG CGC CAA AGA GTA ACT CTCAAA GGC ACG CGC CCC AAT CTT CC-3′

12.名称：3′-Not-接头-试验1(57-聚体)

序列：5′-GGC CGG AAG ATT GGG GCG CGT GCC TTT GAG AGT TACTCT TTG GCG CCC CAA TCT TCC-3′

13.名称：5′-Not-Mbo-接头-telo(92-聚体)

序列：5′-GGC CGG AAG ATT GGG GCG TTA GGG TTA GGG TTA GGGTTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGGCGC CCC AAT CTT CC-3′

14.名称：3′-Not-Mbo-接头-telo(92-聚体)

序列：5′-GGC CGG AAG ATT GGG GCG CCC TAA CCC TAA CCC TAACCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAACGC CCC AAT CTT CC-3′

15.5’-SL-接头-Fok1-RT(111-聚体)

序列：5′-CTA GTC GGA TGC GGC CGC TGC ACA ACA ACA CAC AACACA GCG GCC GCA TCC GAT CAG CGG GGG TCT TTC ATT TGG GGGCTC GTC CGG ATC GGG AGA CCC CTG CCC AGC GCC-3′

16.3’-SL-接头-Fok1-RT(103-聚体)

序列：5′-CTG GGC AGG GGT CIC CCG ATC CGG ACG AGC CCC CAAATG AAA GAC CCC CGC TGA TCG GAT GCG GCC GCT GTG TTG rrr GTTGTT GTG CAG CGG CCG CAT CCG A-3′

17.名称：XmaI-BglII-终止子1

序列：5′-CCGGATCTAGACCGCAAGCTTCATTTAAA-3′

18.名称：XmaI-BrlII-终止子2

序列：5′-GATCTTTAAATGAAGCTTGCGGTCTCGAT-3′

序列表

<110>西托吉尼克斯公司(INGENE，INC.)

<120>用体内产生的ssDNA改变基因表达

<130>INGA，004/CIP/PCT

<140>PCT/US00/27381

<141>2000-10-04

<150>PCT/US99/23936

<151>1999-10-12

<160>34

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>149

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>1

agcttggtcg gcggccttga agagcggccg cactcacgat agagtgggag atgggcgcga 60

gaaagtgcgg ccgctcttca aggccgccga ccttaattaa gtcagcgggg gatccttttt 120

gggggctcgt ccgggatcgg gagacccct 149

<210>2

<211>149

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>2

ggccaggggt ctcccgatcc cggacgagcc cccaaaaagg atcccccgct gacttaatta 60

aggtcggcgg ccttgaagag cggccgcact ttctcgcgcc catctcccac tctatcgtga 120

gtgcggccgc tcttcaaggc cgccgacca 149

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>3

gatgtaagtc gttgtagcta gcctcccctg 30

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>4

gatccagggg aggctagcta caacgactta catcat 36

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>5

ggtgggcgcc tcgttgtagc tagcctcggt gtggg 35

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>6

gatccccaca ccgaggctag ctacaacgag gcgcccacca t 41

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>7

aatgcatgtc tcgttgtagc tagcccaggc ggga 34

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>8

gatctcccgc ctgggctagc tacaacgaga catgcattat 40

<210>9

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>9

agatggagac tcgttgtagc tagccccctt gagggcagat tggcgcccga acagggactt 60

gaagga 66

<210>10

<211>72

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>10

gatctccttc aagtccctgt tcgggcgcca atctgccctc aagggggcta gctacaacga 60

gtctccatct at 72

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>11

ccggatctag accgcaagct tcaccgc 27

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>12

ggtgaagctt gcggtctaga t 21

<210>13

<211>129

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>13

ctaggtcggc ggccgcgaag attggtgcgc acacacacaa cgcgcaccaa tcttcgcggc 60

cgccgacccg tcagcggggg tctttcattt gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg 120

cccagggcc 129

<210>14

<211>121

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>14

ctgggcaggg gtctcccgat cccggacgag cccccaaatg aaagaccccc gctgacgggt 60

cggcggccgc gaagattggt gcgcgttgtg tgtgtgcgca ccaatcttcg cggccgccga 120

c 121

<210>15

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>15

ggccggaaga ttggggcgcc aaagagtaac tctcaaaggc acgcgcccca atcttcc 57

<210>16

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>16

ggccggaaga ttggggcgcg tgcctttgag agttactctt tggcgcccca atcttcc 57

<210>17

<211>92

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>17

ggccggaaga ttggggcgtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt agggttaggg 60

ttagggttag ggttagggcg ccccaatctt cc 92

<210>18

<211>92

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>18

ggccggaaga ttggggcgcc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa 60

ccctaaccct aaccctaacg ccccaatctt cc 92

<210>19

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>19

ggccttgaag agcggccgca ctaacaccac cacagtgcgg ccgctcttca a 51

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>20

ggccttgaag agcggccgca ctgtggtggt gttagtgcgg ccgctcttca a 51

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>21

gggatcagga gctcagatca tgggaccaat gg 32

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>22

cttgtgcaca agctttgcag gtct 24

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>23

ctagcggcaa gcgtagct 18

<210>24

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>24

acgcttgccg 10

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>25

caattaagga aagctttgaa aaattatgtc 30

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>26

taatggcccg ggcatagtcg ggtaggg 27

<210>27

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>27

agctggatcc cccgctcccc accaccacca ccaccctgcc cct 43

<210>28

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>28

agcaggggca gggtggtggt ggtggtgggg agcgggggat cc 42

<210>29

<211>121

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>29

atatctatta attttggcaa atcatagcgg ttatgctgac tcaggtgaat gccgcgataa 60

ttttcagatt gcaatctttc atcaatgaat ttcagtgatg aattgccaag attgatgttg 120

c 121

<210>30

<211>111

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸

<400>30

gacgagatct cctccaggaa ttctcgagaa ttcggatccc ccgctcccca ccaccaccac 60

caccaccctg ccccgcggat gaaaaattat gtgagcaaca tcaatcttgg c 111

<210>31

<211>111

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：接头

<400>31

ctagtcggat caggccgctg cacaacaaca cacaacacag cggccgcatc cgatcagcgg 60

gggtctttca tttgggggct cgtccggatc gggagacccc tgcccagcgc c 111

<210>32

<211>103

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：接头

<400>32

ctgggcaggg gtctcccgat ccggacgagc ccccaaatga aagacccccg ctgatcggat 60

gcggccgctg tgttgtttgt tgttgtgcag cggccgcatc cga 103

<210>33

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>33

ccggatctag accgcaagct tcatttaaa 29

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>34

gatctttaaa tgaagcttgc ggtctcgat 29

Claims

1.改变靶细胞中内源性核酸靶序列的表达的方法，包括如下步骤：

将含有目的序列及其侧翼的反向串联重复序列和3′引物结合位点PBS的序列盒导入靶细胞，该目的序列含有下述核酸序列，该核酸序列设计成逆转录时产生能结合内源性核酸序列的核酸序列；

从PBS开始逆转录所述序列盒的mRNA转录子以便在细胞中释放单链cDNA转录子；和

将该cDNA转录子结合到内源性核酸靶序列上以改变该靶序列的表达。

2.权利要求1的方法，还包括将逆转录酶/RNase基因转染进所述靶细胞。

3.权利要求1的方法，还包括使目的序列的转录子线性化。

4.权利要求3的方法，其中当目的序列的cDNA转录子通过反向串联重复序列的Watson-Crick碱基配对形成茎环中间体时，目的序列的转录子通过已在反向串联重复序列中导入的限制性核酸内切酶位点被线性化。

5.权利要求2的方法，还包括诱导性启动逆转录酶基因的转录。

6.权利要求5的方法，其中用真核启动子启动逆转录酶基因的转录。

7.一种靶细胞，其中按照权利要求1的方法改变了核酸靶序列的表达。