CN113912706A

CN113912706A - 结合乙型肝炎病毒表面抗原的抗体及其应用

Info

Publication number: CN113912706A
Application number: CN202110780817.5A
Authority: CN
Inventors: 许铮; 常红艳; 李响; 宋瑞; 刘影; 李峰
Original assignee: Beijing Kawin Technology Share Holding Co ltd
Current assignee: Beijing Kawin Technology Share Holding Co ltd
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2022-01-11
Also published as: JP2023534422A; ZA202300172B; TWI868379B; US20230265168A1; EP4180456A4; EP4180456A1; TW202214683A; WO2022007955A1

Abstract

本发明属于抗体技术领域，提供了一种与乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包含该抗体或抗原结合片段的药物组合物及其用途。另外，本发明还提供了编码该抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞，以及制备该抗体的方法。

Description

结合乙型肝炎病毒表面抗原的抗体及其应用

对相关申请的交叉引用

本申请要求享有2020年07月9日提交的中国申请202010659026.2，以及2020年7月10日提交的中国申请202010659828.3的优先权权益，其全部内容通过引用合并于此。

技术领域

本发明属于抗体技术领域，涉及一种结合乙型肝炎病毒表面抗原的抗体，以及该抗体在治疗与乙型肝炎病毒感染相关的疾病中的用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。全球肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为30％和45％。我国肝硬化和HCC患者中，由HBV感染引起的比例分别为60％和80％。我国是慢性乙型肝炎的人口大国，流调显示目前尚有超过7％的人为乙型肝炎病毒感染者，总人数接近1亿人。截至2015年底，只有9％的乙型肝炎病毒感染者得到了检测和诊断；在诊断为乙型肝炎病毒感染的患者中，仅有8％接受了治疗(中国肝炎防治基金会数据)。他们不仅需要长期甚至终身治疗，为家庭、社会带来巨大负担，而且还有发展成肝硬化、肝癌的危险。据测算，我国有2800万慢性乙型肝炎患者，每年新增近百万肝硬化病人和约30万肝癌病人。按照慢性肝炎患者5％的就诊率和肝硬化、肝癌患者95％的就诊率推算，我国每年用于治疗乙型肝炎相关的直接医疗费用达到800亿元-1200亿元。

乙型肝炎患者经抗病毒治疗后，虽可降低体内病毒载量，延缓严重疾病进程，但很多人不能完全清除乙型肝炎病毒。乙型肝炎患者需要长期服药，患者经济负担严重。根据中国疾控动态公布的数据显示，慢性肝炎患者的年平均诊疗费用占家庭年均总收入的56.24％，代偿性肝硬化占81.53％，失代偿性肝硬化占157.21％，肝癌占96.76％。沉重的经济负担造成很多患者或者放弃治疗或者导致家庭因病返贫。此外，从近十余年肝病的诊疗费用演变过程看，肝病的诊疗费用呈现逐年递增势态，每年增幅10％～20％左右，个人承担部分也随之增加。

研究显示乙型肝炎患者血液中大量存在的由HBsAg组成的亚病毒颗粒是抑制免疫系统使感染肝细胞无法清除的主要原因。依靠某种技术降低血液中HBsAg水平10-100倍，可激活人体自身的T细胞免疫，使得机体自身免疫系统可开始有效杀伤被感染肝细胞。因此有效降低血液中的HBsAg水平不但是乙型肝炎重要的治愈标准之一，更是治疗乙型肝炎清除被感染细胞的前提。

最新的临床研究结果显示,经过核苷酸类似物治疗清除病毒DNA的患者，如果HBsAg低于某个水平(如HBsAg<1500IU/mL)，其干扰素清除HBsAg的几率可超过50％，远大于我们通常认为的干扰素治愈率只有5-10％的比例。

但由于目前缺少有效降低HBsAg的药物，绝大部分患者(超过90％)HBsAg水平均超过这个指标，导致干扰素无法治愈这些病人(这就是干扰素治愈率只有5-10％的原因)。这些新的临床证据对降低HBsAg的治疗方法有了更现实更迫切的需要。

目前研究发现降低乙型肝炎病毒表面抗原主要有3种途径：抑制HBsAg的表达(siRNA)、阻止HBsAg从细胞释放(NAPs)、HBsAg抗体。

确定了用抗体技术降低HBsAg水平的研究方向，经过筛选我们已经获得了多株抗体，体外研究表明本发明抗体可特异性结合HBsAg，动物模型研究结果显示可有效降低HBsAg水平。

发明概述

本申请的目的之一在于提供与乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。体外抗原亲和力体外试验证明了本申请的抗体具有特异性结合HBsAg的能力。而体内试验进一步证明了本申请的抗体可以作为乙型肝炎病毒(HBV)的中和抗体，有效降低HBsAg水平，抑制HBV增殖。

具体地，本申请涉及：

1、一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列，其中：

所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：

HCDR1:X1YX3FX5X6X7Y(SEQ ID NO：33)，

HCDR2：X11NX13X14X15X16X17X18(SEQ ID NO：34)，

HCDR3：ARDX21WX23X24X25X26DX28YGMDX33(SEQ ID NO：35)；

所述轻链可变区包含如下所示的CDR氨基酸序列：

LCDR1:X34X35X36SX38X39(SEQ ID NO：36)，

LCDR2：X40X41X42(SEQ ID NO：37)，

LCDR3：QQSYSTPLX51(SEQ ID NO：38)；

其中，X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33、X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51各选自任一种氨基酸。

2、项1的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中：

X1选自G或A，X3选自T、A或S，X5选自T、A或I，X6选自G、A、Y或D，X7选自Y或A，X11选自I或A，X13选自P或A，X14选自N、A或Y，X15选自S、A或N，X16选自G或A，X17选自G或A，X18选自T或A，X21选自L、V或A，X23选自N、Q或A，X24选自D、Q或A，X25选自D、G或A，X26选自V、G或A，X28选自Y或A，X33选自V或A，X34选自Q或A，X35选自S或A，X36选自I、A或V，X38选自T、A或S，X39选自Y或A，X40选自A、G、D、T或S，X41选自A或S，X42选自A或S，X51选自T或A。

3、项2的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中：

HCDR1中X1、X3、X5、X6和X7依次选自下述的任一种组合：

G、T、T、G、Y；A、T、T、G、Y；G、A、T、G、Y；G、T、A、G、Y；G、T、T、A、Y；G、T、T、G、A；G、S、I、G、Y；G、T、T、D、Y；G、T、T、Y、Y；

HCDR2中X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18依次选自下述的任一种组合：I、P、N、S、G、G、T；A、P、N、S、G、G、T；I、A、N、S、G、G、T；I、P、A、S、G、G、T；I、P、N、A、G、G、T；I、P、N、S、A、G、T；I、P、N、S、G、A、T；I、P、N、S、G、G、A；I、P、Y、N、G、G、T；

HCDR3中X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33依次选自下述的任一种组合：L、N、D、D、V、Y、V；A、N、D、D、V、Y、V；L、A、D、D、V、Y、V；L、N、A、D、V、Y、V；L、N、D、A、V、Y、V；L、N、D、D、A、Y、V；L、N、D、D、V、A、V；L、N、D、D、V、Y、A；V、Q、Q、G、G、Y、V；

LCDR1中X34、X35、X36、X38、X39依次选自下述的任一种组合：

Q、S、I、T、Y；A、S、I、T、Y；Q、A、I、T、Y；Q、S、A、T、Y；Q、S、I、A、Y；Q、S、I、T、A；Q、S、I、S、Y；Q、S、V、S、Y；

LCDR2中X40、X41、X42依次选自下述的任一种组合：

A、A、S；S、A、S；A、S、S；A、A、A；G、A、S；D、A、S；T、A、S；且，

LCDR3中的X51选自：T或A

4、项3的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33依次选自下表1中的任一种组合：

表1：

5、项3或4的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51依次选自下表2中的任一种组合：

表2：

6、项3的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33、X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51依次选自下表3中的任一种组合：

表3：

在一些实施方案中，在所述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段中，所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ IDNO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：25所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：20所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：24所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：25所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：22所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：27所示的LCDR1；如SEQ ID NO：29所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：27所示的LCDR1；如SEQ ID NO：30所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：30所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3。

7、项1-6中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，包含人类通用框架区(FR)。在一些实施方案中，所述VH包含人类亚组III通用框架区(FR)。在一些实施方案中，所述VL包含人类亚组

通用框架。在一些实施方案中，包含人类通用框架区(FR)和在人类通用框架区(FR)基础上的一个或多个氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述框架区为人类通用框架区，并且包含一个或多个(例如1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3个)氨基酸取代。在一些实施方案中，所述框架区为人类通用框架区或与人类通用框架区具有70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％同一性。在本发明的一些示例性实施方案中，所述VH包含如下所示的FR氨基酸序列：

HFR1：Z1Z2Z3LZ4Z5SGAEVKKPGASZ6KVSCKAS(SEQ ID NO：39)

HFR2：Z7HWVRQAPGQGZ8EWMGW(SEQ ID NO：40)

HFR3：NYAQKFQGRVTZ9TZ10DZ11SZ12STAYMELSZ13LRSZ14DTAVYYC(SEQ ID NO：41)

HFR4：WGZ15GTZ16VTVSS(SEQ ID NO：42)

VL包含如下所示的FR氨基酸序列：

LFR1：Z17Z18Z19LTQSPZ20Z21LSZ22SZ23GZ24RZ25TZ26Z27CRAS(SEQ ID NO：43)

LFR2：LZ28WYQQKPGZ29APZ30LLIZ31(SEQ ID NO：44)

LFR3：Z32Z33Z34Z35GZ36PZ37RFSGSGSGTZ38FTLTIZ39SLZ40Z41Z42DZ43ATYYC(SEQID NO：45)

LFR4：FGZ44GTZ45Z46Z47IKR(SEQ ID NO：46)

其中，Z1-Z47各选自任一种氨基酸。

8、项7的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中，

Z1选自Q或E，Z2选自V或I，Z3选自Q或T，Z4选自V或K，Z5选自E或Q，Z6选自V或M，Z7选自M、I或L，Z8选自L或P，Z9为M或I，Z10为R或A，Z11为T或K，Z12为I或T，Z13为R或S，Z14为D或E，Z15选自K或Q，Z16选自L或M，Z17选自D或E，Z18选自I或T，Z19选自Q、T或V，Z20选自S、A或G，Z21选自S或T，Z22选自A或L，Z23选自V或P，Z24选自D或E，Z25选自V或A，Z26选自I或L，Z27选自T或S，Z28选自N或A，Z29选自K或Q，Z30选自K、Q或R，Z31选自Y或S，Z32选自S或N，Z33选自L或R，Z34选自Q或A，Z35选自S或T，Z36选自V或I，Z37选自S或A，Z38选自D或E，Z39为S或R，Z40选自Q或E，Z41选自P或S，Z42选自E或G，Z43选自F或L，Z44选自G、Q或P，Z45选自K或R，Z46选自V或L，Z47选自D或E。

9、项8的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中：

HFR1中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6依次选自下述的任一种组合：Q、V、Q、V、E、V；E、V、Q、V、Q、V；E、V、Q、V、E、V；Q、I、T、K、E、V；E、V、Q、V、Q、M；

HFR2中Z7、Z8依次选自下述的任一种组合：M、L；L、L；I、P；

HFR3中Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14的组合为：M、R、T、I、R、D；或I，A，K，T，S，E

HFR4中Z15、Z16依次选自下述的任一组合：K、L；Q、M；Q、L；或K、M；

10、项8或9的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中：

LFR1中Z17、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27依次选自下述的任一种组合：D、I、Q、S、S、A、V、D、V、I、T；E、I、V、G、T、L、P、E、A、L、S；E、I、V、A、T、L、P、E、A、L、S；E、T、T、S、T、A、V、D、V、I、T；

LFR2中Z28、Z29、Z30、Z31依次选自下述的任一种组合：N、K、K、Y；A、Q、R、Y；N、K、K、S；N、K、Q、Y；

LFR3中Z32、Z33、Z34、Z35、Z36、Z37、Z38、Z39、Z40、Z41、Z42、Z43依次选自下述的任一种组合：S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、E、F；S、R、A、T、I、A、E、S、Q、S、E、F；N、R、A、T、I、A、D、S、E、P、E、F；S、L、Q、S、V、S、E、R、Q、P、E、F；S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、G、L；

LFR4中Z44、Z45、Z46、Z47依次选自下述的任一种组合：G、K、V、D；G、K、L、E；P、K、V、E；G、K、V、E；Q、R、L、E；

11、项10的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中Z1-Z16依次选自下表4的任一种组合：

表4：

12、项8-11中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中Z17-Z47依次选自下表5的任一种组合：

表5：

13、项8的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，Z1-Z47依次选自下表6中的任一种组合：

表6：

14、项1的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中VH序列选自选自SEQID NO：1-6中的任一序列，或与SEQ ID NO：1-6中的任一序列具有至少80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

15、项1或14的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中VL序列选自SEQID NO：7-13中的任一序列，或与SEQ ID NO：7-13中的任一序列具有至少80％、85％、90％、95％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

16、项1-15任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中VH序列与VL序列选自如下任一组：

SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：2与SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：3与SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：5与SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：7、与上述VH序列或VL序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

17、项1-16中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其选自：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、Fv、Fd、dAb、双体抗体(diabody)、或多体抗体(multibody)。

18、项1-17中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全人源抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体或纳米抗体。

19、项1-18中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含重链恒定区和轻链恒定区，其中，所述重链恒定区选自IgG的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ链或λ链。

20、项19的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中重链恒定区为人IgG1的重链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：14具有70％或以上序列同一性的氨基酸序列(例如75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列)。

21、项19或20的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中轻链恒定区源自人κ链。在一些实施方案中，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：15具有70％或以上序列同一性的氨基酸序列(例如75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列)。

22、项1-21中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其为单特异性抗体、双特异性抗体、或多特异性抗体。

23、一种分离的核酸分子，其包含编码项1-22中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。

24、一种构建体，其包含项中的核酸分子，所述构建体选自：质粒、噬菌粒、病毒载体、或线性核酸。

25、一种病毒、噬菌体或细胞，其表达项1-22中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，或包含项23中的核酸或项24中的构建体。

26、一种药物组合物，其包含：项1-22中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、项23中的核酸、项24中的构建体、或项25中的病毒、噬菌体或细胞。

27、一种试剂盒，其包含：项1-22中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、项23中的核酸、项24中的构建体、或项25中的病毒、噬菌体或细胞。

28、一种治疗或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，或缓解乙型肝炎症状的方法，其包含向患者施用有效量的项26中的药物组合物。

29、一种检测HBV的方法，包括使项1-22中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、项23中的核酸、项24中的构建体、或项25中的病毒、噬菌体与来自受试者的体液接触。

30.项29的方法，其中所述体液为受试者的血浆或血清。

附图说明

图1显示选用鼠源IgG1恒定区的005、062、079及083抗体尾静脉注射后对AAV/HBV小鼠血浆HBV DNA的影响。

图2显示选用鼠源IgG1恒定区的005、062、079及083抗体尾静脉注射后对AAV/HBV小鼠血浆HBsAg的影响

图3显示选用鼠源IgG1恒定区的005、021、062及088抗体尾静脉注射后对AAV/HBV小鼠血浆HBV DNA的影响。

图4显示选用鼠源IgG1恒定区的005、021、062及088抗体尾静脉注射后对AAV/HBV小鼠血浆HBsAg的影响

图5显示选用人源IgG1恒定区的021、090、091及093抗体尾静脉注射，以及选用人源IgG1恒定区的021腹腔注射后分别对AAV/HBV小鼠血浆HBV DNA的影响。

图6显示选用人源IgG1恒定区的021、090、091及093抗体尾静脉注射，以及选用人源IgG1恒定区的021腹腔注射后分别对AAV/HBV小鼠血浆HBsAg的影响

图7显示选用人源IgG1恒定区的021、095及096抗体尾静脉注射，以及选用人源IgG1恒定区的021腹腔注射后分别对AAV/HBV小鼠血浆HBV DNA的影响。

图8显示选用人源IgG1恒定区的021、095及096抗体尾静脉注射，以及选用鼠源IgG1恒定区的021腹腔注射后分别对AAV/HBV小鼠血浆HBsAg的影响。

图9显示对小鼠连续施用本申请的抗体对AAV/HBV小鼠血浆HBsAg的影响。

发明详述

本申请旨在提供一种全新的可与乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其通过所述结合降低患者血液中HBsAg的表达水平，激活人体自身的T细胞免疫，使得机体自身免疫系统得以开始有效杀伤被感染的肝细胞，抑制HBV增殖。通过所述特异性结合的抗体或其抗原结合片段，本申请为HBV的防治提供了新的选项和思路，同时为HBV的检测和诊断提供了新的工具。

定义

如本文所用，术语“抗体”也称为“免疫球蛋白”，涵盖具有天然抗体结构特征的抗体和具有不同于天然抗体的结构特征但表现出对抗原分子的结合特异性的抗体样分子。术语抗体旨在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。

在本文中，抗体的“抗原结合片段”可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促切割或化学切割产生。抗原结合片段尤其包括Fab、Fab’、F(ab’)2、FV、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双体抗体和这样的多肽，其至少含有免疫球蛋白足以赋予该多肽特异性抗原结合的部分。本文所述的抗原抗体片段实例包括但不限于：(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(ii)Fab’片段，即在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C-末端的一个或多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(v)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature 341，544-546(1989))；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键桥接的两个Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird等，Science242：423-426(1988)；和Huston等，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含与同一多肽链中的轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)(参见，例如，EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Pr℃.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述Fd区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利No.5,641,870)。

术语“重链”(“CH”)、“轻链”(“CL”)、“轻链可变区”(“VL”)、“重链可变区”(“VH”)、“框架区”(“FR”)是指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和合成(例如重组)结合蛋白(例如人源化抗体)的相应结构域。天然存在的免疫球蛋白(例如IgG)的基本结构单元是具有两条轻链和两条重链的四聚体。每条链的氨基末端(“N”)部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。羧基末端(每条链的“C”部分定义了一个恒定区，轻链具有单个恒定区，重链通常具有三个恒定区和一个铰链区。因此，天然存在的轻链结构IgG分子为N'-VL-CL-C'，IgG重链结构为N'-VH-CH1-H-CH2-CH3-C'(其中H为铰链区)。IgG分子的可变区包含互补决定区(CDR)，其负责识别与接触抗原，非CDR片段，即框架区(FR)，框架区维持可变区结构并决定CDR环的位置。因此，VL和VH域具有结构N'-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-C'。在本申请中，VH的3个CDR分别称为HCDR1、HCDR2、和HCDR3；VH的4个框架区分别称为HFR1、HFR2、HFR3、HFR4；VL的3个CDR分别称为LCDR1、LCDR2、和LCDR3；VL的4个框架区分别称为LFR1、LFR2、LFR3、LFR4。

在本申请中，所述CDR和FR根据ImMunoGeneTics(IMGT)编号系统(参见,例如,Lefranc M.P.The IMGT unique numbering for immunoglobulins,T-cell receptors,and Ig-like domains.The immunologist 7,132-136,1999(1999)))进行确定。

在本文中，术语“纳米抗体”，即仅由抗体重链的可变区组成的单域抗体。由于其相对分子尺寸为纳米级，故被称为纳米抗体。纳米抗体能像正常抗体一样与抗原紧密结合，但不像单链抗体那样容易相互粘连聚集成块。术语“单域抗体”是由一个可变区或一个仅协助靶标结合的工程化的恒定结构域组成的独立的抗原结合单元。术语“双体抗体”是scFv的二聚体，两个scFv片段通过VH和VL结构域的链间配对(交叉配对)共表达形成双体抗体。同样的，由多条scFv形成的多聚体称为多体抗体。例如，由三条scFv形成的三体抗体，由四条scFv形成的四体抗体等。其中，各scFv可以具有相同的抗原特异性，也可以具有不同的抗原特异性。

如本文所用，“单特异性抗体”、“双特异性抗体”和“多特异性抗体”分别指可以与一个、两个和多个不同抗原或同一抗原的一个、两个和多个不同抗原表位相结合的单个抗体分子。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指组合有来自不同物种的抗体片段的抗体。具体的，例如来自一个物种(例如小鼠)的一种单克隆抗体，其Fc恒定区经由DNA重组技术替换为来自一个物种(例如人)的Fc恒定区。参见例如专利申请PCT/US86/02269；EP/173,494。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含人免疫球蛋白框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠、兔或合成)免疫球蛋白的一个或多个CDR的抗体。除CDR以外，人源化抗体中的所有其他部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。通过基因工程构建人源化抗体的方法参见例如专利申请US/5,585,089。

如本文所用，术语“全人源抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本技术的全人源抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“全人源抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种(例如兔)的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。因此，如本文所用，术语“全人源抗体”是指其蛋白质分子的几乎各个部分(例如，CDR、FR、CL、HC结构域(例如，CH1、CH2、CH3)、铰链、VL、VH)在人体中几乎无免疫原性，其相对于人天然免疫球蛋白只有很小的序列变化或变异。因此，全人源抗体不同于嵌合或人源化抗体。需要指出的是，全人源抗体可由能够表达功能重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。

如本文所用，术语“特异性结合”是指由抗原决定簇和抗体分子可变区空间构象决定的以高亲和力互补结合的特性。这种高亲和力决定了所述抗体分子一旦与所述抗原结合，便可发挥其相应的生理功能，例如，在本申请的一些实施例中，所述抗体结合并帮助清除所述抗原的功能。

“人类通用框架”为代表在选择人类免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常存在的氨基酸残基的框架。一般而言，人类免疫球蛋白VL或VH序列选自于可变域序列的亚组。一般而言，序列亚组为如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一些实施方案中，对于VL而言，所述亚组为如Kabat等人(同上)描述的亚组

。在一些实施方案中，对于VH而言，所述亚组为如Kabat等人(同上)描述的亚组III。

两氨基酸序列或核苷酸序列间的“同源性”或“同一性”指两序列间氨基酸残基或核苷酸残基完全相同的百分数。如果待相互比较的两序列长度有别，则序列“同源性”或“同一性”优选是指较短序列中与较长序列氨基酸残基或核苷酸残基完全相同的核苷酸残基的百分数。序列同一性可以通过使用本领域常用的序列分析软件，诸如Wisconsin序列分析包等常规确定。

本申请中,术语“多核苷酸”或“核酸”、“核酸分子”可互换使用，包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。

如本文所用，“构建体”是指通过其可以将多核苷酸序列(例如外来基因)引入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体，包括质粒、噬菌粒、病毒载体等。

如本文所用，术语“噬菌粒”是丝状噬菌体衍生的载体，其基本成分主要包括质粒的复制起点、选择标记、基因间隔区(IG区)，通常还包含负链和正链的包装序列和复制起点、噬菌体外壳蛋白的基因、限制性内切酶识别位点、启动子和编码信号肽的DNA片段。此外，噬菌粒还可以包含一个分子标签，以方便筛选基于噬菌粒的文库。噬菌粒无法独立完成子代噬菌体颗粒的组装，完成其生命周期所需的其他结构和功能蛋白质由辅助噬菌体提供。而辅助噬菌体是一种自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体突变型，因此辅助噬菌体与噬菌粒包装形成的噬菌体共同感染宿主菌时，可包装大量含有噬菌粒的噬菌体，而仅包装少量辅助噬菌体。

如本文所用，“质粒”是指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质或细胞核中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

如本文所用，“病毒载体”是指以病毒为基础的基因载体，是一种经过基因工程改造的病毒基因组，其可携带外源基因和相关基因元件，并被包装成病毒颗粒，通过病毒侵染将其携带的外源基因导入细胞中。

除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

抗体或其抗原结合片段

一方面，本申请提供了一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体或其抗原结合片段。通常本申请的抗体包含重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列，其中：

所述重链可变区包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列通式：

HCDR1:X1YX3FX5X6X7Y(SEQ ID NO：33)，

HCDR2：X11NX13X14X15X16X17X18(SEQ ID NO：34)，

HCDR3：ARDX21WX23X24X25X26DX28YGMDX33(SEQ ID NO：35)；

所述轻链可变区包含如下所示的CDR氨基酸序列：

LCDR1:X34X35X36SX38X39(SEQ ID NO：36)，

LCDR2：X40X41X42(SEQ ID NO：37)，

LCDR3：QQSYSTPLX51(SEQ ID NO：38)；

其中，X1、X3、X5、X6、X7、X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33、X34、X35、X36、X38、X39、X40、X41、X42、X51均可选自任一种氨基酸。所述任一种氨基酸可以为20种天然氨基酸中的任一种，也可为人工合成或改造的氨基酸。

其中HCDR1、HCDR2、HCDR3表示重链可变区中的三个CDR，且其从重链可变区的N’端到C’端依次排列。同样LCDR1、LCDR2、LCDR3表示轻链可变区中的三个CDR，且其从轻链可变区的N’端到C’端依次排列。

本申请的实施例中，挑选了部分氨基酸对所述通式提供的CDR进行检测，包括：当X1为G或A时，X3为T、A或S时，X5为T、A或I时，X6为G、A、Y或D时，X7为Y或A时，X11为I或A时，X13为P或A时，X14为N、A或Y时，X15为S、A或N时，X16为G或A时，X17为G或A时，X18为T或A时，X21为L、A、或V时，X23为N、Q或A时，X24为D、Q或A时，X25为D、G或A时，X26为V、G或A时，X28为Y或A时，X33为V或A时，X34为Q或A时，X35为S或A时，X36为I、A或V时，X38为T、A或S时，X39为Y或A时，X40为A、G、D、T或S时，X41为A或S时，X42为A或S时，X51为T或A时。其检测结果证实包含所述通式的本申请的抗体可特异性结合HBsAg。

本领域技术人员应当知晓，所述通式中各Xn(其中n代表通式中各X的整数角标)的各个取值均可互相组合。例如，在一些实施方案中，HCDR1中X1、X3、X5、X6和X7依次选自下述的任一种组合：G、T、T、G、Y；A、T、T、G、Y；G、A、T、G、Y；G、T、A、G、Y；G、T、T、A、Y；G、T、T、G、A；G、S、I、G、Y；G、T、T、D、Y；G、T、T、Y、Y。在一些特定的实施方案中，HCDR1选自GYTFTGYY(SEQ ID NO：17)；GYSFIGYY(SEQ ID NO：18)；GYTFTDYY(SEQ ID NO：19)；GYTFTYYY(SEQ ID NO：20)。

HCDR2中X11、X13、X14、X15、X16、X17、X18依次选自下述的任一种组合：I、P、N、S、G、G、T；A、P、N、S、G、G、T；I、A、N、S、G、G、T；I、P、A、S、G、G、T；I、P、N、A、G、G、T；I、P、N、S、A、G、T；I、P、N、S、G、A、T；I、P、N、S、G、G、A；I、P、Y、N、G、G、T。在一些特定的实施方案中，HCDR2选自INPNSGGT(SEQ ID NO：21)；INPYNGGT(SEQ ID NO：22)。

HCDR3中X21、X23、X24、X25、X26、X28、X33依次选自下述的任一种组合：L、N、D、D、V、Y、V；A、N、D、D、V、Y、V；L、A、D、D、V、Y、V；L、N、A、D、V、Y、V；L、N、D、A、V、Y、V；L、N、D、D、A、Y、V；L、N、D、D、V、A、V；L、N、D、D、V、Y、A；V、Q、Q、G、G、Y、V。在一些特定的实施方案中，HCDR3为ARDLWNDDVDYYGMDV(SEQ ID NO：23)或ARDVWQQGGYYYYMDV(SEQ ID NO：24)。

LCDR1中X34、X35、X36、X38、X39依次选自下述的任一种组合：Q、S、I、T、Y；A、S、I、T、Y；Q、A、I、T、Y；Q、S、A、T、Y；Q、S、I、A、Y；Q、S、I、T、A；Q、S、I、S、Y；Q、S、V、S、Y。在一些特定的实施方案中，LCDR1选自QSISTY(SEQ ID NO：25)；QSISSY(SEQ ID NO：26)；QSVSSY(SEQ ID NO：27)。

LCDR2中X40、X41、X42依次选自下述的任一种组合：A、A、S；S、A、S；A、S、S；A、A、A；G、A、S；D、A、S；T、A、S；在一些特定的实施方案中，LCDR2选自AAS(SEQ ID NO：28)；GAS(SEQ IDNO：29)；DAS(SEQ ID NO：30)；TAS(SEQ ID NO：31)。

LCDR3中的X51选自：T或A。在一些特定的实施方案中，LCDR3为QQSYSTPLT(SEQ IDNO：32)。

在一些实施方案中，所述VH包含：

如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3；或

如SEQ ID NO：20所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：24所示的HCDR3；或

如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：22所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3；或

如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3。

在一些实施方案中，所述VL包含：

如SEQ ID NO：25所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

如SEQ ID NO：27所示的LCDR1；如SEQ ID NO：29所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

如SEQ ID NO：27所示的LCDR1；如SEQ ID NO：30所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：30所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列，其中：

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：25所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；

其中任选一种组合后，便可根据上述通式确定一组CDR的具体序列。HCDR1、HCDR2、HCDR3的具体序列又可进一步组成具体的重链CDR组合，例如前述表1中的组合。同样的，LCDR1、LCDR2、LCDR3的具体序列又可进一步组成具体的轻链CDR组合，例如前述表2中的组合。HCDR的组以及LCDR的组亦可进行随机组合。例如，在一些特定的实施方案中，轻链与重链的CDR组合如前述表3中所示。

此外，在一些实施方案中，所述特异性结合HBsAg的抗体在各CDR区的两侧还包含框架区(FR)，所述框架区为人类通用框架区，或者是包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入的人类通用框架区。在一个示例性的方案中，VH包含如下所示的FR氨基酸序列：

HFR1：Z1Z2Z3LZ4Z5SGAEVKKPGASZ6KVSCKAS(SEQ ID NO：39)

HFR2：Z7HWVRQAPGQGZ8EWMGW(SEQ ID NO：40)

HFR3：NYAQKFQGRVTZ9TZ10DZ11SZ12STAYMELSZ13LRSZ14DTAVYYC(SEQ ID NO：41)

HFR4：WGZ15GTZ16VTVSS(SEQ ID NO：42)

VL包含如下所示的FR氨基酸序列：

LFR1：Z17Z18Z19LTQSPZ20Z21LSZ22SZ23GZ24RZ25TZ26Z27CRAS(SEQ ID NO：43)

LFR2：LZ28WYQQKPGZ29APZ30LLIZ31(SEQ ID NO：44)

LFR4：FGZ44GTZ45Z46Z47IKR(SEQ ID NO：46)其中，Z1-Z47各选自任一种氨基酸。所述任一种氨基酸可以为20种天然氨基酸中的任一种，也可为人工合成或改造的氨基酸。

其中HFR1、HFR2、HFR3、HFR4表示重链可变区中的4个FR，且其从重链可变区的N’端到C’端依次排列。同样LFR1、LFR2、LFR3、LFR4表示轻链可变区中的4个FR，且其从轻链可变区的N’端到C’端依次排列。

在本申请的实施例中，挑选了部分氨基酸以构成具体的FR序列，通过与前述CDR进行随机匹配，以检测所述FR氨基酸序列的通式对CDR构象的支持作用，所选择的氨基酸包括，例如：

在一些实施方案中，HFR1中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6依次选自下述的任一种组合：Q、V、Q、V、E、V；E、V、Q、V、Q、V；E、V、Q、V、E、V；Q、I、T、K、E、V；E、V、Q、V、Q、M；HFR2中Z7、Z8依次选自下述的任一种组合：M、L；L、L；I、P；HFR3中Z9、Z10、Z11、Z12、Z13、Z14的组合为：M、R、T、I、R、D；或I，A，K，T，S，E；HFR4中Z15、Z16的组合为：K、L；Q、M；Q、L；或K、M。在一些实施方案中，所述LFR1中Z17、Z18、Z19、Z20、Z21、Z22、Z23、Z24、Z25、Z26、Z27依次选自下述的任一种组合：D、I、Q、S、S、A、V、D、V、I、T；E、I、V、G、T、L、P、E、A、L、S；E、I、V、A、T、L、P、E、A、L、S；E、T、T、S、T、A、V、D、V、I、T。在一些实施方案中，LFR2中Z28、Z29、Z30、Z31依次选自下述的任一种组合：N、K、K、Y；A、Q、R、Y；N、K、K、S；N、K、Q、Y。在一些实施方案中，LFR3中Z32、Z33、Z34、Z35、Z36、Z37、Z38、Z39、Z40、Z41、Z42、Z43依次选自下述的任一种组合：S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、E、F；S、R、A、T、I、A、E、S、Q、S、E、F；N、R、A、T、I、A、D、S、E、P、E、F；S、L、Q、S、V、S、E、R、Q、P、E、F；S、L、Q、S、V、S、D、S、Q、P、G、L。在一些实施方案中，LFR4中Z44、Z45、Z46、Z47依次选自下述的任一种组合：G、K、V、D；G、K、L、E；P、K、V、E；G、K、V、E；Q、R、L、E。

在一些实施方案中，重链可变区中FR的可变参数Zn(其中n代表通式中各Z的整数角标)依次可以选自前述表4的任一种组合。同理，轻链可变区中FR的可变参数Zn依次可以选自前述表5的任一种组合。在一些实施方案中，轻链与重链的CDR组合如前述表6中所示。

这里需要明确的是，本申请中所有表格，例如表1至表6，其每一行单元格中的所有参数取值(例如Zn的参数取值或Xn的参数取值)组成一个或一种组合。

在一些具体的实施方案中，VH序列选自：SEQ ID NO：1-6。在一些具体的实施方案中VL序列选自：SEQ ID NO：7-13。在一些具体的实施方案中所述抗体的VH序列选自：SEQ IDNO：1-6且所述VL序列选自SEQ ID NO：7-13。在一些具体的实施方案中，VH序列与VL序列选自如下任一组：SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：6与SEQ ID NO：7。

然而本领域技术人员应当知晓，并非所有的抗体或其抗原结合片段均包含完整的重链可变区和轻链可变区。并且，在很多情况下，仅包含抗体抗原结合片段的蛋白分子，依然具有特异性结合和/或中和抗原的能力。在一些实施方案中，所述抗体可以仅包含抗体的VH和/或VL，例如dAb，只含有轻链可变区的单域抗体，纳米抗体等。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以不含恒定区，例如scFv，其包含前述HCDR和LCDR。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、Fd、双体抗体(diabody)、或多体抗体(multibody)。其中所述双体抗体及多体抗体包含所述一个、两个或多个前述scFv，并且可以包括其它特异性结合HBsAg或其它抗原的scFv。在一些实施方案中，所述抗体为单特异性抗体、双特异性抗体、或多特异性抗体。此外，作为本申请所述抗体的抗原结合片段，本申请公开的各种CDR、所述CDR的组合、以及包含所述CDR(例如HCDR3和/或LCDR3等)且保有对HBsAg特异性识别能力的抗体或抗体结合片段也涵盖在本申请的保护范围中。

在一些实施方案中，本申请所述抗体为全人源抗体、人源化抗体、鼠源抗体、嵌合抗体或纳米抗体。

在一些实施方案中，本申请所述的抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区和/或轻链恒定区源自天然免疫球蛋白，例如所述重链恒定区可源自，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY，或亚型，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。轻链恒定区可选自κ链或λ链。在一些具体的实施方案中，所述重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，包含如SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：14具有70％或以上序列同一性，例如与SEQ ID NO：14具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述轻链恒定区源自κ链，包含如SEQ IDNO：15中所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：15具有70％或以上序列同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：15具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的的氨基酸序列。

核酸、构建体、病毒、噬菌体或细胞

一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子为RNA或DNA分子。在一些实施方案中，所述核酸为单链或双链。在一些实施方案中，所述核酸为线状或环状。所述核酸可以由细胞合成，亦可由化学合成。在一些实施方案中，所述核酸为经过化学修饰的核酸分子。

一方面，本申请还提供了一种构建体，其包含前述核酸分子，所述构建体选自：质粒、噬菌粒、病毒载体、或线性核酸。本申请还提供了一种构建体的组合物，包含前述构建体，其中组合物中的各构建体可以分别包含编码前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段的核酸分子的一个部分。例如，一种构建体的组合物，所述构建体为质粒，且所述构建体的组合物包含分别包含编码前述抗体分子重链和轻链的质粒。

一方面，本申请还提供了一种病毒、噬菌体或细胞，其表达或含有前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，或包含前述核酸、前述构建体或前述构建体的组合物。所述病毒选自例如AAV、慢病毒等。所述噬菌体选自例如λ噬菌、T噬菌体、M13噬菌体、f1噬菌体、fd噬菌体等。所述细胞可选自，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、真菌等。

此外，本申请还包括将核酸、构建体、病毒、噬菌体或细胞用于生产所述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段的用途。

药物组合物及疗法

本申请还提供了一种药物组合物，其包含前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、前述核酸、前述构建体、或前述病毒、噬菌体或细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含适当含量的药学上可接受的辅料。这些制剂纳入配方是为了改善递送和耐受性等。在所有药剂化学家熟知的药典：雷氏药学大全(Remington′s PharmaceuticalSciences,Mack Pub lishing Company，Easton，PA)中可找到大量适当的配方。在本文中，药学上可接受的辅料指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。其中，稀释剂、赋形剂，如微晶纤维素、甘露醇等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如碳酸钙和/或碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；载体、溶剂，如水、生理盐水、高岭土、皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，本发明的药物组合物优选为注射剂。

在本发明的一些实施方案中，本发明药物组合物中的抗体或其抗原结合片段以1mg/ml至1000mg/ml的浓度存在，优选以10mg/ml至1000mg/ml的浓度存在，更优选以50mg/ml至500mg/ml的浓度存在，更优选以100mg/ml至300mg/ml的浓度存在。

本发明的药物组合物优选具有3.0至9.0的pH。其中，可进一步包含缓冲系统、防腐剂、表面张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物是含水制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮。本发明的具体实施方案中，该药物组合物是稳定的含水溶液。在本发明的另一个具体实施方案中中，该药物组合物是一种冻干制剂，在使用前医师或患者加入溶剂和/或稀释液溶解所述冻干制剂。

一方面，本申请还提供了一种治疗HBV感染的方法，其包含向患者施用合适剂量的前述药物组合物。所述合适剂量随受试者年龄和体型大小、目标疾病、症状、施用途径等不同而调整。当本发明的药物组合物为包含前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段用来治疗成人的各种与乙型肝炎病毒感染相关的病症和疾病时，可采用静脉施用所述药物组合物，通常单剂按每公斤体重计约0.01至约20mg抗体给药，例如约0.1至约15、约1至约10，约3至约10mg/kg体重(mpk)，约12mpk体重。根据病症的严重性，可对治疗的频度和持续时间进行调整。例如每周对患者施用一次。

已知有各种药物递送系统可用来施用本发明的药物组合物，例如包裹在脂质体、微颗粒、微胶囊中的胶囊化，能够表达变异病毒的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参阅如Wu等人(1987)，J.Biol.Chem.262：4429-4432)等。给予药物的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜，和口腔等途径。该药物组合物可采用任何方便的途径施用，如通过灌注或静脉团注、上皮和粘膜层(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收，并可与其它生物活性药剂一起施用。施用方式可为全身性或局部性施用。

该药物组合物也可通过液囊递送，尤其是通过脂质体液囊递送(参阅Langer(1990)Science249：1527-1533；Treat等人(1989)in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez Berestein and Fidler(编著)，Liss，New York,第353-365页；Lopez-Berestein，同上，第317-327页)。

在某些情况下，该药物组合物可以通过受控释放系统递送。在一个实施方案中，可使用泵(参阅Langer，如上；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料(参阅Medical Applic ations of Controlled Release，Langer and Wise(编著)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)。关于其它受控释放系统的讨论见Langer(1990)Science2 49：1527-1533。

所述药物组合物可以单独施用亦可联合施用，并使通过降低乙型肝炎病毒表面抗原的载量而使患者症状得到改善。在一些实施方案中，所述施用为联合施用，其中HBsAg抗体或其抗原结合片段与一种或多种治疗药剂(或称第二种治疗药剂)联合施用。共同给药和联合治疗并不限于同时给药，而是还包括在涉及给予患者至少一种其它治疗药剂的疗程中至少给予一次抗HBsAg抗体或或其抗原结合片段的治疗方案。第二种治疗药剂可能为另一种HBV治疗药物，如另一种抗体/抗体片段，或可溶的细胞因子受体(如干扰素、细胞介素、胸腺法新等)、核苷类似物(替诺福韦、恩替卡韦、阿德福韦等)。

本发明还包括本文所述的任何抗HBsAg抗体或抗原结合片段在制备治疗疾病或症状的药物中的应用，其中的疾病或症状是通过降低人体内HBsAg水平而得到改善的。

试剂、试剂盒、检测方法

一方面，本申请提供了一种包含前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、前述核酸的互补链或所述互补链的片段、或前述构建体、病毒、噬菌体或细胞。在一些实施方案中，所述试剂进一步包含标记分子。在一些实施方案中，述标记分子可选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记分子，荧光蛋白分子，荧光素分子，生物素分子，同位素等显影剂。在一些实施方案中，所述标记分子与所述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、前述核酸的互补链或所述互补链的片段、或前述构建体、病毒、噬菌体或细胞耦合，形成复合物。

另一方面，本申请还提供了一种试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒包含前述核酸、所述核酸片段，或所述核酸的互补链或所述互补链的片段。在一些实施方案中，所述试剂盒包含前述构建体、病毒、噬菌体或细胞。在一些实施方案中，所述试剂盒包含前述试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒是体外检测试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒是免疫检测试剂盒，例如ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒，其包含前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒是体内无创诊断试剂盒，其包含前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，且所述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段与标记分子形成复合物。在一些实施方案中，所述体内无创诊断试剂盒，可用于选自以下的显像方法：放射免疫显像或靶向超声造影。当用于放射免疫显像时，所述标记分子为放射性核素。当用于靶向超声造影时，所述标记分子为超声造影剂。

此外，本申请还提供了一种使用前述特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、前述试剂或试剂盒检测HBV、诊断HBV感染或判断HBV相关疾病进程的方法。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

应当理解，以上描述以及随后的实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面，优点和修改对于本发明所属领域的技术人员将是显而易见的。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

实施例1：HBsAg抗体表达载体的构建

将HindIII酶切位点、Kozak序列、分泌信号肽基因和HBsAg抗体重链编码基因(包括VH氨基酸序列的编码基因和人源IgG1的恒定区编码基因)、终止码和EcoRI编码基因依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.1(+)(购自Invitrogen Corportation，货号V790-20)中并测序验证，得到用于HBsAg抗体重链的表达质粒pCDNA3.1(+)-DH。

将HindIII酶切位点、Kozak序列、分泌信号肽基因和HBsAg轻链编码基因(包括VL氨基酸序列的编码基因和κ链恒定区的编码基因)、终止码和EcoRI编码基因依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.1(+)中并测序验证，得到用于抗体轻链的表达质粒pCDNA3.1(+)-DL。

其中，VH的氨基酸序列为：Z₁Z₂Z₃LZ₄Z₅SGAEVKKPGASZ₆KVSCKASX₁YX₃FX₅X₆X₇YZ₇HWVRQAPGQGZ₈EWMGWX₁₁NX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈ NYAQKFQGRVTZ₉TZ₁₀DZ₁₁SZ₁₂STAYMELSZ₁₃LRSZ₁₄DTAVYYCA RDX₂₁WX₂₃X₂₄X₂₅X₂₆DX₂₈YGMDX₃₃ WGZ₁₅GTZ₁₆VTVSS(SEQ ID NO：47)；

VL的氨基酸序列为：Z₁₇Z₁₈Z₁₉LTQSPZ₂₀Z₂₁LSZ₂₂SZ₂₃GZ₂₄RZ₂₅TZ₂₆Z₂₇CRASX₃₄X₃₅X₃₆SX₃ ₈X₃₉ LZ₂₈WYQQKPGZ₂₉APZ₃₀LLIZ₃₁ X₄₀X₄₁X₄₂ Z₃₂Z₃₃Z₃₄Z₃₅GZ₃₆PZ₃₇RFSGSGSGTZ₃₈FTLTIZ₃₉SLZ₄₀Z₄₁Z₄₂DZ₄₃ATYYCQQSYSTPLX₅₁ FGZ₄₄GTZ₄₅Z₄₆Z₄₇IKR(SEQ ID NO：48)

其中下划线部分为CDR，无下划线部分为FR，Xn和Zn(n指代任一整数角标)可选自任意氨基酸。

本申请实施例中测试的HBsAg抗体中，编号分别为021、021-M1、021-M3、021-M5、021-M6、021-M7、021-M11、021-M13、021-M14、021-M15、021-M16、021-M17、021-M18、021-M21、021-M23、021-M24、021-M25、021-M26、021-M28、021-M33、021-M34、021-M35、021-M36、021-M38、021-M39、021-M40、021-M41、021-M42、021-M51的抗体，其Zn和Xn的取值分别如下表7(Zn)和发明概述中的表3(Xn)所示：

表7：

编号分别为005、062、079、083、088、090、091、093、095、096的抗体，其Xn和Zn的取值分别如发明概述中的表3(Xn)和表6(Zn)所示。其具体的VH和VL序列分别为：

VH序列：

021及079：QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)

005、095、096：EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGQGTMVTVSS(SEQ IDNO：2)

062：EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)

088：QITLKESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFIGYYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPYNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)

090、091、093：EVQLVQSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGPEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDLWNDDVDYYGMDVWGKGTMVTVSS(SEQ IDNO：5)

083：EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDVWQQGGYYYYMDVWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)

VL序列：

021、083：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKR(SEQ ID NO：7)

005、062、079、088：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：8)

090：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFATYYCQQSYSTPLTFGPGTKVEIKR(SEQ ID NO：9)

091：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVDIKR(SEQ ID NO：10)

093：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTIRSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：11)

095：DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLISAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPGDLATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：12)

096：ETTLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPQLLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTRLEIKR(SEQ ID NO：13)

其中，上述抗体VH和VL与CDR序列的对应关系如下表8所示：

实施例2：抗HBsAg抗体的表达和纯化

使用实施例1所述的表达质粒pCDNA3.1(+)-DH和pCDNA3.1(+)-DL，通过真核表达细胞FreeStyle^TM 293-F Cells(Invitrogen Corporation,R790-07)表达目的抗体。按照FreeStyle^TM 293ExpressionSystem操作手册，在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x10⁶个/毫升。在质粒转染当天，将质粒按照重链与轻链对应的关系组合(即同一编号抗体的轻链与抗体重链组合)后，与转染试剂混合，加入细胞培养基中。37℃，8％CO2持续培养5-7天后，收集细胞培养上清进行抗体纯化。

表达上清用0.22μM滤膜过滤，利用Mabpurix亲和层析柱(购自Sepax公司，65008)从表达上清中捕获表达抗体，用平衡缓冲液(120mM Tris+100mM NaCl,pH7.5)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(0.15M冰醋酸，pH2.8)洗脱。纯化后的抗体进行SDS PAGE、SEC检测，纯度在95％以上。

可以看出，实施例所用抗体中各Xn和各Zn选用的氨基酸各不相同，因此这些抗体可用于测试上述VH及VL序列通式在Xn和/或Zn参数取值改变时，导致的抗体特异性结合抗原的亲和力的变化。

实施例3：抗原结合亲和力测定

HBsAg蛋白(20μg/ml，由申请人自行分离，其包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列)包被酶标板，100μl/孔，贴封板膜，于4℃过夜，并用洗涤液PBST(0.5‰吐温的PBS)洗板3次，10％牛血清白蛋白溶液(使用洗涤液PBST配置)进行封闭，置以200μl/孔加至酶标板内，37℃孵育2小时。以洗涤液PBST(0.5‰吐温的PBS)洗板3次，100μl/孔加入梯度稀释的待测抗体(20、4、0.8、0.16、0.032、0.064、0.00128、0.00256mg/mL共8个梯度)，并设置系统空白对照，于37℃孵育2小时。使用洗涤液PBST(0.5‰吐温的PBS)洗板3次，加入二抗(1:10000稀释，Jackson ImmunoResearch)，以100μl/孔加至酶标板内，37℃孵育1小时。最后，使用洗涤液PBST(0.5‰吐温的PBS)洗板5次，以100μl/孔加入TMB显色液，置室温避光反应

分钟，加入等体积终止液终止显色反应，使用酶标仪在波长450mn处测定吸光度(OD值)，当与抗原结合的OD值大于0.1时，通常认为抗体在该相应浓度下可检测到结合。

MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYIHHHHHH(SEQ ID NO：16)

测定仪HBsAg抗原结合活性，以酶标仪在波长450mn处测定吸光度(OD值)表示，各抗体稀释浓度均为20、4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128、0.000256μg/mL共8个浓度梯度，每个抗体均检测到OD值小于0.05(通常认为是相当于空白板，没有结合活性)，当抗体与抗原结合的OD值大于0.1时，通常认为抗体在该相应浓度下可检测到结合，抗体021在0.16μg/mL浓度下其与抗原结合的OD值大于0.1，以抗体021为基准，将其活性定义为“++++”等级，取其它抗体在稀释浓度为4μg/mL的相应OD值与021抗体在4μg/mL的相应OD值的比值，当比值大于1.1时，将其活性定义为“+++++”等级，当比值介于0.8至1.1之间时，将其活性定义为“++++”等级，当比值介于0.6至0.8时，将其活性定义为“+++”等级，当比值介于0.4至0.6时，将其活性定义为“++”等级，当比值介于0.2至0.4时，将其活性定义为“+”等级，当比值小于0.2时，认为没有结合活性。

经测试，各测试抗体的亲和力如下表9所示：

表9：

该结果表明本申请的抗体具有良好的特异性结合HBsAg的能力。

021、021-M1、021-M3、021-M5、021-M6、021-M7、021-M11、021-M13、021-M14、021-M15、021-M16、021-M17、021-M18、021-M21、021-M23、021-M24、021-M25、021-M26、021-M28、021-M33、021-M34、021-M35、021-M36、021-M38、021-M39、021-M40、021-M41、021-M42、021-M51具有相同的FR区域，但各CDR中Xn位置处选取的氨基酸不相同，说明本申请提供的抗体在CDR区特定位置上的氨基酸替换仍然能够使抗体保持特异性识别HBsAg的能力。

而对于编号分别为005、062、079、083、088、090、091、093、095、096的抗体，其在具有本申请所述的CDR，和不同FR区的情况下，可特异性识别HBsAg，进一步证明了本申请所述CDR特异性识别并结合HBsAg抗原的能力。此外，我们也为所述CDR区匹配了合适的FR，在Zn取值不同的情况下，所述FR可依然维持本申请抗体CDR构象，使所述抗体特异性识别HBsAg。

实施例4体内药效试验

本实验中，抗体的恒定区选用鼠源IgG1。

动物：

雄性C57BL/6小鼠，5周龄，无特定病原体，购于上海斯莱克实验动物有限公司，并饲养于独立通风笼盒中。小鼠的饲养及使用药明康德IACUC批准的实验方案(IACUC#:ID01-013-2020v1.0)。小鼠度过4天的环境适应期后注射AAV/HBV病毒(即包含D型HBV全套基因组的AAV重组病毒rAAV8-1.3HBV，在本文中“AAV/HBV病毒”与“rAAV8-1.3HBV”可互换使用)

溶剂：PBS。

受试化合物：抗体005，抗体062，抗体079，抗体083，剂量：12mpk。

重组rAAV8-1.3HBV：rAAV8-1.3HBV(D型，ayw)由药明康德提供，批号为awy1-P4-200102，1×10¹²病毒基因组(v.g.)/mL。实验前用无菌PBS稀释至5×10¹¹v.g./mL。每只小鼠注射200μL，即每只小鼠注射1×10¹¹v.g.。

试验方法：

AAV/HBV小鼠模型建立

AAV/HBV注射.rAAV8-1.3HBV在注射前预先用无菌PBS配制成浓度为1×10¹¹v.g./200μL溶液。32只小鼠经尾静脉注射200μL rAAV8-1.3HBV溶液。

分组前采血.病毒注射后第14、21和35天，所有感染的小鼠通过颌下静脉采血～100μL用于收集血浆。采集的静脉血用K2-EDTA抗凝，在4℃，7000g/min条件下离心10分钟并收集血浆。血浆通过qPCR检测HBV DNA，通过ELISA检测HBsAg。血浆样本保存于-80℃直到送至药明康德生物部体外实验室检测相关项目。

第一次给药记为第0天，感染后第45天即第0天。根据病毒注射后第14、21和35天采集的血浆HBV DNA和HBsAg水平对小鼠进行分组，从20只小鼠中挑选16只正式实验用的小鼠，随机分为五组，标记为第一组到第五组，第一组小鼠数量为4，其余组小鼠数量为3。所有小鼠通过尾静脉注射PBS或测试抗体，12mpk，给药一次。所有小鼠给药前称量体重。

采血：

给药后第-1、1、3、5、7、10、14和17天，所有小鼠通过颌下静脉采血，收集血浆，用于检测HBV DNA和HBsAg。

实验终点：测试部分：给药后第22天测试组所有小鼠安乐死。

体重记录：体内实验过程中，每天观察小鼠状态，并在感染当天，给药和采血当天记录小鼠体重。

样品保存和转移.所有血浆样品置于-80℃保存，并用干冰转移至药明康德生物部体外实验室进行相应检测。

定量PCR检测小鼠血浆中HBV DNA含量.提取血浆中DNA，实验步骤参照QIAamp96DNA Blood Kit说明书。定量PCR检测小鼠血浆中HBV DNA的含量。方法简述如下：

配制qPCR反应混合液(Taqman Universal Master Mix(2X))，加入样品和标准品，进行PCR反应。反应条件：95℃，10分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40个循环。

ELISA检测小鼠血浆中HBsAg的含量.实验步骤参照HBsAg ELISA(安图生物，CL0310)试剂盒说明书。方法简述如下：将血浆样品稀释2、10、20或600倍，加入包被板中，与酶结合物共同温育(37℃，60分钟)，重复洗板5次，加入发光底物，室温避光反应10分钟，用酶标仪检测发光强度。

(抗体005、072、079及083，剂量12mpk)在AAV/HBV小鼠模型中对HBV复制的抑制活性通过检测小鼠血浆中HBV DNA含量和HBsAg的表达来进行评价结果如图1及图2所示。

结果如下：

1)受试化合物对AAV/HBV小鼠血浆HBV DNA的影响

溶剂组(组1PBS)小鼠血浆HBV DNA含量在实验中保持相对稳定，在5.31–5.74log10 copy/μL间波动(波动不超过0.43log10 copy/μL)，与溶剂组相比，治疗组组2(抗体005，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低2.69log10 copy/μL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.65 log10copy/μL；治疗组组3(抗体062，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低2.81log10 copy/μL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.45 log10 copy/μL；治疗组组4(抗体079，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低2.68log10 copy/μL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.59 log10 copy/μL；治疗组组5(抗体083，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低0.78log10 copy/μL(p<0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.36log₁₀copy/μL。

2)受试化合物对AAV/HBV小鼠血浆HBsAg的影响

溶剂组(组1)小鼠血浆HBsAg含量在实验中保持相对稳定，在4.65–5.27 log10IU/mL间波动(波动不超过0.62 log10 IU/mL)；与溶剂组相比，治疗组组2(抗体005，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低2.73log10 IU/mL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.87log10 IU/mL；治疗组组3(抗体062，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低2.95 log10 IU/mL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.78 log10 IU/mL；治疗组组4(抗体079，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低2.80log10 IU/mL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.79 log10 IU/mL；治疗组组5(抗体083，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低1.10 log10 IU/mL(p<0.01)，到第3天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.93 log10 IU/mL。

实施例5抗体005、021、062及088体内活性测定

实验方案同实施例4，分5组，每组小鼠4只，所用IgG1为鼠源IgG1。测试结果显示于图3及图4中。具体结果如下：

1)各组小鼠血浆HBV DNA的含量。

溶剂组(组1)小鼠血浆HBV DNA含量在实验中保持相对稳定，在5.21–6.06 log10copy/μL间波动(波动不超过0.85 log10 copy/μL)；与溶剂组相比，治疗组组2(抗体005，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低2.43 log10 copy/μL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.49log10 copy/μL；治疗组组3(抗体021，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低2.44log10 copy/μL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第14天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.81log10 copy/μL；治疗组组4(抗体062，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天均显著降低，平均降低2.51log10 copy/μL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，在第10升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA为5.55log10 copy/μL；治疗组组5(抗体088，12mpk)小鼠血浆HBV DNA在给药后第1天即显著降低，平均降低2.17log10copy/μL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第7天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBVDNA为5.59log10 copy/μL。

2)各组小鼠血浆HBsAg的含量。

溶剂组(组1)小鼠血浆HBsAg含量在实验中保持相对稳定，在4.74–5.11log10 IU/mL间波动(波动不超过0.37log10 IU/mL)；与溶剂组相比，治疗组组2(抗体005m，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低2.74log10 IU/mL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第10天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.75log10 IU/mL；治疗组组3(抗体021，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低2.38log10 IU/mL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第17天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.98log10 IU/mL；治疗组组4(抗体062，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低2.41和2.60log10 IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，在第14升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.95log10 IU/mL；治疗组组5(抗体088，12mpk)小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低2.19log10 IU/mL(p<0.01)，随后呈现逐步回升趋势，到第5天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsA g为5.14log10 IU/mL。

实施例6抗体021 090-097体内实验

实验方法同实施例4，模型小鼠分8组，每组4只，所用IgG1均为人源IgG1。即所述抗体的重链及轻链恒定区如下所示：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：14)

及

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：15)

除组8为腹腔注射抗体021(剂量12mpk)以外，其余各组小鼠均通过尾静脉注射PBS或测试抗体(抗体021，抗体090，抗体091，抗体093，抗体095，抗体096，12mpk)，各组均给药一次，溶剂组注射给与等量PBS。测试结果如图5和图6所示。具体如下：

溶剂组(组1)小鼠血浆HBV DNA和HBsAg含量在实验中保持相对稳定，分别在4.36–4.80log10 copy/μL和4.44–4.70log10 IU/mL间波动(波动不超过0.44log10 copy/μL和0.26log10 IU/mL)；与溶剂组相比，治疗组组2(抗体090，12mpk，IV)小鼠血浆HBV DNA和HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低1.33log10 copy/μL(p<0.01)和0.81log10IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，分别到第11天和第14天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA和HBsAg分别为4.80log10 copy/μL和4.66log10 IU/mL；治疗组组3(抗体091，12mpk，IV)小鼠血浆HBV DNA和HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低1.12log10 copy/μL(p<0.01)和0.93log10 IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，分别到第7天和第11天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA和HBsAg分别为4.57log10copy/μL和4.88log10 IU/mL；治疗组组4(抗体093，12mpk，IV)小鼠血浆HBV DNA和HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低1.19log10 copy/μL(p<0.01)和1.46log10 IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，分别到第7天和第11天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA和HBsAg分别为4.52log10 copy/μL和4.90log10 IU/mL；治疗组组5(抗体021，12mpk，IV)小鼠血浆HBV DNA和HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低1.93log10copy/μL(p<0.01)和1.23log10 IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，分别到第18天和第11天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA和HBsAg分别为4.20log10 copy/μL和4.59log10 IU/mL；治疗组组6(抗体095，12mpk，IV)小鼠血浆HBV DNA和HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低2.04log10 copy/μL(p<0.01)和1.76log10 IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，到第11天均升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBV DNA和HBsAg分别为4.66log10 copy/μL和4.59log10 IU/mL；治疗组组7(抗体096，12mpk，IV)小鼠血浆HBVDNA和HBsAg在给药后第1天均显著降低，分别平均降低1.64log10 copy/μL(p<0.01)和1.22log10 IU/mL(p<0.01)，随后均呈现逐步回升趋势，小鼠血浆HBV DNA到第7天升接近溶剂组的水平，随后轻微波动并保持到实验终点，此时实验终点即给药第18天小鼠血浆HBVDNA为3.83log10 copy/μL。小鼠血浆HBsAg到第11天升至溶剂组水平，此时小鼠血浆HBsAg为4.62log10 IU/mL；与第-3天相比，治疗组组8(抗体021，12mpk，IP)小鼠血浆HBV DNA含量在给药后第1天下降了0.60log10 copy/μL，到第5天下降至LLOQ(量化下限)水平，随后在第11天恢复至第-3天水平，并在第11-18天在2.73-3.14log 10copy/μL间波动(波动不超过0.41log10 copy/μL)。小鼠血浆HBsAg在给药后第1天即显著降低，平均降低0.82log10 IU/mL，最大降低发生在第5天，平均降低1.22log10 IU/mL，随后在第11天恢复至第-3天水平，此时小鼠血浆HBsAg为3.94log10 IU/mL。

综上所述，从实施例4-6结果显示，所有本申请中的抗体，包括亲和力仅为++的062均可作为HBV的中和抗体，显著抑制HBV的增殖和降低HBsAg的表达。

实施例7多次给药实验

AAV/HBV小鼠模型建立同实施例4

模型小鼠分两组，分别为阳性对照组及抗体005组(采用鼠源IgG1)，每组4只，第一次给药计为第0天，以后每隔7天给药一次，给药7次，尾静脉注射给药，剂量为12mpk，阳性对照组给予10mL/kg的PBS溶液。

给药后第-25、-18、-11、-4、1、3、5、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、42、45、49和52天，所有小鼠通过颌下静脉采血，收集血浆，用于检测HBV DNA和HBsAg。

结果表明，小鼠血浆HBsAg在给药后第1天显著降低，平均降低1.61log 10IU/mL(p<0.01)，至第三天最低，平均降低约1.73log10 IU/mL(p<0.01)，在连续给药期间，从第0至52天，小鼠血浆HBsAg水平始终维持在低水平。该结果证明了本申请的抗体在长期使用的过程中，依然可以保持对HBV的良好抗性和治疗效果。并且，不超过每周一次的注射便可长期抑制病毒增殖。

序列表

<110> 北京凯因科技股份有限公司

<120> 结合乙型肝炎病毒表面抗原的抗体及其应用

<130> PE01582

<150> 202010659026.2

<151> 2020-07-09

<150> 202010659828.3

<151> 2020-07-10

<160> 48

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 021及079的VH

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Trp Asn Asp Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 005、095、096的VH

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Trp Asn Asp Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 062的VH

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Trp Asn Asp Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 088的VH

<400> 4

Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Gly Tyr

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Trp Asn Asp Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 090、091、093的VH

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Met Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Trp Asn Asp Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 083的VH

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Val Trp Gln Gln Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 021、083的VL

<400> 7

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 005、062、079、088的VL

<400> 8

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 9

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 090的VL

<400> 9

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 091的VL

<400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 11

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 093的VL

<400> 11

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 095的VL

<400> 12

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Gly Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 13

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 096的VL

<400> 13

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源IgG1重链恒定区

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 15

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源IgG1轻链恒定区

<400> 15

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 16

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HBsAg蛋白包含序列

<400> 16

Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys

35 40 45

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

85 90 95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

100 105 110

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

130 135 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145 150 155 160

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

165 170 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

180 185 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

195 200 205

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

210 215 220

Tyr Ile His His His His His His

225 230

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

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Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr Tyr

1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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1 5

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 23

Ala Arg Asp Leu Trp Asn Asp Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 24

Ala Arg Asp Val Trp Gln Gln Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

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Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 30

Asp Ala Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 31

Thr Ala Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

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<212> PRT

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 33

Xaa Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Tyr

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Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<400> 37

Xaa Xaa Xaa

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 39

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Xaa Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

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<400> 40

Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Xaa Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Trp

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<213> 人工序列

<220>

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<400> 41

Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa

1 5 10 15

Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Trp Gly Xaa Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 43

Xaa Xaa Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Xaa Gly

1 5 10 15

Xaa Arg Xaa Thr Xaa Xaa Cys Arg Ala Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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Leu Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Ala Pro Xaa Leu Leu Ile

1 5 10 15

Xaa

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LFR3

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<220>

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<222> (31)..(31)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Xaa Phe Thr Leu Thr Ile Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LFR4

<220>

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<221> misc_feature

<222> (6)..(8)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 46

Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 47

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222> (5)..(6)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<221> misc_feature

<222> (118)..(118)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 47

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Xaa Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Xaa Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Xaa Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Tyr Gly Met Asp Xaa

100 105 110

Trp Gly Xaa Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<220>

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<222> (1)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222> (9)..(10)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

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<222> (13)..(13)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222> (17)..(17)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222> (19)..(19)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222> (27)..(29)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(32)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222> (34)..(34)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

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<222> (49)..(56)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(60)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(76)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(81)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(83)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (97)..(97)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(105)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 48

Xaa Xaa Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Xaa Gly

1 5 10 15

Xaa Arg Xaa Thr Xaa Xaa Cys Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa

20 25 30

Leu Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Ala Pro Xaa Leu Leu Ile

35 40 45

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Thr Ile Xaa Ser Leu Xaa Xaa

65 70 75 80

Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Xaa Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Ile Lys Arg

100 105

Claims

1.一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)序列和轻链可变区(VL)序列，其中：

HCDR1:X1YX3FX5X6X7Y(SEQ ID NO：33)，

HCDR2：X11NX13X14X15X16X17X18(SEQ ID NO：34)，

HCDR3：ARDX21WX23X24X25X26DX28YGMDX33(SEQ ID NO：35)；

所述轻链可变区包含如下所示的CDR氨基酸序列：

LCDR1:X34X35X36SX38X39(SEQ ID NO：36)，

LCDR2：X40X41X42(SEQ ID NO：37)，

LCDR3：QQSYSTPLX51(SEQ ID NO：38)；

其中：

2.权利要求1的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，其中，所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：25所示的LCDR1；如SEQID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：20所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：24所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：25所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：18所示的HCDR1，如SEQ ID NO：22所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：28所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：27所示的LCDR1；如SEQ ID NO：29所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：27所示的LCDR1；如SEQ ID NO：30所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：19所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：30所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3；或

所述VH包含如下所示的互补决定区(CDR)氨基酸序列：如SEQ ID NO：17所示的HCDR1，如SEQ ID NO：21所示的HCDR2，如SEQ ID NO：23所示的HCDR3，且所述VL包含如SEQ ID NO：26所示的LCDR1；如SEQ ID NO：31所示的LCDR2，如SEQ ID NO：32所示的LCDR3。

3.权利要求1或2的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，包含人类通用框架区(FR)。

4.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-11中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。

5.一种构建体，其包含权利要求12中的核酸分子。

6.一种病毒、噬菌体或细胞，其表达权利要求1-11中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求12中的核酸或权利要求13或14中的构建体。

7.一种药物组合物，其包含：权利要求1-11中任一项的特异性结合HBs Ag的抗体或其抗原结合片段、权利要求12中的核酸、权利要求13或114中的构建体、或权利要求15中的病毒、噬菌体或细胞。

8.一种试剂盒，其包含：权利要求1-11中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、权利要求12中的核酸、权利要求13或14中的构建体、或权利要求15中的病毒、噬菌体或细胞。

9.一种治疗或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，或缓解乙型肝炎症状的方法，其包含向患者施用有效量的权利要求16中的药物组合物。

10.一种检测HBV的方法，包括使权利要求1-11中任一项的特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段、权利要求12中的核酸、权利要求13或14中的构建体、或权利要求15中的病毒、噬菌体或细胞与来自受试者的体液接触。