CN1261029C - 一种酶法改性乳蛋白的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种酶法改性乳蛋白的方法及其应用，涉及乳品生物技术。本发明提出了复合酶“一步法”的酶法改性乳蛋白工艺，采用固定化复合酶结合离子调控蛋白质结构和加热处理技术对乳蛋白进行选择性地水解乳蛋白中的αs酪蛋白和β-乳球蛋白，使αs-酪蛋白的消化性提高和β-乳球蛋白的致敏性降低，控制水解程度，防止苦味产生。本发明改性后的乳蛋白其中乳清蛋白和酪蛋白的比例可达到类似于人乳的蛋白组成，消化性高和致敏性低，应用于新生婴儿的配方乳和老年人、病人或消化不良者适用的配方乳中。
Description
技术领域
一种酶法改性乳蛋白的方法及其应用，涉及乳品生物技术。
背景技术
乳蛋白是哺乳动物乳中的重要营养成分，在人类和动物乳中其含量为0.9～5.5％(见表1)。全世界的乳产量每年约为56×107吨，其中85％来自乳牛，11％来自水牛，2％来自绵羊，另外2％来自山羊。一般来说，骆驼、牦牛、马和驯鹿等产乳动物所产乳量较少，尽管在有些地区它们相当重要。假定奶牛、水牛、绵羊和山羊所产乳中分别含有3.4％、3.8％、5.5％和2.9％的蛋白质，那么每年全世界所产乳蛋白的量大约为20×106吨。
表1不同哺乳动物乳的成分含量(％)
| 种类 | 总蛋白 | 脂肪 | 乳糖 | 灰分 |
| 人类山羊乳牛水牛印度象绵羊 | 0.92.93.43.84.95.5 | 3.84.53.77.411.67.4 | 7.04.14.84.84.74.8 | 0.20.80.70.80.71.0 |
乳蛋白主要是由酪蛋白和乳清蛋白组成。动物乳经酸或酶处理后从乳中沉淀出来的是酪蛋白，而保持溶解状态的是乳清蛋白。酪蛋白含有四种基本蛋白质，即αs(包括αs1-，αs2-)，β-和κ-酪蛋白，分别约占总酪蛋白的48％(38％、10％)、36％和12％。乳清蛋白中最重要的蛋白质是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，它们占乳清中蛋白含量的70％～80％。其他的乳清蛋白主要包括免疫球蛋白、
胨和血清白蛋白。
牛乳是世界上最主要的乳蛋白来源，牛乳因营养价值高而成为人类消费量最大的蛋白质资源之一，其最主要的营养功效体现在婴儿配方食品中如作代母乳食品或老年人、病人的营养食品中。对于大多数正常人来说，乳蛋白可以被消化吸收，而对于婴儿特别是新生婴儿和一些老年人、病人或消化不良者，其中αs-酪蛋白就不易被消化吸收，而β-乳球蛋白是成为呕吐、腹泻等的致敏原。因此，为了解决乳蛋白的消化性和致敏性，世界乳业发达国家都在开展研究，主要的研究工作集中在酶法改性去除αs-酪蛋白，酶法或化学法、膜分离法去除β-乳球蛋白。这些研究的应用目前尚存在一些困难：(1)牛乳经脱脂后，需要分离酪蛋白和乳清蛋白，并分别对乳清蛋白和酪蛋白进行改性，再重组处理，工艺路线长，不能实现工业化；(2)消除β-乳球蛋白的致敏性，国外通常采用盐析法(FeCl3等盐)，将β-乳球蛋白选择性沉淀，该方法带来后道操作需要脱盐的问题，同时由于完全去除了牛乳乳清中占主要比例的β-乳球蛋白和部分α-乳白蛋白，使整个乳清中蛋白质的回收率仅为30％，导致产品成本高。另外盐析后的蛋白溶液浓度过低，为工业化生产带来极大的困难；(3)国内外酶水解αs-酪蛋白产生严重的苦味；(4)酶水解时直接将酶放入乳蛋白中，使乳蛋白中被引入外源性异蛋白质，易造成食品安全问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种酶法改性乳蛋白的方法及其应用，采用复合酶对乳蛋白进行“一步法”的酶法改性，选择性地水解乳蛋白中的αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，使αs-酪蛋白的消化性提高和β-乳球蛋白的致敏性降低，不产生苦味。本发明改性后的乳蛋白其中乳清蛋白和酪蛋白的比例可达到类似于人乳的蛋白组成，消化性高和致敏性低，应用于新生婴儿的配方乳中和老年人、病人或消化不良者适用的乳制品中。
本发明的技术方案：对乳蛋白溶液用离子调控蛋白质结构和加热处理，再用固定化复合酶一步法水解乳蛋白中的αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，使其同时被酶选择性地改性，控制水解程度，防止苦味产生的酶法改性工艺，再通过过滤除去固定化复合酶。
所用原料乳蛋白为动物乳经脱脂分离后的脱脂乳，包括酪蛋白和乳清蛋白，脂肪含量≤0.2％；或在脱脂乳中加入脱盐乳清粉，所加脱盐乳清粉质量为脱脂乳体积5～15％质量/体积比的比例；或在脱脂乳中加入大豆蛋白，所加大豆蛋白质量为脱脂乳体积3～10％质量/体积比的比例；乳蛋白溶液中蛋白浓度为3～10％。
对乳蛋白进行离子调控蛋白结构和加热处理：在乳蛋白溶液中用Ca2+、K+和Na+的溶液按1～2∶1～2∶1的比例调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5。操作时用3mol/L的CaCl2、10mol/L的NaOH和10mol/L的KOH滴加入乳蛋白溶液中，使pH呈中性或微碱性，使蛋白质肽链展开，易于酶的作用。将乳蛋白溶液升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至40-65℃。
固定化复合酶是以海藻酸钠(alginate)、或壳聚糖(chitosan)、或海藻酸钠/壳聚糖为载体，戊二醛作为交联剂，采用载体交联法制备的一种高活力的固定化复合酶，将海藻酸钠、或壳聚糖、或海藻酸钠和壳聚糖配制成浓度为1～5％的溶液，按酶与载体质量比为1∶10～50的比例加入复合酶。壳聚糖应以1％-2％的醋酸溶液溶解，6mol/L NaOH调pH至7.5后，抽干并以pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，然后再加入酶液，搅拌吸附30-40min，在10～35℃下滴加戊二醛，至溶液中戊二醛浓度为0.3～0.8％，搅拌反应5～10小时，水冲洗后抽干得固定化复合酶。
复合酶同步水解，所用酶种为：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶；所用复合酶为上述酶种中两种酶的组合，两种酶的用量比为4～6∶6～4，水解反应中复合酶总用量为乳蛋白质量的0.2‰～1‰，将固定化复合酶加入乳蛋白溶液中，在45～65℃下搅拌反应1～4小时，控制水解程度，使αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率达到50％～95％。
将酶解后的乳蛋白溶液进行过滤，除去固定化复合酶，并冷却到40℃以下。
牛乳的酶法改性制备新生婴儿配方乳，在脱脂牛乳中加入脱盐乳清粉，所加脱盐乳清粉质量为脱脂乳体积5～15％质量/体积比的比例进行酶法改性，水解后的乳蛋白溶液经配方重组，再进行均质、浓缩、喷雾干燥制得乳粉，每100g乳粉，控制蛋白质12～18g，脂肪25-31g。
牛乳的酶法改性制备适合消化不良者或病人、老年人食用的乳制品，在脱脂牛乳中加入大豆蛋白，所加大豆蛋白质量为脱脂乳体积3～10％质量/体积比的比例进行酶法改性，水解后的乳蛋白溶液经配方重组，再进行均质、浓缩、喷雾干燥制得乳粉，每100g乳粉，控制蛋白质20-26g，脂肪10-16g。
改性率的测定方法
SDS-PAGE电泳法分离测定改性酪蛋白和乳清蛋白的改性率方法
样品处理：将改性前后的样品(乳粉先按1∶7加超纯水溶解)分别离心分离脱脂(7200r/min)，脱脂后的样品测定体积(V1)，溶液稀释适当倍数(100-200倍)，采用Lowry法测定可溶性蛋白质(X1)。然后将样品采用超纯水透析，透析袋截留分子量为10000，24h后，离心分离(7200r/min)，上清液测定体积(V2)，溶液稀释适当倍数(100倍左右)后，采用Lowry法测定总可溶性蛋白质(X2)，然后采用常规PAGE电泳测定蛋白质组成。用浓度为10％的分离胶和浓度为3％的浓缩胶作为不连续凝胶系统，采用pH8.3Tris-甘氨酸溶液作为电极缓冲液体系，蛋白样品浓度为0.2-4mg/ml，样品上样量为4μl-10μl。在光密度扫描仪上对电泳谱带进行扫描并通过积分计算待测蛋白质所占的百分含量(M)，改性率按下式计算。
即
改性率％＝(改性前-改性后)待测蛋白质含量/改性前待测蛋白质含量×100％
本发明的有益效果：采用固定化复合酶结合离子调控蛋白质结构和加热处理，使αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的肽链展开，容易被酶水解，提高蛋白质的酶水解程度，使酶水解的选择性增加。不需要对乳蛋白中的酪蛋白和乳清蛋白分离，在“一步法”的酶水解条件下，同时对酪蛋白和乳清蛋白发生水解，使αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率达到50％～95％，并且无苦味产生，工艺路线大大缩短，实现了工业化生产。
用酶法选择性水解消除β-乳球蛋白的致敏性并使α-乳白蛋白全部回收，工艺上突破了前人在此领域采用盐析法分离的局限。国际上现有的α-乳白蛋白的回收率最高为85％，而本发明α-乳白蛋白回收率100％。
用固定化酶水解使外加酶可以通过过滤完全被除去，防止在乳蛋白中引入外源性异蛋白质，解决了食品安全性问题。并且不需要通过加热灭酶，排除加热对蛋白质营养和功能性质的影响，节约能源，所生产的乳制品质量高。过滤收集的固定化复合酶可以被反复使用20次以上。
乳蛋白经固定化复合酶水解后，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白被水解为相对分子质量低于3000的小分子多肽，不但使消化吸收率大大增加和过敏性被消除，而且小分子多肽对人体具有许多很好的保健作用和营养价值，适合于0～6个月婴儿食用和消化不良者或老年人食用。
应用该酶法改性脱脂牛乳，脱脂牛乳中加入乳清粉或大豆蛋白，处理后的乳清蛋白和酪蛋白的比例可达到类似于人乳的蛋白组成，消化性高和致敏性低，应用于新生婴儿配方乳和老年人或消化不良者适用的乳制品，所生产的乳制品具有无苦味、无致敏性、消化吸收好、营养价值高、风味好、易溶解等质量高的特点，产品有很好的市场前景。我国目前每年有2000万新生儿诞生，约有30％的婴儿需要人工哺乳，虽然母乳永远是婴儿最理想的食物，但在没乳或缺乳的情况下，婴儿配方乳粉尤为重要，按我国婴幼儿人数和食用量计，每年则需要大约15万吨。但目前国内婴儿配方乳粉不足5万吨，远远不能满足市场需求。同时我国正在进入老年化社会，老年人和病人约占1/3。因此，这些乳制品有着很高的经济效益和社会效益。
具体实施方式
实施例1
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳。脱脂乳经离子调节和加热处理：以1～2∶1～2∶1的比例用Ca2+、K+和Na+溶液调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；溶液中蛋白浓度为3.1％，通过热交换器加热升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至45-65℃。固定化复合酶酶解：酶种为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，两种酶比例为4∶6，载体为海藻酸钠，海藻酸钠溶液浓度为5％，酶/载体质量比为1∶25，滴加戊二醛使溶液中戊二醛浓度为0.6％，在35℃下搅拌反应10h，得到固定化复合酶。酶解条件为：酶用量为乳蛋白质量的1‰，55℃酶解2.5h，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率分别达到85％，95％。再通过过滤除去固定化复合酶。过滤收集的固定化复合酶可以被反复使用20次以上。
实施例2
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳。脱脂乳中添加脱盐乳清粉，添加量为5％的质量/体积比，经离子调节和加热处理：以1～2∶1～2∶1的比例用Ca2+、K+和Na+溶液调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；溶液中蛋白浓度为3.7％左右，通过热交换器加热升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至45-65℃。固定化复合酶酶解：酶种为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，两种酶比例为5∶5，载体为壳聚糖，壳聚糖溶液浓度为3.5％，壳聚糖应以1％-2％的醋酸溶液溶解，6mol/L NaOH调pH至7.5后，抽干并以pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，然后再加入酶液，搅拌吸附30-40min，酶/载体质量比为1∶50，滴加戊二醛使溶液中戊二醛浓度为0.8％，在25℃下搅拌反应7h，得到固定化复合酶。酶解条件为：酶用量为乳蛋白质量的0.5‰，45℃酶解1h，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率分别为75％，87％。通过过滤除去固定化复合酶。
实施例3
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳。脱脂乳中添加脱盐乳清粉，添加量为10％的质量/体积比，经离子调节和加热处理：以1～2∶1～2∶1的比例用Ca2+、K+和Na+溶液调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；溶液中蛋白浓度为4.4％左右，通过热交换器加热升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至45-65℃。固定化复合酶酶解：酶种为木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，两种酶比例为6∶4，载体为海藻酸钠/壳聚糖，海藻酸钠/壳聚糖溶液浓度为2％(海藻酸钠浓度为1％、壳聚糖浓度为1％)，酶/载体质量比为1∶10，滴加戊二醛使溶液中戊二醛浓度为0.3％，在10℃下搅拌反应5h，得到固定化复合酶。酶解条件为：酶用量为乳蛋白质量的0.2‰，65℃酶解4h，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率分别75％，85％。通过过滤除去固定化复合酶。
实施例4
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳。脱脂乳经离子调节和加热处理：以1～2∶1～2∶1的比例用Ca2+、K+和Na+溶液调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；溶液中蛋白浓度为3.1％，通过热交换器加热升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至45-65℃。固定化复合酶酶解：酶种为胃蛋白酶和菠萝蛋白酶，两种酶比例为4∶6，载体为海藻酸钠，海藻酸钠溶液浓度为5％，酶/载体质量比为1∶10，滴加戊二醛使溶液中戊二醛浓度为0.6％，在35℃下搅拌反应10h，得到固定化复合酶。酶解条件为：酶用量为乳蛋白质量的1‰，40℃酶解1h，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率分别为75％，88％。通过过滤除去固定化复合酶。
实施例5
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳。脱脂乳中添加大豆蛋白，添加量为3％的质量/体积比，经离子调节和加热处理：以1～2∶1～2∶1的比例用Ca2+、K+和Na+溶液调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；溶液中蛋白浓度为5％左右，通过热交换器加热升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至45-65℃。固定化复合酶酶解：酶种为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，两种酶比例为5∶5，载体为壳聚糖，壳聚糖溶液浓度为3.5％，壳聚糖应以1％-2％的醋酸溶液溶解，6mol/L NaOH调pH至7.5后，抽干并以pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，然后再加入酶液，搅拌吸附30-40min，酶/载体质量比为1∶25，滴加戊二醛使溶液中戊二醛浓度为0.8％，在20℃下搅拌反应7h，得到固定化复合酶。酶解条件为：酶用量为乳蛋白质量的0.5‰，55℃酶解2.5h，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率分别为82％，95％。通过过滤除去固定化复合酶。
实施例6
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳。脱脂乳中添加大豆蛋白，添加量为10％的质量/体积比，经离子调节和加热处理：以1～2∶1～2∶1的比例用Ca2+、K+和Na+溶液调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；溶液中蛋白浓度为10％左右，通过热交换器加热升温至70-90℃，维持5-15s，然后降温至45-65℃。固定化复合酶酶解：酶种为胃蛋白酶和胰蛋白酶，两种酶比例为6∶4，载体为海藻酸钠/壳聚糖，海藻酸钠/壳聚糖溶液浓度为2％(海藻酸钠浓度为1％、壳聚糖浓度为1％)，酶/载体质量比为1∶50，滴加戊二醛使溶液中戊二醛浓度为0.3％，在10℃下搅拌反应5h，得到固定化复合酶。酶解条件为：酶用量为乳蛋白质量的0.2‰，65℃酶解4h，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率达到72％，87％。通过过滤除去固定化复合酶。
实施例7
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳，脱脂乳中添加脱盐乳清粉，添加量为15％的质量/体积比，进行酶解处理。其余操作同实施例1。在脱除固定化复合酶的水解后的乳蛋白溶液中回加前道分离出来的奶油，再按照人乳的营养成分要求，加入其他成分，按1000ml脱脂乳计，加入植物油60g、乳糖29g，复合维生素1.2g、复合微量元素0.5g以及生理活性物质如免疫球蛋白0.4g、乳铁蛋白0.2g、溶菌酶0.15g、核苷酸0.06g、胆碱0.15g、牛磺酸0.15g等经配方重组，并进行均质、浓缩、喷雾干燥制得婴儿配方乳粉，其中免疫球蛋白和溶菌酶单独包装与奶粉配合。每100g乳粉，控制蛋白质12-18g，脂肪25-31g。
实施例8
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳，脱脂乳中添加脱盐乳清粉，添加量为7％的质量/体积比，进行酶解处理。其余操作同实施例7。
实施例9
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳，脱脂乳中添加大豆蛋白，添加量为5％的质量/体积比，进行酶解处理。其余操作同实施例1。在脱除固定化复合酶的水解后的乳蛋白溶液中回加前道分离出来的奶油，再经配方重组，并进行均质、浓缩、喷雾干燥制得老年人配方乳粉。其他添加物添加量按1000ml脱脂乳计：麦芽糊精60g，低聚异麦芽糖20g，维生素A 14mg，维生素D322μg，维生素E 28mg，维生素C 84mg，活性钙1000mg，葡萄糖酸亚铁120mg，葡萄糖酸锌65mg。每100g乳粉，控制蛋白质20-26g，脂肪10-16g。
实施例10
新鲜牛乳用离心机分离去除脂肪得脱脂乳，脱脂乳中添加大豆蛋白，添加量为8％的质量/体积比，进行酶解处理。其余操作同实施例9。
Claims (3)
1.一种酶法改性乳蛋白的方法，其特征是对乳蛋白溶液用离子调控蛋白质结构和加热处理，再用固定化复合酶一步法水解乳蛋白中的αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，使其同时被酶选择性地改性，控制水解程度，防止苦味产生的酶法改性工艺，再通过过滤除去固定化复合酶；
(1)原料乳蛋白为：动物乳经脱脂分离后的脱脂乳，包括酪蛋白和乳清蛋白，脂肪含量≤0.2％；或在脱脂乳中加入脱盐乳清粉，所加脱盐乳清粉质量为脱脂乳体积5％～15％质量/体积比的比例；或在脱脂乳中加入大豆蛋白，所加大豆蛋白质量为脱脂乳体积3％～10％质量/体积比的比例；乳蛋白溶液中蛋白浓度为3％～10％；
(2)对乳蛋白溶液进行离子调控蛋白结构和加热处理：在乳蛋白溶液中用Ca2+、K+和Na+的溶液按1～2∶1～2∶1的比例调节离子浓度，使pH达到7.0～7.5；使乳蛋白溶液升温至70-90℃，维持5-15秒，然后降温至40-65℃；
(3)固定化复合酶的配制：以海藻酸钠、或壳聚糖、或海藻酸钠和壳聚糖为载体，戊二醛作为交联剂，采用载体交联法制备的一种高活力的固定化复合酶，将海藻酸钠、壳聚糖或海藻酸钠和壳聚糖配制成浓度为1％～5％的溶液，按酶与载体质量比为1∶10～50的比例加入复合酶，壳聚糖应以1％-2％的醋酸溶液溶解，用6mol/L的NaOH调pH至7.5后，抽干并以pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，然后再加入酶液，搅拌吸附30-40分钟，在10～35℃下滴加戊二醛，至溶液中戊二醛浓度为0.3％～0.8％，搅拌反应5～10小时，水冲洗后抽干得固定化复合酶；所用酶种为：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶；所用复合酶为上述酶种中两种酶的组合，两种酶的用量比为4～6∶6～4；
(4)复合酶同步水解：水解反应中复合酶总用量为乳蛋白质量的0.2‰～1‰，将固定化复合酶加入乳蛋白溶液中，在45～65℃下搅拌反应1～4小时，控制水解程度，使αs-酪蛋白和β-乳球蛋白的改性率达到50％～95％；
(5)过滤除去固定化复合酶：将酶解后的乳蛋白溶液进行过滤，除去固定化复合酶，并冷却到40℃以下。
2.如权利要求1所述酶法改性乳蛋白的方法的应用，其特征是用于牛乳的酶法改性制备新生婴儿配方乳，在脱脂牛乳中加入脱盐乳清粉，所加脱盐乳清粉质量为脱脂乳体积5％～15％质量/体积比的比例进行酶法改性，水解后的乳蛋白溶液经配方重组，再进行均质、浓缩、喷雾干燥制得乳粉，每100g乳粉，控制蛋白质12～18g，脂肪25-31g。
3.如权利要求1所述酶法改性乳蛋白的方法的应用，其特征是用于牛乳的酶法改性制备适合消化不良者或病人、老年人食用的乳制品，在脱脂牛乳中加入大豆蛋白，所加大豆蛋白质量为脱脂乳体积3％～10％质量/体积比的比例进行酶法改性，水解后的乳蛋白溶液经配方重组，再进行均质、浓缩、喷雾干燥制得乳粉，每100g乳粉，控制蛋白质20-26g，脂肪10-16g。
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