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CN1261571C - 米黑木霉膨胀素蛋白质与编码dna序列 - Google Patents

米黑木霉膨胀素蛋白质与编码dna序列 Download PDF

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CN1261571C CNB988085488A CN98808548A CN1261571C CN 1261571 C CN1261571 C CN 1261571C CN B988085488 A CNB988085488 A CN B988085488A CN 98808548 A CN98808548 A CN 98808548A CN 1261571 C CN1261571 C CN 1261571C
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Abstract

本发明描述了一种新的微生物蛋白质，该蛋白质与植物苹果青霉素蛋白质具有显著的同源性，而且具有使滤纸强度降低和使纤维素膨胀的能力。本发明描述了编码此新蛋白质的DNA。

Description

米黑木霉膨胀素蛋白质与编码DNA序列
发明领域
本发明涉及源于微生物的膨胀素蛋白质及其编码DNA。
发明背景
水的渗透吸收是植物细胞膨胀的驱动力。当水进入细胞时，原生质体扩展，但受到细胞壁的限制。此外，嵌入到果胶、半纤维素和蛋白质的的胶状基质中的纤维素微纤丝聚合物的刚性复合物形成了成熟细胞中的部分细胞壁。长期以来人们认为一定存在某种“壁松弛”因子，该因子改变未成熟细胞壁的机械特性而使其能够进行延伸过程。McQueen-Mason等人，植物细胞(Plant cell)，4卷，1425～1433页(1992)通过采用重建方法研究了植物细胞的增大调节。这些作者发现，来自正在生长的黄瓜幼苗的细胞壁之粗蛋白质提取物具有诱导离体细胞壁扩展的能力。活性壁提取物的连续HPLC分级分离揭示出与活性相关的分子量为29和30kD的两种蛋白质。每种蛋白质依靠其自身能够诱导壁的扩展而没有可检测到的细胞壁分解性降解，其似乎调节离体细胞壁的“酸生长”反应，可能通过一种新的生化机制催化植物细胞壁的延展。
Shcherban等人，美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA)，92卷，9245-9249(1995)分离出了编码这两种黄瓜蛋白质的cDNA，并将它们与多种来源的无名表达的序列标记比较。从这些收集物中鉴别出了水稻和拟南芥属(Arabidopsis)苹果青霉素cDNA，其显示在水稻中至少有四种不同的苹果青霉素cDNA，而在拟南芥属中至少有六种不同的苹果青霉素cDNA。这些作者推断苹果青霉素在大小和序列上具有高度的保守性(在任何的配对比较之间，有60-87％氨基酸相同性，75-95％相似性)，在单子叶植物与双子叶植物间的进化趋异之前已经形成多基因家族。Shcherban等人认为：这种多基因家族的高度保守性表明苹果青霉素促进细胞壁延展的机制仅允许蛋白质结构有微小变化。
白质，它们似乎与表现出细胞壁延展特性的S1和S2蛋白质类似。在生长的番茄叶片[Keller等人，植物杂志(The Plant Journal)，8卷，第6期，795-802页(1995)]和燕麦胚芽鞘细胞壁[Li等人，植物(Planta)，191卷，349-356页(1993)]中也发现了类似的蛋白质。
Cosgrove等人，试验植物学期刊(J.Exp.Botany)，45卷，特刊，1711-1719页(1994)提出在苹果青霉素蛋白质与果胶酶和纤维素酶之间可能发生协作作用，其中所述的酶改变基质以使其它的壁延展机制更加有效。Fry，当代生物学(Current Biology)，4卷，第9期(1994)提出：在松弛的细胞壁中，苹果青霉素似乎不可能打破纤维素-纤维素键，因为在生长过程中微纤丝保持完整。因此，这些作者将所观察到的在滤纸上的氢键断裂降低为次要问题，并提出苹果青霉素可能通过引起半纤维素链从纤维素微纤丝上分离延长微纤丝间的束缚，从而允许延展。
尽管在细胞壁延展及其原因方面以前已经作了开拓性工作，但有关苹果青霉素的有效性和可操作性的工作仍然处于起步阶段。此外，到目前为止苹果青霉素的来源仅仅来源于植物，其表达系统对于大规模生产可能不理想。因而，能够大量由生物体生产的苹果青霉素类物质的简便资源很有价值，其中生物体是已有的生物物质的高产者，如真菌、细菌或其它熟知的微生物。
发明概述
本发明的一个目的是提供来源于非植物的微生物资源的膨胀素(swollenin)蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种膨胀素蛋白质，该蛋白质在熟知的微生物(如真菌或细菌)中表达以有利于其大量生产。
本发明的另一个目的是提供一种对应于微生物膨胀素的DNA序列，该DNA序列可以用于膨胀素蛋白质的工业化生产。
本发明的另一个目的是提供新的改变纤维素底物(如纸浆和纸、基于纤维素的纺织品纤维、动物饲料和谷物湿磨或干磨的多糖废弃产品或其它纤维素生物质)的有用方法。
根据本发明，提供了来源于真菌或细菌的部分或全部分离的膨胀素蛋白质。膨胀素蛋白质优选地来源于丝状真菌，更优选地来源于如木霉属(Trichoderma spp.)、腐质霉属(Humicola spp.)、脉孢菌属(Neurosporaspp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、镰孢属(Fusarium spp.)、青霉属(Penicilliumspp.)或粘帚霉属(Gliocladium spp.)的种的丝状真菌。最优选地来源于木霉属的种。在本发明的一个尤其优选的实施方案中，膨胀素包含根据SEQ.IDNO：2的序列，该序列与在SEQ.ID NO：2中提供的序列至少具有70％序列相同性，或包含根据SEQ.ID NO：2的序列的衍生物，其中所述的膨胀素还具有使滤纸强度降低和/或使棉花纤维膨胀的能力。
在本发明的另一个实施方案中，提供了来源于真菌或细菌的编码膨胀素蛋白质的DNA。此DNA优选地来源于丝状真菌如木霉属、腐质霉属、脉孢菌属、曲霉属、镰孢属、青霉属或粘帚霉属的丝状真菌。此DNA也优选地包含根据SEQ.ID NO：1的序列。另一方面，该DNA包含与根据SEQ.ID NO：1的序列至少具有70％序列相同性的序列，或包含根据SEQ.ID NO：1的序列的衍生物，其中所述的DNA编码具有使滤纸强度降低和/或使棉花纤维膨胀的能力的膨胀素。在本发明一个优选的实施方案中，此DNA可与具有SEQ.ID NO：1所提供序列的全部或部分的DNA杂交。
在本发明的另一个实施方案中，提供了编码微生物(如真菌或细菌)的膨胀素的DNA，该DNA可与编码具有由SEQ.ID NO：14、SEQ.IDNO：15、SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17或SEQ.ID NO：18组成的氨基酸序列的肽的DNA杂交。含有这样DNA的载体、用这样的载体转化的宿主细胞以及通过这样转化的宿主细胞生产的发酵液也属于本发明的范围。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种生产膨胀素蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得用包含编码膨胀素蛋白质的DNA的载体转化的宿主细胞，所述DNA从真菌或细菌分离；(b)在适合于所述的膨胀素蛋白质表达和任选地分泌的条件下培养所述宿主细胞；(c)回收含有所述膨胀素蛋白质的发酵液。
因为真菌和细菌通常没有纤维素细胞壁，而且在任何情况下都不以和高等植物相同的机制增加其大小。本申请人发现：与植物苹果青霉素相关的以前的著作没有暗示过这些微生物产生具有苹果青霉素样性质的蛋白质。这样，没有预期到分解纤维素的真菌木霉属的种可产生苹果青霉素样蛋白质这一发现。然而，很明显，微生物蛋白质的种类不同于迄今在植物中发现的蛋白质种类。例如，在本文所述的微生物膨胀素蛋白质上存在对应于真菌纤维素分解酶的纤维素结合结构域的区域表明：为了促进在环境中纤维素的水解，其可分泌该蛋白质以与天然分泌的纤维素酶和半纤维素酶协调作用。与该观点一致的是：当真菌在作为唯一碳源的纤维素上生长时，发现米黑木霉(Trichoderma reesei)膨胀素基因表达，但当用于生长的碳源是葡萄糖时却不表达。这种基因表达的调节方式类似于所观察到的许多木霉属纤维素和半纤维素基因的调节方式。这些出人意料的发现导致了如下结论：降解纤维素或半纤维素的微生物(包括细菌、酵母和真菌)也产生这样的膨胀素蛋白质。
因而，本发明的一个优点是：如此提供的膨胀素在目前使用纤维素的许多应用中有用，例如，清洗纺织品(洗衣清洁剂和预洗组合物)、改良纺织品(去丸、恢复颜色、抗灰化)、石洗斜纹棉布、将生物质转化成葡萄糖以及改良动物饲料的营养价值。类似的，可以注意到本发明的一个优点是，膨胀素在与其它酶(具体地说是纤维素酶，如内切葡聚糖酶)结合时可能具有协同或叠加效果。在其它情况下，膨胀素在应用中可能产生有害效果；例如，当作为副作用存在于通过微生物发酵产生的内切葡聚糖酶中并用于织物清洁或修饰时，它们可能会引起过度的纤维强度损失。在这种情况下，从纤维素酶产品中除去膨胀素是有益的，可以通过从形成的纤维素酶混合物中用生化方法除去该产物、通过遗传工程以防止其表达，或使其基因失活，或通过向包含膨胀素的组合物添加化学抑制剂来完成。
附图简述
图1说明了从在混合碳源上生长后的米黑木霉(longibrachiatum)RNA获得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及推定的相应氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图2说明了植物苹果青霉素蛋白质的共有氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和本文所述的膨胀素序列(SEQ ID NO：4)的比较，显示了氨基酸同源的区域。
图3说明了制备自生长在不同碳源上的米黑木霉(longibrachiatum)菌丝体的RNA样品用膨胀素cDNA探查的Northern印迹结果。泳道1：纤维素；泳道2：葡萄糖；泳道3：山梨醇；泳道4：由槐糖诱导的山梨醇。
图4说明了九种已知植物苹果青霉素氨基酸序列(SEQ ID NO：5-13)的比较，显示了在植物苹果青霉素中存在的广泛的同源性。
图5显示了pGAPT-exp的质粒图谱。
图6说明了培养上清液和对照所进行的SDS-PAGE凝胶电泳结果。生产米黑木霉膨胀素的曲霉属转化子在66kD标记带上面有一条带，在阴性对照(转化前的曲霉属菌株)的泳道中没有这条带。
发明详述
定义
“膨胀素”是指微生物(即真菌和细菌)来源的蛋白质或多肽，或者蛋白质或多肽的结构域，它们有能力促进使滤纸强度降低和棉纤维的膨胀，而没有分解纤维素的活性(即参与将单个纤维素链分解成更小单体(葡萄糖)或低聚物(多糖)的催化活性)。尽管将此术语宽泛地用在根据McQueen-Mason等人，植物细胞，4卷，1425-1433页(1992)描述的苹果青霉素蛋白质定义膨胀素，显然微生物膨胀素具有不同的性质，例如，微生物膨胀素是比植物苹果青霉素大得多的蛋白质，而且与植物苹果青霉素只有低水平的序列一致性。而且，某些微生物膨胀素蛋白质与纤维素结合结构域相连，还可与催化性纤维素酶结构域一起存在。例如，本文所述的源自米黑木霉的膨胀素蛋白质具有纤维素结合结构域。
在此构思了膨胀素可以是微生物来源的，具体地说来源于真菌或细菌。具体地说，构思了具有纤维素裂解能力的微生物将是极好的膨胀素来源。在本发明的一个特别优选的实施方案中，膨胀素源自木霉属的种，具体地说是米黑木霉(longibrachiatum)。然而，根据本发明的膨胀素和/或编码膨胀素的DNA也优选地源自真菌，如犁头霉属的种(Absidia spp.)；顶孢霉属的种(Acremonium spp.)；蘑菇属的种(Agaricus spp.)；Anaeromyces spp.；曲霉属的种，包括A.auculeatus、泡盛曲霉(A.awamori)、黄曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、A.fumaricus、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidiumspp.；Cephalosporum spp.；毛壳菌属的种(Chaetomium spp.)；鬼伞属的种(Coprinus spp.)；Dactyllum spp.；镰孢属的种，包括F.conglomerans、F.decemcellulare、爪哇镰孢(F.javanicum)、亚麻镰孢(F.lini)、尖镰孢(F.oxysporum)和腐皮镰孢(F.solani)；粘帚霉属的种；腐质霉属的种，包括H.insolens和H.lanuginosa；毛霉属脉(Mucor spp.)；脉孢菌属的种，包括粗糙脉孢菌(N.crassa)和好食脉孢菌(N.sitophila)；Neocallimastix spp.；Orpinomyces spp.；青霉属的种；展齿革菌属(Phanerochaete spp.)；射脉菌属(Phlebia spp.)；Piromyces spp.；假单胞菌属(Pseudomonas spp.)；根霉属(Rhizopus spp.)；裂褶菌属(Schizophyllum spp.)；Trametes spp.；木霉属的种，包括米黑木霉，米黑木霉(longibrachiatum)和绿色木霉(T.viride)；接霉属(Zygorhynchus spp.)。相似的是，考虑到本文所述的膨胀素和/或编码膨胀素的DNA可在纤维素裂解细菌中找到，这些细菌如芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)；纤维单胞菌属的种(Cellulomonas spp.)；梭菌属的种(Clostridium spp.)；毁丝霉属的种(Myceliophthora spp.)；高温单胞菌属的种(Thermomonospora spp.)；链霉菌属的种(Streptomyces spp.)，包括产橄榄色链霉菌(S.olivochromogenes)，尤其是降解纤维的反刍动物细菌，如产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)；酵母，包括Candidatorresii、C.parapsllosis、清酒假丝酵母(C.sake)、涎沫假丝酵母(C.zeylanoides)、Pichia minuta、红酵母(Rhodotorula glutinis)、胶红酵母(R.mucilaginosa)和不对称掷孢酵母(Sporobolomyces holsaticus)。
根据本发明的膨胀素蛋白质优选地被分离或纯化。分离或纯化意味着从膨胀素天然相关的某些或所有天然产生的组分中分离膨胀素，从而改变膨胀素的天然状态。这可以通过本领域已知的分离技术(如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其它蛋白质盐沉淀、离心、大小排阻层析、过滤、微孔过滤、凝胶电泳或以梯度分离以除去在最终组合物中不需要的完整细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶)完成。还可将组分添加到提供其它益处的包含膨胀素的组合物(如活化剂、抗抑制剂、所需离子、化合物)中以控制pH或其它酶(如纤维素酶)。
本文使用杂交以分析给定的片段或基因是否对应于本文所述的膨胀素，因而这也包括在本发明的范围之内。杂交分析基本上如下：根据制造厂商的指导，用限制性酶(如EcoRI、HindIII、BamHI、ClaI、KpnI、MluI、SpeI、BglII、NcoI、XbaI、XhoI和XmaI(由New England Biolabs公司、Beverly、MA和Boehringer Mannheim供应))将特定来源的基因组DNA消化成片段。然后将样品通过琼脂糖凝胶(如0.7％琼脂糖)电泳以使DNA片段的分离可以通过其大小观察。可以将凝胶在蒸馏水中短暂漂洗，然后在适当的溶液(如0.25M HCl)中轻微震荡脱嘌呤，随后变性30分钟(例如，在0.4M NaOH中)。可以包括复性步骤，其中将凝胶放置在1.5M NaCl、1M Tris、pH 7.0中轻微震荡30分钟。然后应该使用转移溶液(如6×SSC(900mM NaCl，90mM柠檬酸三钠))将DNA转移到适当的带正电的膜上，如Maximum Strength Nytran Plus膜(Schleicher & SchueII，Keene，N.H.)。在完成转移后(通常需约2小时或更长时间)，漂洗膜并在使用漂洗溶液(如2×SSC[2×SSC＝300mM NaCl，30mM柠檬酸三钠])后在室温下风干。然后应该通过UV交联或通过使用膜制造商推荐的温度在炉中烘焙将DNA交联到膜上。然后将膜在适当的预杂交溶液(例如，每100ml包含30-50ml甲酰胺、25ml 20×SSPE(1×SSPE＝0.18M NaCl，1mM EDTA，10mM NaH2PO4，pH 7.7)、2.5ml 20％SDS、1ml 10mg/ml剪切的鲱精液DNA的水溶液)中预杂交(大约2小时或更长时间)。
通过在琼脂糖凝胶上电泳分离取自在图1中的序列的一个DNA探针，从凝胶上切取所述片段并从切取的琼脂糖中回收。然后标记纯化的DNA片段(例如，根据制造厂商的指导使用Megaprime标记系统以将32P掺入DNA(Amersham International plc，Bucjinghamshire，英国))。通过加热至95℃保持5分钟将标记的探针变性，然后立即添加至包含膜之上述预杂交溶液中。杂交反应应该在适当的条件下进行适当的时间，例如，在37℃下轻微震荡18小时。漂洗膜(例如，在2×SSC/0.3％SDS中)，然后用适当的洗涤溶液洗涤并伴随轻微搅动。所需条件的严格程度是洗涤膜(滤膜)的条件的反映。
具体地说，给定反应条件的严格程度(即成功杂交必需的同源性程度)依赖于来自Southern印迹的滤膜在杂交后的洗涤条件。本文所定义的“低严格程度”条件包括用0.2×SSC/0.1％SDS的溶液在20℃下洗涤得自Southern印迹的滤膜15分钟。“标准严格程度”条件包括再一次的洗涤步骤，该步骤包括用0.2×SSC/0.1％SDS的溶液在37℃下第二次洗涤得自Southern印迹的滤膜30分钟。
“纤维素酶”在本领域中是一种分类很清楚的酶类，包括能将纤维素聚合物水解成较短的低聚物和/或葡萄糖的酶。纤维素酶的普通例子包括外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶，它们获自许多种分解纤维素的生物体，具体地说包括真菌和细菌。
“半纤维素酶”在本领域也是一种分类很清楚的酶类，包括能将半纤维素聚合物水解成较短的低聚物的酶。半纤维素酶的普通例子包括木聚糖酶和甘露聚糖酶。
“含纤维素物质”是指包含纤维素聚合物作为其组分之一的物质。这样，纤维素包括缝好的和未缝好的织物或其它纯棉或棉混合物制成的物品，包括棉编织的织物、棉针织物、棉粗斜纹布、棉纱线等或其包含一种或多种非棉纤维的混合物，其中非棉纤维包括合成纤维(如聚酰胺，例如尼龙6和尼龙66)、丙烯酸纤维(如聚丙烯腈纤维)、聚酯纤维(如聚乙烯对苯二酸酯)、聚乙烯醇纤维(如维纶)、聚氯乙烯纤维、聚氯亚乙烯纤维、聚氨基甲酸酯纤维、聚脲纤维和芳族聚酰胺纤维。“纤维素”还指任何含纤维素的棉或非棉织物，或者含纤维素混合物的棉或非棉织物，其中含纤维素混合物包括天然纤维素和人造纤维素(如黄麻、亚麻、苎麻、人造纤维、TENCEL)。人造纤维所包括的是本领域熟知的再生纤维，如人造纤维。其它人造纤维包括化学改良的纤维素纤维(如通过醋酸酯衍生的纤维素)和溶剂纺成的纤维素纤维。当然，含纤维素织物的定义包括的是任何制自这样的材料的服装或纱线。类似地，“含纤维素织物”包括制自这样的材料的纺织品纤维。另外，包含纤维素的材料包括木材、木浆和其它基于植物的纤维(即草、饲料、种子、树、玉米壳)、纸、厚纸板、包装板(particle board)、营养性纤维和非营养性纤维。
“衍生物”是指源自通过向前体蛋白质(如天然蛋白质)的C-和N-端其中之一或两端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列的一个或多个不同位点取代一个或多个氨基酸、在蛋白质的末端之一或两端或氨基酸序列中的一个或多个位点删除一个或多个氨基酸、或在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸的蛋白质。膨胀素衍生物的制备优选地通过这样的方式实现：修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将DNA转化进适合的宿主、表达修饰的DNA序列以形成膨胀素衍生物。本发明的衍生物包括包含与前体氨基酸序列(如野生型或天然状态的膨胀素)相比改变的氨基酸序列的肽，该肽保持了前体膨胀素特征性的膨胀素性质，但在某些特定方面具有改变了的性质。例如，膨胀素衍生物可能具有提高的pH最优值或提高的温度或氧化稳定性，但是保持其特征性的纤维素改良活性。相似的是，根据本发明的衍生物包括纤维素结合结构域，该结构域被以这样的方式添加、除去或修饰，从而显著地削弱或增强其纤维素结合能力。相似的是，催化分解纤维素的结构域也可以被添加、除去或修饰以与膨胀素有效连接。已预期根据本发明的衍生物可以源自编码膨胀素衍生物的DNA片段，其中保持了表达膨胀素衍生物的功能活性。衍生还包括化学修饰以改变膨胀素的特性。
“表达载体”是指包含DNA序列的DNA构建体，其中DNA序列有效地连接到能影响该DNA在适合的宿主中表达的适合的控制序列上。这样的控制序列可以包括影响转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上的合适的核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。优选地不同的细胞类型与不同的表达载体一起使用。在枯草芽孢杆菌(Bacillu subtilis)中使用的用于载体的优选启动子是AprE启动子，在大肠杆菌中使用的优选启动子是Lac启动子，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)中使用的优选启动子是PGK1，在黑曲霉中使用的优选启动子是glaA，用于米黑木霉(longibrachiatum)的优选启动子是cbhI。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或简单地为潜在的基因组插入片段。一旦转化进适合的宿主，载体可以复制并独立于宿主基因组起作用，或可在适合的条件下整合进基因组自身。在本说明书中，质粒和载体有时互换使用。然而，本发明有意包括其它形式的起同样作用并在本领域已知的表达载体。这样，多种宿主/表达载体组合可以用于表达本发明的DNA序列。例如，有用的表达载体可以包括染色体片段、非染色体和合成DNA序列(例如多种已知的SV40衍生物和已知的细菌质粒(如得自大肠杆菌的质粒，包括col E1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC19及其衍生物))、广谱宿主范围质粒(如RP4)、噬菌体DNA(如λ噬菌体的多种衍生物，例如NM989)和其它DNA噬菌体(如M13和丝状单链DNA噬菌体)、酵母质粒(如2μ质粒或其衍生物)、用于真核细胞的载体(如用于动物细胞的载体和源自质粒和噬菌体DNA组合的载体，例如，被修饰以使用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒)。使用本发明的表达载体的表达技术在本领域是已知的，通常在如Sambrook等人，分子克隆：试验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港出版社(1989)中描述。通常，通过整合将包含本发明DNA序列的表达载体直接插入特定种的基因组中以转化进单细胞宿主(参见，例如，Bennett &Lasure，真菌多基因操作(More Gene Manipulations in Fungi)，学术出版社，San Diego，70-76页(1991)以及其中引用的文献，它们描述了在真菌宿主中的定点基因组插入，此处引用作为参考)。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是指适合于包含根据本发明的DNA的表达载体的宿主。用于本发明的宿主细胞通常是原核或真核宿主，包括任何其中可以进行表达的可转化微生物。具体地说，宿主菌株可以是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、米黑木霉(longibrachiatum)、酿酒酵母或黑曲霉。使用由重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样转化的宿主细胞能复制编码膨胀素及其变体(突变体)的载体，或表达所需的肽产物。在根据本发明的一个优选实施方案中，“宿主细胞”是指源自木霉属的种的细胞和原生质体。
“信号序列”是指一段连接到蛋白质的N-端部分的氨基酸序列，该序列有助于成熟形式的蛋白质分泌出细胞。信号序列的定义是功能性的定义。成熟形式的胞外蛋白质无信号序列，该序列在分泌过程中被切除。
“DNA构建体或载体”(在本文中互换使用)是指一段核苷酸序列，该序列包含编码任何上述新膨胀素或衍生物的一种或多种DNA片段或DNA变体片段。
“功能性地连接到”是指连接到结构基因并控制该基因表达的调节区域，如启动子、终止子、分泌信号或增强子区域。
膨胀素的制备
本发明涉及膨胀素和膨胀素衍生物的表达、纯化和/或分离及其用途。这些膨胀素优选地通过重组方法制备。然而，用于本发明的膨胀素蛋白质可以通过其它本领域知晓的方法(如从天然分离物纯化)获得。
制备根据本发明的膨胀素的优选方式包括用DNA构建体转化木霉属的种的宿主细胞，其中所述的DNA构建体包含至少一种编码部分或全部功能性地连接到启动子上的膨胀素的DNA片段。然后将已转化的宿主细胞在利于表达所需蛋白质的条件下生长。随后，将所需的蛋白质产物纯化至基本上为均质。
待转化的微生物优选地包括源自木霉属的种或曲霉属的种的菌株。更优选地，所述菌株包括用于获得超量表达的蛋白质的米黑木霉(longibrachiatum)或Aspergillus niger var.awamori。例如，已知由Sheir-Neiss等人在应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnology)，20(1984)46-53页描述的RL-P37分泌大量的纤维素酶。RL-P37的功能等同物包括米黑木霉(longibrachiatum)菌株RUT-C30(ATCC 56765号)和菌株QM9414(ATCC 26921号)。另一个例子包括Ward等人在应用微生物生物技术，39：738-743(1993)中描述的超量生产突变体。已预见这些菌株对于超量表达木霉属膨胀素也是有用的。
当需要在无分解纤维素活性时获得膨胀素蛋白质，获得例如，木霉属宿主细胞菌株是有用的，这些菌株在导入包含编码膨胀素的DNA片段的DNA构建体或质粒之前已有一个或多个纤维素酶基因缺失。这样的菌株可以通过在美国专利5,246,853和WO 92/06209中公开的方法制备，此处引用其说明书作为参考。通过在缺失一个或多个纤维素酶基因的宿主微生物中表达膨胀素，可以简化鉴别和随后的纯化过程。任何得自已克隆的木霉属的种的基因都可以被删除，例如，cbh1，cbh2，egl1和egl3基因以及那些编码EGIII和/或EGV蛋白质的基因(分别参见，例如，美国专利5,475,101和WO 94/28117)。
基因缺失可以按照本领域已知的方法通过将待缺失或破坏的所需基因插入质粒完成。然后，在对所需基因编码区来说是内部的适当限制性酶切位点切割缺失质粒，用选择性标记取代基因编码序列或其部分。待缺失或破坏的基因位点的侧翼DNA序列(优选地为约0.5至2kb)保留在选择性标记基因的任一侧。适当的缺失质粒通常具有独特的限制性酶位点，该位点可使包含缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和选择性标记基因以单一线性片段形式被除去。
必须选择选择性标记以使所转化真菌的检出成为可能。可在所选微生物内表达的任何选择性标记基因都是适合的。例如，对于木霉属的种，选择选择性标记以使选择性标记在转化体中的存在不明显影响其性质。这样的选择性标记可以是编码可分析的产物的基因。例如，如果在宿主菌株中缺失导致宿主菌株表现出营养缺陷表型，可以使用这种木霉属的种的基因之功能性拷贝。
在一个优选的实施方案中，用功能性pyr4基因转化木霉属的种pyr4-衍生菌株，这样就提供了用于转化的选择性标记。pyr4-衍生菌株可以通过选择抗氟代乳清酸(FOA)的木霉属的种的菌株获得。pyr4基因编码尿苷生物合成所需的乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶。具有完整的pyr4基因的菌株可在无尿苷的培养基上生长，但对氟代乳清酸敏感。通过选择FOA抗性可选择无功能性乳清酸核苷单磷酸脱羧酶且生长需要尿苷的pyr4-衍生菌株。使用FOA选择技术，可获得无功能性乳清酸焦磷核糖转移酶且需要尿苷的菌株。可用编码该酶的基因的功能性拷贝转化这些细胞(Berges和Barreau，1991，当代遗传学(Curr.Genet.)19，359-365页)。使用上述FOA抗性技术易于进行衍生菌株的选择，这样，pyr4基因优选地用作选择性标记。
为了转化pyr4-木霉属的种以缺失表达一个或多个纤维素酶基因的能力，从缺失质粒分离包含被破坏或缺失的纤维素酶基因的单DNA片段，并用于转化适当的pyr木霉属宿主。然后鉴别转化体并基于其表达pyr4基因产物的能力进行选择，这样，给予了宿主菌株尿苷营养缺陷性质。然后对形成的转化体进行Southern印迹分析，鉴定并确认双交换整合，该整合用pyr4选择性标记取代了待缺失的基因之基因组拷贝的编码区的部分或全部。
尽管上述特定的质粒载体涉及pyr-转化体的制备，本发明并不限于这些载体。使用上述技术可以在木霉属的种的菌株中删除或取代多种基因。另外，如上所述，可以使用任何可得到的选择性标记。事实上，可以使用上述方法将任何已克隆并鉴定的木霉属的种的基因从基因组删除。
如上所述，所使用的宿主菌株是木霉属的种的衍生菌株，该衍生菌株缺失或具有非功能性的、对应于所选可选择标记的一个或几个基因。例如，如果选择了pyr4选择性标记，在转化过程中使用特定的pyr4-衍生菌株作为受体。类似地，可以使用包含木霉属的种的基因之选择性标记，其中所述木霉属的种的基因等效于构巢曲霉基因amdS、argB、trpC、niaD。因此，相应的受体菌株一定分别是，如argB-、trpC-、niaD-衍生菌株。
然后制备用于插入适当微生物的编码膨胀素蛋白质的DNA。根据本发明，编码膨胀素酶的DNA包含编码具有功能性的膨胀素活性所必需的所有DNA。因而，DNA可以源自任何生产膨胀素的微生物来源，只要该基因能根据本文描述的方法鉴定并分离。在一个优选的实施方案中，编码膨胀素蛋白质的DNA源自木霉属的种，更优选地源自米黑木霉(longibrachiatum)。
可以将编码膨胀素或衍生物的DNA片段或DNA变体片段功能性地连接到真菌启动子序列上，如cbh1和egl1基因的启动子上。
也可以考虑到将超过一个拷贝的编码膨胀素的DNA重组进菌株以促进超量表达。
编码膨胀素的DNA可以通过表达载体的构建制备，其中所述表达载体携带编码截短的纤维素酶的DNA。携带编码膨胀素的插入DNA片段的表达载体可以是任何可在给定宿主生物体中自主复制或可以整合进宿主DNA的载体，一般是质粒。在优选的实施方案中，考虑两种用于获得基因表达的表达载体。第一种包含启动子、基因编码区和终止子序列都来自待表达基因的DNA序列。基因截短的实现可以通过删除不想要的DNA序列(如编码不想要的结构域的DNA序列)以使待表达的结构域在其自身转录和翻译调节序列的控制下。选择性标记也可被包含在载体中从而可以选择新基因序列的多个拷贝在宿主中的整合。
第二类表达载体经预装配，包含高水平转录所需的序列和选择性标记。构思了将基因或其部分的编码区插入普通用途的表达载体中以使得其处于表达盒启动子和终止子序列的转录控制下。例如，pTEX是这样的一种普通用途的表达载体。可以将基因或其部分插入强cbh1启动子的下游。
在载体中，应该将编码本发明膨胀素的DNA序列有效地连接到转录和翻译序列上，即在结构基因读框内的适合的启动子序列和信号序列上。启动子可以是任何在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，其可源自编码对宿主细胞同源或异源的蛋白质基因。信号肽使得膨胀素或其衍生物可以胞外生产。编码信号序列的DNA优选地是与待表达的基因天然相连的DNA，然而，得自任何适合来源的信号序列(如得自木霉属的外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)在本发明的考虑范围。
用于连接编码本发明膨胀素的DNA序列和启动子并插入适合载体的方法在本领域固知。
可以根据已知的技术(如转化、转染、显微注射、微孔法、biolistic轰击等)将上述的DNA载体或构建体导入宿主细胞。
在优选的转化技术中，必须考虑到在木霉属的种中细胞壁对DNA的通透性很低。因而，所需DNA序列、基因或基因片段的吸收是很低的，有许多方法可以在转化过程前增加衍生菌株(即缺失对应于所使用的选择性标记的功能性基因)中木霉属的种的细胞壁的通透性。
本发明中优选的制备用于转化的木霉属菌株的方法包括从真菌菌丝体制备原生质体。菌丝体可从已萌芽的营养孢子获得。用消化细胞壁的酶处理所述菌丝体以获得原生质体。通过在悬浮培养基中存在渗透稳定剂保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常这些稳定剂的浓度处于0.8M到1.2M之间。优选地在悬浮培养基中使用大约1.2M的山梨醇溶液。
DNA被吸收进宿主木霉属的种的菌株依赖于钙离子浓度。通常在吸收溶液中使用大约10mM CaCl2至50mM CaCl2。在吸收溶液中除了需要钙离子外，其它通常包括的是缓冲液系统，如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS、pH 6.0缓冲液(吗啉丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。人们认为聚乙二醇可以起融合细胞膜的作用，这样使得待递送的培养基内容物可以进入木霉属的种的菌株的细胞质，将质粒DNA转移进细胞核。所述融合通常将多拷贝的质粒DNA串联地整合进宿主染色体。
在转化中通常使用包含木霉属的种的原生质体或细胞的悬浮液，其中对所述的原生质体或细胞以108至109/ml的密度，优选地以2×108/ml进行通透性处理以用于转化。将在适当溶液(如1.2M山梨醇；50mM CaCl2)中的100ml体积的这些原生质体或细胞与所需DNA混合。通常将高浓度的PEG添加到吸收溶液中。可向原生质体悬浮液添加0.1至1体积25％的PEG 4000。然而，优选地向原生质体溶液添加约0.25体积。也可以向吸收溶液加入添加剂(如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等)以帮助转化。
然后，通常将混合物在大约0℃下温育10-30分钟。然后再向混合物中添加PEG以进一步增强所需基因或DNA序列的吸收。通常将25％PEG4000以5至15倍于转化混合物的体积添加；然而更大或更小的体积也可能是适合的。优选地25％PEG 4000大约10倍于转化混合物的体积。在添加PEG后、添加山梨醇和CaCl2之前，在室温下温育转化混合物。然后将原生质体悬浮液添加到熔化的生长培养基的等分试样中。该生长培养基仅允许转化体的生长。任何适合于培养所需转化体生长的生长培养基都可用于本发明。然而，如果要选择pyr+转化体，优选地使用不包含尿苷的生长培养基。随后将菌落在无尿苷的生长培养基上转移并纯化。
在该阶段，可以通过稳定的转化体在无尿苷固体培养基上更快的生长速率，以及形成光滑而非粗糙轮廓的环状菌落将其与不稳定的转化体区分开。另外，在某些情况下，可以通过下列步骤进一步测定稳定性：在固体非选择性培养基(即含尿苷)上培养、从该培养基收获孢子、确定这些孢子随后在缺乏尿苷的选择性培养基上萌发和生长的百分比。
在上述方法的具体实施方案中，从在液体培养基中生长后从宿主细胞回收活性形式的膨胀素或其衍生物，或是作为新膨胀素或其衍生物适当的翻译后加工的结果的形式之膨胀素。
利用常规技术从培养基中回收表达的膨胀素，该技术包括通过离心、过滤或用盐(如硫酸铵)沉淀上清液(或滤液)中的蛋白质从培养基中分离细胞。另外，也可以使用层析方法，如离子交换层析或亲和层析。可以制备针对天然纯化的膨胀素的抗体(多克隆或单克隆)，或者可以用膨胀素分子的部分制备合成肽，用于制备多克隆抗体。
实施例1
编码新膨胀素的米黑木霉(longibrachiatum)cDNA克隆
图1显示了从在混合碳源上生长的米黑木霉(longibrachiatum)RNA制备的cDNA文库获得的cDNA克隆之核苷酸(SEQ ID NO：1)及推定的对应氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，如Saloheimo等人，1994，分子微生物学(Molec.Microbiol.)，13：219-228所述。cDNA表现出了下列帮助描述该基因的特性：
鉴别出了1482nt的开放读框并推导出了所编码的氨基酸。
推定蛋白质的前18个氨基酸具有下列预期的分泌信号序列和信号裂解位点的特性。带正电的氨基酸(赖氨酸)邻近于氨基端蛋氨酸，蛋氨酸后是疏水氨基酸序列以及在氨基酸Ile18后的表观信号肽酶裂解位点。成熟膨胀素的推定N-端是Gln-Gln。类似地，许多产自木霉属的成熟纤维素酶在其N-端存在谷氨酰胺残基(如，CBHI，CBHII，EGI，EGII和EGIII，且EGI和EGII均以一对谷氨酰胺残基起始)，这支持了该端是N-端的结论。因而，预期成熟蛋白质的长度为475个氨基酸，分子量为大约49.5kDa(不包括任何可能的糖基化或其它修饰)，基于其氨基酸组成计算出其pI值大约为4.6。该蛋白质在天冬酰胺160、336和406具有三个潜在的N-连接的糖基化位点(具有N-X-S/T的共有氨基酸序列)。
推定成熟蛋白质序列的4-39残基与产自木霉属的纤维素酶和其它真菌纤维素酶的纤维素结合结构域(CBD)非常相似(与木霉属CBHII的CBD有58％相同性)。CBD也与某些非分解纤维素的胞外真菌酶(如得自米黑木霉(longibrachiatum)的乙酰基木聚糖酯酶及甘露聚糖酶)有关，在膨胀素CBD和这些CBD之间也显示出了相似的一致性。
在推定木霉属蛋白质的CBD后是富含Ser、Thr、Gly和Pro残基的区域(从残基41到大约残基86)，该区域应该与存在于木霉属或其它真菌纤维素酶的接头或绞链区具有相似的功能，并将CBD与催化结构域连接。
在图1的木霉属膨胀素的推定氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和已知的高等植物苹果青霉素之间观察到了相似性。图2显示了预期的木霉属蛋白质的一部分和Shcherban等人，同上，取自九种植物苹果青霉素的共有序列(SEQ.ID NO：3)的序列对比。使用Lasergene软件包(DNASTAR公司)内的Jotun Hein算法比较这些序列，计算出在两种氨基酸序列之间具有36％的相似性。在用于该序列对比的木霉属膨胀素序列的322个氨基酸中，70个氨基酸或21.7％与高等植物共有序列相同。
在米黑木霉(longibrachiatum)膨胀素和富含纤连蛋白类型重复区的人肌联蛋白之间，也观察到了相似性。在用程序BLAST(Altschul等人，1990，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，215：403-410)进行的蛋白质序列数据库的相似性检索中检测到了同源性，在例子中显示的序列对比是由该程序产生的。与米黑木霉膨胀素同源的肌联蛋白区域是纤连蛋白类型重复区的部分。在某些细菌修饰碳水化合物的酶中发现了纤连蛋白重复区(Little等人，1994，分子进化杂志(J.Mol.Evol.)，39：631-643)，但没有在任何真菌蛋白质中发现该纤连蛋白重复区。BLAST检索表明：在植物苹果青霉素和包含纤连蛋白重复区的蛋白质之间没有相似性。
米黑木霉膨胀素283GGPYYFALTAVNTNGPGSVTKI  (SEQ.IDNO：21)
人肌联蛋白12268GNEYYFRVTAVNEYGPGVPTDV  (SEQ.IDNO：22)
米黑木霉膨胀素100TKGSVTASWTDPMETLGA  (SEQ.IDNO：23)
人肌联蛋白9114TKGSMLVSWTPPLDNGGS(SEQ.ID NO：24)
当真菌在纤维素作为唯一碳源的培养基上生长时表达米黑木霉(longibrachiatum)膨胀素基因，但在葡萄糖作为唯一碳源的培养基上生长时却不表达。
为了研究在木霉属中表达膨胀素基因的调节，进行了下列试验。在振荡烧瓶(28℃，200转/分)中的基本培养基(Penttila等人，1987，基因(Gene)，61：155-164)中培养米黑木霉(longrbrachiatum)菌株QM9414三天，所述培养基包含5％葡萄糖或2％纤维素。为了测定槐糖诱导，在含2％山梨醇的基本培养基中培养菌株三天，然后添加槐糖直至达到1mM的最终浓度。再进行10小时培养并添加相同量的槐糖。在第二次添加后5小时结束培养。在不添加槐糖的2％山梨醇中培养87小时作为对照。在培养后，通过用玻璃纤维滤器过滤收获菌丝体，用0.9％NaCl洗涤并冰冻。根据Chirgwin等人(1979，生物化学杂志(Biochem.J.)，18：5294-5299)的方法从菌丝体样品中分离总RNA。用乙二醛处理5μg的RNA样品，并在处于10mM磷酸钠缓冲液(pH7)中的1％琼脂糖凝胶中电泳。根据制造厂商的建议在Hybond-N尼龙膜(Amersham)上进行毛细管印迹。通过用EcoRI和XhoI消化携带膨胀素cDNA的cDNA文库制备杂交探针，在0.8％琼脂糖凝胶上对消化的质粒进行电泳并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中分离cDNA片段。使用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)用32P-dCTP标记探针。杂交在50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、1％SDS、1M NaCl、125μg/ml鲱精液DNA中于42℃下进行24小时。将滤膜在42℃下以5×SSPE洗涤15分钟，于1×SSPE、0.1％SDS中洗涤两次，每次15分钟，于0.1×SSPE、0.1％SDS中在室温下洗涤两次，每次15分钟(1×SSPE是0.18M NaCl、1mMEDTA、10mM NaH2PO4，pH 7.7)。本试验结果在图3显示。在葡萄糖中培养后没有观察到膨胀素mRNA，在山梨醇中培养后，观察到的膨胀素mRNA很少。相对而言，在纤维素中培养或向山梨醇生长培养基中加入槐糖后，观察到了高水平的膨胀素mRNA。
实施例2
克隆的编码木霉属膨胀素的DNA分子的制备
以下提供了一种制备包含在实施例2中描述的完整膨胀素基因的克隆的方法。在本实施例中，基因组DNA或cDNA克隆源自木霉属，并利用下述方法制备。
合成如下所示的寡核苷酸：
EXP-A  5′-GGCGAGATCTTGCTGCCCATCATATTGTGC-3′(SEQID NO：19)
EXP-B 5′-GGCGTCTAGACTGCACACCAATGTCAATGT-3′(SEQID NO：20)
寡核苷酸EXP-A在5′端附近包含一个BglII限制性酶识别位点，其后是SEQ ID NO：1的从nt 425到nt 445的DNA序列。寡核苷酸EPX-B在5′端附近包含一个XbaI识别位点，其后是SEQ ID NO：1的从nt1471到nt1490DNA序列的反向互补序列。
使用寡核苷酸EXP-A和EXP-B作为引物，以从米黑木霉菌株QM6a(ATCC 13631)分离的总基因组DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。所使用的DNA聚合酶(Pwo聚合酶)、缓冲液和脱氧核苷酸混合物由Boehringer Mannheim提供。PCR使用下列条件：步骤1：94℃下1分钟；步骤2：92℃下40秒；步骤3：50℃下1分钟；步骤4：72℃下2分钟；步骤2、3和4重复29次；步骤5：72℃下5分钟。
PCR的主要DNA产物是大约1.3kb(通过琼脂糖凝胶电泳估计)的片段。用BglII和XbaI消化PCR产物，从琼脂糖电泳凝胶纯化1.3kb DNA片段。将该DNA片段与用BglII和XbaI消化的pSL1180(Pharmacia)连接。形成的质粒被命名为pSLexpPCR。DNA序列分析证实了pSLexpPCR中1.3kb插入片段对应于木霉属膨胀素基因的预期片段。DNA序列表明在1.3kb片段内存在着三个对应于SEQ.ID NO：1的nt575与nt576、nt791与nt792、nt969与nt970之间的内含子。
所述质粒或其包含的1.3kb插入片段可用作杂交探针，从而可以从任何目的基因组DNA或cDNA文库克隆完整膨胀素基因。在pSLexpPCR内编码膨胀素的DNA不包括对应于CBD或接头(绞链)区的区域。因而，通过设计，可以期望该DNA可与其它膨胀素DNA序列杂交，但是不与可能是其它非膨胀素基因部分的编码CBD的序列杂交。
分别用各种不同的限制性内切核酸酶消化得自米黑木霉(longibrachiatum)菌株QM6a的总基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。随后将该DNA印迹到Nytran(S&S)膜滤器上，用分离自pSLexpPCR的1.3kb BglII-XbaI DNA片段探查，其中该片段已通过由Amersham提供的Megaprime随机标记系统用32P标记。与该探针的杂交在包含30％甲酰胺、5×SSPE、0.5％SDS的缓冲液中于38℃下以中等严格程度进行。随后以中等严格程度在2×SSC、0.1％SDS中于55℃下洗涤，然后对X-射线底片曝光。结果表明：米黑木霉膨胀素基因的基因组拷贝位于大约4.5kb BglII片段上，或位于大约5.5kb XbaI片段上。
给定如上提供的例证膨胀素基因，对本领域普通技术人员来说，使用插入pSLexDPCR内的PCR片段作为探针，通过菌落杂交从基因组DNA或cDNA文库克隆米黑木霉膨胀素基因是常规的工作。
实施例3
克隆米黑木霉膨胀素基因组拷贝及其在A.niger var.awamori中的表达
通过PCR克隆米黑木霉膨胀素的基因组拷贝。模板DNA得自米黑木霉RutC-30(ATCC 56765)，对应于膨胀素编码区的5′和3′末端的引物定名为GCI-PVS-055(gcg cag atc tca gca atg gct ggt aag ctt atc ctc g)和GCI-PVS-056(gcg ctc tag atc aat tct ggc taa act gca cac c)。
用BglII和XbaI消化PCR扩增的片段，将其克隆进BglII-XbaI切开的pGAPT-PT以形成pGAPT-expC。对插入片段进行测序表明膨胀素基因的染色体拷贝有五个内含子。
将膨胀素基因的染色体拷贝(即pGAPT-expC)转化进曲霉属中，使用如上所述的用于cDNA的方法筛选转化体。
实施例4
分离微生物中编码膨胀素的DNA序列的方法
可以将实施例2和3中的常规技术与已知的技术结合，以获得包含得自其它真菌和细菌的膨胀素或膨胀素类型基因的克隆。可以将质粒pSLexpPCR或分离的编码膨胀素基因部分的1.3kb DNA插入片段(实施例2)以及膨胀素的核心区(实施例3)标记。然后使用该DNA探针与得自其它真菌或细菌的基因组DNA或cDNA杂交。已发表的高等植物苹果青霉素的序列表明了很高水平的氨基酸一致性(参见，例如，图4，其中下划线部分表示高度同源性区域)。将推断的木霉属膨胀素的氨基酸序列与已知高等植物苹果青霉素的氨基酸序列进行比较，鉴定出了膨胀素和植物苹果青霉素之间某些保守的氨基酸区域。这些保守区域提供了设计用于从其它微生物PCR扩增编码膨胀素的DNA简并引物的基础。这些方法在本领域通常是已知的并被认为是常规的(参见，例如，McPherson等人，PCR实用方法(PCR A Practical Approach)，171-186页(1991))。尽管可以使用其它保守区，对应于SEQ.ID NO：2氨基酸192-200和366-371的保守区用于这种用途时特别有用(也参见图2的突出显示的部分)。
SEQ.ID NO：2氨基酸残基192-200的序列TSGGACGFG(SEQ.IDNO：14)与共有植物苹果青霉素序列TMGGACGYG(SEQ.ID NO：15)的对应序列具有高度的同源性(图4中的位置号19-27)。基于该同源性区域，可合成包含所有可能的编码部分或全部氨基酸序列T(M/S)GGACG(Y/F)G的DNA序列的简并寡核苷酸(参见，例如，McPherson等人，同上，174页)。
SEQ.ID NO：2的氨基酸残基366至371的序列YRRVQC(SEQ.IDNO：16)与共有植物苹果青霉素序列YRRVPC(SEQ.ID NO：17)和FRRVPC(SEQ.ID NO：18)的对应序列具有高度的同源性(图4中位置127-132)。基于该同源性区域，合成包含所有可能的编码部分或全部氨基酸序列(F/Y)RRV(P/Q)C的DNA序列的简并寡核苷酸。源自该氨基酸序列的寡核苷酸可以和源自前面提到的氨基酸序列的寡核苷酸一起作为引物，用于使用基因组DNA的常规PCR试验。然后就可以容易地从任何微生物获得基因组DNA或cDNA，并用作这种PCR试验的模板。以这种方式就可能克隆编码得自多种微生物膨胀素的基因。
实施例5
用于从其它微生物分离编码膨胀素的序列的异源杂交方法
用HindIII消化得自不同微生物的基因组DNA，在1.0％琼脂糖凝胶上电泳。将凝胶脱嘌呤、变性并印迹，如第7页所述对膜进行UV交联。使用Boehringer Mannheim的DIG/GeniusTM系统进行预杂交、杂交、探针的标记以及检测。
所述探针对应于编码米黑木霉膨胀素核心区的序列。用NcoI和EcoRI消化初始的cDNA亚克隆(实施例1)，形成312bp的DNA片段，根据制造厂商(Boehringer Mannheim)的指导通过随机引物标记方法用DIG-dUTP(地高辛-dUTP)标记该DNA片段。
所述膜在5×SSC-0.1％N-月桂酰肌氨酸-0.02％SDS-1％GeniusTM封闭剂中于45℃下预杂交和杂交。杂交(过夜)后于室温下在6×SSC中洗涤两次(每次10分钟)，然后于45℃下在6×SSC中洗涤两次(每次5分钟)。用抗DIG-碱性磷酸酶偶联物检测，根据制造厂商的指导使用化学发光底物CSPD使其可视化。
该试验结果表明：除了米黑木霉之外，至少下列物种可与该探针杂交：康宁木霉(Trichoderma koningii)、坚韧肉座菌(Hypocrea lenta)和Hypocreaschweinitzii。在HindIII消化中，米黑木霉和康宁木霉具有大于5kb的、可与米黑木霉膨胀素基因杂交的带。对于H.schweinitzii，杂交的带大小为3.7kb，对于坚韧肉座菌，其大小约为3.3kb。该方法及其变化方法(不同的杂交及洗涤条件)可以用于检测来自任何生物体的编码膨胀素的基因。
实施例6
用于表达米黑木霉膨胀素的酿酒酵母克隆的制备
根据Margolles-Clark等人(应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，62：3840-3846，1996)描述的方法，在获得实施例1中提到的米黑木霉cDNA的过程中，获得了酿酒酵母克隆，该克隆包含一个表达质粒，其中SEQ.ID NO：1的cDNA序列被插入到质粒pAJ401酿酒酵母PGK1启动子和终止子区域之间(Saloheimo等人，1994，分子微生物学(Molec.Microbiol.)，13卷，219-228(1994))。简言之，将米黑木霉cDNA连接到EcoRI-XhoI切割的质粒pAJ401上。通过使用特定接头将酵母PGK启动子和终止子之间的两个克隆位点EcoRI和XhoI改变成相反方向，从质粒pFL60(Minet和Lacroute，当代遗传学，18卷，287-291页(1990)得到质粒pAJ401。根据制造厂商的指导使用电穿孔法(Bio-Rad)转化大肠杆菌菌株JS4，产生了1.3×106个独立克隆的文库。这些克隆之一包含携带SEQ.ID NO：1的cDNA的pAJ401，该cDNA插入到EcoRI和XhoI位点之间，随后将该克隆转化进酿酒酵母菌株DBY746。还获得了包含pAJ401而无SEQ.ID NO：1的cDNA序列的第二个酵母克隆，用作实施例5和6中的对照。
在发酵罐中培养两个酵母克隆(一个对照克隆和一个包含米黑木霉(longibrachiatum)膨胀素cDNA的克隆)2-3天。使用Chemap CMF微型1升或Biolafitte 14升发酵罐。培养基是无尿嘧啶的合成完全培养基(Sherman，1991，酶学方法(Methods Enzymol.)194，3-21)。将pH保持在5.0，通气速率是小发酵罐1L/分钟，大发酵罐8L/分钟，搅拌速率为300-600转/分。发酵后通过离心除去细胞，将上清液浓缩50-100倍。
实施例7
米黑木霉膨胀素cDNA在Aspergillus niger var.awamori中的表达曲霉属表达载体的构建
用于表达米黑木霉膨胀素cDNA的曲霉属表达载体的构建包括三个步骤：(1)膨胀素cDNA的PCR-扩增，并将其亚克隆进pSP73-hind3(即HindIII位点被除去)，(2)将PCR产生的膨胀素基因的中间部分交换到得自cDNA亚克隆的初始膨胀素基因中，以消除PCR扩增产生的错误，(3)将膨胀素插入片段亚克隆进曲霉属表达载体pGAPT-PT中，以用于在A.niger var.awamori glaA启动子(葡糖淀粉酶)控制下的表达。
1.膨胀素cDNA的PCR扩增：
使用引物ExAspBgl2(CATTAGATCTCAGCAATGGCTGGTAAGCTTATCCTC)和ExAspXba1(CGACTCTAGAAGGATTAGTTCTGGCTAAACTGCACACC)进行米黑木霉膨胀素cDNA编码区的PCR扩增(使用实施例1的载体)。
ExAspBgl2在glaA(葡糖淀粉酶)启动子序列的最后五个核苷酸之前有一个BglII克隆位点，其中所述的glaA启动子序列位于翻译起始位点(ATG)之前。ExAspBgl2的ATG之后是对应于膨胀素信号序列的19-mer。ExAspXba1具有XbaI克隆位点、终止密码子和编码膨胀素基因的最后7个密码子的序列。
用BglII和XbaI消化PCR扩增的1.5kb膨胀素片段，并将其连接进BglII-XbaI切开的pSP73-Hind3载体中。在此克隆步骤之前，首先使pSP73缺失掉其HindIII位点。这通过用HindIII切开载体(pSP73)进行，在将载体接回到一起之前用T4聚合酶(与dNTP)填充突出末端。将该载体定名为pSP73-Hind3。
将包含1.5kb膨胀素插入片段的pSP73-Hind3定名为pPCRAexp。
2.用初始序列取代PCR扩增的序列：
用HindIII和BstEII消化pPCRAexp。HindIII切割在信号序列内的编码膨胀素的序列，BstEII邻近于编码膨胀素序列的末端。丢弃得自pPCRAexp的1.4kb HindIII-BstEII膨胀素片段，用得自初始膨胀素cDNA亚克隆的1.4kb HindIII-BstEII膨胀素片段取代(实施例1)。将产生的载体定名为pWTAexp。
3.克隆进表达载体：
用BglII和XbaI消化pWTAexp，形成了具有完全编码区的1.5kb膨胀素插入片段，该插入片段位于glaA启动子序列的五个核苷酸之后，其侧翼是可以在曲霉属表达载体pGAPT-PT中glaA启动子和终止子序列连接之间进行的克隆位点(如下所述)。连接该插入片段和载体序列，将形成的载体命名为pGAPT-exp(6.5kb)。这是在黑曲霉中表达米黑木霉膨胀素cDNA的载体。
用于构建pGAPT-exp的表达载体pGAPT-PG(5.1kb)包含A.nigervar.awamori glaA启动子序列的1.1kb SpeI-BglII片段、黑曲霉glaA终止子序列的0.2kb片段以及1.6kb的在pUC18主链上的构巢曲霉pyrG标记基因。glaA终止子片段位于glaA启动子序列之后，通过可以用于插入待表达的序列的多克隆位点分离。
对glaA启动子序列的3′末端(即：pGAPT-exp中膨胀素基因的翻译起始位点之前的序列)进行遗传工程操作(多克隆位点)，使其具有下列起始于glaA启动子的Xmnl位点的序列：
GAAGTGCTTCCTCCCTTTTAGACGCAACTGAGAGCCTGAGCTTCATCCCCAGCATCATTAGATCTCAGCAATG
其中在末端的ATG是膨胀素cDNA的起始密码子。
终止密码子周围的序列如下(从对膨胀素中初始′TGA′终止密码子遗传工程操作的′TAA′终止密码子开始)：
TA ATCCTTCTAGAGTCGA CCGCGACGGTGACC
直到glaA终止子序列中的BstEII位点(GGTGACC)。
曲霉属的pGAPT-exp转化
将pGAPT-exp转移进Ward等人在应用微生物生物技术，39：738-743(1993)中描述的菌株A.niger var.awamori dgr246 p2。曲霉属转化之后进行与13-16页所述的用于木霉属的相同基本步骤。A.nigervar.awamori dgr246 p2的转化步骤也在Ward等人，应用微生物生物技术，39：738-743(1993)中描述。
基于转化体在没有尿苷的基本营养物中生长的能力选择转化体。未转化的细胞的生长需要尿苷。
转化体筛选
如Ward等人，生物技术(Bio/Technology)，8：435-440(1990)所述，将曲霉属转化体培养在250ml振荡烧瓶中的50ml液体培养基中5-11天。复合培养基包含15％麦芽糖以诱导glaA启动子，从而启动膨胀素基因的表达。将培养物上清液在SDS-PAGE凝胶上电泳。产生米黑木霉膨胀素的曲霉属转化体在66kD标记带上部有一条带，该带没有出现在阴性对照(转化之前的曲霉属菌株)的泳道内(图6)。
实施例8
用米黑木霉膨胀素处理对纤维素结构的影响
将Whatman 3号滤纸环切割成2×7cm的带。所使用的缓冲液是50mM醋酸钠，pH 5.0。在室温下将滤纸带浸入包含下列物质的溶液中至少30分钟：水、缓冲液、缓冲液中的8M脲、产自包含米黑木霉膨胀素基因的酵母克隆或对照酵母克隆的培养液，其中对照酵母克隆在缓冲液中不产生米黑木霉膨胀素(稀释倍数从7ml缓冲液中1ml培养液到4ml缓冲液中4ml培养液)。
将Thwing-Albert拉力试验装置的测试速度设置为0.1cm/分钟，拉力能量在0至50磅的范围内测量。将每条滤纸放置在夹具中并测定最大负载量。此实验结果定量了在纸破碎之前可承受的负荷程度。每种样品类型测定2至3条。几个不同的试验的结果如表1和2所示。
   表1
  样品  试验1  试验2  试验3   平均值
  缓冲液  .55  .58  .59   .57
  8M脲  无值  .36  .32   .34
  对照培养液  .49  .49  .47   .48
  含膨胀素培养液  .40  .42  .42   .41
   表2
 样品  试验4  试验5   平均值
 缓冲液  .56  .59   .58
 8M脲  .42  .41   .42
 对照1ml  .52  .52   .52
 对照3ml  .52  .47   .50
 含膨素1ml  .43  .42   .43
 含膨素3ml  .46  .40   .43
如所预料的，与仅用缓冲液处理的带相比，用8M脲(已知脲破坏氢键相互作用)处理的纸条的负载(不破裂)要低。在两个试验中，用膨胀素培养液处理的纸条比用对照培养液处理的纸条之最大负载量明显地低(大约15％)。在这两种培养液之间的唯一不同是：一种得自包含米黑木霉膨胀素基因的酵母菌株的发酵液，而对照菌株不包含该基因。这些结果表明：在膨胀素培养液中具有使滤纸强度降低的组分。
实施例9
用膨胀素处理棉花纤维
在特定的条件下培养上述实施例4中所述的酵母克隆，将外部细胞物质和碎片与发酵液分离。在相同的条件下培养包含表达质粒但无插入编码膨胀素cDNA序列的对照酵母克隆，通过除去外部细胞物质和碎片分离发酵液。将得自两种发酵过程(一种包含用膨胀素基因转化的酵母，一种包含没有用膨胀素基因转化的酵母作为对照)的培养上清液浓缩大约50倍，并用于确定米黑木霉膨胀素与棉纤维温育的结果。进一步将两种上清液的作用与用米黑木霉的纤维二糖水解酶I(CBHI)比较。
将作丝光处理的棉纤维悬浮在包含得自酵母发酵上清液(稀释倍数1∶4)和CBHI(剂量为5μg/g)的缓冲液(50mM醋酸钠，pH 5.0)中。于25℃下温育240分钟后，过滤掉悬浮的纤维，通过Sumner和Somers(1994)的方法确定释放入滤液中的还原糖的量。用缓冲液漂洗纤维一次，接着将纤维与玻璃细珠悬浮在蒸馏水中，然后使用探针尖超声波仪(Vibra Celland Materials公司)超声处理1分钟。然后染色纤维并通过光学显微镜观察，以确定对其结构的总体效果。得自对照处理的滤液与源于包含膨胀素基因的酵母菌株的滤液未表现出水解活性，也就是说，从棉纤维中没有释放出还原糖。相比之下，仅含CBHI的滤液释放出的还原糖为初始干重的0.08％。在超声处理之前，用得自对照酵母菌株的上清液处理的纤维和用得自包含膨胀素基因的酵母菌株的上清液处理的纤维间没有明显的区别。然而，在超声处理后，在用得自包含膨胀素基因的酵母的上清液处理的纤维中膨胀和被破坏的区域是明显的，而在用获自对照酵母菌株的上清液处理的纤维中不存在膨胀和被破坏的区域(图5)。仅用CBHI在纤维上引起轻微的纤维性颤动，但是没有检测到切开的或膨胀的区域，而这却是用包含得自膨胀素基因的酵母的上清液处理的典型效果。

Claims (33)

1.一种来源于微生物的部分或完全分离的膨胀素蛋白质，其具有与SEQ.ID NO：2所提供的氨基酸序列至少有70％序列相同性的序列，且其还具有使滤纸强度降低和/或使棉花纤维膨胀的能力。
2.根据权利要求1的膨胀素蛋白质，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的膨胀素蛋白质，其来源于真菌或细菌。
4.根据权利要求3的膨胀素蛋白质，其中所述的真菌是丝状真菌。
5.根据权利要求4的膨胀素蛋白质，其中所述的丝状真菌为木霉属(Trichoderma spp.)、腐质霉属(Humicola spp.)、脉孢菌属(Neurosporaspp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、镰孢属(Fusarium spp.)、青霉属(Penicillium spp.)或粘帚霉属(Gliocladium spp.)的种。
6.编码根据权利要求1的膨胀素蛋白质的DNA，其具有与SEQ.IDNO：1所提供序列至少有70％序列相同性的序列，或为SEQ.ID NO：1序列的衍生物。
7.根据权利要求6的DNA，其来源于真菌或细菌。
8.根据权利要求7的DNA，其中所述的真菌为丝状真菌。
9.根据权利要求8的DNA，其中所述的丝状真菌为木霉属、腐质霉属、脉孢菌属、曲霉属、镰孢属、青霉属或粘帚霉属的种。
10.根据权利要求6的DNA，其能与具有SEQ.ID NO：1所提供序列的全部或部分的DNA杂交。
11.根据权利要求10的DNA，其能与编码具有SEQ.ID NO：14、SEQ.ID NO：15、SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17或SEQ.ID NO：18氨基酸序列的肽的DNA探针杂交。
12.根据权利要求6的DNA，其具有根据SEQ.ID NO：1的序列。
13.一种载体，该载体包含权利要求6的DNA。
14.一种宿主细胞，该宿主细胞用权利要求13的载体转化。
15.根据权利要求14的宿主细胞，其中所述的宿主细胞在遗传上已经改变以缺失一个或多个纤维素酶基因。
16.根据权利要求14的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为丝状真菌。
17.根据权利要求16的宿主细胞，其中所述的丝状真菌为木霉属、腐质霉属、脉孢菌属、曲霉属、镰孢属、青霉属或粘帚霉属的种。
18.一种生产根据权利要求1的膨胀素蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
(a)获得用包含编码膨胀素蛋白质的DNA的载体转化的宿主细胞，所述的DNA从真菌或细菌中分离；
(b)在适合于所述膨胀素蛋白质表达和任选地分泌的条件下培养所述宿主细胞；
(c)回收含有所述膨胀素蛋白质的发酵液。
19.根据权利要求18的方法，其中所述的DNA来源于丝状真菌。
20.根据权利要求19的方法，其中所述的丝状真菌为木霉属、腐质霉属、脉孢菌属、曲霉属、镰孢属、青霉属或粘帚霉属的种。
21.根据权利要求18的方法，其中所述的DNA具有与SEQ.ID NO：1所提供序列至少有70％序列相同性的序列，或为根据SEQ.ID NO：1的序列的衍生物。
22.根据权利要求18的方法，其中所述的DNA能与具有SEQ.IDNO：1所提供序列的全部或部分的DNA杂交。
23.根据权利要求18的方法，其中所述DNA能与编码具有SEQ.IDNO：14、SEQ.ID NO：15、SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17或SEQ.IDNO：18氨基酸序列的肽的DNA探针杂交。
24.根据权利要求18的方法，其中所述的DNA具有根据SEQ.IDNO：1的序列。
25.一种改变纤维素底物特性的方法，该方法包括使所述的纤维素底物和包含根据权利要求18的方法产生的膨胀素蛋白质的组合物接触。
26.根据权利要求25的方法，其中所述方法包括改变动物饲料的营养特性。
27.根据权利要求25的方法，其中所述方法包括改变含有纤维素纤维的织物或纱线的特性。
28.根据权利要求25的方法，其中所述方法包括改变造纸过程中木浆或其衍生物的特性。
29.根据权利要求25的方法，其中所述方法包括在纤维素生物质还原为葡萄糖的过程中改变含纤维素生物质的特性。
30.根据权利要求25的方法，其中所述方法包括在含纤维素的谷物种皮纤维还原为葡萄糖的过程中改变其特性。
31.一种动物饲料，其含有根据权利要求1所述的膨胀素蛋白质。
32.一种洗衣用清洁剂组合物，其含有根据权利要求1所述的膨胀素蛋白质。
33.一种纺织品处理组合物，其含有根据权利要求1所述的膨胀素蛋白质。
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