CN1240702C - 高获得率提取替曲朵辛的方法 - Google Patents

Abstract

从河豚鱼卵巢中提取替曲朵辛的方法包括以下5个步骤：第一步：用水和加入卵巢重量0.1%-1%的乙酸浸泡河豚鱼卵巢数小时，然后加压快速过滤。第二步：加热浸取液70-95℃除去可溶蛋白。第三步：用有机碱的水溶液(例如氨水)调节过滤出蛋白的清液pH值在6.0-7.5之间，过阳离子交换树脂富集"替曲朵辛"。第四步：调节含替曲朵辛溶液的pH值并在一定时间内通过活性炭与硅藻土柱，去除碱性氨基酸。第五步：真空浓缩纯化”替曲朵辛″结晶。按照该提取方法，可将替曲朵辛的提取率提高到现有技术的3倍，即以100公斤河豚鱼有毒卵巢计算，可以提取出纯度为80-88%的″替曲朵辛″4-6克。

Description

高获得率提取替曲朵辛的方法

本发明涉及一种能以高获得率从河豚鱼内部组织(例如卵巢)中提取替曲朵辛的方法。

替曲朵辛属于小分子非蛋白的高活性神经毒素，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏和血液中，其它部分含量极微。TTX也在其它动物甚至海藻中发现，包括蜥蜴，加州蝾螈，虎虾鱼，蓝环章鱼等。

替曲朵辛化学名是：

八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基-5，9：7，10α-二甲桥-10αH-[1，3]二桥氧并[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-戊醇

分子式：C₁₁H₁₇N₃O₈

分子量：319.27

其结构式为：

TTX的结构特征是：仅有一个碳环，一个胍基，六个羟基和-个半醛糖内酯基团。纯的″替曲朵辛″是无色的结晶粉末。加热到220℃结晶变暗没有分解。″替曲朵辛″溶于酸性水溶液，不溶于水及有机溶剂：在水溶液中的Pka为8.76，属于碱性动物生物碱。在中性或有机酸性溶剂中对热相当稳定，在强酸和强碱性水溶液中迅速破坏。

用高压液相法分离、测定的天然河豚鱼中的毒素是含有10余种类似物的混合物，其中主要成分叫″替曲朵辛″它的含量在70％-80％之间。另外三种主要类似物为河豚酸、4-表替曲朵辛和脱水4-表替曲朵辛。这三个″替曲朵辛″的化学性质，有些微小的差别，但生物活性差别较大，例如它们的毒性，TTX的毒性为4500鼠单位/毫克，4-表替曲朵辛”的毒性仅为710鼠单位/毫克，而脱水4去4替曲朵辛”的毒性降低到92鼠单位/毫克(Toxicon，23 271-7276(1985))。

获取TTX的方法有2种，即人工合成和生物提取。1975年日本山口大学农业化学系的岸义人等人成功地合成了外消旋TTX。对TTX的生物提取始于本世纪初的1909年，日本人田原(J.pharm-soc.Japan  22 587(1909)，Biochem-z. 30 255，1911)用醋酸铅与氨水处理河豚鱼卵巢，得到了毒力为4.1γ(对1克小鼠平均极限致死量表示为MLD4.1γ/g，简写为4.1γ)的粗品，并将其命名为现在使用的”Tetrodotoxin”。在以后几十年中，又出现了多种提取方法，有代表性的如：

横尾在1950年(日本化学杂志 71 590，1950)用水浸取其卵巢，蒸干，得到干物质后，用醋酸铅与氨水使毒素共同沉淀，用磷钨酸，苦味酸汞除去不纯物，用苯肼除糖，再用苦味酸汞处理，最后依次用苦酮酸、甲醇、苦酮酸再处理，从20公斤卵巢中仅获得MLD0.8的结晶毒素13mg。

永井1951年(福冈医志经1(1954))第一次使用离子交换树脂Amberlite IRe-50吸附毒素，用盐酸洗脱，再用Amberlite IR-4B除去盐酸，浓缩后用无水乙醇提取毒素，最后从20公斤卵巢中得到MLD0.008r的结晶毒素2.5mg。

1952年，津田与河村搞了一个用活性炭层析的大规模生产法(津田，化学的η领域，增刊， 80 9(1967))，可以处理1000公斤卵巢并获得MLD10μg/kg的毒素10克。在此同时，美国哈佛大学的Woodward(R.B.Woodward，Pure Appl.chem..9249-74(1967))也获得类似的结果。

1964年後藤俊夫(後藤俊夫、高桥等，日本化学杂志 85 508，1964)使用离子交换和活性炭吸附的提纯方法，从100公斤卵巢可以获得他们称的粗毒素1-2克，使得率有了明显的提高。其工艺流程见图1.。

1980年代后，陆续有学者报导了一些新的提取方法，迄今为止发表的提取方法不少于十几种，但得率并没有大的提高，仅为100公斤卵巢中提取TTX1-2g。而本专利申请的提取方法，可以从100公斤卵巢中提取TTX4-6g，得率高出已有方法的3倍。其工艺流程见图2.。

由此，本发明提供了一种从河豚鱼内部组织中提取替曲朵辛的方法，其包括以下步骤：

(a)用含乙酸的水浸泡河豚鱼内部组织，然后加压快速过滤得到浸取液；

(b)在沸点以下的温度加热浸取液以除去可溶性蛋白并得到澄清溶液；

(c)用有机碱溶液调节所述澄清溶液的pH值，以从所述的澄清溶液中除去中性和酸性氨基酸，然后，通过弱酸性阳离子交换树脂富集替曲朵辛；

(d)调节含替曲朵辛溶液的pH值并通过活性炭与硅藻土柱，以去除碱性氨基酸，以及

(e)真空浓缩替曲朵辛溶液。

优选的是，所述内部组织为卵巢。

在本发明的实施方案中，优选的是，所述水的重量为所述内部组织重量的1.2-1.7倍，以及，优选的是，在步骤(a)中，乙酸的添加量为所述内部组织重量的0.1-1％。并且，在步骤(a)中，优选对浸取液采用加压快速过滤的方法并重复3-4次。

在本发明的实施方案中，优选的是，在步骤(b)中，加热浸取液的时间为3-25分钟，并且，优选加热温度为70-95℃。

在本发明的实施方案中，优选的是，在步骤(c)中，pH值调节为6.0-7.5，更优选为7.0。

在本发明的实施方案中，优选的是，在步骤(d)中，用氨水调节含替曲朵辛溶液的pH值为8-9，并且，优选将所述的pH值保持2-4小时。

在本发明的实施方案中，优选的是，在步骤(e)中，替曲朵辛溶液的浓缩温度为40-50℃，并且，优选在步骤(e)中，浓缩过程是在4小时内完成。

“替曲朵辛”(简称TTX)结晶品提取采用如图1所示工艺流程操作。

1.水浸取过程

取河豚鱼有毒性的卵巢数十公斤，绞碎为小于1厘米的碎块，放置于浸取一过滤装置中，加入1∶1.5去离子水，为了使TTX更好地从卵巢中浸取出，加入卵巢重量0.1-1％的乙酸。开动搅拌，在室温搅拌数小时，停止搅拌，然后开动真空泵减压过滤，数分钟后，开动压缩机，让浸取一过滤装置上部压力达到0.5-1公斤/平方厘米。收集滤液，快速加热至70-95℃，加热时间3-25分钟，冷却后过滤出析出的蛋白，得黄色透明液体，称为第一次浸取清液。

用0.4毫升第一次浸取清液注射于20克重量小白鼠的腹腔，如果小白鼠在50秒内死亡，则该卵巢定为猛毒性原料：如果小白鼠在50-70秒内死亡，则该卵巢被认为强毒性原料：如果小白鼠在70-90秒内死亡，则卵巢被认为弱毒性原料：超过90秒死亡的卵巢浸取液，没有使用价值。最好使用条纹东方豚的强毒性卵巢。

向第一次浸取过滤后的滤渣加入去离子水，搅拌数小时，如第一次浸取一样，过滤，加热，过滤，收集第二次浸取液。用类似的方法，收集第三次、第四次浸取清液。如果使用猛毒性和强毒性卵巢，仍需收集第四次浸取清液，如果使用弱毒性卵巢，只需收集第三次浸取清液。

将第一、第二、第三和第四次浸取液合并在一起，叫做浸取清液，用生物法或HPLC法测定浸取清液毒素含量。

2.离子交换富集和分离毒素过程

将浸取清液用氨水调节溶液pH值达6.0-7.5，如果有沉淀产生，过滤出沉淀，将过滤所得浸取清液通过阳离子交换树脂柱，流出速度为2000-3750毫升/小时，流出液用硅胶薄版监控有没有毒素泄露。如果发现有TTX泄露立即更换新的树脂柱。

浸出清液全部通过柱子后，用去离子水洗柱子直到洗到交换柱不再保留蛋白为止。再用5-12％的乙酸溶液洗交换柱，洗脱流出速度500-2500毫升/小时，按每份1500毫升收集洗脱液，每份用TLC检测，收集含有毒素的洗脱液。

3.活性炭纯化过程

合并从离子交换柱上用乙酸洗脱出含有毒素的溶液，用浓氨水调节溶液pH值为8-9，该条件下的时间应控制在2-4小时。然后通过由活性炭和另一组份硅藻土填充的柱子，去离子水洗柱子后，用含有酸的醇溶液(酸和醇浓度在0.5-40％之间)洗柱，尽可能洗下所吸附的毒素(用TLC检测)。

4.浓缩结晶过程

将全部从柱上洗脱下来的含有毒素的溶液在减压下浓缩，冷却后，用氨水调节溶液pH值为8-9，放置后让TTX沉淀.然后过滤出沉淀，用去离子水洗沉淀数次，然后抽干将沉淀溶于乙酸，再加氨水让TTX沉淀再沉淀，如此操作再重复一次，将获得的TTX结晶放在真空干燥器中干燥24小时，干燥至恒重后，得到TTX结晶。用HPLC方法测定其含量。

实施例

以下实施例对本发明的方法作出阐释，但无意以任何方式对本发明作出限制。

实施例1

取河豚鱼有毒性的卵巢20公斤，绞碎为一厘米大小的碎块，放置于浸取一过滤装置中，加入30公斤去离子水，和30毫升乙酸，搅拌10小时后，开动真空抽气机使过滤装置中的滤液流出，然后开动空气压缩机使滤液快速流出，过滤完毕后，重新加入30公斤去离子水，进行第二次浸取，浸取10小时后，再过滤。如此进行四次，直到过滤出的滤液(注射小白鼠检查清液)中TTX每升中含量低于0.5毫克为止。

然后，将上述滤液合并，滤液被加热到80℃5分钟，冷却后，过滤出凝固的蛋白。用氨水调节过滤出蛋白后的清液pH值达7.5。将pH值达7.5的清液通过直径6cm，填充D-152树脂(中国天津南开大学化工厂生产)铵型的1米高弱酸性阳离子交换树脂柱，所有清液通过树脂柱后，用去离子水洗柱子，柱子被洗清后用10％乙醋水溶液淋洗出TTX。收集含TTX洗脱液，用浓氨水中和至pH8.5。将pH8.5含TTX溶液通过活性炭.硅藻土柱，让TTX吸附在活性炭.硅藻土柱上，然后用含0.1％乙酸的20％乙醇水溶液洗出TTX，洗出的含TTX溶液在旋转蒸发器中浓缩到10-20毫升，冷却后用浓氨水调节浓缩液至pH等于9，放置冰箱中冷却析出TTX结晶，将结晶过滤出，溶于5％乙酸，再用浓氨水调节溶液pH等于9，再一次沉淀出TTX.过滤出TTX，获得TTX结晶后放在真空干燥器中干燥24小时，干燥至恒重后，TTX结晶经HPLC测定，其含量为86.17％(见图3)，从20公斤卵巢获得TTX结晶1200mg，如按100公斤算，可得TTX结晶6.0克。比现有方法收率提高3倍。

实施例2

捣碎20公斤河豚鱼卵巢，加水30升和30ml0.5％的乙酸，搅拌后过滤残渣，收集滤液，然后收集所有滤液加热煮沸10分钟，继之冷却，减压，抽滤除去凝固的蛋白，依此法反复操作4次得到微黄色的透明液体。以下步骤按本发明方法实施。最后得到纯度为82％的TTX结晶350mg。此次试验得率低的原因是参照了后藤俊夫的方法，将滤液煮沸，从而加速了TTX的分解，使煮沸后TTX总量减少了很多。

实施例3

捣碎20公斤河豚鱼卵巢，加去离子水30升但不加入乙酸，按实施例1的步骤操作。最后得到纯度为82％的TTX结晶620mg。此法得率低的原因是在浸泡液中没有加入一定比例的乙酸。因为TTX在卵巢中以某种结合方式存在，加乙酸后使得TTX易溶于水，因此可以提高TTX的获得率。

实施例4

20公斤河豚鱼卵巢捣碎后按实施例1的步骤操作，但没有调节通过离子交换树脂柱的浸取液的pH，最后得到纯度为85％的TTX结晶410mg。此法得率低的原因在于没有调节通过离子交换树脂柱的浸取液的pH，未经调节的取液pH为5.5，在此种酸性条件下，不能除去滤液中的中性氨基酸和酸性氨基酸，故用氨水很难充分地沉淀出TTX。

实施例5

20公斤河豚鱼卵巢捣碎后按实施例1的步骤操作，只是对滤液的加热温度准确控制在90℃，加热时间控制在5分钟，从而获得纯度为85.56％(见图4，5，6，7)的TTX结晶1198mg。结果表明加热温度可以在低于沸点的一定范围内变化而不会对获得率产生明显的影响。

实施例6

20公斤河豚鱼卵巢捣碎后按实施例1的步骤操作，只是对卵巢碎块的搅拌时间控制在8小时而不是10小时，最后获得纯度为91.06％(见图8，9，10，11)的TTX结晶1050mg。结果表明搅拌时间可以在一定范围内变化而不会对获得率产生明显的影响。

实施例7

20公斤河豚鱼卵巢捣碎后按实施例1的步骤操作，只是对滤液的加热温度控制在75℃，加热时间控制在25分钟，从而获得纯度为88.23％(见图12，13，14，15)的TTX结晶960mg。结果表明加热温度(低于沸点)及加热时间可以同时在一定范围内变化而不会对获得率产生明显的影响。

Claims (13)

1.从河豚鱼内部组织中提取替曲朵辛的方法，其包括以下步骤：

(a)用含乙酸的水浸泡河豚鱼内部组织，然后加压快速过滤得到浸取液；

(b)在沸点以下的温度加热浸取液以除去可溶性蛋白并得到澄清溶液；

(c)用有机碱溶液调节所述澄清溶液的pH值，以从所述的澄清溶液中除去中性和酸性氨基酸，然后，通过弱酸性阳离子交换树脂富集替曲朵辛；

(d)调节含替曲朵辛溶液的pH值并通过活性炭与硅藻土柱，以去除碱性氨基酸，以及

(e)真空浓缩替曲朵辛溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述内部组织为卵巢。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述水的重量为所述内部组织重量的1.2-1.7倍。

4.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，乙酸的添加量为所述内部组织重量的0.1-1％。

5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，对浸取液采用加压快速过滤的方法并重复3-4次。

6.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，加热浸取液的时间为3-25分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，加热温度为70-95℃。

8.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，pH值调节为6.0-7.5。

9.如权利要求8所述的方法，其中在步骤(c)中，pH值调节为7.0。

10.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中，用氨水调节含替曲朵辛溶液的pH值为8-9。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述的pH值被保持2-4小时。

12.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中，替曲朵辛溶液的浓缩温度为40-50℃。

13.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中，浓缩过程是在4小时内完成。

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