CN113906285A

CN113906285A - 采用膜荧光染色和光谱强度比进行抗生素敏感性快速检测的显微镜法

Info

Publication number: CN113906285A
Application number: CN202080040345.3A
Authority: CN
Inventors: 摩西·本-大卫
Original assignee: Pocared Diagnostics Ltd
Current assignee: Pocared Diagnostics Ltd
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2022-01-07
Also published as: WO2020250094A1; US20200393377A1; JP2022553589A; EP3983782A4; IL288854A; CA3142867A1; EP3983782A1

Abstract

单染料荧光染色、显微镜成像以及强度和光谱发射差异的组合允许确定使细菌失活所需的抗生素的最小浓度(最小抑制浓度(MIC))，从而为快速抗生素敏感性测试(AST)提供了一种手段。通过使用显微镜成像(例如共聚焦成像)，为临床医生提供了一种快速简便的方法来为患有细菌感染的患者(包括那些最终导致败血症的患者)确定合适的治疗方案。

Description

采用膜荧光染色和光谱强度比进行抗生素敏感性快速检测的显微镜法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2019年6月11日提交的第62/859890号美国临时专利申请和2020年6月2日提交的第16/890050号美国非临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

技术领域

快速可靠的诊断和治疗方法对于有效的患者护理至关重要。不幸的是，目前的抗菌药物敏感性测试技术通常需要事先通过培养分离微生物(例如，大约12至48小时)，然后再进行大约6至24小时的过程。例如，对感染类型的确诊传统上需要进行微生物分析，包括接种血液培养物、培养16-24小时、将致病微生物接种在固体培养基上、另一个培养期以及1-2天后的最终鉴定。即使立即积极治疗，这也会严重影响患者的预后，具体取决于感染类型，在某些情况下可能导致死亡。

在实施正确的治疗之前，每损失一个小时都会对患者的结果产生至关重要的差异。因此，医生确定何种抗生素对治疗有效是很重要的。鉴于目前的方法可能需要两天或更长的时间才能得出答案，因此迫切需要更快速的抗生素敏感性测试，最好是能够在抽取血样后仅数小时内确定特定抗生素敏感性的测试。例如，采集血样后1-3小时、1-5小时、1-10小时、24小时内或24小时后。在另一个例子中，在抽取血样并确定为细菌感染阳性后24小时。因此，这种类型的快速测试将允许医生从一开始就启动最佳药物治疗，而不是从次优或完全无效的抗生素开始，从而大大提高临床反应性。

细菌感染患者治疗中遇到的另一个问题是抗生素耐药性。当微生物(即细菌和/或细菌株)自发或通过基因转移获得基因突变，使其对一种或多种抗菌剂(即抗生素)的治疗产生耐药性时，产生抗菌(即抗菌)耐药性。耐药微生物可能对一线抗生素产生耐药性，因此需要使用微生物敏感的二线药物。在一些细菌菌株对多种药物产生耐药性的情况下，对二线甚至三线抗生素的耐药性依次获得。

抗性可能采取的形式是自发的或诱导的基因突变，或通过接合、转导或转化的水平基因转移从其他细菌物种获得抗性基因。许多抗生素耐药性基因存在于促进抗生素耐药性基因转移的可传播质粒上。抗生素耐药性质粒通常包含对几种不同的抗生素产生耐药性的基因。

临床实践中出现的抗生素耐药细菌感染的增加率源于人类和兽医药使用抗生素。任何抗生素的使用都会增加细菌种群的进化选择压力，使耐药细菌茁壮成长，非耐药细菌死亡。随着对抗生素的耐药性变得越来越普遍，对替代治疗的需求也越来越大。抗生素耐药性对公众健康构成了一个日益严重的全球性问题。随着越来越多的菌株对抗生素产生耐药性，需要药物帮助的个人无法获得他们所需要的适当治疗。

因此，除了确定适当的药物治疗外，确定要实施的药物治疗的浓度/剂量也是至关重要的。因此，本发明的目的是提供：1)快速确定微生物的抗生素敏感性，2)抑制微生物所需的最低浓度。

现有的抗生素敏感性测试(AST)技术是一个漫长的过程。总的来说，目前鉴定、分离和区分有无抗生素耐药基因的菌株的做法通常涉及微生物学实验室复杂而漫长的过程。在当前过程中，含有细菌的生物样品首先被接受进入实验室。诸如BD Phoenix和BiomeriexVitex 2系统的系统可用于以本领域已知的方式检测细菌菌株。在另一个过程中，生物样品然后在含有营养丰富的培养基(例如溶源性肉汤或任何其他合适的肉汤)的琼脂平板上使用灭菌环进行划线。这个琼脂培养皿中含有用抗生素处理过的斑点。在平板上划线后，将琼脂平板置于专用培养箱中至少12小时。然后定期检查琼脂平板的菌落生长情况。如本领域普通技术人员所理解的，如果生物样品含有细菌，则预期细菌菌落生长在不含抗生素的斑点上。如果细菌没有获得抗生素抗性基因，那么含有抗生素的斑点就不会生长。然而，如果该菌株获得了抗生素耐药基因，则在使用抗生素处理的斑点上会出现菌落生长。例如，参见美国专利申请公开号2008/0220465。

在另一个过程中，生物样品在收集后进行分类、标记，然后使用灭菌环接种到含有血琼脂培养基的玻璃圆底试管或任何其他合适的营养丰富的生长培养基(例如溶源性肉汤)中。然后将标本插入培养箱中12至24小时。然后观察样品并筛选阳性(即含细菌)和阴性(即不含细菌)培养物。对似乎含有阳性培养物的样品进行处理，以便将细菌分离并悬浮在生化液体中。该过程涉及悬浮、稀释、涡流和浊度测量，从而产生生化废物。然后对培养物进行物种鉴定和抗生素敏感性试验，将细菌悬浮液暴露于多种试剂中。在另外6至24小时的温育期后，实验室技术人员将解释和报告研究结果。整个过程通常需要至少11个或更多个步骤和至少50个小时才能获得试样结果，并且该过程是劳动密集型的。

区分和鉴定细菌种类和/或菌株的其他过程涉及各种核酸测序方法。简单地说，DNA测序是确定DNA分子内核苷酸的精确顺序的过程。它包括用于确定DNA链中四种碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)顺序的任何方法或技术。在这些方法中，一旦获得生物样品，首先需要扩增生物样品中包含的细菌。换句话说，首先收集生物样品，然后将其用于接种合适的细菌生长培养基(例如血液生长培养基或溶源性肉汤)。然后在适当条件下培养接种样品12-24小时。生长后，将细菌细胞从培养基中制成颗粒、裂解并处理以提取细菌DNA。然后将细菌DNA清洗、纯化并放入DNA测序仪中。细菌的生长和细菌DNA的分离不仅需要试剂，而且会产生生物废料，而且是一个耗时的过程。此外，核酸测序方法需要使用引物序列。引物是一条短的核酸序列链(通常约10个碱基对)，作为DNA合成的起点。这是DNA复制所必需的，因为催化这一过程的酶(DNA聚合酶)只能向现有的DNA链中添加新的核苷酸。由于需要引物序列，这种方法还需要对菌株类型的一些最低限度的了解。如前所述，测序还可能耗时且昂贵。

一旦确定了这种微生物，患者就会接受抗生素治疗。在某些情况下，由于多种原因(例如抗生素耐药性)，初始浓度/剂量可能无效。因此，当患者以正确的剂量接受适当的抗生素时，预后可能会受到显著阻碍。

因此，鉴于上述情况，需要一种快速的抗菌敏感性测试方法，以便快速向需要该方法的患者提供有效治疗。

发明内容

本发明提供了一种确定样品中一种或多种细菌的最小抑制浓度(MIC)的方法。该方法包括：在多个容器中制备多个细菌悬浮液；向多个细菌悬浮液中的两个或多个添加不同量的抗菌剂，从而产生包含细菌和抗菌剂的组合的多个悬浮液；将包含细菌和抗菌剂组合的多个悬浮液在适当温度下温育适当时间，以产生包含细菌和抗菌剂组合的多个温育悬浮液；向多个温育悬浮液中添加单一膜相关染料；用针对所述染料的一个或多个激发波长的光照射包含染料的温育悬浮液；获得在染料的两个发射波长处的包含染料的温育悬浮液的显微图像(例如，在第一发射波长处的第一图像和在第二发射波长处的第二图像)；使用至少一个处理器确定每个图像中单个细菌细胞在染料的两个发射波长处的发射光强度；使用至少一个处理器，基于每个图像中单个细菌细胞在染料的两个发射波长处发射光的SIR(光谱强度比)，确定样品中细菌的MIC。上述任何一项都可以是计算机实现和/或自动化的。

以下编号的条款描述了本发明的各种实施方式或方面：

条款1.一种确定样品中一种或多种细菌的最小抑制浓度(MIC)的方法，包括：

在多个容器中制备多个细菌悬浮液；

向所述多个细菌悬浮液中的两个或多个添加不同量的抗菌剂，从而产生包含细菌和抗菌剂组合的多个悬浮液，

将所述包含细菌和抗菌剂组合的多个悬浮液在适当温度下温育适当时间，以产生包含细菌和抗菌剂组合的多个温育悬浮液；

向所述多个温育悬浮液中添加单一膜相关染料；

用针对所述染料的一个或多个激发波长的光照射包含所述染料的温育悬浮液；

在染料的两个发射波长处获得所述包含染料的温育悬浮液的显微图像；

使用至少一个处理器确定每个图像中单个细菌细胞在染料的两个发射波长处的发射光强度；

使用至少一个处理器，基于所述每个图像中单个细菌细胞在染料的两个发射波长处的发射光的相对强度，确定所述样品中细菌的MIC。

条款2.根据条款1所述的方法，其中所述MIC通过以下方式确定：

根据所述每个图像中单个细菌细胞在染料的两个发射波长处的发射光强度，确定每个温育悬浮液的光谱强度比；和

根据光谱强度比或光谱死活比(SDL)确定作为抗菌剂浓度的函数的MIC。

条款3.根据条款1所述的方法，其中使用阶跃函数确定MIC。

条款4.根据条款1所述的方法，其中使用阶跃函数确定MIC，阶跃函数的形式为：

其中a是比例参数，b确定阶跃斜率，并且c是MIC值。

条款5.根据条款1所述的方法，其中使用阶跃函数确定MIC，所述阶跃函数的形式为：

y(x)＝a·tanh[b(x-c)]，其中a是比例因子，b确定阶跃函数斜率，并且c是MIC；或

y(x)＝a·atan[b(x-c)]，其中a是比例因子，b确定阶跃函数斜率，并且c是MIC。

条款6.根据条款2所述的方法，还包括，使用至少一个处理器：

根据所述每个图像中单个细菌细胞在染料的两个发射波长处的发射光强度，确定每个悬浮液中细菌细胞的死/活(D/L)比；

通过获取所述光谱强度比以及将它们与D/L比相乘，计算光谱死活比(SDL)值；以及

根据所述SDL确定作为抗菌剂浓度的函数的MIC。

条款7.根据条款6所述的方法，其中所述MIC通过绘制SDL作为抗菌剂浓度的函数来确定。

条款8.根据条款6所述的方法，其中所述MIC是所述SDL的一阶导数或二阶导数。

条款9.根据条款1-8中任一项所述的方法，其中所述图像是使用共焦显微镜获得的。

条款10.根据条款1-9中任一项所述的方法，其中所述单一膜相关染料是苯乙烯基染料或菁染料。

条款11.根据条款1-9中任一项所述的方法，其中所述单一膜相关染料是N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴盐或N-(3-三乙基氨丙基)-4-(6-(4-(二乙氨基)苯基)己三烯基)吡啶二溴盐。

条款12.根据条款1-11中任一项所述的方法，其中所述激发波长是在360nm至570nm范围内选择的波长。

条款13.根据条款1-12中任一项所述的方法，其中所述发射波长是520nm至850nm范围的波长。

条款14.根据条款1-13中任一项所述的方法，其中所述样品是体液。

条款15.根据条款14条所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清或尿液。

条款16.根据条款1-13中任一项所述的方法，其中所述样品是临床分离物。

条款17.根据条款1-16中任一项所述的方法，其中适当的温育温度为35℃至40℃。

条款18.根据条款1-17中任一项所述的方法，其中适当的温育时间段是30分钟至5小时。

条款19.根据条款1-18中任一项所述的方法，其中不同浓度的抗菌剂通过连续稀释制备。

条款20.根据条款1-19中任一项所述的方法，其中将所述样品中的细菌浓缩并稀释至固定的细菌浓度，以在多个容器中制备多个细菌悬浮液。

条款21.根据条款20所述的方法，其中通过离心或过滤浓缩所述样品中的细菌。

条款22.根据条款20所述的方法，其中所述细菌在液体生长培养基中稀释。

条款23.根据条款1-22中任一项所述的方法，其进一步包括在向所述多个细菌悬浮液中的两个或多个添加不同量的抗菌剂后，移除所述包含细菌和抗菌剂组合的多个温育悬浮液中的每一个的一部分，并将移除的每一部分放置在新容器中。

条款24.根据条款1-23中任一项所述的方法，还包括在用染料的一个或多个激发波长的光照射包含染料的温育悬浮液之前，确定样品中一种或多种细菌的革兰氏类型。

附图说明

图1是显示本申请所述方法和系统的总体工艺流程的流程图。

图2提供了大肠杆菌细胞的显微照片，分别带有绿色滤光片(530nm，左)和红色滤光片(610nm，右)。

图3提供了显示SIR作为InCell测量(顶部)和流式细胞仪测量(底部)的抗生素浓度函数的曲线图。

图4提供了显示四种抗菌剂浓度下样品图像在红色波长(610nm)下的荧光强度与绿色波长(530nm)下的荧光强度的散点图。

具体实施方式

以下描述在本质上仅是示例性的，并不打算限制本发明、其应用或用途。虽然描述旨在允许本领域普通技术人员制造和使用本发明，并且为此目的提供了具体实施例，但它们不应被认为是限制性的。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，对以下内容的各种修改将落入所附权利要求的范围。本发明不应被视为限于本发明公开的方面，无论是在本发明的实施例中还是在本发明的其他地方提供的。

除非另有明确说明，否则本申请中规定的各种范围内数值的使用均表示为近似值，就好像所述范围内的最小值和最大值前面都有“约”一词，高于和低于所述范围的微小变化可用于实现与范围内的值基本相同的结果。此外，除非另有说明，否则范围的披露旨在作为一个连续范围，包括最小值和最大值之间的每个值。如本文所用，“一(a)”和“一(an)”指一个或多个。

如本文所用，术语“包括(comprising)”、“包括(comprise)”或“包括(comprised)”及其变体是开放式的，不排除存在未标识的其他元素。相反，术语“由……组成(consistingof)”及其变体旨在封闭，并排除除微量以外的任何其他元素。

如本文所用，术语“患者”或“受试者”指动物界的成员，包括但不限于人类，“哺乳动物”指所有哺乳动物，包括但不限于人类。

如本文所用，术语“样品”指待测试或分析的材料。样品含有细菌，并且可从各种来源获得。例如，待分析的样品可以是液体、半液体或干样品。样品可从饮用水、食品或饮料、药品、个人护理产品或体液中获得。样品可从市政供水系统、水井、饮用水、废水、自然水源、休闲用水或土壤中获取。在不同实施方式中，样品从医疗设备获得。医疗设备的示例包括但不限于植入物、贴片和心脏瓣膜。在其他情况下，可从体液中获取样品。这些可能包括，但不限于，血液或血浆、唾液、尿液、咽喉样品或胃肠液(也可称为“生物样品”)。“样品”也可指临床分离物。在某些情况下，临床分离物可以指从体液中分离并通过适当的实验室手段储存的细菌。一般来说，临床分离物是指分离的细菌。因此，简单地说，“样品”一词最广泛地是指细菌的存在(或推测存在)。在某些情况下，样品可以是从来源(如临床分离物)分离的细菌，而在其他情况下，样品可以指携带细菌/微生物剂的物质(如血液、尿液、水等)。

如本文所用，术语“细菌”(细菌(bacterial)或细菌(bacterium))和“微生物”(微生物的)指的是同一事物。也就是说，它们是指单细胞、原核微生物，它们很小，通常呈杆状或球菌状，并且可能是致病的。引起疾病的细菌通常用抗生素治疗。此外，“细菌株”或“细菌分离物”指的是同一事物。此外，如本文所述，“临床分离物”指与“细菌分离物”相同的事物。即，菌株/分离物是细菌的遗传变体或亚型。换句话说，一种细菌种类可能包含几种不同的菌株。菌株基于基因突变而不同，例如通过获得额外的基因，例如抗生素抗性基因等。本领域的普通技术人员将理解这些术语。

如本文所使用的，术语“抗菌的”和“抗微生物的”指的是同一事物。也就是说，它们是指能够杀死和/或使细菌或微生物失活的任何东西。

如本文所用，“活细胞”、“活细菌”或“活性细菌”指具有生长和分裂潜能的细菌细胞。“死的”和“灭活的”交替使用来指代死的细菌细胞。

如本文所用，伤口、缺损、感染等的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指通过任何合适的给药方案、程序和/或给药途径，向患者施用有效且目的在于达到理想临床/医学终点的量的组合物、装置或结构，包括吸引祖细胞、愈合伤口、纠正缺陷等。

如本文所用，“给药方案”是指每单位时间内特定浓度的治疗剂剂量表，包括两次给药之间的时间(例如，每6小时)或给药时间(例如，每天上午8点和下午4点)以及在每个特定时间给予的药物的剂量(即浓度)指。

“治疗有效量”是指是指在必要的剂量和时间段内有效实现希望的治疗结果的量。用于治疗病症的“有效量”是有效实现可确定终点的活性剂或剂型的量，例如本文所述的团聚体组合物。“有效量”最好是安全的-至少在某种程度上，治疗的益处超过损害和/或损害是普通技术人员和/或适当的管理机构(例如美国食品和药物管理局)可接受的。治疗有效量的药物或给药方案可根据诸如疾病状态、年龄、性别、个体体重以及药物或给药方案在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是指药物或给药方案的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现理想的预防结果的量。通常，由于在疾病之前或疾病的早期阶段在受试者中使用预防剂量，预防的有效量可小于治疗的有效量。

可调整给药方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以随时间分次施用，或者可以连续或以脉冲方式施用，并且以固定间隔施用组合物，例如，每10、15、20、30、45、60、90或120分钟，每天每2到12小时施用一次剂量或部分剂量，或每隔一天等，剂量可根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加。在某些情况下，为了便于施用和剂量均匀性，以剂量单位形式配制肠外组合物可能特别有利。本发明的剂量单位形式的说明书直接取决于(a)活性化合物的独特特性以及要达到的特定治疗或预防效果和(b)混配此类活性化合物用于治疗个体敏感性的技术中固有的局限性。

在一些情况下，如本文所述，给药方案可能意味着向有需要的患者施用一种或多种抗生素以及特定浓度，并且在特定时间施用。

荧光光谱在化学和生物化学中已被广泛应用于分子结构和功能的研究。然而，它在微生物鉴定和表征方面的有效性直到最近二十年才得到认可。

可见光是通常在380nm到780nm波长范围内的电磁辐射，“绿光”通常在475nm至570nm的波长范围内，例如从500nm至565nm，或者，例如，530nm，“红光”通常在590nm至780nm的波长范围内，或者，例如，610nm。

简单地说，如本领域普通技术人员所理解的，荧光光谱是指分析来自样品的荧光的一类电磁光谱。它包括使用一束光(例如紫外线)，激发某些化合物荧光分子中的电子并使它们发光；通常(但不一定)是可见光。在激发荧光分子(例如荧光染料)的波长内的光具有荧光分子的激发光谱内的激发频率(λ_ex)。在荧光分子激发时产生的波长范围内的光在荧光染料的发射光谱内具有发射频率(λ_em)。

“成像”是指获得样品的一个或多个图像，例如显微图像，其中单个细胞可通过视觉或任何合适的图像分析、计算机程序、过程、软件、应用程序、算法、模块等进行区分。可以在一个或多个特定波长处(例如通过使用光学或数字滤波器)获得图像，或者在广泛的波长范围(包括例如红光和绿光)上获得图像。数字图像可以通过任何有用的方法和设备获得。有两种类型的传感器广为人知，用于数字成像；电荷耦合器件(CCD)和互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。可以如本文所述使用商业或专有软件处理图像。图像可以在不同波长下连续拍摄，例如使用不同的光学或数字滤波。

成像可以在显微镜载玻片中进行，任选地包括用于转移固定体积的孵育细胞的孔。众所周知，多孔板可用于高通量筛选。例如，用于使用荧光显微镜进行高含量筛选的96孔微孔板包括光学透明的孔底，例如聚苯乙烯、环烯烃共聚物或玻璃底，例如具有平坦、光学透明玻璃底的

HCS玻璃底微孔板。

在一个实施方式中，光学滤波器用于在有限光谱上获得图像，例如在本文所述荧光染料的发射光谱内，例如在500nm至780nm范围内，或在绿色波长(例如从500nm至565nm，或530nm)和红色波长(例如从590至780nm，例如610nm)处。在另一个实施方式中，连续拍摄两个图像，其中对第一个图像进行数字滤波以产生绿色图像，对第二个图像进行数字滤波以获得红色图像，反之亦然。以这种方式，可以快速连续地获得两个图像，或者使用具有不同滤光片的两个相机来获得两个图像，从而减少图像之间的细菌移位，并且可以微调所获得图像的波长以获得最大分辨率。普通技术人员可以选择合适的方法来确定不同波长图像中单个细菌的光谱强度，包括选择光学和处理算法。

图像处理可包括过程或算法以识别、勾勒或以其他方式区分并任选地定位图像中的单个细胞，例如，与背景相比由增加的强度或亮度或不同颜色来定义，并以任何有用的方式量化荧光发射的强度。在广谱图像中，可以定位单个细胞，以确保从单个细胞获得红光和绿光波长的发射强度。在不同时间获得红色和绿色图像的情况下，单个细胞可以移动，因此，单个细胞的移动和定位/跟踪可能更困难，但是可以使用合适的方法和跟踪算法来跟踪单个细胞。

在一个实施方式中，激光共焦成像设备用于获得细菌培养物的一个或多个图像。该装置以激光的形式产生光，在本文所述分析中使用的染料的激发光谱内发射。例如，对于Synaptogreen或FM 1-43，合适的激发波长为480nm。在一个实施方式中，绿色光学滤波器(例如光学带通滤波器)插入到样品和成像传感器之间，通过例如从500nm到565nm范围内的光，例如530nm。一旦获得“绿色”图像，移除绿色光学滤波器并由“红色”光学滤波器代替，将橙色光传递到在例如从590至780nm的范围内(例如610nm)的红色光。在另一个实施方式中，可以使用2个相机同时拍摄图像，每个相机具有不同的滤波器。成像系统不限于共焦成像，可以使用其他显微成像系统，例如其他光学或无透镜显微成像系统。

本文提供了利用荧光光谱的方法，该方法允许检测活细菌(与死细菌相比)，并进一步允许确定抗生素抑制细菌活性所需的最小浓度。

具体而言，本文提供一种用于确定给药方案的有效性和确定给药方案的最小抑制浓度(MIC)的方法。一般而言，该方法包括：获得含有细菌的样品；准备一组容器，例如装有样品的试管或96孔板(第一容器)；以及在适当温度(例如30℃至50℃之间、35℃至40℃之间或37℃左右)下将含有一系列不同浓度(例如通过连续稀释)抗菌剂的样品的容器(例如试管或平板)温育给定时间(例如，30分钟至5小时之间或2小时至4小时之间)。温育后，可将所有或部分温育样品转移至成像兼容容器(例如光学杯、反应杯)或多孔培养皿的孔(第二或新容器)中。向细菌中添加合适的荧光染料，并对细菌进行光学分析，其中光学分析包括显微镜或显微镜荧光成像系统(例如基于激光的共焦成像平台)，并且其中光学分析包括通过用光(电磁辐射)在染料的一个或多个激发波长处照射样品激发流体样品，在显微镜中对样品成像；确定在至少两个电磁辐射波长的发射强度比，从而确定光谱强度比(SIR)以及活细菌与死细菌的比率；并基于该比率确定最小抑制浓度。

在某些情况下，例如样品是体液的情况下，则该方法可首先包括以下：1)获得体液样品，2)离心样品(例如，在24x g 15分钟)，以及3)用合适的肉汤(例如，阳离子调节的穆勒-辛顿肉汤(CAMHB))稀释上清液。

在某些情况下，例如样品可能是临床分离物的情况下，则该方法可首先包括以下步骤：1)获得临床分离物，2)在含有合适生长培养基(例如血琼脂板)的琼脂板上划线，3)在37℃下培养过夜，4)挑选单个菌落并将它们悬浮在合适的缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中，并将细菌数量调整至0.5McFarland标准。

在某些情况下，本文提供的方法依赖于连续稀释以确定特定抗菌剂灭活给定微生物所需的最小浓度。连续稀释在本领域中是众所周知的，通常指逐步稀释溶液中的物质。通常，每一步的稀释系数是恒定的，导致浓度以对数方式呈几何级数。如本文所规定，抗菌剂的连续稀释允许测试抗菌剂的一系列浓度，以确定抗菌剂是否能够有效灭活微生物，如果是，则确定灭活微生物所需的最低浓度。

如本文所提供，抗菌剂的给定浓度可因微生物而不同(如果已知)、因抗菌剂而不同、因微生物中存在耐药基因或任何其他相关因素而不同。在连续稀释的每个步骤中，抗菌剂的浓度将根据这些因素和其他因素而变化，并不意味着是限制性特征。例如，抗菌剂的浓度可在0μg/ml至5mg/ml范围内，且其中包括所有子范围。例如，抗菌剂的一个示例浓度范围可以是：0(对照样品)、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml以及它们之间的所有子范围。此外，稀释度可大于256μg/ml或小于0.5μg/ml。

本文所述的方法使用荧光染料染色微生物细胞。例如，当用荧光膜染料(例如苯乙烯基染料)染色细菌时，活细菌相对于非活性细菌的发射荧光较弱并发生位移。这种现象可能是活细胞中亲脂性膜环境中的染料相互作用的结果，相比之下，在非活性细胞中，染料插入细胞质中更亲水的环境中。

染料包括但不限于并入脂质双层的荧光染料。荧光染料的实例包括苯乙烯基染料和菁染料。代表性苯乙烯基染料包括

1-43、

1-43FX、

4-64和

4-64FX、

2-10染料。具有代表性的菁染料包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。FM 1-43是N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁胺基)苯乙烯基)吡啶二溴盐，购自生命技术公司(LifeTechnology)(#T-35356)，也由Sigma作为“Synaptogreen”(#S6814)出售。FM 4-64是N-(3-三乙基铵丙基)-4-(6-(4-(二乙氨基)苯基)己三烯基)吡啶二溴盐，购自生命技术公司(#T-13320)或Sigma作为“Synaptored”(#S6689)。

可使用多种染料，但本方法可使用单一染料。单一染料的使用不仅简化了该方法，而且减少了由于两种染料的存在而引起的变异性。

在某些情况下，本文提供了用于区分和比较活细菌与非活细菌的方法。该方法采用光谱强度比(SIR)分析。SIR测量两个波长激发后发射光的强度，并获得两个波长之间发射光的比率。具体而言，在特定波长下激发样品时，活细菌和非活细菌之间的最大发射峰值和发射强度存在明显的可测量差异。因此，两个指定波长的发射强度比或光谱强度比可用作区分活细菌和非活性细菌的方法。据信，SIR的使用并不取决于所用染料的数量和细胞的数量，因为SIR取决于强度的比率。

更具体地，光谱强度比(SIR)可以如下确定：

其中I_λ1＝I1＝第一波长处的发射强度，以及

其中，I_λ2＝I2＝第二波长处的发射强度，例如

其中，“I”(发射强度)是每个波长处散点图的平均值。

在这种情况下，I_λ＝610是610nm波长处的强度，I_λ＝530是530nm波长处的强度。对于革兰氏阴性细菌和synaptogreen染色，I₂＝I_λ＝610和I₁＝I_λ＝530是优选的。较低的SIR值对应于活性菌群，而较高的SIR值表示更大的非活性菌群。I_λ可在其他波长处，具体用于革兰氏阳性细菌和synaptogreen染色，其中I₂＝I_λ＝780和I₁＝I_λ＝670。此外，革兰氏阳性染色细菌可在两个波长(例如488nm或532nm)中的一处发光。革兰氏阳性菌使用合适的染料。

如上所述，本发明的方法可包括在温育后移除部分样品，将所述部分的具有不同浓度抗菌剂的温育样品转移到比色杯或其他合适的容器中；向所述部分添加合适的荧光染料；然后对样品进行光学分析，通过显微成像和图像分析获得SIR。然而，在某些情况下，在与一种抗菌剂温育后，可将染料直接置于具有不同浓度抗菌剂的稀释样品中。

本发明的方法通过依赖基于单个细菌水平的激发/发射分析而非基于培养的验证，以及仅需要使用一种染料来成功区分，从而允许活细胞与非活性细胞的准确和快速区分。因此，如上所述，在某些情况下，该方法可包括以下步骤：用单一膜相关染料染色样品；在激发时用入射光照射样品；测量每个细菌细胞(i)波长λ₁处的发射光的强度I1；以及(ii)波长λ₂处的发射光的强度I2；以及计算比率I2/I1。在一个实施方式中，这可以在单个细胞上完成，并且在另一个实施方式中，可以对多个细胞执行相同的过程。在进一步的此类实施方式中，可测量体积强度以确定样品是否含有活的或非活性的细菌。如上所述，光学分析可在用于温育的同一容器中进行，或在单独的容器中进行。在实施方式中，尽管对于革兰氏阴性细菌的样品，激发波长优选为488nm，对于革兰氏阳性细菌，激发波长优选为488nm或532nm，但也可以使用其他激发波长。

可使用光谱分析仪或发射滤波器测量发射光谱特征。激发波长可在约360nm与约600nm之间，并且测量I1与I2的波长可在约520nm与约800nm之间。在一个实施方式中，对于染料FM 1-43，激发波长为488nm，并且测量I1和I2的发射波长分别为530nm和610nm。对于染料FM 4-64，激发波长可能在488nm至570nm之间，并且测量I1和I2的发射波长分别为670nm和780nm。通过将红色(例如610nm)通道的平均荧光值除以绿色(例如530nm)通道的平均荧光值来计算光谱强度比(SIR)。活性细菌的典型SIR值低于非活性细菌的SIR值，例如活性细菌的SIR值在0.7至2之间，非活性细菌的SIR值大于2.5。

在一些实施方式中，可分析样品以确定细菌失活处理的成功或失败，细菌失活处理包括例如(但不限于)抗生素或抗菌处理(本文也称为抗菌剂)、氯失活、加热、乙醇和UV辐射。在进一步的实施方式中，可通过获取预处理样品的I2/I1并随后与样品的I2/I1进行比较来确定阈值，以确定细菌失活处理的功效。

染色后，如上所述，使用荧光滤光器(例如，λ₁＝530/30nm和λ₂＝616/30nm)确定样品的荧光强度，以确定和分析SIR。此外，可以确定活细菌和非活细菌的事件(例如种群事件)以及它们之间的比率(即死/活)。

从图像生成的数据可以以一维绘制以生成直方图，也可以以二维点图绘制，甚至可以以三维绘制。这些图上的区域可以根据荧光强度顺序分离。我们可以根据两个种群的平均荧光强度来区分死细菌和活细菌。随后，可根据该分析确定死/活比。该比率的“死亡”部分指死亡细菌种群的平均强度，该比率的“活”部分指活细菌种群的平均强度。

死/活比(以下简称“D/L”)然后乘以计算的SIR指数，如上所述，从而增强结果信号。SIR与D/L比的乘积描述如下：

SDL＝SIR*(死/活)

如上所述，SIR可绘制为抗菌剂浓度的函数，并近似于阶跃函数以确定MIC。同样，SDL(光谱死活比)也可绘制为抗菌剂浓度的函数，并近似于阶跃函数以确定MIC。

D/L比的加入增加了死亡种群和存活种群之间的差异，从而更容易确定阶跃函数。当阶跃函数仅使用SIR时，差异较小。SDL的加入导致更大的阶跃函数，从而更容易确定MIC。此外，由于阶跃函数变大，抗生素治疗的效果更容易观察和/或确定。此外，由于阶跃函数变大，细菌样品的温育时间也会缩短。总的来说，加入SDL(而非SIR)可提高灵敏度，更容易确定MIC。本发明的另一个优点是，通过使用比率，所用染料的浓度不应影响分析结果。

与SIR一样，SDL可用于确定细菌是否对治疗产生耐药性。SDL和SIR有相同的行为。与SIR相比，SDL的优势在于它强调了活种群和死种群之间的差异，因此阶跃函数更清晰。至于确定细菌是否具有耐药性或易感，进行与SIR相同的方式。如果SDL表现为斜率小于特定限值的线性线，且其截距大于对照样品的SDL，则细菌易受抗菌剂的影响。如果SDL表现为斜率小于某个值的线性线，且其截距与对照样品值的量级相同，则细菌对抗菌剂具有耐药性。

值得注意的是，使用的函数类型取决于细菌的敏感性。如果细菌对抗菌剂具有耐药性，则作为抗菌剂浓度函数绘制的SIR是几乎平行于x轴的线性线，而不是阶跃函数。如果施用抗菌剂的医疗指南高于细菌MIC，则也是如此。只有当MIC在测试的抗菌剂浓度值范围内时，才会产生阶跃函数。

如本文所述，“最小抑制浓度”或“MIC”是指在过夜培养后将会抑制微生物可见生长的抗微生物(例如抗菌)药物的最低浓度。据信，在这一过程之前，样品必须在培养基中培养，以确保适当的抗生素-细菌相互作用发生。

如本文所述，可通过绘制SIR作为抗菌剂浓度的函数并将其近似为阶跃函数来计算MIC，例如，以以下形式：

其中a、b和c为参数，erf为误差函数。MIC是参数c的值。

误差函数的值如下：y(x)是SIR或SDL。SIR和SDL都是无量纲物理值，因为在SIR强度的情况下，它们是相同物理量的比率。参数“a”是标度值，也是无量纲的，“b”确定阶跃斜率，其维数为1/(抗生素浓度)，“c”是x值，其中误差函数等于零，其维数为抗生素浓度[μg/ml]。可以使用其他合适的函数，例如tanh函数。根据具体情况确定不同浓度的SIR。

可以使用其他步骤函数，例如但不限于：

tanh，其中y(x)＝a·tanh[b(x-c)]，其中a是比例因子，b确定阶跃函数斜率，c是MIC，或

arctan(atan)，其中y(x)＝a·atan[b(x-c)]，其中a是比例因子，b确定阶跃函数斜率，c是MIC。

可以使用其他合适的方式来确定MIC。例如，一个选项是计算每个点(即每个SIR或SDL点)的一阶导数。MIC是一阶导数最大值对应的抗菌剂浓度。另一种选择是使用以下公式：(Max(SIR或SDL)+Min(SIR或SDL))/2并找到与该值对应的抗菌剂浓度值。

如上所述，本发明涉及对当前使用膜荧光染色和SIR来确定细菌活力、最小抑制浓度和细菌对抗生素治疗的敏感性或耐药性的方法的改进。

细菌可包括但不限于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，例如大肠菌群(coliformbacteria)、肠杆菌(enterobacteria)、沙门氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、志贺菌(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)或甲烷杆菌(Methanobacterium)。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、不动杆菌(Acinetobacter)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、阴沟肠球菌(Enterococcus cloacae)、气单胞菌(Aeromonass)、催产克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。

抗生素(或抗菌剂)可包括但不限于氨苄西林、庆大霉素、喹诺酮类(如环丙沙星)、阿莫西林、碳青霉烯类(如亚胺培南)、四环素、氯霉素、替卡西林、杆菌肽等。

在某些方面，首先过滤样品以分离浓缩形式的细菌，然后稀释至固定浓度的细菌。在其他方面，样品最初通过离心浓缩，然后稀释至固定浓度的细菌。浓缩细菌的稀释可在合适的培养基中进行，例如液体生长培养基。

在下面的示例中更具体地描述了本发明，这些示例仅为说明性的。

图1中描述了本文提供的方法的总体工艺流程100。最初获得细菌样品。样品可以来自任何来源，例如来自患者的临床样品或环境样品。在液体培养基中通过任何合适的方法培养细菌，并且可在液体培养基或其他合适的稀释剂中稀释以进行培养。样品的培养可在任何合适的容器(如试管、烧瓶、小瓶或多孔培养皿)中进行，这在微生物学领域中是众所周知的。样品稀释可通过任何合适的方法制备，例如，根据标准系列稀释方法，可选地根据任何合适的实验室标准或标准操作程序制备。在一个示例中，由于本文所述分析的性质，制备了至少三个样品或等分，仅使用培养基但不使用测试样品的第一个对照品、使用参考细菌样品的第二个对照品和测试样品。待测抗菌剂的多次稀释可通过任何有用的方法制备，例如通过抗菌剂的连续稀释。过程100可首先包括用抗生素110处理测试样品，并将测试样品温育适当的时间段(例如2-4小时)以确定抗生素对测试样品中任何微生物(例如细菌细胞)的影响。对照品(包括不含抗生素的对照品)可与测试样品一起温育。在其中温育细胞的容器可适于成像，或任选地，在成像之前将每个样品转移到成像容器中。成像容器是适用于容纳样品以便使用如本文所述的显微镜成像系统成像的容器，例如与显微镜成像系统兼容的腔室、载玻片、孔等，例如96孔板。适合成像容器的非限制性示例，例如用于高含量筛选的容器，包括具有聚苯乙烯、环烯烃共聚物或玻璃底的容器，例如具有平坦、光学透明玻璃底的

HCS玻璃底微孔板。

接下来，在培养细胞的容器中，或者在转移到成像容器后，使用合适的荧光染料120处理样品，例如通过向样品中添加染料暴露于荧光染料。本文描述了合适荧光染料的实例。用荧光染料处理样品后，将成像容器中的样品暴露于适当激发波长的光下(例如如本文所述的)，以产生样品中细胞的荧光。获得细胞的一个或多个图像130，并且获得两个波长(例如610nm和530nm)处的单个细胞的发射强度，并且针对每个细胞计算SIR 140。可计算SDL。在实施例中，可以使用不同的光学滤波器获得两个图像，或者可以使用各自具有合适滤波器的两个相机获得两个不同波长的输出。然后使用每个细胞的SIR计算150细胞MIC的合适表示，例如SIR与抗生素浓度的曲线图。如上所述，SIR用于任选地计算SDL，作为确定MIC的一部分。或者，可以制备样品的散点图作为输出，轴表示两个波长下的荧光强度，例如610nm和530nm处的荧光强度。

本文所述的数据处理、比较和计算活动的任一个可以并且优选地全部或部分地通过使用计算设备来执行，例如，作为计算机实现的方法，包括但不限于计算SIR、MIC、SDL或D/L，图像获取，图像处理，统计分析，图像比较，绘制或绘图，产生输出等等。如本文所使用的，术语“计算设备”可指配置为处理数据的一个或多个电子设备。在一些实施例中，计算设备可以包括接收、处理和输出数据的必要组件，例如处理器、显示器、存储器、输入设备、网络接口等。数据由处理器按照指令(例如选择并配置为以期望方式处理数据的软件和算法)的指示进行处理，并且因此处理器被编程和/或配置为执行指定任务。计算设备可以集成到成像系统中，例如GE IN Cell Analyzer系统(GE Healthcare Life Sciences)，如下所述。例如，计算设备可以是光学设备、一站式光学平台、台式计算机或其他形式的非移动计算机，包括适合于处理本文所述数据的适当分析软件，例如MATLAB。计算设备可以是移动设备。例如，移动设备可以包括手机(例如智能手机或标准手机)、便携式计算机、可穿戴设备(例如手表、眼镜、镜头、衣服和/或类似设备)、个人数字助理(PDA)和/或其他类似设备。

激光共焦成像系统或类似系统，例如GE IN Cell Analyzer系统(GE HealthcareLife Sciences)，例如具有可变孔径设计的IN Cell Analyzer 6000，可用于获得样品的图像，例如，从具有足够显微镜光学质量的孔底的适当96孔微孔板获得样品的图像。此类设备通常提供多个激发波长、光学滤波器的选项，并使用分析软件进行高通量筛选方法，如本文所述。合适的分析软件的一个非限制性示例是IN-Carta(GE Healthcare Life Sciences)图像分析软件，该软件可与GE IN-Cell Analyzer系统结合使用。其他产品(例如MATLAB)可用于产生和分析本文所述的图像。

如上所述，在第一波长(例如610nm)和第二波长(例如530nm)处获得细胞的单独图像。然后使用计算机实现的方法分析图像，例如，使用可以分析图像中单个细胞强度的软件。各种计算机系统、过程、算法、模块等可用于产生代表活细胞和死细胞比例的输出，以及适当的输出，如MIC或其他相关AST输出。

在如本文所述的用于分析细胞的计算机实现的方法的一个实施方式中，通过本文所提供的方法获得的细胞的图像被接收为任何合适的文件格式的输入。分析图像以识别图像中的如下单一细胞，其将在一个或多个波长(例如，在第一波长(例如610nm)和/或在第二波长(例如530nm)处表现出增加或减少的发射强度。成像技术中已知的一个或多个图像参数，例如白平衡、色调、颜色平衡、亮度、对比度、锐度等，可作为分析过程的一部分进行调整，以使图像正常化，以及对照样品，例如未经抗生素处理的测试样品，或者，包含大量死细胞的样品可用于标准化图像值以进行进一步的图像处理。图像的标准化可以在计算机实现的过程中自动进行，但也可以使用合适的图像处理软件手动完成。

在图像归一化之后，在第一波长(例如610nm)和第二波长(例如530nm)处评估图像场中单个细胞、固定数量的细胞或所有细胞的发射强度。在第一波长(例如610nm)和第二波长(例如530nm)处单独测量单个细胞的发射强度。然后，可以使用第一波长(例如610nm)和第二波长(例如530nm)处的强度值来计算SIR，并且如本文所述，可以绘制SIR与抗生素浓度的关系图或以其他方式进行评估，以确定被测抗生素的MIC。可以使用其他计算机实现的方法，以及适当的过程和/或算法来评估MIC。例如，聚类方法可用于将测试样品中的细胞分类为活的或死的，并且可基于在红色波长(例如610nm)和绿色波长(例如530nm)下发射强度比率的显著偏移来确定MIC(参见，例如图4)。

实施例：

实施例1：

在本实施例中，提出了一种直接从血液培养中快速确定AST和MIC的方法，在抗生素暴露2-4小时后，其周转时间小于5分钟，每孔少于1秒。

材料和方法：一般情况下，该方法包括血液培养离心、细菌抗菌剂暴露2至4小时、使用单一荧光染料进行细菌染色，然后使用激光共聚焦显微镜以及数学分析。

样品制备-宏观稀释法

a)根据CLSI建议制备抗菌剂(庆大霉素)储备溶液，并在CAMHB中稀释至比每种抗菌剂组合建议的最高浓度高2倍的浓度(“II类特殊控制指导文件：抗菌药物敏感性试验(AST)系统”，2009年8月28日，FDA)。

b)对于每个样品/抗菌剂组合，准备一组试管，其中添加1ml CAMHB培养基，第一根试管除外。

c)将2ml抗菌储备液(b)分配到该装置的每个第一根试管中。

d)从第一个试管开始，通过将1ml溶液转移到下一个试管中，直到CLSI达到所需的最低浓度，制备2倍的系列稀释液。从每组试管的最后一根试管中丢弃1ml。

e)向组中的每根试管中添加1ml细菌样品溶液(a)。

f)对于每个系列稀释组，添加两个对照。作为阴性对照，使用含有2ml CAMHB的试管。作为阳性对照，使用含有细菌样品溶液(a)的试管，细菌样品溶液(a)不含抗菌剂。

g)所有试管均在37℃下温育。

h)温育开始2-4小时后，将每根试管中的200μl转移到96孔组织培养板中，用2μlSynaptogreen或FM 1-43(分别为Sigma-Aldrich；分子探针)染色，并使用GE生命科学细胞分析仪(GE Lifesciences IN Cell Analyzer)6000进行成像。调整放大倍数，以便能够单独区分细菌。使用480nm激光激发样品，并从每个孔依次拍摄15张图像。对于每幅图像，一个接一个地通过绿色滤光片(530nm)和红色滤光片(615nm)拍摄图像。

i)使用GE In-Cell Investor图像分析软件对图像进行分析。对于每个图像，执行以下操作；图像分割化以识别细菌，记录每种细菌的绿色和黄色强度，并绘制细菌种群的散点图(x轴-绿色强度，y轴-红色强度)。

数据解释：

为了量化特定抗菌剂暴露的影响，我们将光谱强度比(SIR)定义如下：

其中(I)是每个波长处散点图的平均值。较低的光谱强度比(SIR)值对应于活性菌群，而较高的值则表示更大的非活性菌群。使用单一染料和上述光谱强度比(SIR)的主要优点是消除了染料浓度和光学效率对结果的依赖性。

通过绘制光谱强度比(SIR)作为抗菌剂浓度的函数，并将其近似为如下形式阶跃函数来计算MIC：

其中a、b和c为参数，erf为误差函数。参数用于将测量的SIR近似为阶跃函数；a是比例参数，b确定阶跃斜率，c是MIC值或其函数。SIR值用于通过最佳拟合近似确定erf参数。

结果：

我们测量了暴露于4个浓度的庆大霉素的大肠杆菌。使用光谱强度比(SIR)计算和使用MATLAB软件的阶跃函数估计来计算MIC。

图2显示了大肠杆菌细胞的图像示例，分别带有绿色滤波片(左)和红色滤波片(右)。图3提供了显示SIR作为InCell测量(顶部)和流式细胞仪测量(底部)抗生素浓度函数的曲线图。从图中可以看出，它们的形状相似，尽管InCell测量的数据点较少，两种情况下的MIC均为0.5μg/ml。活菌群(0μg/ml)的SIR低于死菌群(>0.5μg/ml)。在MIC(0.5μg/ml)下，SIR大幅增加。这是由于出现了大量的非活性细菌。当抗生素浓度非常高(>4μg/ml)时，SIR降低。

图4提供了散点图，显示了红色波长(610nm)下的荧光强度与绿色波长(530nm)下的荧光强度，这两种荧光强度来自于用指定浓度的抗生素温育的细胞图像。MIC附近的活细菌数量(菱形)低于死细菌数量(方形)。群沿箭头1移动。在较高抗生素浓度(三角形和×)下，死亡群转移到较低强度(箭头2)。在流式细胞仪实验中也观察到了这种行为。

总之，使用高含量筛选(GE InCell)可以测量光谱偏移并确定细菌是活的还是死的。因此，InCell系统是快速测量SIR(例如每孔小于1秒)的理想选择。

虽然已经根据上述示例和详细描述描述了本发明，但是普通技术人员将理解，可以在本发明的精神范围内进行修改。因此，本发明能够在具体实现方案中进行许多变化，这些变化可以由本领域的普通技术人员从本文所包含的描述中得出。

Claims

1.一种确定样品中一种或多种细菌的最小抑制浓度(MIC)的方法，包括：

在多个容器中制备多个细菌悬浮液；

向所述多个培养悬浮液中添加单一膜相关染料；

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MIC通过以下方式确定：

3.根据权利要求1所述的方法，其中使用阶跃函数确定MIC。

4.根据权利要求1所述的方法，其中使用阶跃函数确定MIC，阶跃函数的形式为：

其中a是比例参数，b确定阶跃斜率，并且c是MIC值。

5.根据权利要求1所述的方法，其中使用阶跃函数确定MIC，所述阶跃函数的形式为：

6.根据权利要求2所述的方法，还包括，使用至少一个处理器：

根据所述SDL确定作为抗菌剂浓度的函数的MIC。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述MIC通过绘制SDL作为抗菌剂浓度的函数来确定。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述MIC是所述SDL的一阶导数或二阶导数。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述图像是使用共焦显微镜获得的。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述单一膜相关染料是苯乙烯基染料或菁染料。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述单一膜相关染料是N-(3-三乙基铵丙基)-4-(4-(二丁基氨基)苯乙烯基)吡啶二溴盐或N-(3-三乙基铵丙基)-4-(6-(4-(二乙氨基)苯基)己三烯基)吡啶二溴盐。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述激发波长是在360nm至570nm范围内选择的波长。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述发射波长是520nm至850nm范围的波长。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述样品是体液。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清或尿液。

16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述样品是临床分离物。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中适当的温育温度为35℃至40℃。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中适当的温育时间段是30分钟至5小时。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中不同浓度的抗菌剂通过连续稀释制备。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将所述样品中的细菌浓缩并稀释至固定的细菌浓度，以在多个容器中制备多个细菌悬浮液。

21.根据权利要求20所述的方法，其中通过离心或过滤浓缩所述样品中的细菌。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌在液体生长培养基中稀释。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其进一步包括在向所述多个细菌悬浮液中的两个或多个添加不同量的抗菌剂后，移除所述包含细菌和抗菌剂组合的多个温育悬浮液中的每一个的一部分，并将移除的每一部分放置在新容器中。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，还包括在用染料的一个或多个激发波长的光照射包含染料的温育悬浮液之前，确定样品中一种或多种细菌的革兰氏类型。