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CN1254292A - 通过膈下内吸收途径使用的抗螺杆菌疫苗组合物,以及粘膜/非肠道联用免疫方法 - Google Patents

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CN1254292A
CN1254292A CN98804722A CN98804722A CN1254292A CN 1254292 A CN1254292 A CN 1254292A CN 98804722 A CN98804722 A CN 98804722A CN 98804722 A CN98804722 A CN 98804722A CN 1254292 A CN1254292 A CN 1254292A
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helicobacter
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J·哈恩斯勒
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MERIEUX ORAVAX
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Abstract

本发明的目标是使用源自螺杆菌的免疫原性物质制备用于诱导抗螺杆菌的T辅助细胞1(Th1)型免疫应答以防止或治疗哺乳动物的螺杆菌感染的药用组合物。这具体是通过例如,在哺乳动物的膈下区域通过内吸收途径或非肠道途径施用药用组合物实现的。本发明还包括用于治疗或防止螺杆菌感染的粘膜/非肠道免疫方法。

Description

通过膈下内吸收途径使用的抗螺杆菌疫苗 组合物，以及粘膜/非肠道联用免疫方法
本发明的目的是使用疫苗制备物在哺乳动物中特效诱导针对感染粘膜的病原有机体保护性免疫反应，具体地说是螺杆菌属(Helicobacter)细菌。
螺杆菌是细菌的一个属，其特征为革兰氏染色阴性的螺旋状细菌。其中几个种位于哺乳动物的胃肠道。其中尤其值得一提的是幽门螺杆菌(H.pylori)，H.heilmanii，H.filis和鼬鼠螺杆菌(H.mustelae)。H.pylori是最经常与人类的感染相关的，但在一些罕见的病例中也可能分离到H.heilmanii和H.felis。螺杆菌类型的一种细菌，Gastrospirillumhominis在人类中也有报道。
螺杆菌对成年人口的感染率在发达国家为50％，而在发展中国家接近100％。这表明其为全世界范围的主要感染源。
目前为止，在人类中仅在腹部的粘膜表面，特别是在十二指肠溃疡和胃部的火山型伤口附近，发现H.pylori。这种细菌被认为是窦胃炎(antral gastritis)的原初致病因子并且是发展的溃疡所需的辅助因子之一。并且，胃癌的发生可能和H.pylori的作用相关。
因此发展防止或治疗螺杆菌感染的疫苗是非常合乎需要的。
目前，几种螺杆菌的蛋白已被提出做为疫苗抗原的候选。并且通常建议使用的接种疫苗的方法包括将抗原送达胃粘膜水平，即免疫应答发生的预期位点，为了达到这些目的，选择了口腔(oral)的方式。
同样为了这一目的，即在胃部水平上引导免疫应答，最近提出将抗原送达胃粘膜以外的粘膜，如鼻腔或直肠粘膜，的粘膜位点，例子见(WO 96/31235)。淋巴细胞被所谓的诱导粘膜区的抗原激活后能选择性地迁移和循环以到达所谓的效应粘膜区产生免疫应答。
这些方法的变例包括在通过鼻腔途径施用抗原之前通过内吸收途径进行第一次免疫。
对于通过粘膜途径施用的抗原(经常为细菌裂解物或纯化的蛋白)常常和适当的佐剂如霍乱毒素(CT)或来自E.coli的热不稳定毒素(LT)联用。
当使用粘膜途径时，观察到的体液与应答的类型主要为IgA型。这事实表明发生了区域免疫应答。
一些作者很早就考虑过，在保护性效果和强IgA型应答之间有很好的相关性(Czinn et.al.Vacinne(1993)11：637)。其他人给出了更保守的意见(Bogstedt et.al.，Clin.Exp.Immunol.(1996)105：202)。尽管目前为止这一问题还没有真正的定论，对于大多数作者而言诱导特定的IgA型抗体似乎是合乎需要的。
通常而言，IgA的产生意味着II型T辅助淋巴细胞产生应答(Th2应答)。
事实上，一种特定抗原对T辅助淋巴细胞的激活可能得到不同亚群的T辅助细胞，这些亚群的特征是不同的细胞因子合成类型。
具体而言，Th1细胞选择性地产生白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(TFN-γ)，而Th2细胞优先分泌IL-4，IL-5和IL-10。由于它们在产生细胞因子上的分化，这两种类型的T辅助细胞扮演两种不同的角色：Th1细胞促进细胞介导的免疫，如炎症类型的应答；而Th2细胞促进IgA，IgE和一些IgG亚型类型的应答。已知由小鼠Th1细胞产生的细胞因子能促进抗体应答，具体地说，IFN-γ诱导IgG2a应答。这样，根据先前技术中的各种研究来看，特征为IgA的出现的Th2应答对于保护效应如果不是充分的也是必要的。
让人惊奇的是，现在发现Th2应答纵然是无害的，还必需诱导高效的Th1应答。事实上，现在实验结果表明Th1应答比Th2应答更易于与保护效应相关。
与最初的探索相反(D’Elios et al.，J.Immunol.(1997)158：962)，本申请揭示在免疫时间内诱导炎症型的Th1应答的重要性，没有它则不能观察到保护效应。
因此，本发明的目的是：
(i)衍生于感染哺乳动物的胃十二指肠粘膜的微生物，如从螺杆菌的免疫原性物质在生产用于诱导抗上述微生物，如螺杆菌的Th1-型免疫应答的药用组合物中的应用，这种组合物用以治疗或防止哺乳动物中的感染，如螺杆菌感染；
(ii)一种方法，该方法用于治疗或防止由有能力感染哺乳动物胃十二指肠粘膜的微生物促进的感染，如螺杆菌的感染。根据这种方法对哺乳动物一次或多次施用来源于上述微生物，如来源于螺杆菌的免疫原性物质，从而诱导抗，例如，螺杆菌的免疫应答。
通过比较，例如，在鼠中诱导出的抗螺杆菌的IgG2a和IgG1的水平(分别为Th1应答和Th2应答发生的指示)可估计Th1应答相对Th2应答的水平，从而可为本发明的目的示明有效的Th1应答的诱导。事实上，所探索的Th1应答通常伴随着Th2应答。但是，通常认为相对于Th1应答而言Th2应答不会明显占主要地位。假如检测IgG2a和IgG1两种亚型的手段具有相同的敏感性，具体而言，抗IgG2a和抗IgG1抗体具有相同的敏感性，在小鼠中诱导IgG2a和IgG1的水平可传统地使用ELISA检测。
具体用于测试IgG2a和IgG1的量的方法与以下描述的相同或相似。聚碳酸酯的ELISA板的孔用100μl螺杆菌，如H.pylori，的细菌抽提物(约10μg/ml，溶于碳酸缓冲液)包被。ELISA板在37℃温育2hrs然后4℃过夜。用含0.05％ Tween 20的缓冲液(PBS/Tween缓冲液)洗板。每孔用250μl含1％牛血清白蛋白的PBS饱和，以防止抗体的非特异性吸附。在37℃温育1hrs后，用PBS/Tween缓冲液洗板。在小鼠施用诱导抗螺杆菌Th1型免疫应答的组分后数天从小鼠采集血清，用PBS/Tween缓冲液稀释成浓度序列。每孔加入100μl稀释液。板在37℃保温90分钟，洗板，然后按照标准程序测量。例如，用氧化物酶标记的羊抗鼠IgG2a或IgG1抗体。加入此抗体后在37℃继续温育90分钟。洗板后加入适当的底物反应，如标记酶为过氧化物酶时底物为O-双盐酸苯二胺(O-phenyl-diamine dihydrochloride)。反应通过测定分光光度法吸收的比色法测量。抗血清的IgG2a滴定度或IgG1滴定度相当于在490nm的光吸收为1.5时的样品的稀释倍数。
为本发明的目的诱导有效Th1应答的标志为小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于1/100，1/50或1/20，最好是大于1/10，优选地大于1/3，最优选地大于1/2，5或10。当该比率为1左右时，Th1/Th2应答被认为是混合的或平衡的。当该比率等于或大于5，Th1应答被认为是占优势的。
在小鼠中产生Th1(或Th2)应答是对在人中产生Th1(或Th2)应答的预测。尽管在小鼠中测量应答类型会更容易一些，在人中也是可以做到的。这可以通过一方面测量Th1应答特异的细胞因子的水平，另一方面测量对随后诱导的Th2应答特异的细胞因子的水平。Th1应答和Th2应答相对彼此的水平可以在对两种应答特异的细胞因子水平的基础上(见上文)比如，在IFN-γ/IL-4比率的基础上直接测量。
作为替代，如果使用了上文描述的测试方法，可以预计反应IgG2a的量ELISA滴定度应大于或等于10,000，优选地等于或大于100,000，特别优选地，应等于或大于1,000,000；这意味着Th1应答很明显。
药用组合物或该方法所针对的哺乳动物最好是灵长类，优选地为人类。
通过调整一系因素，如，施用的途径，可以诱导抗螺杆菌的Th1应答。事实表明，使用内吸收途径或非肠道途径可以得到与使用粘膜途径时相似的或更强的保护作用。
相应地，本发明的目的具体地为：
(i)衍生于螺杆菌的免疫原性物质在药用组合物制备中的应用，该药用组合物用于在哺乳动物，尤其是灵长类动物，中的膈下的一部分通过内吸收途径或非肠道途径施用该药用组合物，从而治疗或防止螺杆菌感染。
(ii)用于在哺乳动物中防止或治疗螺杆菌感染的一种方法，根据该方法，在上述哺乳动物中通过内吸收途径或非肠道途径一次或多次施用至少一种免疫原性物质。
与该方法相关，为了诱导所需的免疫应答，免疫原性物质通过内吸收途径或非肠道途径的施用最好重复一次或几次，优选地，至少两次与该方法相关，得到保护效果的一种优选方法具体而言是这样的，根据它免疫原性物质是完全通过内吸收途径或非肠道途径(严格内吸收途径)施用的。“一种免疫原性物质的施用是通过严格内吸收途径进行的方法”是这样定义的：一种不使用内吸收途径以外的施用途径的方法。比如，通过内吸收途径和粘膜途径施用免疫原性物质的方法就与以上给出的定义不符合。换言之，“一种免疫原性物质的施用是通过严格内吸收途径进行的方法”应理解为该方法的免疫原性物质的施用只通过内吸收途径，并排除使用任何其它途径，尤其是粘膜途径。
依然与该方法相关，通过内吸收途径或非肠道途径施用有利地是在哺乳动物的膈膜以下的部分进行的。
源自螺杆菌的免疫源性制剂最好选自灭活的螺杆菌细菌，螺杆菌的细胞裂解物或纯化后的源自螺杆菌的肽或多肽制备物。免疫原性物质也可以是多聚核苷酸分子，尤其是一个编码源自螺杆菌的肽或多肽，并且该DNA被置于对它在哺乳动物细胞中表达所必须的元件的控制之中；或者替代地，另一包括编码源自螺杆菌的肽或多肽的病毒疫苗载体，并且该载体处于对它在哺乳动物细胞细胞中表所必须的元件的控制之中。
为了本发明的目的，可以根据精通本工艺的人士所熟知的传统方法制备灭活细菌。细胞裂解物的制备也是类似的适合于预防目的或治疗目的的灭活细菌或细胞裂解物的剂量可由精通本工艺的人士确定并且依赖于几个因素，如疫苗的具体对象，如具体对象的年龄，抗原自身特性，施用的途径与方式，是否使用佐剂以及佐剂的类型等等，这些影响因素可由精通本工艺的人士确定。通常而言，适当的剂量为约50μg至约1mg裂解物。
源自螺杆菌的肽或多肽可纯化自螺杆菌或者通过遗传工程的方法得到或者替代地通过化学合成的方法得到。对于肽而言后一过程是有利的。“肽”是少于50个氨基酸左右的任何氨基酸链。更大时使用术语“多肽”，“多肽”与术语“蛋白质”可以互换使用。对本发明的目的有用的肽或多肽可与天然状态中存在的相同或相似。它的相似性在于它能诱导同一类型的免疫应答，但它包括某些结构变化，比如，突变，加入脂性质的残基或者，作为替代，它可以是一融合形式的多肽或肽。
对预防目的或治疗目的合适的肽或多肽的剂量可由精通本工艺的人士确定并且依赖于一些因素，如疫苗的施用具体对象，如具体对象的年龄，抗原本身的特征，施用的方式和途径，使用或不使用佐剂以及佐剂的类型，这些因素可由精通本工艺的人士确定。通常而言，合适的剂量为10μg至1mg，优选地为100μg。
DNA分子最好为不能复制并且基本上不能整合到哺乳动物基因组中的质粒。上述的编码序列被置于使其能在哺乳动物细胞中表达的启动子的控制之中。这种启动子可以是普适性的或者是对一种组织特异的。在普适性病毒中值得一提的巨细胞病毒早期启动子(在US.Patent.no.4,168,068中有描述)和劳氏肉瘤病毒启动子(Norton和Coftin在Molec.Cell.Biol.(1985)5：281中有描述)。桥粒蛋白启动子(Liet al.Gene(1989)78：244443；Li & Paulin，J.Biol.Chem.(1993)268：10403)是一种选择性启动子，可在肌细胞中和皮肤细胞中表达。对肌肉细胞特异的启动子可为，如，肌球蛋白基因或肌营养不良蛋白基因的启动子。可用于本发明目的的质粒载体在WO 94/21797和Hartikka et.alHuman Gene Therapy(1996)7：1205中有所描述。
用于本发明的目的的一种有用的药用组合物，核苷酸分子，比如，DNA分子，可以按配方或其它方法配制。配方的选择可以有很大的变化。上述DNA可以简单地用带载体或不带载体的生理上可接受的溶液稀释。当使用后者时，上述溶液可以是等渗的或为高渗的，并可具有低离子强度，比如，这些条件可由蔗糖溶液，如20％的蔗糖溶液来满足。
作为替代，多聚核苷酸可以和促进进入细胞的试剂联用。这可以是(i)改变细胞通透性的化学试剂如bupivacaine(见WO 94/16737)，或(ii)与多聚核苷酸结合并作为载体促进多聚核苷酸的运输的试剂如多聚赖氨酸或多胺，如精胺的衍生物如亚精胺(见WO 93/18759)。也可以是融合肽，如GALA或短杆菌肽S(见WO 93/19768)或者替代地，源自病毒融合蛋白的肽。
这也可以是阴离子脂类或阳离子脂类。很长时间以来就已知阴离子脂类或中性脂类可以用作运输物质，比如，以脂质体的形式，运送大量复合物，包括多聚核苷酸。对这些脂质体，它们的成分以及制备它们的过程可以在，如Liposomes：A Practical Approach，RPS NEWEd.IRL Press(1990)这本书中找到。
阳离子脂类也已知可用于并被广泛用于多聚核苷酸的运送。值得一提的例子是LipofectinTM，也名为DOTMA(氯化N-〔1-(2，3-双油氧基)-丙基〕-N，N，N-三甲基氨，N-〔1-(2，3-dioleyloxy)propyl〕-N，N，N-trimethylammonium chloride)，DOTAP(1，2-双(油氧基)-3-(三甲基-铵)丙烷，1，2-bis(oleyloxy)-3-(trimethyl-ammonio propane)，DDAB(溴化二甲基双十八烷基铵，dimethyldioctadecylammonium bromide)，DOGS(双十八烷基氨基甘氨酰基精胺，dioctadecylamidoglycyl spermine)，和胆固醇衍生物，如DC-胆(3-β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆甾醇(DC-chol(3-beta-(N-(N′，N′-dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol)。对这些脂类的描述可见EP187，703，WO90/11092，U.S.Patent No.5,527,928。阳离子脂类优选地和中性脂类如DOPE(双油酰磷脂乙醇胺，dioleyphosphatidylethanolamine)，如，WO 90/11092中所描述。
金微粒或钨钢微粒也可作为运送剂，如WO 91/359，WO 93/17706中所描述和如Tang.，et，al.，Nature(1992)356：152中所描述。这些具体的例子中，多聚核苷酸在氯化钙和精胺存在的情况下被沉淀到微粒上。然后使用无针设备通过高速气流打入皮肤中或表皮中，如U.S.Patent Nos.4,945,050和5,015,580以及WO 94/24243中所描述。
使用于接种一具体对象的DNA的量依赖于一些因素，如，用于表达抗原的启动子的强度，表达产物的免疫原性，作为施用对象的哺乳动物的状态(如体重，年龄，和大体的健康状况)，施用的方式，配方的类型等。具体情况表明通过肌肉内途径施用比通过使用无针设备以及内途径需要更大量的DNA。通常而言，在人类成人中用于预防目的或治疗目的的合适剂量为从约1μg到5mg，优选地从约10μg到约1mg，更优选地为从25μg到约500μg。
上述的免疫原性物质中包括病毒载体。具体而言腺病毒和原病毒也包括在源自病毒的载体中，US.Paten No.4,920,209描述了一种源自腺病毒的载体的例子以及一种构建能用表达编码对本发明的目的有用的肽或多肽的DNA分子的载体的方法。可用于相似用途的原病毒为，如，牛痘病毒以及黄雀菌素原病毒(canarypox virus)。它们分别在U.S.Patenets Nos.4,722,848和5,364,773中有所描述(也见，如，Tartaglia et.al.Virology(1992)188：217和Taylor et，al.Vaccine(1995)13：539)。能表达对本发明的目的有用的肽或多肽的原病毒可通过同源重组得到，如Kieny et.al.Nature(1984)312：163中所描述，这样使编码肽或多肽的片段被置于适于其在哺乳动物中表达的条件下。也可用细菌载体如胆汁的Calmette-Guerin杆菌。
通常而言，用于预防或治疗目的病毒载体的剂量为约1×104至约1×1011，有利地从约1×107至约10×1010，优选地从约1×107至约1×109噬斑形成单位每千克。
源自螺杆菌的免疫原性物质可以是任何源自螺杆菌如H.pylori的多肽。具体而言，这可以是位于胞质中的多肽，内膜或外膜的多肽，或分泌到外部基质的多肽。多种源自螺杆菌的多肽在文献中已有描述，或者是关于从克隆的或鉴定的基因中推测出的氨基酸序列，或者是关于从天然环境中分离的纯化步骤。作为指南，以下文献尤其值得一提：WO94/26901和96/34624(HspA)，WO 94/09023(cagA)，WO 96/38475(HpaA)，WO 93/181150(细胞毒素)，WO 95/27506和Hazell et al.，J.Gen.Microbiol.(1991)137：57(过氧化氢酶)，FR 2724936(人乳铁蛋白的膜受体)，WO 96/41880(AlpA)，EP752473(FibA)和O′Toole et al.，J.Bact.(1991)173：505(TsaA)。其它多肽在WO 96/40893，WO 96/33274，WO 96/25430和WO 96/33220中也有描述。在能促进抗螺杆菌的免疫应答上，对本发明的目的有用的多肽和这里作为参考文献引用的之一相同或相似。为了满足最后的条件，免疫原性物质也可以是源自作为参考文献引用的多肽的一段肽段。
最好使用螺杆菌脲酶的UreA或UreB亚基中的一个多肽(WO90/4030)。优选地，两者都被使用，可以是以结合成脱辅基脲酶的形式或者替代地以多聚体形式(见WO 96/33732)。
类似地，用于本发明目的的疫苗载体或DNA分子包括能编码以上描述的任何多肽或肽的序列。
DNA分子，优选地病毒疫苗载体，也可以在适于在哺乳动物细胞中表达的元件的控制下包括编码细胞因子如淋巴因子，例如白介素-2或白介素-12的一段序列。作为这种选择的一种替代方式也包括在包含-DNA分子或载体的对本发明的目的有用的药用组合物中加入另一分子，或加入编码细胞因子的载体。
对本发明的目的有用的药用组合物可包含单一的免疫原性物质或几种免疫原性物质。比如，一种有利的组分可包括UreA和UreB，(比如，以脱辅基酶的形式)，并同时包括选自以上提及的一种或多种其它多肽。类似地，当涉及一种DNA分子或一种疫苗载体时，上述组分可包含几种，每种编码一特定的多肽，或者包含编码几种肽或多肽的单一的DNA分子或疫苗载体。
并且，对本发明的目的有用的药用组合物可以含有免疫原性物质自身以外的复合物，这些复合物的性质在一定程度上决定于免疫原性物质，灭活细菌，细胞裂解物，肽，或多肽，DNA分子或疫苗载体的性质。这样，如上所述，当涉及DNA分子时，药用组合物也可包括各种配伍物质。通过内吸收途径或非肠道途径施用时，药用组合物还可包括恰当的佐剂，例如，铝化合物，如氢氧化铝，磷酸铝，羟基磷酸铝。通常，失活的细菌不需要佐剂。对DNA分子也是这样的。另一方面，当免疫原性物质是细菌裂解物或纯化的肽或多肽时，佐剂的存在是优选的。最后，当免疫原性物质为疫苗载体时，最好避免使用佐剂以使针对载体本身的免疫应答保持最小。
除了铝化合物以外，在本工艺中还存在大量适用于通过内吸收途径或非肠道途径施用的佐剂，精通本工艺的人士可以从中选择最适于他们需要的佐剂，特别是可以促进Th1应答或Th1+Th2型平衡应答的复合物。作为指南，尤其值得一提的是脂质体，ISCOMS，微球，蛋白chochleates，由非离子表面活性剂组成的微团，阳离子两亲性在分散物，油/水乳剂，胞壁酰二肽(MDP)当其衍生物如葡糖基胞壁酰二肽(GMDP)，苏氨酰基-MDP，murametide和胞壁棕榈酸甘油酯，以及QuilA和其亚组分，以及各种其它化合物如单磷酰-脂A(MPLA)，细胞如E.coli，Salmonella  minnesota，Salmonella typhimurium或Shigella flexneri，的胞壁的主要脂多糖；gama-葡淀粉，calcitriol，loxoribine。
对本发明的目的有用的脂质体可特别从对pH敏感的脂质体中选出，如由混合胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)以及二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的脂质体；含有以融合性著称的阳离子脂类如3-β(N-(N，N′-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆固醇(DC-chol)及其类似物(在U.S.Patent No 5,283,185和WO 96/14831中有所描述)，溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)和EP91645及EP206031中描述的BAY，例如Bay R1005(N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰基-β-D-吡喃型葡糖基)-N-8-癸基十二烷基胺醋酸酯等的脂质体；以及含有MTP-PE，MDP(muramidyldipeptide)的亲脂性衍生物的脂质体。这些脂质体可用作佐剂加入到引用的所有的免疫原性物质中。
对本发明的目的有用的ESCOMS可具体选自这些复合物：QuilA或QS-21结合使用的胆固醇以及，供选地，结合使用如磷脂酰胆碱这样的磷脂。这些对于配制含脂的抗原是尤为有利的。
对本发明的目的有用的微球具体地可由如polylactide-co-glycolide(PLAGA)，藻酸盐，脱乙酰壳多糖，polyphosphazene以及许多其它多聚物形成。
对本发明的目的有用的protein chochleates可选自具体由胆固醇以及，供选地，磷脂如磷脂酰胆碱形成的。这些对于配制含脂的抗原尤其有利。
对本发明的目的有用的由非离子表面活性剂组成的微团可具体由1-单-棕榈酰基-甘油，胆固醇，和dicetylphosphate混合物形成，它们是传统脂质体的替代物并可用于配制所有引用的免疫原性物质。
对本发明的目的有用的油/水乳剂可具体选自MF59(Biocine-Chiron)，SAF1(Syntex)和montanides ISA51和ISA720(Seppic)。
对本发明的目的有用的佐剂可以是源自南美洲的树QuillajaSaponarla Molena的树皮的一个组分；例如一种通过HPLC色谱纯化得到的一个组分，QS-21，如US.Patent No.5,057,540中所描述。由于QS-21可能具有一些毒性，将其与脂质，尤其是基于固醇的脂质体，一起使用也许是有利的，如WO 96/33739中所描述。
最后，佐剂效果也可通过在对本发明的目的有用的肽或多肽中加入脂类而得到。这样的肽或多肽通过共价键和能促进诱导Th1-型免疫应答的脂或含脂化合物连接以形成含脂的脂肽或多肽缀合物，这可以通过精通本工艺的人士所熟知的几种方法达到。例如，可以使用EP 431327中描述的化合物如N-棕榈酰基-S-2，3-(二棕榈酰基氧基)丙基牛胱氨酰丝氨酰基丝氨酸)(N-palmitoyl-S-2，3-(bispalmitoyoxyl)propylcysteinylseryl serine(Pam3CSS))，它通过已知的方式与肽或多肽的N-末端结合。
根据本发明的方法或应用的治疗或预防效果可以根据标准方法评定，例如通过测量免疫应答的诱导或测量治疗性免疫或保护性免疫的测量。上述测量可以通过，例如，鼠/H.felis模型以及Lee et al.，Eur.J.Gastroenterology & Hepatology(1995)7：303或Lee et al.，J.Infect.Dis.(1995)172：161中描述的程序进行。精通本工艺的人士将意识到在鼠模型中H.felis可由另一螺杆菌的种替代。比如，源自H.pylori的免疫原性物质的效果最好使用适用于鼠的H.pylori菌株。效果可通过与对照组比较胃部组织的感染程度(通过测量脲酶活性，细菌量或者胃炎的状况)而确定。与对照组相比感染减轻时则治疗效果或保护效果存在。
对本发明的目的有用的药用组合物可通过传统方式制造。具体而言，其可以用可药用的稀释液或载体配制，例如用水或盐溶液。通常而言，可以根据施用的方式与路径以及根据药疗实践选用稀释液或载体。这在此领域的一本标准参考书，Remington’s PharmacenticalSciences，中有描述。
根据本发明的方法以及对此目的有用的组分可用于治疗或预防，i.a.，螺杆菌的感染并从而治疗或防止和这些感染相关的胃十二指肠疾病，包括急性，慢性或萎缩性胃炎，以及消化性溃疡，例如胃或十二指肠溃疡。
使用的内吸收途径可以是非肠道途径，可以选用静脉内途径，肌肉内途径，皮内途径或表皮内途径以及皮下途径；然而后四种途径比静脉内途径更受欢迎。特别建议使用肌肉内途径和皮下途径。在所有的情况下，对药用组合物的使用可在位于一个个体的膈下的施用位点进行。例如腰部背侧即为一个适合的施用位点。
为了得到保护效果或治疗效果，由施用，例如，通过膈下内吸收途径，对本发明的目的有用的药用组合物组成的施用操作可重复一次或几次，在每次施用之间保留一定的时间间隔；时间间隔的范围在一周或一个月。对时间间隔的精确确定是在精通本工艺的人士的能力之内并根据各种因素，如免疫原性物质的特性，具体对象的年龄等等，而变化。在此具体例子中，施用途径是严格内吸收途径类型。通过非限制性说明的方法，这里将提及一种接种方案，它包括在腰部背侧区域通过皮下途径三次施用脱辅基脲酶，每次施用之间的间隔为2至4个星期。
根据一替代方式，可以设想以严格内吸收施用方式操作，但在构成接种程序的步骤中使用不同的免疫原性物质。通过非限制说明的方法，这里将提及一种严格内吸收途径的接种方案，包括三步：第一次施用(激发)包括施用编码，例如UreAt UreB的POX载体，接着两次连绵施用(促进)脱辅基脲酶。
因此，通常而言，本发明的目标为一种用于治疗或防止螺杆菌感染的药用组合物，其包括连续施用，几种产品，每种产品被配制成适于在膈下内吸收途径施用，并且每种产品包含一种源自螺杆菌的免疫原性物质，上述免疫原性物质分别独立地选自灭活螺杆菌细菌制备物，螺杆菌细胞裂解物，肽纯化形式的来自螺杆菌的多肽，包含编码源自螺杆菌的肽或多肽的序列并置于其表达所必需的元件的控制之下的DNA分子。上述药用组合物优选地这样提供：第一个产品包含肽或多肽，第二个产品包含DNA分子或疫苗载体，DNA分子或疫苗的编码序列编码第一产品中包含的肽或多肽。
最后，一种替代的接种程序包括几种时间上错开的施用，例如，在一个星期或一个月的时间间隔之内(由精通本工艺的人士决定)，上述程序包括通过膈下内吸收途径的第一次施用以及通过鼻腔内途径之外的粘膜途径的第二次施用，例如通过眼睛，口腔。例如，口腔途径或胃途径或肺途径或肠途径或直肠途径或阴道途径或尿道途径。通过非限制性说明的方法，这里将提及一种接种程序，它包括通过膈下内吸收途径施用DNA分子或疫苗载体，然后通过胃途径施用多肽。上述DNA分子或疫苗载体优选地编码通过胃途径施用的多肽。
因此，通常而言本发明的目标为一种用于治疗或防止螺杆菌感染的药用组合物，它包含用于连续施用的几种产品，其中一种产品被配制成适于通过膈下内吸收途径施用，另一种产品被配制成适于通过鼻腔内途径以外的途径施用。每一种产品含有一种源自螺杆菌的免疫原性物质，上述免疫原性物质分别独立地选自灭活螺杆菌细菌制备物，螺杆菌细胞裂解物，肽，纯化形式的来自螺杆菌的多肽，包含编码源自螺杆菌的肽或多肽的序列并置于其表达所必需的元件的控制之下的DNA分子，以及包含编码源自螺杆菌的肽或多肽的序列并且置于其表达所必需的元件的控制之下的疫苗载体。上述药用组合物优选地这样提供：第一个产品包含肽或多肽，第二个产品包含DNA分子或疫苗载体，DNA分子或疫苗载体的编码序列编码第一种产品中的肽或多肽。
用于通过粘膜途径施用的疫苗载体可以选自以上描述的那些。并且，可以选自细菌载体如Shigella，Salmonella，Vibrio cholerae，Lactobacillus和Streptococcns。
可用作活疫苗载体的Vibrio cholerae的无毒突变株在，例如，Mekalanos et al.Nature(1983)306：551和U.S.Patent.No.4,882,278中(突变株中编码两个等位基因ctxA的大部分区域已被缺失，从而不能产生有功能的毒素)，和WO 94/1533(通过缺失得到的缺少有功能的ctxA和attRS1序列的突变)中有所描述。如WO 94/19482中所描述，这些菌株可通过遗传工程改造表达外源抗原。
遗传工程改造或其它改造的用于重组表达外源抗原的Salmonellatyphimurium的减毒菌株以及它们作为疫苗的应用在Nakayama et.al.，BioTechnology(1988)6：693和WO 92/11361中有所描述。
其它用作疫苗载体的细菌在High et al.EMBO(1992)11：1991和Sizemore et al.，Science(1995) 270：299(Shigella &flexneri)；Medaglini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：6868(Streptococcus gordonii)；和Flynn J.L.Cell.Mol.Biol.(1994)40(Suppl.I)：31，WO 88/6626，WO 90/0594，WO 91/13157，WO 92/1796和WO 92/21376(Calmetre-Guerin bacillus)中有描述。
在细菌载体中，编码源自螺杆菌的肽或多肽的DNA序列可以被插入到细菌基因组中或替代地保持自由状态，由质粒携带。显然，该序列被置于对其在细菌载体中表达所必需的元件的控制之下。
这些用于通过粘膜途径施用的细菌载体可和合适的佐剂联用。这样的佐剂可选自细菌毒素，例如霍乱毒素(CT)，E.coli的热不稳定毒素(LT)，clostridium difficile毒素，以及百日咳毒素(PT)，或者是源自这些毒素的复合物，亚基，类毒素，突变型。例如，可能使用纯化的天然霍乱毒素的B亚基(CTB)。如果这些毒素的片段，同源物，衍生物及融合物保留其佐剂活性的话也同样适用。优选地，选用毒性减小的突变型。这些突变型在，例如WO 95/17211(CT Arg-7-Lys突变)，WO 96/6627(LT Arg-192-Gly突变)，和WO 95/34333(PTArg-9-Lys和Glu-129-Gly突变)中有所描述。其它具有以下突变中至少一种的LT突变型也可使用：Ser-63-Lys，Ala-69-Gly，Glu-110-Asp和Glu-112-Asp。
其它化合物，如MPLA，PLGA，DC-chol和QS-21也可在粘膜途径中用作佐剂。
本发明还包括治疗或防止螺杆菌例如(H.pylori)感染的免疫方法，涉及粘膜(例如口腔，鼻腔内，胃内，肺内，肠内，直肠内，眼，阴道或尿道)施用，接着是非肠道(例如肌肉内，皮下，皮内，粘膜内，静脉内或腹膜内)施用。在这些方法的一个例子中，先进行粘膜施用以激发对一种抗原的免疫应答，然后进行非肠道施用以加强对该抗原的免疫应答。这些方法的其它例子包括交替使用非肠道施用与粘膜施用。例如，可以使用以下方式：肌肉内施用，胃内加鼻腔内联合施用，精通本工艺者很容易确定使用的抗原，配方，佐剂，施用方式，特定的粘膜途径与非肠道途径，以及剂量。这些方法中调整这些参数以适于应用的具体例子上文已给出。
在上文的描述中，提及的基本上是螺杆菌感染以及通过阻止和预防的手段与其作斗争的方法。上文所声明的原理和方法在细节上做必要的修正后能被应用到任何其它感染位置为胃，十二指肠或小肠的微生物的感染上。
并且声明，所有在本申请中引用或发表的文件作为参考被结合于其中。
下文参照附图说明本发明。
图1与实施例1相关，示明对唾液腺中(Fig1A)和胃中(Fig1B)的局部应答的研究。上述局部应答是通过ELISPOT的方法评估的。上述ELISPOT方法是指通过皮下途径(SC)在腰下左后部〔a和c〕或颈部〔b和d〕10天(一次)施用脲酶并随后通过鼻腔内途径(N)和胃内途径(IG)在第28天〔a和b〕或在第28天和第56天〔c和d〕促进应答之后测量诱导出的抗脲酶IgA，用斑点数/106细胞表示(Fig1A)或表现出2IgA斑点/鼠的产生应答的人鼠数表示(FiglB)。
图2与实施例1相关，示明接触致病性感染物后的脲酶活性水平。上述活性是在杀死小鼠4小时后测量的。上述小鼠分别在第0天第28天和第56天已通过胃内途径〔(a)和(c)〕或腰下佐后侧部分皮下途径(b)接受过三次灭活细菌。在实验(c)中细菌制备物中还加入10μg霍乱毒素。实验(d)和(e)分别为阳性与阴性对照。
图3相应于实施例1，示明接受致病性感染物后的脲酶活性水平。上述脲酶活性是在杀死小鼠4小时后测量的。上述小鼠分别在第0天，第28天和第56天接受了三次：(a)包在大约80％ DC-chol中的脲酶制剂，施用于腰部背侧的肌肉中；或(b)含有霍乱毒素佐剂的脲酶制剂，通过胃内途径施用，实验(c)与(d)分别为阳性与阴性对照。
图4相应于实施例1，示明接触致病性感染物后的脲酶活性水平。上述脲酶活性是在杀死小鼠后4小时测量的。上述小鼠分别在第0天，第28天和第56天接受了三次：(a)含有霍乱毒素佐剂的脲酶制剂，通过胃内途径施用或(b)含有QS-21佐剂的脲酶制剂，通过腰下左后侧的皮下途径施用。实验(c)和(d)分别为阳性与阴性对照。
图5示明进行实施例2中的免疫程序后猴子血清中诱导出的免疫球蛋白的量，用ELISA滴定度表示。组成了含有4只猴子的一个对照组以及三个测试组，每个测试组含有8只猴子，每个测试组分成为两个含有4只猴子的分组，一个分组只接受灭活的H.pylori制剂(1，2和3)，另一分组接受灭活的H.pylori制剂和重组的脲酶(1u，2u和3u)。组1和组1u的施用程序为〔鼻腔加胃内，4次〕；组2和组2u的施用程序为〔肌肉内，4次〕；组3和组3u相应于施用程序〔鼻腔加胃内；肌肉内；鼻腔加胃内，肌肉内〕。ELISA滴定度测量三次：第0天为第一次(白带)，第42天第二次(阴影带)，第78天第三次(黑带)。
图6A和6B示明4小时后用Jatrox实验(Procter & Gamble)测量的脲酶活性(Fig6A)以及感染H.pylori后进行A-H治疗的小鼠的细菌载量：〔A：LT加脲酶，口腔；B：QS-21加脲酶，颈部非肠道途径；C：QS-21加脲酶，腰部非肠道途径；D：单独的QS-21，腰部区域皮下途径；E：Bay R1005加脲酶，颈部非肠道途径；F：BayR1005加脲酶，腰部区域非肠道途径；G：单独Bay R1005，腰部区域皮下途径(对照)；H：盐，腰部区域皮下途径(阳性对照)〕I代表阴性对照。
图7示明小鼠进行粘膜激发/非肠道加强方案，使用脲酶免疫诱导对H.pylori致病物感染最有效的保护的结果。小鼠或者口腔25μg脲酶加5μg LT或非肠道途径施用含或不含100μg矾佐剂的10μg脲酶。如图所示小鼠先口腔施用脲酶加LT，三个星期后通过非肠道途径或口腔途径施用两次促进剂量。最后一次免疫后两个星期小鼠接触H.pylori致病物，并在接触两个月后安乐死。尸体剖检时径向切下三分之一的胃，匀浆，并培养H.pylori。
图8示明恒河猴与H.pylori致病物接触时脲酶免疫的效果。猴子通过非肠道途径(100μg脲酶加1mg血清或800μg Bay)或通过粘膜引发(口腔4mg脲酶加100μg LT)非肠道促进(脲酶加血清)方案免疫。上述第二种免疫方法中前三次每三星期一次并在第一次引发后的第20个星期施用第四次。在最后一次促进施用后猴子，与致病感染物接触。接触后十个星期实行安乐死，从每只动物的胃部收集十孔活组织并培养以确定H.pylori菌落情况。以上每个符号代表每只猴子的10只培养的平均CFU。线代表治疗组的CFU中间值。
图9示明与H.pylori致病感染物接触后免疫与未免疫的恒河猴的胃炎值。
猴子三星期后用4mg脲酶加100μg LT口腔激发免疫。第一次激发施用后20个星期进行两次非肠道施用。猴子在最后一次促进施用后与致病感染物接触。猴子在接触后10个星期实行安乐死，在胃体，窦和胃体的窦连接处取2cm2的样品用10％的缓冲福尔马林固定，包埋在石蜡中并且用H&E染色。通过对染色部分的显微检查给出特征为淋巴细胞，浆细胞和多形核细胞浸润的胃炎的胃炎值。
图10示明与H.pylori致病感染物接触后免疫与非免疫的恒河猴的上皮变化。接触三个星期后猴子用4mg脲酶加100μg LT口腔激发免疫。接着每三个星期一次100μg脲酶加1mg血清共两次。在第一次激发免疫后的20个星期施用一次脲酶加矾。10个星期后猴子安乐死，从胃体，窦，胃体的窦连接处取2cm2的样品，用10％的缓冲福尔马林固定，石蜡包埋并H & E染色。上皮变化，定义为组织变形，萎缩或/和组织增生，可通过对染色样品的显微检查评定，以上的每个符号代表每只猴的三个区域的平均胃炎值。实施例1：小鼠中的免疫研究1A-材料与方法小鼠：
6-8星期大的雌鼠由Janvier(法国)提供，在整个实验中使用无菌材料；鼠笼用“isocaps”保护；小鼠用过滤处理的水与辐射处理的食物喂养。施用程序：
在每个实验中，小鼠接受三次相同的产品；每次间隔28天(0，28，56天)。产品的施用是通过鼻腔途径(对醒着的老鼠多达50μl)，通过口腔途径(300μl于0.2M NaHCO3中，用胃饲管)，或通过皮下途径(300μl，颈部皮下或腰部左侧的皮下)。在一些情况下，未麻醉小鼠的腰部背侧肌肉进行肌内接种(50μl)。通过鼻腔，皮下或肌内途径施用10μg脲酶，或通过口腔途径施用40μg。对于灭活的细菌制备物，通过皮下途径或口腔途径施用400μg细胞。抗原和佐剂
如WO 96/31235中的实施例5所描述，H.pylori的脱辅基脲酶可在E.coli中被表达与纯化。在本文的其余部分，脱辅基脲酶被简称为脲酶。
灭活的H.pylori细菌(WC)制备物是这样制备的：一瓶冻存的细菌ATCC 43579在75cm2的烧瓶(Costar)中用两相介质稀释。该介质包含固体成分(10ml Colubia琼脂(BioMerieux加6％绵羊血)(BioMerieux))和液体成分(3ml TSB，BioMerieux)。烧瓶放在含有微需氧菌(BioMerieux)的袋子(generbag)中，轻缓摇动37℃温育48小时。然后分析培养物(迁移性，脲酶，过氧化氢酶，氧化酶产物)并3,000rpm 4℃离心20分钟(或者收集几个烧瓶后再离心)。沉淀重悬浮于含1％福尔马林(37％福尔马林，Sigma)的PBS(BioMerieux)中。调整体积使终浓度达到2mg/ml(离心之前在600nmO.D.为1的1ml相当于377μg蛋白)。该产物4℃轻轻地混合4小时，用PBS洗3次，最终的溶液被浓缩至100μg蛋白/50μl。分装后的样品保存于-70℃。
含有脲酶的DC-chol脂质体如下制备。首先，为了得到一层干的含有100mg DC-chol(R-Gene Therapeantics)和100mg DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)(Avanti Polar Lipids)的膜薄膜，这些产品以粉状混合后溶于5ml氯仿中。溶液用旋转蒸发仪在真空下挥发。这样得到的容器壁上的脂质体至少在高真空度下干燥了4个小时。与此平行20mg冻干的脲酶和100mg蔗糖稀释于13.33ml的20mM Hepes缓冲液pH7.2中。10ml这样的溶液(含1.5mg脲酶和0.75％蔗糖)过滤通过0.22μM的Millex滤器然后用于重新水化脂膜。该悬浮液搅拌4小时后挤出(10次通过0.2μM多聚碳酸酯膜)或微流化(microfluidized)(在500kPa的压力下10次通过Microfluidics CoY10 microfluidizer)。这样即可得到脂质体悬液。内包的脲酶为10％到60％。将蔗糖浓度调到5％后(每10ml加入425mg蔗糖)将悬液冻干。使用前，冻干粉用一定体积的水或缓冲液溶解后用不连续蔗糖密度梯度(0，30％，60％)纯化，以得到内包的脲酶总脲酶的70％以上的制备物。
在粘膜中用作佐剂的霍乱毒素的量为10μg/剂脲酶或细菌制剂。
用作佐剂的QS-21(Cambridge Bioscience；Aquila)的量为15μg/剂脲酶。攻击
在第二次促进后两个星期，小鼠通过胃饲管加入300μl适于小鼠的一株H.pylori，菌株ORV 2002，的悬液(1×107活菌悬于200μl PBS；OD550吸收为0.5)。没有接受抗原而作为对照的一组也同样被攻击。对攻击的分析
接触后四个星期，该鼠被拉断颈椎而被杀死。胃部被取出以测量脲酶活性与作组织学分析。脲酶活性在4至24小时后(OD550nm)用Jatrox实验测试(Procter & Gamble)24小时后仍为阴性的小鼠被标明。用ELISPOT测量局部抗体应答(唾液腺与胃)
ELISPOT实验根据Mega et al.J.Immunol.(1992)148：2030进行。酶标板用50μg/ml的H.pylori蛋白抽提物包被。
为了检测胃部的抗体应答水平，我们对方法做如下改进：胃的一半用切人组织的自动设备(McIllwain Laboratories，Gilford，UK)切成1mm2的小块，然后用中性蛋白酶(2mg/ml，Bocehringer Mannheim)消化。上述中性蛋白酶溶于改进的Joklil溶液中(加入了10％马血清(Gibco)，谷氨酰胺和抗生素)。在37℃轻轻消化4次每次半个小时。这样消化的细胞在每一步之后用70μm的滤膜(Falcon)过滤，然后用补充了5％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640(Gibco)洗3次，并在覆盖着硝酸纤维素膜(Millipore)的板上用相同的溶液保温至少4个小时(100μl每孔，4孔)，大约每半个胃可得到1至3×105个细胞(体积大的细胞及巨噬细胞不算在内)。
生物素标记的IgA和链霉亲和素-生物素标记的过氧化物酶复合物来自Amersham。斑点在加入底物AEC(Sigma)后显现出来，并且板一干就在显微镜下记数(16倍或40倍放大)。四个孔中的IgA斑点的平均值可由此计算出并表示为斑点数/106细胞。ELISA分析应答
ELISA分析根据标准程序进行(生物素标记的偶联物及链霉亲和素-过氧化物酶购自Amersham，OPD(O-phenyl-diaminedihydrochloride)底物来自Sigma)。酶标板用溶于碳酸缓冲液的H.pylori抽提物(5μg/ml)包埋。在每个实验中使用了抗H.pylori的鼠对照血清。滴定度相应于在490nm的OD值为1.5时的稀释倍数之倒数。1B-结果
结果由上文所述的图1至4以及下文的陈述示明：
图1示的使用皮下途径时，如果施用部位为鼠的后部，即腰后区域，时，在唾液腺和胃部的区域应答的结果会提高很多。
在说明图2至图4之前，应当注意到，这些图示明的结果是来自含佐剂的抗原，并且是通过胃内途径施用的。此实验被称为标准参考实验因为之前工艺中CT/IG联用得到的结果是目前最好的。
图2比较了不带佐剂的灭活细菌制剂通过胃内途径施用和通过皮下途径施用的结果。它清楚地表明，在腰下区域通过皮下途径施用时可得到好很多的结果。进而，通过皮下途径施用后的结果与标准参考实验相同或略好些，在标准参考实验中与霍乱毒素佐剂联用通过胃内途径施用。
进而，参照图2中的实验(a)到(e)中脲酶活性的结果。上述结果是在杀死小鼠4个小时以后得到。图2表明，在小鼠死后24个小时脲酶活性仍然为阴性小鼠数分别为(a)0/8，(b)4/8，(c)4/8，(d)0/8，(e)10/10。这和前段中的结论一致，即实验(b)的结果与标准参考实验中得到的结果相似。
图3表明包入DC-chol脂质体的脲酶制剂并通过腰下区域皮下途径施用得到的结果与标准参考实验一样好。
进而，参照图3中的实验(a)到(d)中脲酶活性的结果。上述结果是在杀死小鼠4小时后得到的。图3表明在小鼠死后24个小时脲酶活性仍为阴性的小鼠数分别为(a)5/10，(b)4/10，(c)0/10，(d)10/10。这与前段中的结论是一致的，即实验(a)得到的结果与标准参考实验的结果相似。
图4与QS-21佐剂联用的脲酶制剂通过腰下区域皮下途径施用得到的结果与标准参考实验的一样好。
进而，参照图4中的实验(a)到(d)中的脲酶活性的结果。上述结果是在杀死小鼠4小时后得到的，图4表明在小鼠死后24个小时脲酶活性仍为阴性的小鼠数分别为(a)1/8，(b)5/8，(c)0/8，(d)10/10。这与前段的结论一致，即实验(b)得到的结果与标准参考实验相似。
下表给出了上文的实验中诱导出的IgA，IgG1和IgG2a的量。上述实验的结果在图2到图4已经以脲酶活性以及死后4到24小时内脲酶活性的OD小于0.1的小鼠数的形式给出。IgA，IgG1以及IgG2a的量用ELISA滴定度的方式给出。
脲酶CTIG WCIG WCCTIG WCSC 脲酶DC-chol脂质体SC 脲酶QS-21SC
 IgA 45 91 107 63 0 1
 IgG1 65700 1920 349 1273146 620000 2970399
 IgG2a 20200 399 3440 42900 321000 1136095
 OD＜0.14小时 5/10 0/8 5/8 6/8 5/10 5/8
 OD＜0.124小时 4/10 0/8 4/8 4/8 5/10 5/8
实施例2：猴子中的免疫实验2A-材料与方法猴子
本实验中使用了28只2岁的猴子(Maeaca fascicularis)(Mauritus)。在进行以下的各种免疫程序之前，活组织检查表明它们中大部分都长期感染了类似Gastrospirillum hominis(GHLO)或H.heilmanii的微生物。施用程序
由于几乎所有的这些猴子都感染了GHLOs决定测试不同的程序在治疗中的效果。总结如下表
  组别   第0天    第21天   第42天   第63天
  1和1u2和2u3和3u   IN+IG    IN+IG    IN+IG    IN+IGIM       IM       IM       IMIM       IN+IG    IM       IN+IG
特别指出，肌肉内施用途径是在腰部背侧的肌肉中进行的。抗原和佐剂
由于GPOLs与H.pylori之间有交叉反应，选择单独使用灭活的H.pylori细菌如实施例1A中所述或根据实施例1A中所参考的文献制备的重组脲酶联用。
E.coli的热不稳定素素(LT)(Sigma)或霍乱毒素的B亚基(CTB)(Pasteur Merieux serums & vaccins)被用作粘膜途径的佐剂而DC-chol被用作非肠道途径的佐剂。DC-chol粉末简单地用抗原制备物重新水化。
使用的剂量如下表：
  途径   微生物   脲酶   DC-chol   LT   CTB
  IG   400μg   2.5mg   -   25μg   -
  IN   400μg   400μg   -   25μg   25μg
  IM   400μg   100μg   400μg   -   -
活组织检查，脲酶测试和细菌学/组织学研究：
每只猴在免疫前或免疫后(第三次促进施用后一个月)进行活组织检查。利用活组织检查进行脲酶测试和组织学研究。
脲酶活性通过Jatrox试剂盒(Procter & Gamble)测定。活性水性如下文进行估计：第3级，粉红色在10分钟内出现；第2级，粉红色在加入试剂后10分钟至30分钟之间出现；第1级，粉红色在30分钟至4个小时间出现；第0级，4小时后无粉红色或很弱。
组织学研究使用的是福尔马林固定的活组织样品。细菌量这样定量：无细菌(0)；少量螺杆菌型的细菌(0.5)；较多细菌(1)；相当多细菌(2)；很多细菌(3)。一级之间的区别(比如从1到2)相当于多5倍的细菌。用ELISA测试分析应答
ELISA测试如实施例1A中所描述。2-B  结果
下表是关于免疫前后的细菌量，是用两种实验测试的：(i)通过测量脲酶活性和(ii)通过实行组织学研究。与此相关的结果在第3栏至第6栏中示出。最后三栏表明各组(对照组，组1，2或3)在免疫前后细菌量变化的情况(→)表示的是根据两种测试细菌量均不变化的猴子；(↑)和(↓)分别表明在至少一种测试中细菌量减少或增加，而另一种测试显示细菌量不变。当两次测试的结果显示相似的变化时，向上或向下的箭头为两个。
 猴子 组别    脲酶活性       组织学            变化
免疫前 免疫后 免疫前 免疫后     ↓     ↑     ↓
 H282J005J852J476   CCCC   2-22-20-00-0   3-22-12-02-0   2200   3-21-01-11-1 1/4 1/4 2/4(2/4↑↑)
 H799J845J205J328J197H025G460J607     11111u1u1u1u     2-22-21-12-22-22-22-22-2     2-23-22-21-23-22-23-22-2     22032132     2-22-113-231-12-32 1/8 5/8 2/8(1/8↑↑)
 H549H622H504H798J367G486J522G722     22222u2u2u2u     3-33-33-31-12-22-22-23-3     2-21-11-10-12-12-20-02-0     32213122     2-32-32-11-12-32-22-22-3 6/8 1/8 1/8
 H820J557H588J153H480J344H710J262     33333u3u3u3u     3-32-22-23-32-23-32-23-3     2-21-02-03-32-22-02-22-2     32322323     2-21-2*1-23-33-32-23-33-2 5/8(3/8↓↓) 0 3/8
因此，本发明通过严格粘膜途径免疫程序的组的结果和阴性对照组基本相同。另一方面，通过肌内途径和粘膜内途径混合程序免疫或者通过严格肌肉内途径免疫的组可观察到细菌量显著减少。这强调了免疫条件尤其是免疫次数；因此，建议使用在膈下区域应用非肠道途径的免疫程序，以得到保护性效果。
这些结果应极正确地与图3中的血清中抗体水平的结果联系在一起。该图表明通过严格粘膜途径的免疫方案得到的结果与阴性对照组(1和1u)的结果非常相似。另一方面，通过混合粘膜与肌肉内途径(2和2u)的免疫方案以及，更好的，通过严格肌肉内途径的方案(3和3u)使诱导出比对照组强很多的抗体水平成为可能。
这样，强血清应答可能与保护性效果相关，而相反弱应答与缺乏保护性效果相关。
可能得到既定效果(强血清应答以及保护性效果)的免疫条件包括使用膈下区域的非肠道途径或使用Th1佐剂。实施例3：治疗小鼠的H.pylori感染
为了治疗小鼠模型中的H.pylori感染，我们比较了通过皮下途径(SC)和通过粘膜途径免疫的效果。
OF1小鼠用106个菌落形成单位(cfu)的H.pylori OR2001菌株感染。一个月以后，为了确认感染已经很好地建立了，每100只小鼠随机杀死10只并测试四分之一个整胃的脲酶活性。由于所有的结果都是阳性的，小鼠被免疫(10只每组)，每次间隔3星期。上述免疫是这样进行的：或者皮下施用10μg佐剂以15μg QS-21(Aquila)或400μgBay R1005佐剂(Bayer)的脲酶；或者用40μg混有1μg LT的脲酶口腔施用。对于两个用非肠道途径施用的佐剂或者在颈部施用以到达身体上部的淋巴节或者在腰部施用，以到达身体下部的淋巴节。10只小鼠不感染也不免疫，作为阴性对照，而阳性对照的小鼠则在皮下(腰部区域)接受盐溶液QS-21，或Bay佐剂。
免疫一个月之后，所有的老鼠都被杀死并取出胃，通过测定脲酶活性(每组10只中的10只都被分析)和定量培养(10只中的5只被分析)而确定细菌定居的程度。图6A(脲酶测试)和6B(培养)示明，在腰部区域的皮下用脲酶佐以QS-21免疫的小鼠感染基本上已消失(45只中的4只在定量培养实验中为阴性。与未免疫的小鼠相比，在颈部皮下佐以QS-21免疫的小鼠以及口腔接受脲酶加LT的小鼠的感染减小10到100倍。Bay佐剂诱导出相同的减小，在腰部区域免疫的小鼠中尤其显著。
在同样的这些小鼠中进行的组织病学实验并未显示比对照更大面积的胃炎。
在我们先前的预防性研究中观察到(实施例1)，受保护的小鼠的血清中两种抗体亚型IgG1和IgG2的水平很高，这代表了Th2/Th1均衡应答。进而，在腰部区域皮下免疫的小鼠具有最高水平的IgA，这显示粘膜应答。
这些结果表明，定位的内吸收免疫能治疗小鼠的获得性H.pylori感染，并且使用佐剂诱导Th1/Th2均衡的粘膜应答对于达到该目标是有利的。实施例4：引起小鼠的抗H.pylori感染的脲酶免疫中的粘膜激发/非肠
     道加强策略
用粘膜激发/非肠道加强策略体免疫Swiss Wabster小鼠。口腔施用单一剂量的25μg重组H.pylori脲酶(脲酶)和5μg Escherichia coli热不稳定肠毒素(LT)作为激发。三个星期以后小鼠通过非肠道途径施用两剂100μg脲酶加100μg明矾加强。剂与剂之间间隔3个星期。与未免疫的对照相比，通过这种激发/加强策略免疫的小鼠H.pylori菌落形成单位中值(CFUs)减小2000倍(图7)。这种策略的免疫比3剂粘膜疫苗免疫更有效。三剂粘膜免疫可使菌落减少1000倍。单一激发剂量的口腔施用的脲酶加LT只使H.pylori CFUs中值减小10倍，面非肠道施用不含佐剂的脲酶的加强只使CFUs中值减小2倍。
这种免疫方案被用于免疫恒河猴使之抵抗用H.pylori进行的攻击。实施例5：
恒河猴，H.pylori血清学阴性，经四倍疗法(quadruple therapy)治疗并通过对胃部活组织样品的培养与活组织检查确定无H.pylori感染。19只猴子被随机分成4组：4只接受假免疫，5只接受重组H.pylori脲酶(脲酶)疫苗，上述疫苗通过肌肉内途径以矾(氢氧化铝，Rehydragel)为佐剂施用，5只通过口腔途径，以Escherichia coli热不稳定肠毒素(LT)做为佐剂，接受脲酶疫苗作为激发剂量，随后是两次通过非肠道途径，以矾为佐剂，施用脲酶疫苗，5只猴子通过肌肉内途径以Bay为佐剂接受脲酶疫苗。前三次接种每次三个星期，第四次在第20星期施用。
最后一次接种后一个星期，猴子用H.pylori攻击。猴子在接触后10个星期被杀死，尸体时，在胃部10处(1处贲门，2处胃体，3处胃体-胃窦连接处，3处胃窦，1处幽门)取样，即5mm直径打孔取出的活组织样用于细菌培养。在胃的5个区域取出其它样品用作组织病理学研究。
尽管由于实验目的的攻击，所有的猴子都感染了H.pylori，但是经脲酶加LT粘膜激发并随后3次脲酶加矾非肠道加强而免疫的小鼠与假免疫的对照小鼠相比，菌落数在统计学上有明显减少(p＝0.05，Wilcoxon检验)(图8)，假免疫的对照组的CFU中值为1.3×104(从1.5×103到1.8×105CFU)，与之相比，通过粘膜激发/非肠道促进方案接受疫苗的猴子的CFU中值减少了20倍以上(5.8×102CFU，从1.0×102到6.7×102CFU)。
接受粘膜激发/非肠道加强方案的脲酶疫苗的组的猴子在感染H.pylori致病物质有类似的胃炎(图9)和上皮变化(图10)，没有证据表明接种增强了胃炎或上皮恶化。
与接受粘膜激发/非肠道加强方案的猴子相反，通过非肠道途径施用脲酶加Bay免疫的猴子在菌落上与假免疫的对照相比并无差别(p＝1.00)而用脲酶加矾免疫的猴子显示部分效果(p＝0.33)(图8)由于胃部样品被其它细菌严重污染，接受脲酶加Bay这一组的一只猴子没有培养的数据。
这些结果显示，使用脲酶加LT激发并随后用脲酶加矾加强的方案免疫对于在非人灵长类中防止H.pylori感染是有效的。选择这种方案是基于以下原理的：免疫系统必须被激发以对粘膜感染产生应答，即利用适当的佐剂进行粘膜免疫。然而，一旦建立了恰当的免疫应答之后，更传统的佐剂，如矾，可被用于非肠道免疫以加强应答。这种方案不仅比单纯体的粘膜方案更有效，而且它用的抗原比较少。因为非肠道抗原的剂量(100μg脲酶)可以比粘膜剂量(4mg)少很多。
其它实施例包括在随后的权利要求书中。

Claims (36)

1.源自螺杆菌的免疫原性物质在制备药物组合物中的应用，该药物组合物用于诱导针对螺杆菌的T辅助细胞1(Th1)型免疫应答从而防止或治疗螺杆菌在哺乳动物中的感染的应用。
2.根据权利要求1中的应用，其中Th1-型免疫应答特征为(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比率大于或等于1∶100，或者为(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比率大于或等于1∶100。
3.根据权利要求2的应用，其中Th1-型免疫应答特征为(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比率大于或等于1∶10，或者(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比率大于或等于1∶10。
4.根据权利要求3的应用，其中Th1-型的免疫应答的特征为(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比率大于或等于1∶2，或者为(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比率大于或等于1∶2。
5.源自螺杆菌的免疫原性物质在制备药物组合物中的应用，该药物组合物用于治疗或防止螺杆菌感染，上述组合物是用于在哺乳动物，尤其是灵长类动物，的位于膈下区域的一部分上通过内吸收途径施用的。
6.根据权利要求5的应用，其中的组分通过膈下内吸收途径施用时能诱导Th1-型免疫应答。
7.根据权利要求5或6的应用，其中的Th1-型免疫应答的特征为(i)IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于或等于1∶100，或者为(ii)IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比大于或等于1∶100。
8.根据权利要求7的应用，其中Th1-型免疫应答的特征为：(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于或等于1∶10，或者为(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比大于或等于1∶10。
9.根据权利要求8的应用，其中Th1-型的免疫应答的特征为(i)小鼠中IgG2a∶IgG1的ELISA滴定度比大于或等于1∶2，或者为(ii)小鼠中IgG2a∶IgA的ELISA滴定度比大于或等于1∶2。
10.根据权利要求1到9中的一项的应用，其中源自螺杆菌的免疫原性物质选自灭活的螺杆菌细菌，螺杆菌细胞裂解物，肽，源自螺杆菌的纯化形式的多肽，含有编码源自螺杆菌的肽或多肽的一段序列并且置于对其表达必需的控制元件的控制之下的DNA分子，和含有编码源自螺杆菌的肽或多肽的一段序列并置于对其表达必需的控制元件的控制之下的疫苗载体。
11.根据权利要求10的应用，其中源自螺杆菌的免疫原性物质为螺杆菌的脲酶的UreB或UreA亚基。
12.根据权利要求10的应用，其中源自螺杆菌的免疫原性物质为包含有编码螺杆菌脲酶的UreB或UreA亚基的一段序列的DNA分子或疫苗载体。
13.根据权利要求10、11或12的应用，其中免疫原性物质源自Helicobacter pylori。
14.根据权利要求5到13中之一的应用，其中药用组合物是被用于通过严格内吸收途径施用的。
15.根据权利要求5到14中之一的应用，其中药用组合物是被用于通过选自皮下途径，肌肉内途径和皮内途径中之一的内吸收途径施用的。
16.根据权利要求5到14中之一的应用，其中的药用组合物是被通过粘膜途径施用，接着通过非肠道途径施用。
17.根据权利要求16的应用，其中的药用组合物是被用于通过非肠道途径，接着通过粘膜途径，接着通过非肠道途径，接着通过粘膜途径施用的。
18.根据权利要求5到17中之一的应用，其中的药用组合物是被用于施用在上述哺乳动物的腰部背侧的。
19.根据权利要求5到18中之一的应用，其中药用组合物是被用于在同一疗程中通过内吸收途径施用两次或三次，以防止或治疗螺杆菌感染。
20.根据权利要求5到18中之一的应用，其中免疫原性物质选自灭活的螺杆菌细菌，螺杆菌细胞裂解物，源自螺杆菌的纯化的多肽并且和至少一种能促进诱导Th1-型免疫应答的复合物联用。
21.根据权利要求20的应用，其中能促进诱导Th1-型免疫应答的复合物选自脂质体，微球，QS-21，DC-chol和Bay R1005。
22.根据权利要求20的应用，其中能够促进Th1-型免疫应答的诱导的化合物选自QS-21，DC-chol和Bay R1005。
23.根据权利要求22的应用，其中免疫原性物质和至少两种能促进诱导Th1-型免疫应答的诱导的复合物联用，第一种复合物选自脂质体，微球，第二种复合物选自QS-21，DC-chol和它们的对等物。
24.根据权利要求20的应用，其中的免疫原性物质是肽或多肽，它们通过共价键连接到至少一种能促进诱导Th1-型免疫应答的脂，从而形成脂肽或含脂的多肽缀合物。
25.用于防止或治疗哺乳动物螺杆菌感染的方法，上述方法依次包括以下步骤：
在对上述哺乳动物粘膜施用源自螺杆菌的免疫原性物质；然后
对上述哺乳动物非肠道施用上述源自螺杆菌的免疫原性物质。
26.权利要求25中的方法，其中粘膜施用进行一次以上。
27.权利要求25中的方法，其中非肠道施用进行一次以上。
28.权利要求25中的方法，其中进行粘膜施用是用于激发针对上述源自螺杆菌的免疫原性物质的免疫应答，进行非肠道施用是用于加强针对上述源自螺杆菌的免疫原性物质的。
29.权利要求25或28中的方法，其中的粘膜施用是口腔施用(oraladministration)。
30.权利要求25或28中的方法，其中的非肠道施用是肌肉内施用或皮下施用。
31.权利要求25中的方法，其中源自螺杆菌的免疫原性物质选自灭活螺杆菌细菌制备物，螺杆菌细胞裂解物，肽，源自螺杆菌的纯化的多肽，包含有编码源自螺杆菌的肽或多肽的一段序列并且处于对其表达必需的元件的控制之下的DNA分子，和包含有编码源自螺杆菌的肽或多肽的一段序列并且处于对其表达必需的元件的控制之下疫苗载体。
32.权利要求31中的方法，其中源自螺杆菌的免疫原性物质为螺杆菌脲酶的UreB或UreA亚基。
33.权利要求31中的方法，其中源自螺杆菌的免疫原性物质是包含编码螺杆菌脲酶的UreB或UreA亚基的序列的DNA分子或疫苗载体。
34.权利要求31、32或33中的方法，其中免疫原性物质是源自Helicobacter pylori的。
35.权利要求25中的方法，其中粘膜佐剂选自Escherichia coli热不稳定肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，Clostridium  difficile毒素，百日咳毒素(PT)以及它们的复合物，亚基，类毒素，源自它们的突变体，上述佐剂与粘膜施用免疫原性物质共同施用。
36.权利要求25中的方法，其中的非肠道佐剂选自由矾，QS-21，DC-chol和Bay组成的一组佐剂，上述佐剂与非肠道施用的免疫原性物质共同施用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108743929A (zh) * 2018-06-14 2018-11-06 四川大学 一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法和用途

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0029919D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Chiron Spa Helicobacter pylori prime & boost vaccination
ES2728949T3 (es) 2008-06-27 2019-10-29 Zoetis Services Llc Composiciones adyuvantes novedosas
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Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69334197T2 (de) * 1992-03-02 2008-12-11 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Helicobacter pylori Cytotoxin verwendbar in Impfstoffe und Diagnostik
US5679769A (en) * 1994-03-15 1997-10-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of asparagine-linked glycopeptides on a polymeric solid support
AUPM612494A0 (en) * 1994-06-08 1994-06-30 Csl Limited Treatment or prevention of helicobacter infection
US5610060A (en) * 1994-06-24 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Isolated Helicobacter hepaticus
AR003125A1 (es) * 1995-06-01 1998-07-08 Astra Ab Antigenos bacterianos para el diagnostico de infecciones con helicobacter pylori, una molecula de adn que lo codifica, un vector, una celula huesped,procedimiento para producir el polipeptido, composiciones para vacunas adecuadas para uso terapeutico y profilactico, el uso del polipeptido en la
SK165197A3 (en) * 1995-06-07 1999-01-11 Astra Ab Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108743929A (zh) * 2018-06-14 2018-11-06 四川大学 一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法和用途
CN108743929B (zh) * 2018-06-14 2021-07-27 四川大学 一种用作尿素清除剂的脲酶凝胶微球的制备方法和用途

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WO1998048835A1 (en) 1998-11-05

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