CN1268138A

CN1268138A - 化合物

Info

Publication number: CN1268138A
Application number: CN98808429A
Authority: CN
Inventors: P·哈姆利; A·皮姆; A·蒂克
Original assignee: BRITISH ASTRA PHARMACEUTICALS Ltd
Current assignee: BRITISH ASTRA PHARMACEUTICALS Ltd
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 1998-06-22
Publication date: 2000-09-27
Also published as: EE9900602A; SE9702534D0; EP1000064A1; KR20010014367A; WO1999001455A1; JP2002507987A; IS5323A; NO996544D0; AU8135698A; AR013004A1; US6083952A; IL133729A0; NO996544L; ID25585A; US6211189B1; ZA985326B; SK170299A3; PL337536A1; HUP0003104A3; HUP0003104A2

Abstract

本发明提供式(Ⅰ)化合物,其中A代表芳族碳环或含有1—3个可能相同或不同的选自O、N或S的杂原子的5或6元杂芳环;X代表－(CH₂)_n－,其中n代表0或1;而R¹、R²和R³的定义见于说明书,及其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体;以及它们的制备方法,含有它们的组合物和将他们在治疗中的用途。这些化合物为一氧化氮合成酶抑制剂因而对于治疗或预防炎性疾病和疼痛特别有用。

Description

化合物

本发明领域

本发明涉及为氨基螺环哌啶喹唑啉衍生物的新化合物。本发明还涉及其相关方面包括这些化合物的制备方法、含有这些化合物的组合物以及将它们作为药品的用途。本发明也提供对制备这些化合物有用的化学中间体。

本发明背景

一氧化氮在哺乳动物细胞内由L-精氨酸在特异性的一氧化氮合成酶(NOSs)的作用下生成。这些酶分为两种不同的类型--组成NOS(cNOS)和诱导NOS(iNOS)。目前，已鉴定出两种组成NOSs和一种诱导NOS。组成NOS中，内皮酶(ecNOS)与平滑肌松弛及调节血压和血流有关，而神经酶(ncNOS)作为神经递质并显示与调节多种生物学功能如脑缺血有关。诱导NOS特别与炎性疾病发病机理有关。因此调节这些酶为治疗多种疾病状况提供了极大的潜力(J.E.Macdonald，ann.Rep.Med.Chem.，1996，31，221-230)。

WO97/14686公开的化合物中，有如下结构的用作药品的氨基螺环哌啶喹唑啉衍生物：其中R³代表各种取代基。治疗和预防炎症疾病作为特别药学用途而被公开。

本发明的公开

根据本发明，提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体：

其中：

R¹和R²独立地代表氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、卤素、羟基、三氟甲基或氨基；

R³代表一个或一个以上的取代基，所述取代基独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、卤素、羟基、三氟甲基、氨基、氰基、硝基、三氟甲氧基、甲磺酰基、氨磺酰基、-NR⁴R⁵、-COOR⁶、-CONR⁷R⁸、苄氧基、苯基、含有1-3个相同或不同的选自O、N或S杂原子的五元杂环芳环，其苯基和五元杂环芳环被任选取代，其任选取代基是C1-6烷基、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷氧基、三氟甲基或三氟甲氧基；

R⁴、R⁵和R⁶独立地代表氢或C1-6烷基；

R⁷和R⁸独立地代表氢、C1-6烷基或苯基，其苯基任选被一个或一个以上的独立选自C1-6烷基、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷氧基、三氟甲基或三氟甲氧基的基团取代；

X代表-(CH₂)_n-，其中n代表0或1；且

A代表芳族碳环或含有1-3个相同或不同的选自O、N和S杂原子的5或6元杂环芳环。

式(I)化合物及其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体的优点在于它们是巨嗜细胞中存在的一氧化氮合成酶的可诱导的同工酶(iNOS)是强效抑制剂。

本发明进一步提供这些化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体的制备方法。

根据本发明本文还提供式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体作为药物。

本发明的另一个方面是提供式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体在用于治疗或预防其中抑制一氧化氮合成酶活性是有益的疾病或病症的药物制备中的用途。

本发明的另一个更特殊的方面是提供式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体在用于，以治疗或预防炎性疾病的药物制备中的用途。

根据本发明，还提供治疗或减少其中抑制一氧化氮合成酶有益的疾病或病症发病危险的方法，该方法包括给予患有或可能有患所述疾病或病症危险的人有效治疗量的式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体。

更具体地，本发明还为患有或可能有患炎症疾病危险的人提供治疗或减少患炎性疾病危险的方法，其中的方法包括给予患者有效治疗量的式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体。

本发明化合物还可有利地与第二种药学活性物质，尤其是可诱导的环氧酶(COX-2)同工酶的选择性抑制剂联合用药。由此，本发明的再一个方面是提供将式(I)化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体与COX-2抑制剂联合用药以治疗炎症、炎性疾病以及与炎症相关的疾病的用途。并且，对于患有或可能有患炎症、炎性疾病和与炎症相关疾病危险的人，本发明还提供治疗或减少所述疾病发病危险的方法，其中的方法包括以有效治疗量的式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体与COX-2抑制剂对患者联合用药。

在式(I)中的A优选代表苯并环。

在式(I)中的R¹优选代表氢。此外，在式(I)中R¹优选代表氟代。

在式(I)中的R²优选代表氟代。

在其他优选实施方案中，式(I)中n值为0。

本发明的具体化合物包括：

(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-1，3，4，10a-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-1，3，4，10a-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4-氨基-5-氟-3b′，4′，6′，7′-四氢螺环[喹唑啉-2，5′(2H，9′H)-噻吩并[3，2-a]中氮茚]-9′-酮；(R^*S^*)-4-氨基-5-氟-3b′，4′，6′，7′-四氢螺环[喹唑啉-2，5′(2H，9′H)-噻吩并[3，2-a]中氮茚]-9′-酮；(R^*R^*)-4-氨基-5-氟-6′，7′，9′，9a′-四氢螺环[喹唑啉-2，8′(2H，4′H)-噻吩并[2，3-a]中氮茚]-4′-酮；(R^*S^*)-4-氨基-5-氟-6′，7′，9′，9a′-四氢螺环[喹唑啉-2，8′(2H，4′H)-噻吩并[2，3-a]中氮茚]-4′-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-7-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-7-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-8-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-8-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-9-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-9-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-10-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-10-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-7，8-二氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-7，8-二氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-7-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-7-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-8-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-8-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-8-甲氧基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-8-甲氧基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-8-氰基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-8-氰基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-8-氰基-5′，8′-二氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-8-氰基-5′，8′-二氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-7，8，10，10a-四氢螺环[吡啶并[3，4-a]中氮茚-9，2′(1′H)-喹唑啉]-5-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-7，8，10，10a-四氢螺环[吡啶并[3，4-a]中氮茚-9，2′(1′H)-喹唑啉]-5-酮；(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-6b，7，9，10-四氢螺环[萘并[2，1-a]中氮茚-8，2′(1′H)-喹唑啉]-12-酮；(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-6b，7，9，10-四氢螺环[萘并[2，1-a]中氮茚-8，2′(1′H)-喹唑啉]-12-酮；及其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体。

除另有说明外，本文涉及的术语“C1-6烷基”是指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基或含有3-6个碳原子的环烷基。这些基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、环丙基和环己基。

除另有说明外，本文涉及的术语“C2-6链烯基”是指含有2-6个碳原子并含有一个双键的直链或支链烃基或含有3-6个碳原子并含有一个双键的环烃基。这些基团的实例包括乙烯基、1-和2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、2-丁烯基、环戊烯基和环己烯基。

除另有说明外，本文涉及的术语“C2-6炔基”是指含有2-6个碳原子并含有一个叁键的直链或支链烃基。这些基团的实例包括乙炔基、1-和2-丙炔基和2-丁炔基。

除另有说明外，本文涉及的术语“C1-6烷氧基”是指含有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基。这些基团的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。

其它基团，例如，烷硫基，作类似解释。

前述的制备本发明化合物，或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体的方法，包括使式(II)化合物

其中R¹和R²的定义同上，与式(III)化合物或其保护的衍生物反应，

其中R³、A和X的定义同上。

该反应可以在极性溶剂，例如，甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，在适当温度下，通常在20℃至溶剂沸点之间进行，或没有溶剂而在20℃-200℃之间的温度下进行。我们发现有时采用保护形式的式(III)化合物较方便，例如缩醛如二乙氧基缩醛。该过程因此优选在酸催化剂存在下进行。所需的缩醛可以采用本领域熟知的方法使未保护的式(III)化合物与醇如乙醇反应而形成。

本发明包括盐形式的式(I)化合物，尤其是酸加成盐。合适的盐包括与有机酸及无机酸形成的那些盐。尽管在所讨论的化合物的制备和纯化中可能使用非药学上可接受的酸，这些酸加成盐通常是药学上可接受的。由此，优选的盐包括那些与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、甲磺酸或苯磺酸形成的盐。

式(I)化合物的盐可以使游离碱、或其盐、对映体、外消旋体或互变异构体与一个或一个以上当量的适当的酸反应形成。该反应可以在该盐不溶的溶剂或介质或在该盐可溶的溶剂中进行，例如，水、二噁烷、乙醇、四氢呋喃或乙醚、或它们的混合物，可用真空或冷冻干燥将其除去。该反应也可能为复分解过程或者在离子交换树脂上进行。

新的式(II)和式(III)中间体构成了本发明的另一个方面。

式(II)化合物可采用诸如WO97/14686描述的方法制备。

式(III)化合物或者自身己知的或者采用本领域熟知的方法制备，例如，式(III)化合物可以通过式(IV)化合物环化获得，

其中R³、A和X的定义如上而M是碱金属或碱土金属。这些金属M的例子包括锂、钠、钾或镁。

式(IV)化合物可以采用本领域熟知的方法用金属M或其有机金属衍生物或盐处理式(IV′)化合物而原位形成，其中Hal代表卤原子，尤其是溴或碘。该反应最好在非质子传递溶剂如乙醚、四氢呋喃或二甘醇二甲醚中于-100℃和30℃之间温度下进行。

式(IV′)化合物可以通过式(V)化合物与式(VI)化合物的酸衍生物反应制备其中R³、A、X和Hal的定义同前，而L是离去基团。该反应可在有机溶剂如乙醇、二氯甲烷或二甲基甲酰胺中，在0℃至溶剂沸点之间的温度下进行。该反应可加碱催化；可用的碱包括有机胺(如，三乙胺或吡啶)和碱金属的氢氧化物、醇盐或氢化物。合适的离去基团包括卤素(尤其是氯)和咪唑。这些酸的衍生物可以采用本领域熟知的方法由相应的酸(式(VI)化合物其中L是OH)制备。

可以采用保护形式的中间体化合物。保护基以及将其除去的详细过程可以通过查阅标准参考书Greene和Wuts编写的“ProtectingGroups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)”第二版(1991)而发现。

本发明化合物及中间体可以从反应混合物中分离出来并且，如果需要的话，采用标准技术进一步纯化。

式(I)化合物可以以对映体形式存在。因此，所有对映体、非对映体、外消旋体及其混合物均包括在本发明的范围内。采用常规技术，如，分步结晶或HPLC分离化合物的外消旋体混合物可以将多种旋光异构体分离出来。

中间体化合物也可能以对映体形式存在并且可以使用纯化的对映体、非对映体、外消旋体或混合物。

式(I)化合物可以互变异构体形式存在。式(I)化合物以其中一种互变异构体或其混合物形式提供。

式(I)化合物、和其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体和互变异构体是有用的，因为它们在动物体内具有药理学活性。特别是，这些化合物作为一氧化氮合成酶抑制剂是有活性的。更特别的是，它们是存在于巨嗜细胞的可诱导的一氧化氮合成酶的同工酶的抑制剂，而这预期在治疗中，例如，作为抗炎药是有用的。

这些化合物及其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体和互变异构体的适应症是用于治疗或预防部分原因是由于一氧化氮合成酶合成或过量合成所致的疾病或病症。特别是，这些化合物的适应症是用于治疗包括人在内的哺乳动物的炎性疾病。

应特别指出的疾病有：

骨关节炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风性关节炎和其它关节疾病、关节发炎；

湿疹、牛皮癣、皮炎或其它皮肤炎症性疾病如晒斑；

炎症性眼病包括葡萄膜炎和结膜炎；

与炎症有关的肺病，例如，哮喘、支气管炎、pigeon、农民肺、急性呼吸窘迫综合征；

菌血症、内毒素血症(脓毒性休克)、口疮性溃疡、牙龈炎、发热、疼痛和胰腺炎；

胃肠道病症包括克罗恩氏病、萎缩性胃炎、胃炎varialoforme、溃疡性结肠炎、腹腔疾病、局部性回肠炎、消化性溃疡、刺激性肠道综合征、由于感染如幽门螺杆菌(helicobacter pylori)感染或非甾体类抗炎药治疗引起的胃肠道损伤；

以及其它与炎症相关的病症。

这些化合物对于治疗和减轻急性或慢性炎症性或神经性疼痛或中枢源疼痛也是有用的。

除上文提及到的之外，式(I)化合物和其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体和互变异构体还可用于治疗或预防其他疾病或病症。例如，这些化合物可用于治疗动脉粥样硬化、囊性纤维变性、脓毒性/或中毒性休克有关的低血压，治疗免疫系统失调，在器官移植治疗中作为短期免疫抑制辅助药，治疗与糖尿病有关的血管并发症，与细胞因子如TNF或白介素联合用药。

式(I)化合物还可表现出对一氧化氮合成酶的神经同工酶的抑制活性。因此也可有利于治疗缺氧，如在下列情况下，心搏停止和休克，神经变性病包括一些疾病中的神经变性和/或神经坏死如缺氧，低血糖，癫痫，和外部损伤(例如脊髓和头部受伤)，高压氧惊厥和中毒，痴呆如早老性痴呆，阿尔海默氏病和与爱滋病相关的痴呆，西登哈姆氏舞蹈病，帕金森氏病，拉塔氏综合征，亨廷顿氏病，肌萎缩性侧索硬化，科尔萨可夫氏病，与大脑脉管病相关的痴愚，睡眠障碍，精神分裂症，抑郁，孤独癖，季节性情感障碍，jet-lag，与经前期综合征(PMS)相关的抑郁或其它综合征，焦虑和脓毒性休克。预期式(I)化合物还可显示出在预防和逆转对阿片制剂和安定类的耐受性，治疗药物成瘾性，治疗偏头痛和其它血管性头痛、神经源性炎症，治疗胃肠道蠕动失调、癌症和在引产方面显示出活性。

对于上述治疗上的适应症，自然，用药剂量随所用化合物、治疗方式和所需的治疗而变化。然而，一般地说，当每天以剂量1mg至2000mg之间的固体形式的化合物用药时可取得满意的效果。

式(I)化合物，及其药学上可接受的衍生物，可以其自身使用，或以适合的药用组合物形式使用，在组合物中该化合物或其衍生物与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合。可以通过，但不限于，肠内(包括口服、舌下或直肠内)、鼻内、静脉内、局部或其它胃肠外途径用药。选择和制备合适的药物制剂的常规方法参见，例如，“Pharmaceuticals-The Science of Dosage From Designs”，M.E.Aulton，Churchill Livingstone，1998。该药用组合物优选含有低于80％更优选低于50％的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体。

本文还提供这些药用组合物的制备方法，其包括混合各组分。

式(I)化合物，及其药学上可接受的衍生物，还可优先与COX-2抑制剂联合用药。特别优选的COX-2抑制剂是Celecoxib和MK-966。NOS抑制剂和COX-2抑制剂可以共同配制成以单位剂量形式用药的同一药用组合物，或者对各组分进行分别制剂，这样可以同时或顺次地以各自的剂量用药。

本发明以下列实施例说明，但不受其限制：

制备12，3-二氯-6-碘代苯甲酰氯a) 2，3-二氯-6-碘代苯甲酸

0℃下将正-丁基锂(1.45M的己烷溶液，19.4mmol，13.4ml)滴加到搅拌的二异丙胺(21.4mmol，3.0ml)的四氢呋喃(90ml)溶液中。 30分钟后，将该溶液冷至-78℃并滴加1，2-二氟-4-碘代苯(5.30g，19.4mmol)的THF(10ml)溶液。10分钟后，小心加入固体二氧化碳并任此混合物升至室温并超过16小时。该混合物以水稀释并以乙酸乙酯提取两次。水层以稀释的盐酸水溶液酸化并以乙醚提取两次。提取液以硫酸钠干燥并蒸发给出黄色固体的标题化合物(3.59g)。300MHz ¹HNMR(d₆-DMSO)11.5(1H，br.s)，7.82(1H，d，j8.4Hz)，7.44(1H，d，J8.4Hz)。b) 2，3-二氯-6-碘代苯甲酰氯

将DMF(一滴)加到搅拌的2，3-二氯-6-碘代苯甲酸(1.53g，4.83mmol)和草酰氯(2ml)的乙酰乙酯(20ml)溶液中。2小时后，将溶剂蒸干并直接使用此产物。

制备23-氰基-6-碘代苯甲酰氯a)2-氨基-5-氰基苯甲酸甲酯

2-氨基-5-溴苯甲酸甲酯(4.6g，20mmol)和氰化铜(I)(3.6g，40mmol)在N-甲基吡咯烷二酮(20ml)溶液中于200℃下加热4小时。冷却至室温后，该溶液以水稀释，并以乙酸乙酯提取。水提液以2N盐酸酸化并过滤。分离有机层，以硫酸钠干燥并蒸干。残留物以含50％乙酸乙酯的己烷液作为洗脱剂经快速硅胶柱层析纯化而得到无色油状的标题化合物(1.0g)。MS(+EI)m/z 176[M⁺]。b)2-碘-5-氰基苯甲酸甲酯

在0℃下用10分钟的时间里将亚硝酸钠(0.8g，11.4mmol)滴加到搅拌的2-氨基-5-氰基苯甲酸甲酯(2.0g，11.4mmol)的水(30ml)溶液和浓硫酸(15ml)中。15分钟后5℃下，快速加入碘化钾(3.5g，21mmol)的水(30ml)溶液并任此混合物升至室温。加入10％的硫代硫酸钠水溶液，以乙酸乙酯提取混合物，提取物以硫酸镁干燥并蒸干。残留物以含20％乙酸乙酯的己烷作为洗脱剂经快速硅胶柱层析纯化而得到无色油状的标题化合物(2.8g)。MS(+EI)m/z 287[M⁺]。c)2-碘-5-氰基苯甲酸

将氢氧化钠(0.44g，11mmol)的水(10ml)溶液加入到2-碘-5-氰基苯甲酸甲酯(2.7g，9.4mmol)的甲醇溶液中。将混合物搅拌20小时，然后最大限度地蒸发溶剂，残留物以2N盐酸酸化。过滤所得沉淀并干燥给出白色固体(1.7g)。MS(-CI)m/z 272[M-H]⁺。d)2-碘-5-氰基苯甲酰氯

以制备1(b)的方法制备该化合物并直接应用。

其它酰氯化合物或者本身已知或者由已知酸通过制备1(b)的方法制备。

制备31-(2-溴-6-氯苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮

将2-溴-6-氯苯甲酰氯(0.5mmol)的二氯甲烷(5ml)溶液滴加到2，3-二氢-4-吡啶酮(5.1mmol，495mg)和三乙胺(1.2ml)的二氯甲烷(20ml)溶液中。搅拌30分钟后，该溶液以水稀释，分离，水提液进一步以二氯甲烷提取，合并有机提取液并以盐水洗涤，硫酸钠干燥并蒸发，残留物以含30％乙酸乙酯的己烷作为洗脱剂经快速硅胶柱层析纯化而得到浅黄色油状的标题化合物(629mg)。MS(+CI)m/z 316[M+H]⁺。

下列中间体由2，3-二氢-4-吡啶酮和适当酰氯化合物类似地制备：

(i)1-(2-溴-5-甲基苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：无色油状，MS(+EI)m/z 293/295[M⁺]。

(ii)1-(3-溴-4-吡啶酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：白色固体，MS(+EI)m/z 280/282[M⁺]。

(iii)1-(2，3-二氯-6-碘代苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：白色固体，MS(+EI)m/z 395/397[M⁺]。

(iv)1-(5-氰基-2-碘代苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：无色油状，不经过纯化而使用。

(v)1-(2-甲基-6-碘代苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(+EI)m/z 341[M⁺]。

(vi)1-(2-溴-3-氯代苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(+EI)m/z313/315[M⁺]。

(vii)1-(2-溴-4-氯代苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(+EI)m/z314[M⁺]。

(viii)1-(2-溴-5-氯代苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(+EI)m/z314[M⁺]。

(ix)1-(2-溴-3-噻吩酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(-CI)m/z284/286[M-H]⁺。

(x)1-(2-溴-5-甲氧基苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(+EI)m/z 309/311[M⁺]。

(xi)1-(2-碘-1-萘酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：MS(-CI)m/z 376[M-H]⁺。

(xii)1-(2-碘-3-噻吩酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮：无色油状：300MHz¹H NMR(d₆-DMSO)7.55(1H，d，J5.4Hz)，7.47-7.43(1H，m)，7.00(1H，d，J5.4Hz)，5.40(1H，d，J8.1Hz)，4.18(2H，t，J7.2Hz)，2.68(2H，t，J7.2Hz)。

制备4(±)-7-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

将1-(2-溴-6-氯苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮(制备3)(300mg，0.954mmol)，三乙胺(0.39mmol，0.54ml)，甲酸(0.05ml，1.3mmol)和双(三苯基膦)二乙酸基钯(47mg，0.063mmol)的DMF(3ml)混合液在80℃下加热2小时。溶液冷却后以硅藻土过滤，用水稀释，用乙酸乙酯提取两次，提取液以硫酸钠干燥并蒸发。残留物以50％乙酸乙酯的己烷为洗脱液通过快速硅胶柱层析纯化得到无色油状的标题化合物(70mg)。MS(+CI)m/z 235/23 7[M+H]⁺。

制备5-7中的化合物采用制备4的方法合成：

制备5(±)-7，8-二氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

从1-(2，3-二氯-6-碘苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。白色固体。MS(+EI)m/z 269/271[M⁺]。

制备6(±)-8-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

从1-(2-溴-5-氯苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。无色油状物。MS(+EI)m/z 235/237[M⁺]。

制备7(±)-3b，4，6，7-四氢噻吩并[3，2-a]中氮茚-5，9-二酮

从1-(3-溴-2-噻吩)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。无色油状。MS(+CI)m/z 208[M+H]⁺。

制备8(±)-8-甲基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

将1-(2-溴-5-甲基苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮(1.19g，4.03mmol)，三-正-丁基氢化锡(1.14ml，4.24mmol)和偶氮双(异丁腈)(AIBN，66mg，10mol％)的甲苯(40ml)混合液在95℃下加热2小时，冷却，蒸发并以30％乙酸乙酯的己烷为洗脱液通过快速硅胶柱层析纯化得到浅黄色油状的标题化合物(276mg)。MS(+EI)m/z 215[M⁺]。

制备9-12中的化合物采用制备8的方法合成：

制备9(±)-8-氰基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

从1-(5-氰基-2-碘苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。MS(-CI)m/z226[M⁺]。

制备10(±)-7，8，10，10a-四氢吡啶并[3，4-a]中氮茚-5，9-二酮

从1-(3-溴-4-吡啶酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。MS(+EI)m/z 202[M⁺]。

制备11(±)-7-甲基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

从1-(2-甲基-6-碘苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。MS(+EI)m/z215[M⁺]。

制备12(±)-6b，7，9，10-四氢萘并[2，1-a]中氮茚-8，12-二酮

从1-(2-碘-1-萘酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。MS(+CI)m/z 252[M+H]⁺。

制备13(±)-8-甲氧基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

在-78℃下将丁基锂(3.1ml，0.9M的己烷液，2.8mmol)滴加到1-(2-溴-5-甲氧基苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮(0.75g，2.4mmol)的THF(20ml)溶液中。搅拌2小时后，以水淬灭反应，乙酸乙酯提取，提取液以硫酸镁干燥并蒸发。残留物以50％乙酸乙酯的己烷为洗脱液通过快速硅胶柱层析纯化得到无色油状的标题化合物(240mg)。MS(+EI)m/z 231[M⁺]。

制备14-16中的化合物采用制备13的方法合成：

制备1410-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

从1-(2-溴-3-氯苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始：无色油状物。MS(+EI)m/z 235/237[M⁺]。

制备159-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮

从1-(2-溴-4-氯苯甲酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始：无色油状物。MS(+EI)m/z 235/237[M⁺]。

制备166，7，9，9a-四氢噻吩并[2，3-a]中氮茚-4，8-二酮

从1-(2-溴-3-噻吩酰基)-2，3-二氢-4-吡啶酮起始。MS(+CI)m/z 208[M+H]⁺。

实施例1(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-1，3，4，10a-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)喹唑啉]-6-酮

将2-氨基-6-氟苯甲脒(0.13g，0.61mmol)和1，3，4，10a-四氢[吡啶并[2，1-a]]异吲哚-2，6-二酮(0.12g，0.59mmol)(J.C.S.Perkin Trans.1，1984，2477；Tetrahedron，1993，2239)的乙醇(15ml)溶液搅拌回流18小时。使混合物冷却并过滤得到黄色固体(0.1g)，以快速中性氧化铝柱层析纯化，以二氯甲烷/甲醇(99∶1-95∶5)为洗脱液进行洗脱，得到黄色固体的标题化合物的一种非对映异构体(含有RR和SS对映体)(0.05g)。M.p.207-209℃。

实施例2(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-1，3，4，10a-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)喹唑啉]-6-酮

将沉淀的实施例1产物过滤后浓缩得到棕色油(0.19g)。以快速中性氧化铝柱层析纯化，以二氯甲烷/甲醇(99∶1-95∶5)为洗脱液进行洗脱，得到第二种黄色固体的标题化合物的非对映异构体(含有RS和SR对映体)(0.03g)。M.p.184-186℃。

实施例3(±)-(R^*R^*)-4-氨基-5-氟-3b′，4′，6′，7′-四氢螺环[喹唑啉-2，5′(2H，9′H)-噻吩并[3，2-a]中氮茚]-9′-酮

将2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐(100mg，44mmol)和3b，4，6，7-四氢噻吩并[3，2-a]中氮茚-5，9-二酮(制备7，80mg，39mmol)的乙醇(10ml)溶液加热回流5小时。蒸发溶剂，残留物采用二氯甲烷-甲醇混合液为洗脱液通过快速硅胶柱层析分离。第一洗脱部分提供标题化合物(63mg，43％)的浅黄色固体，m.p.193-195℃。MS(+CI)m/z 343[M+H]⁺。

实施例4(±)-(R^*S^*)-4-氨基-5-氟-3b′，4′，6′，7′-四氢螺环[喹唑啉-2，5′(2H，9′H)-噻吩并[3，2-a]中氮茚]-9′-酮

从实施例3中所述层析的第二洗脱部分得到标题化合物(33mg，22％)，m.p.218-220℃。MS(+CI)m/z 343[M+H]⁺。

实施例5-30的化合物采用所述中间体以实施例3和4的方法制备。

实施例5-6的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和6，7，9，9a-四氢噻吩并[2，3-a]中氮茚-4，8-二酮(制备16)。

实施例5(±)-(R^*R^*)-4-氨基-5-氟-6′，7′，9′，9a′-四氢螺环[喹唑啉-2，8′(2H，4′H)-噻吩并[2，3-a]中氮茚]-4′-酮

获得其盐酸盐，m.p.＞275℃。MS(+CI)m/z 343[M+H]⁺。

实施例6(±)-(R^*S^*)-4-氨基-5-氟-6′，7′，9′，9a′-四氢螺环[喹唑啉-2，8′(2H，4′H)-噻吩并[2，3-a]中氮茚]-4′-酮

获得其盐酸盐，m.p.225-230℃。MS(+CI)m/z 343[M+H]⁺。

实施例7和8的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和7-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备4)。

实施例7(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-7-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮盐酸盐

MS(+CI)m/z 371/373[M+H]⁺；300MHz ¹H NMR(d₆-DMSO)7.62(1H，d，J7.5Hz)，7.54(1H，t，J7.5Hz)，7.45(1H，d，J7.2Hz)，7.13(1H，dt，J6.6，6.6，8.1Hz)，6.59(1H，s)，6.40(1H，d，J7.2Hz)，6.37-6.33(1H，m)，5.85-5.8(2H，br，s)，4.79(1H，dd，J3.3，11.4Hz)，4.12(1H，dd，J3.9，13.8Hz)，3.40-3.35(1H，m)，2.60-2.55(1H，m)，1.91(1H，d，J12Hz)，1.37(1H，dt，J5.7，12.9，12.9Hz)，1.04(1H，t，J11.7Hz)。

实施例8(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-7-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮盐酸盐

MS(+CI)m/z 371/373[M+H]⁺；300MHz ¹H NMR(d₆-DMSO)7.61-7.46(4H，m)，7.27-7.20(2H，m)，6.74(1H，d，J8.1Hz)，6.44(1H，dd，J8.4，12.3Hz)，4.75(1H，dd，J3.6，3.9Hz)，3.32-3.19(1H，m)，2.0-1.95(1H，m)，1.5-1.4(1H，m)，1.3-1.1(1H，m)。

实施例9和10的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和8-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备6)。

实施例9(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-8-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.308℃。(分解)。

实施例10(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-8-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

经反向HPLC纯化后得其三氟乙酸盐(无定形)。MS(+CI)m/z 371[M+H]⁺；MS(-CI)m/z 369[M-H]⁺。

实施例11和12的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和9-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备15)。

实施例11(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-9-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮获得其盐酸盐，m.p.225℃。(分解)。

实施例12(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-9-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.210℃。(分解)。

实施例13和14的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和10-氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备14)。

实施例13(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-10-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，MS(+CI)m/z 371[M+H]⁺。

实施例14(±)-(R⁺S^*)-4′-氨基-10-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，MS(+CI)m/z 371[M+H]⁺。

实施例15和16的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和7，8-二氯-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备5)。

实施例15(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-7，8-二氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.258-260℃。

实施例16(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-7，8-二氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.259-261℃。

实施例17和18的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和7-甲基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备11)。

实施例17(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-7-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.201-204℃。

实施例18(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-7-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.215-218℃。

实施例19和20的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和8-甲基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备8)。

实施例19(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-8-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.238-239℃。

实施例20(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-8-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.222-224℃。

实施例21和22的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和8-甲氧基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备13)。

实施例21(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-8-甲氧基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮获得其盐酸盐，MS(+CI)m/z 367[M+H]⁺。

实施例22(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-8-甲氧基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，MS(+CI)m/z 367[M+H]⁺。

实施例23和24的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和8-氰基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备9)。

实施例23(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-8-氰基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮获得其盐酸盐，m.p.241℃(分解)。

实施例24(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-8-氰基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1 ′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.290℃(分解)。

实施例25和26的化合物得自2-氨基-3，6-二氟苯甲脒二盐酸盐和8-氰基-1，3，4，10b-四氢吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，6-二酮(制备9)。

实施例25(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-8-氰基-5′，8′-二氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

获得其盐酸盐，m.p.243℃(分解)。

实施例26(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-8-氰基-5′，8′-二氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮

M.p.180℃(分解)。

实施例27和28的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和7，8，10，10a-四氢吡啶并[3，4-a]中氮茚-5，9-二酮(制备10)。

实施例27(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-7，8，10，10a-四氢螺环[吡啶并[3，4-a]中氮茚-9，2′(1′H)-喹唑啉]-5-酮

获得其盐酸盐。MS(+CI)m/z 338[M+H]⁺；300MHz ¹H NMR(d₆-DMSO)8.97(1H，s)，8.72(1H，d，J5.1Hz)，7.67(1H，d，J5Hz)，7.20(1H，q，J7Hz)，6.8(1H，br.s)，6.46-6.38(2H，m)，4.97(1H，dd，J3.6，12Hz)，4.18(1H，dd，J4.5，12.6Hz)，3.45(1H，dt，J3.3，12.9Hz)，2.76-2.72(1H，m)，1.97(1H，d，J12Hz)，1.45(1H，dt，J5.4，12.9Hz)，1.10(1H，t，J12.0Hz)。

实施例28(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-7，8，10，10a-四氢螺环[吡啶并[3，4-a]中氮茚-9，2′(1′H)-喹唑啉]-5-酮

MS(+CI)m/z 338[M+H]⁺；300MHz ¹H NMR(d₆-DMSO)8.95(1H，s)，8.74(1H，d，J4.8Hz)，7.69(1H，d，J5.1Hz)，7.44-7.25(3H，m)，6.78(1H，d，J7.5Hz)，6.52-6.46(1H，m)，4.94(1H，dd，J3.6，12.3Hz)，4.20(1H，dd，J4.8，13.8Hz)，3.8-3.43(1H，dd，被H₂O遮蔽)，2.71(1H，br.d，J9Hz)，1.98(1H，d，J13.2Hz)，1.55(1H，dt，J5.1，12.9Hz)，1.26(1H，t，J12.9Hz)。

实施例29和30的化合物得自2-氨基-6-氟苯甲脒二盐酸盐和6b，7，9，10-四氢萘并[2，1-a]中氮茚-8，12-二酮(制备12)。

实施例29(±)-(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-6b，7，9，10-四氢螺环[萘并[2，1-a]中氮茚-8，2′(1′H)-喹唑啉]-12-酮

获得其盐酸盐，m.p.208-210℃。

实施例30(±)-(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-6b，7，9，10-四氢螺环[萘并[2，1-a]中氮茚-8，2′(1′H)-喹唑啉]-12-酮

获得其盐酸盐，m.p.235-237℃。

筛选

根据本发明的化合物的药理学活性以下列实验筛选：筛选1

式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体的一氧化氮合成酶抑制活性可以根据Frstermann等，Eur.J.Pharm.，1992，225，161-165中的步骤筛选。一氧化氮合成酶将3H-L-精氨酸转变为³H-L-瓜氨酸，后者可通过阳离子交换层析分离并以液体闪烁计数定量。

从诱导后的培养的鼠巨嗜细胞系J 774A-1(得自皇家癌症研究基金会实验室)制备酶。J-774A-1细胞在补充10％胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺和抗生素(青霉素G 100单位/ml，链霉素100mg/ml和两性霉素B 0.25mg/ml)的Dulbeccos氏改良Eagles培养基(DMEM)中培养。细胞在37℃恒温的含有35ml培养基的225cm3培养瓶中和含5％CO₂的调节湿度的空气下常规生长。

以细胞对干扰素-g(IFNg)和脂多糖(LPS)的反应诱导一氧化氮合成酶产生。从融合培养瓶中去除培养基而以25ml(每瓶)含有1mg/mlLPS和10单位/ml IFNg的新鲜培养基代替。为时17-20小时的培养后，将培养瓶表面的细胞层刮取到培养基中而收获细胞。离心(1000g离心10分钟)收集细胞并将含有50mM Tris-HCl(20℃下pH7.5)、10％(v/v)甘油、0.1％(v/v)Triton-X-100、0.1mM二硫苏糖醇和混合的蛋白酶抑制剂包括亮肽素(2mg/ml)、大豆胰蛋白酶抑制剂(10mg/ml)、抑肽酶(5mg/ml)和苯甲基磺酰氟(50mg/ml)的溶液加入细胞团以制备溶胞产物。

检测时，将25μl底物混合液(50mM Tris-HCl(20℃下pH7.5)、400μM NADPH、20μM黄素腺嘌呤二核苷酸、20μM黄素单核苷酸、4μM四氢生蝶呤、12μM L-精氨酸和0.025mCi L-[³H]精氨酸)加入到含有25μl检测化合物的50mM Tris-HCl溶液的96孔滤板(孔径0.45μM)的孔中。加入50μl细胞溶解物(制备如上)启动反应并在室温下孵育1小时后加入50μl 3mM硝基精氨酸和21mM EDTA的水溶液终止反应。

采用Dowex AG-50W从标记的L-精氨酸中分离标记的L-瓜氨酸。150μl 25％的Dowex 50W(Na⁺形式)的水浆加入检测液后全部滤入96孔板。75μl滤液样品加到含有固体闪烁剂的96孔板中。任样品干燥后以闪烁计数定量测定L-瓜氨酸。

在典型的实验中，每份75μl样品的本底活性为300dpm，其在试剂对照组中升至1900dpm。化合物活性以IC₅₀(检测中对酶产生50％抑制的药物浓度)表示并检测氨基胍，其IC₅₀(50％抑制浓度)为10μM，以此为标准校正实验步骤。检测一定浓度范围的化合物并以其抑制作用计算IC₅₀值。在100μM下抑制酶活性至少达25％的化合物被归入有活性，并且至少重复检测一次。

在上述筛选中，检测实施例1-30中的化合物并得到低于25μM的IC₅₀值，说明其有希望显示出有用的治疗活性。筛选2

下列检测可证实化合物对诱导的人体一氧化氮合成酶也具有抑制作用。

自诱导后的培养的人单克隆肾上腺癌细胞系DLD1(得自European Collection of Animal Cell Culture--细胞系编号90102540)制备酶。DLD1细胞以补充10％胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺和抗生素(100单位/ml青霉素G、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml二性霉素B)的RPMI1640培养基培养。细胞在37℃恒温的含有35ml培养基的225cm³培养瓶中并在调节湿度的含5％CO₂的空气下常规生长。

以细胞对干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-1β(IL-1β)的反应诱导一氧化氮合成酶产生。从融合培养瓶中去除培养基而代之以25ml(每瓶)含有250单位/mlIL-1β和1000单位/mlIFN-γ的新鲜培养基。为时17-20小时的培养后，将培养瓶表面的单细胞层刮取到培养基中而收获细胞。离心(1000g离心10分钟)收集细胞，将含有50mM Tris-HCl(20℃下pH7.5)、10％(v/v)甘油、0.1％(v/v)Triton-X 100、0.1mM二硫苏糖醇和混合的蛋白酶抑制剂包括亮肽素(2μg/ml)、大豆胰蛋白酶抑制剂(10μg/ml)、抑肽酶(5μg/ml)和苯基磺酰氟(50μg/ml)的溶液加入细胞团而制备溶胞产物。

检测时，将25μl底物混合液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、400μMNADPH、20μM黄素腺嘌呤二核苷酸、20μM黄素单核苷酸和4μM四氢生物蝶呤)加入96孔板的孔中。待测化合物与酶预孵育并加入40μl细胞溶解物(制备如上)在37℃下孵育1小时，1小时后，加入溶于50mM Tris-HCl的10μl的30μM L-精氨酸和0.025μCi L-[³H]精氨酸以启动酶促反应。继续在37℃下孵育1小时，加入50μl 3mM硝基精氨酸和21mM EDTA的水溶液终止反应。

采用Dowex AG-50W从标记的L-精氨酸中分离标记的L-瓜氨酸。将120μl 25％的Dowex 50W的水浆加入到96孔滤板(孔径0.45μm)中。向孔中加入120μl最终的检测混合液。取75μl滤液样品并加到含有固体闪烁剂的96孔板中。任样品干燥后以闪烁计数定量测定L-瓜氨酸。

在典型的实验中，试剂对照组的每份75μl样品的本底活性为300dpm，在酶存在时升至3000dpm。化合物活性以IC₅₀(检测中对酶产生50％抑制的药物浓度)表示并检测L-NMMA，其IC₅₀约为0.4μM，以此为为标准校正实验步骤。检测一定浓度范围的化合物并以其抑制作用计算IC₅₀值。

在这项筛选中，实施例1-30中的化合物的IC₅₀值低于25μM，说明其有希望显示出有用的治疗活性。

Claims

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体

其中

R³代表一个或一个以上的取代基，它们独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、卤素、羟基、三氟甲基、氨基、氰基、硝基、三氟甲氧基、甲磺酰基、氨磺酰基、-NR⁴R⁵、-COOR⁶、-CONR⁷R⁸、苄氧基、苯基、或含有1-3个可能相同或不同的选自O、N或S的杂原子的五元杂环芳环，其苯基和五元杂环芳环被任选取代，而任选取代基是C1-6烷基、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-6烷氧基、三氟甲基或三氟甲氧基；

R⁴、R⁵和R⁶独立地代表氢或C1-6烷基；

X代表-(CH₂)_n-，其中n代表0或1；且

A代表芳族碳环或含有1-3个可能相同或不同的且选自O、N或S的杂原子的5或6元杂环芳环。

2.根据权利要求1的式(I)化合物，其中A代表苯并环。

3.根据权利要求1或2的式(I)化合物，其中R¹代表氢。

4.根据权利要求1或2的式(I)化合物，其中R¹代表氟代。

5.根据权利要求1-4任何一项的式(I)化合物，其中R²代表氟。

6.根据权利要求1-5任何一项的式(I)化合物，其中X代表-(CH₂)_n-且n代表零。

7.式(I)化合物为：

(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-1，3，4，10a-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-1，3，4，10a-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4-氨基-5-氟-3b′，4′，6′，7′-四氢螺环[喹唑啉-2，5′(2H，9′H)-噻吩并[3，2-a]中氮茚]-9′-酮；

(R^*S^*)-4-氨基-5-氟-3b′，4′，6′，7′-四氢螺环[喹唑啉-2，5′(2H，9′H)-噻吩并[3，2-a]中氮茚]-9′-酮；

(R^*R^*)-4-氨基-5-氟-6′，7′，9′，9a′-四氢螺环[喹唑啉-2，8′(2H，4′H)-噻吩并[2，3-a]中氮茚]-4′-酮；

(R^*S^*)-4-氨基-5-氟-6′，7′，9′，9a′-四氢螺环[喹唑啉-2，8′(2H，4′H)-噻吩并[2，3-a]中氮茚]-4′-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-7-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-7-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-8-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-8-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-9-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-9-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-10-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-10-氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-7，8-二氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-7，8-二氯-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-7-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-7-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-8-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-8-甲基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-8-甲氧基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-8-甲氧基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-8-氰基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-8-氰基-5′-氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-8-氰基-5′，8′-二氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-8-氰基-5′，8′-二氟-1，3，4，10b-四氢螺环[吡啶并[2，1-a]异吲哚-2，2′(1′H)-喹唑啉]-6-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-7，8，10，10a-四氢螺环[吡啶并[3，4-a]中氮茚-9，2′(1′H)-喹唑啉]-5-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-7，8，10，10a-四氢螺环[吡啶并[3，4-a]中氮茚-9，2′(1′H)-喹唑啉]-5-酮；

(R^*R^*)-4′-氨基-5′-氟-6b，7，9，10-四氢螺环[萘并[2，1-a]中氮茚-8，2′(1′H)-喹唑啉]-12-酮；

(R^*S^*)-4′-氨基-5′-氟-6b，7，9，10-四氢螺环[萘并[2，1-a]中氮茚-8，2′(1′H)-喹唑啉]-12-酮；

或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体。

8.根据权利要求1-7任何一项的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体，用作药物。

9.包含根据权利要求1-7任何一项的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体及药学上可接受的辅助、稀释剂或载体的药用组合物。

10.根据权利要求1-7任何一项的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体在制备用于治疗或预防其中抑制一氧化氮合成酶活性是有益的人体疾病或病症的药物中的用途。

11.权利要求10的用途，其中优先抑制可诱导的一氧化氮合成酶。

12.权利要求1-7任何一项的式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体在制备用于治疗或预防炎性疾病的药物中的用途。

13.权利要求12的用途，其中所述疾病是哮喘或类风湿性关节炎。

14.根据权利要求1-7任何一项的式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体在制备用于治疗或预防疼痛的药物中的用途。

15.根据权利要求1-7任何一项的式(I)化合物、或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体，与COX-2抑制剂一起在制备用于治疗或预防炎性疾病的药物中的用途。

16.治疗和减少其中抑制一氧化氮合成酶活性是有益的人类疾病或病症危险的方法，该方法包括给予患有或患这样的疾病或病症危险增加的人治疗有效量的权利要求1-7任何一项的的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体。

17.根据权利要求16的治疗方法，其中优先抑制可诱导的一氧化氮合成酶。

18.在患有或有患炎性疾病危险的人中治疗所述疾病或减少其危险的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的权利要求1-7任何一项的的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体。

19.权利要求18的治疗方法，其中所述疾病是哮喘或类风湿性关节炎。

20.在疼痛患者、或有患该病危险的人中治疗所述疾病或减少其危险的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的权利要求1-7任何一项的的式(1)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体。

21. 在炎症性疾病患者、或有患该病危险的人中治疗所述疾病或减少其危险的方法，该方法包括联合给予患者治疗有效量的权利要求1-7任何一项的的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体，及COX-2抑制剂。

22.式(III)化合物

其中R³、A及X的定义同权利要求1，条件是R³不代表氢。

23.权利要求1-7任一项的式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映体或互变异构体的制备方法，该方法包括使式(II)化合物或其盐：

其中R¹和R²的定义同权利要求1，与式(III)化合物或其保护的衍生物反应：

其中R³、A和X的定义同权利要求1。