CN113899903B - 结直肠癌生物标志物及其在诊断、预防、治疗及预后中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结直肠癌生物标志物及其在诊断、预防、治疗及预后中的应用。本发明还公开了在健康条件和结肠直肠癌的情况下，血液和肠道ILCs亚群的不同单细胞特征。健康的肠道由ILC1s、ILC3s和ILC3s/NK组成，但没有ILC2s。在CRC患者中确定其他肿瘤特异性ILC1s和ILC2s的亚群。本发明还公开了SLAMF1在肿瘤特异性ILCs上选择性地表达，并在CRC患者的血液中观察到更高水平的SLAMF1+ILCs。高SLAMF1组直肠癌患者的存活率明显高于低SLAMF1组，这表明SLAMF1是CRC中的抗肿瘤生物标志物。本发明还公开了使用无监督层次聚类方法来研究血液、正常黏膜和肠道肿瘤中在稳态和CRC期间的辅助性ILCs异质性。通过所述生物标志物，能够有效对CRC进行诊断、预防、治疗、预后评估及生存率预测等。

Description

结直肠癌生物标志物及其在诊断、预防、治疗及预后中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及结直肠癌生物标志物及其应用、生物标志物的无监督聚类分析方法，通过单细胞转录图谱揭示肿瘤特异性固有淋巴细胞与结直肠癌进展和免疫的关系。

背景技术

基于T细胞的免疫疗法在临床上已非常成功地用于治疗恶性肿瘤，但仅限于一小部分患者(Baumeister et al.,2016；Chen and Mellman,2017；Okazaki et al.,2013；Okazaki and Honjo,2007；Schumacher and Schreiber,2015；Sharma andAllison,2015)。通常在进行T细胞的免疫治疗时，需要同时进行针对其他免疫成分的治疗，以增加接受免疫治疗的患者的治愈比例。固有淋巴细胞(ILCs)是组织固有的与不依赖抗原的淋巴细胞，可调节机体对病原体和共生生物的免疫，以维持组织稳态(Spits et al.,2013；Vivier etal.,2018)。ILCs能够形成异质性细胞群，目前根据这些细胞群产生的细胞因子和表达的转录因子(Vivier et al.,2018)，将ILCs分为五大类(自然杀伤(NK)细胞、辅助性ILC1s、ILC2s、ILC3s和淋巴样组织诱导细胞)。ILCs参与机体免疫功能，包括病原体反应、炎症、组织发育、重塑、修复和体内稳态等。

考虑到ILCs产生的细胞因子的数量和性质，ILCs亚群可能参与癌症免疫，但也可能与肿瘤相关炎症有关。已知NK细胞通过肿瘤抑制特性在癌症中发挥作用，并且能有效地控制转移(Lopez-Soto et al.,2017)。辅助性ILCs在肿瘤发生和癌症免疫中的作用尚不明确，可能取决于肿瘤微环境。ILC1s能够产生大量促炎细胞因子，如IFN-γ和TNF-α，从而有利于肿瘤发生(Chiossone et al.,2018)。然而，在某些特殊的肿瘤微环境中，IFN-α也可以限制肿瘤的生长(Castro et al.,2018；Zaidi,2019)。ILC2s已被证明在各种肿瘤环境中大多有害，例如，胃癌(Bie et al.,2014)和急性早幼粒细胞白血病(Trabanelli et al.,2017)患者的外周血中存在大量ILCs。急性早幼粒细胞白血病(Trabanelli et al.,2017)和人膀胱癌和鼠前列腺肿瘤中，ILC2s来源的IL-13刺激髓系来源的抑制细胞的免疫抑制活性(Chevalier etal.,2017)。然而，ILC2s来源的IL-5可能有助于抑制小鼠模型(Saranchova et al.,2016)中的原发性和转移性肺肿瘤，ILC2s在胰腺癌(Moral et al.,2020)中能够激活组织特异性肿瘤免疫。已有报道，ILC3s在如B16黑色素瘤小鼠模型(Eisenring et al.,2010；Nussbaum et al.,2017)和非小细胞肺癌(NSCLC)患者(Carregaet al.,2015)中有抑癌特性。与之相反的是，ILC3s来源的IL-17和IL-22可能有助于肠癌的发展(Chanet al.,2014；Kirchberger et al.,2013)。因此，亟需研究ILCs亚群在各种癌症适应症中的存在情况和相应作用机制。

尽管目前对于癌症的治疗策略有了显著改善，但结肠直肠癌(CRC)在男性和女性中的发病率位居第三，也是全世界死亡率第二高的癌症(Bray et al.,2018)。ILCs反应失调与肠道癌症的发展有关。在人类许多病理条件下ILC2s含量均较低(Fuchs et al.,2013；Simoni et al.,2017)，且ILC3s(Ikedaet al.,2020；Simoni et al.,2017)水平也异常低，其通常以稳定状态密集分布在结肠中(Fuchs et al.,2013；Ikeda et al.,2020；Simoniet al.,2017)，而在CRC患者肠道中则含有大量的ILC1s(Carrega et al.,2020；Fuchs etal.,2013；Ikeda et al.,2020；Simoni et al.,2017)。此外，ILC3s/ILC1s比率的下降与CRC(Simoni et al.,2017)的严重程度有关。就人类肠道中这些细胞的组成、多样性和功能状态而言，在稳态及肿瘤情况下ILCs亚群图谱仍不明确。

发明内容

固有淋巴细胞(ILCs)是组织驻留淋巴细胞，与传统的T淋巴细胞不同，没有抗原特异性受体。ILCs包括自然杀伤(NK)细胞、ILC1s、ILC2s、ILC3s和淋巴样组织诱导细胞(LTi)亚群。肿瘤ILCs在多种癌症中存在，但它们在癌症免疫和免疫治疗中的作用仍然远没有其他淋巴细胞，如T细胞和NK细胞那样明确。

本发明使用无监督层次聚类方法来研究血液、正常黏膜和肠道肿瘤中在稳态和CRC情况下的ILCs亚群的异质性。健康的肠道由ILC1s、ILC3s和ILC3s/NK组成，但没有ILC2s。本发明首次提出来自CRC患者的ILCs包含两个额外的肿瘤特异性ILCs亚群TILCs：肿瘤特异性ILC1s样亚群(类似TILC1s)和ILC2s(TILC2s)亚群。SLAMF1(信号淋巴细胞激活分子家族成员1，CD150)在TILCs上选择性地表达，在CRC患者的血液中表达SLAMF1的ILCs的频率更高。SLAMF1高表达的CRC患者存活率明显高于SLAMF1低表达患者，这表明SLAMF1是CRC的抗肿瘤生物标志物。

本发明提出了SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、和ILC2亚群之任意的一种或几种的组合作为结肠直肠癌生物标志物的应用，所述应用以SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、和ILC2亚群之任意的一种或几种的组合作为靶点制备结肠直肠癌的发生和/或转移的诊断试剂，或制备结肠直肠癌治疗的药物，或制备预测结肠直肠癌生存时间的试剂，或制备结肠直肠癌预后评价试剂中的应用。

本发明中，肿瘤特异性ILC1样和ILC2亚群还可以与ILC3亚群组合作为生物标志物用于结肠直肠癌的诊断、治疗，生存率预测，以及预后评估等。

本发明还提出了一种对受试者诊断结直肠癌的方法，或对有需要的受试者预防或治疗结直肠癌的方法，或对患有结直肠癌的患者生存时间进行预测或预后评估的方法，所述方法包括：确定从所述患者或受试者获得的样品中SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、ILC2亚群之任意的一种或几种的组合的水平，其中通过所述水平，对所述受试者是否患结直肠癌进行诊断，或对所述患者的生存时间进行预测或预后评估；或，

所述方法包括：以所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、ILC2亚群之任意的一种或几种的组合作为靶点，对所述患者结直肠癌进行预防或治疗。

本发明所述应用或方法中，是以SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的组合的免疫原免疫动物制备抗体；和/或，以SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、和ILC2亚群之任意的一种或几种的组合为靶点制备免疫细胞、蛋白和/或小分子。

本发明所述应用或方法中，测定所述生物标志物的样品是获自所述患者的肿瘤组织或血液的样品，或所述受试者的肠道组织或血液样品。

本发明所述应用或方法中，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的水平是在蛋白质水平上确定的；或，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的水平是在核酸水平上确定的。

本发明所述应用或方法中，当所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的水平在蛋白质水平上确定时，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的水平通过免疫组织化学确定；或

当所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的水平在核酸水平上确定时，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的水平通过对编码所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33之任意的一种或几种的mRNA进行定量确定。

本发明所述应用或方法包括确定所述样品中SLAMF1+ILC、HPGD+ILC、TLE4+ILC、PRDM1+ILC和AQP3+ILC之任意的一种或几种的水平。

本发明所述应用或方法中，一组结合伴侣用于确定从所述患者获得的样品中SLAMF1+细胞的水平，所述结合伴侣对以下细胞表面标志物具有特异性：CD45，CD127，CD117，CRTH2，CD5，TIGIT和SLAMF1；或，

所述SLAMF1+ILC、HPGD+ILC、TLE4+ILC、PRDM1+ILC、AQP3+ILC、IL33+ILC之任意的一种或几种的水平通过流式细胞术方法确定；或，

所述SLAMF1+ILC、HPGD+ILC、TLE4+ILC、PRDM1+ILC、AQP3+ILC、IL33+ILC之任意的一种或几种的水平通过单细胞RNA测序确定。

本发明所述应用或方法中，所述SLAMF1的水平越高，所述患者拥有长的生存时间的概率越高。

本发明所述应用或方法中，所述诊断包括以下步骤：i)确定从所述受试者获得的样品中SLAMF1或激活ILC2的细胞因子IL33的水平；ii)将在步骤i)中确定的所述水平与预定参考值进行比较；iii)当步骤i)中确定的所述水平高于所述预定参考值时，所述测定个体为CRC患者，或当步骤i)中确定的所述水平接近所述预定参考值时，所述测定个体为健康个体；或，

所述诊断包括以下步骤：i)确定从所述受试者获得的肠道样品中SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3的水平；ii)将在步骤i)中确定的所述水平与预定参考值进行比较；iii)当步骤i)中确定的肠道ILC细胞表面的SLAMF1、HPGD、TLE4和PRDM1的特征性上调，AQP3的下调时，所述测定个体为CRC患者；或，

所述预测或预后评估包括以下步骤：i)确定从所述患者获得的样品中SLAMF1或激活ILC2的细胞因子IL33的水平；ii)将在步骤i)中确定的所述水平与预定参考值进行比较；iii)当步骤i)中确定的所述水平高于所述预定参考值时，所述患者预后良好，或当步骤i)中确定的所述水平低于所述预定参考值时，所述患者预后不良；或，

所述预防或治疗包括以下步骤：通过靶向结直肠癌肿瘤特异性生物标志物、信号分子、细胞亚群来预防或治疗有需要的受试者的结直肠癌，包括：向所述受试者施用药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体，有效量的结直肠癌肿瘤特异性生物标志物的调节剂、或信号分子的调节剂、或细胞亚群的调节剂，以及任选地另外的治疗剂，从而预防或治疗结直肠癌；其中，所述结直肠癌肿瘤特异性生物标志物选自SLAMF1、HPGD、TLE4和PRDM1，所述信号分子为AQP3，所述细胞亚群为特异性ILC1样和ILC2亚群。

本发明所述应用或方法中，所述调节剂包括促进剂、抑制剂、改良剂等，例如选自小分子化学剂，反义寡核苷酸，小干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，抗体，以及所述抗体的生物活性片段或同源物等。

本发明还提出了抗肿瘤生物标志物SLAMF1及其在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)疾病中的应用。

本发明还提出了SLAMF1作为生物标志物在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)、预测结肠直肠癌(CRC)存活率中的应用。

本发明还提出了生物标志物SLAMF1的检测试剂在制备诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)、预测结肠直肠癌(CRC)存活率的药物中的应用。

本发明中，高水平SLAMF1与CRC患者更高的生存率有关，可以作为CRC的抗肿瘤生物标志物。其中，所述的高水平根据TCGA数据分析获得。

本发明还提出了肿瘤特异性ILC1s样亚群和ILC2s亚群作为生物标志物在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)中的应用。

本发明还提出了肿瘤特异性ILC1s样亚群和ILC2s亚群作为生物标志物在预测结肠直肠癌(CRC)存活率中的应用。

其中，所述“肿瘤特异性ILC1s样亚群”及“肿瘤特异性ILC2s亚群”是一群新的细胞群。

本发明还提出了肿瘤特异性基因PTGDR2和/或GATA3作为生物标志物在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)中的应用。

本发明还提出了肿瘤特异性基因PTGDR2和/或GATA3作为生物标志物在预测结肠直肠癌(CRC)存活率中的应用。

本发明还提出了肿瘤特异性基因(或基因组合)AQP3作为生物标志物在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)中的应用。

本发明还提出了肿瘤特异性基因(或基因组合)AQP3作为生物标志物在预测结肠直肠癌(CRC)存活率中的应用。

本发明还提出了血液中ILC1s、ILC2s和ILC3s亚群组合作为生物标志物在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)中的应用。

本发明还提出了血液中ILC1s、ILC2s和ILC3s亚群组合作为生物标志物在预测结肠直肠癌(CRC)存活率中的应用。

本发明还提出了血液中SLAMF1，HPGD，TLE4和PRDM1基因组合作为生物标志物在诊断、治疗结肠直肠癌(CRC)中的应用。

本发明还提出了血液中SLAMF1，HPGD，TLE4和PRDM1基因组合作为生物标志物在预测CRC存活率中的应用。

本发明中，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、和ILC2亚群之任意的一种或几种的组合，包括例如单独的SLAMF1作为生物标志物或靶点在诊断或治疗结肠直肠癌(CRC)，在预测结肠直肠癌(CRC)存活率，或在结肠直肠癌预后评价中的应用。其中，通过检测肠道ILC细胞表面的SLAMF1，若SLAMF1特征性上调，可以区分健康个体和CRC患者。

本发明中，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、和ILC2亚群之任意的一种或几种的组合，包括例如单独的细胞因子IL33作为生物标志物或靶点在诊断或治疗结肠直肠癌(CRC)，在预测结肠直肠癌(CRC)存活率，或在结肠直肠癌预后评价中的应用。其中，所述细胞因子IL33是指激活ILC2的细胞因子IL33，所述细胞因子IL33的高表达与CRC患者更长的存活时间有关，这表明TILC2可能预示着CRC患者预后良好。

本发明中，所述SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3、细胞因子IL33、肿瘤特异性ILC1样亚群、和ILC2亚群之任意的一种或几种的组合，包括例如SLAMF1、HPGD、TLE4、PRDM1、AQP3的组合作为生物标志物或靶点在诊断或治疗结肠直肠癌(CRC)，在预测结肠直肠癌(CRC)存活率，或在结肠直肠癌预后评价中的应用。肠道TILC中SLAMF1、HPGD、TLE4和PRDM1的特征性上调，和AQP3的下调，可以区分健康个体和CRC患者。

本发明中，所述肿瘤特异性ILC1样亚群为TIGIT+TILC1-样细胞。

本发明在一个具体实施方式中，提供了一种预测结直肠癌患者生存时间的方法，包括从患者获得的样本中确定SLAMF1的水平，其中该水平与患者的存活时间相关。

如本文所述，“结肠直肠癌”一词包括公认的医学定义，该定义将结肠直肠癌定义为以小肠以下肠道细胞癌(即大肠(结肠)的癌症为特征的医学状况，包括盲肠、上升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠。此外，如本文所述，“结肠直肠癌”一词还包括医疗条件，其特征是十二指肠和小肠细胞的癌症。

本发明的方法特别适用于预测癌症患者的整体生存期(overall survival，OS)、无进展生存(progression-free survival，PFS)和/或无病生存(and/or the disease-free survival，DFS)。

如本文所述，“生存时间短”一语表示患者的存活时间将低于患者在一般人群中观察到的中位数(或均值)。当患者的生存时间很短时，意味着患者将有一个“差的预后”。相反，“长期存活时间”一语表示患者的生存时间将高于在一般癌症患者中观察到的中位数(或平均值)。当患者有很长的生存时间，这意味着病人将有一个"良好的预后"。

本发明所涉及的样本包含任何储藏方式的从病人获得的血液及肠道粘膜及结直肠癌组织样本。所检测的SLAMF1水平包括使用任何手段检测(可以选择性结合SLAMF1的试剂)的SLAMF1的核酸及蛋白质水平。

本发明的方法包括确定样品中SMMLF1+ILCs的水平。特别是对于所述实施例，样品可以是肿瘤组织样本或血液样本。根据目前定义，ILCs指固有淋巴细胞包含自然杀伤(NK)细胞、辅助性ILC1s、ILC2s、ILC3s和淋巴样组织诱导细胞。如本文所述，术语“SLAMF1+ILCs”是指表达SLAMF1的ILCs(即SLAMF1蛋白质或SLAMF1的核酸，如mRNA)。SLAMF1+ILCs水平通过ILCs(例如平均荧光强度MFI)表示为标记物(如蛋白质和/或mRNA)的表达强度的测量，或表示在样品中表达SLAMF1(如蛋白质和/或mRNA)的ILCs量(例如频率(例如百分比)SLAMF1+ILCs和SLAMF1+细胞的密度)。用于量化SLAMF1+ILCs通常涉及是否存在特定的细胞表面标记。包含流式细胞术(Flow Cytometry)，质谱流式(CyTOF)及分选ILCs后使用qPCR/RT-PCR检测SLAMF1水平。

本发明使用的细胞表面标志物组合包含CD45、CD127、CD117、CRTH2、CD5、TIGIT和SLAMF1。本发明包含任何形式的抗体偶联剂以检测到这些表面蛋白。这些抗体包括来自不同种属的单克隆或者多克隆抗体。偶联剂包含用于质谱流式的镧系金属标志物及用于普通流式的荧光偶联物。

本文所述的术语“SLAMF1”是指信号淋巴细胞激活分子1，英文别名包含CDw150,IPO-3,SLAM family member 1和CD150。如下为SEQ ID NO:1为其示例氨基酸序列：

SEQ ID NO:1>sp|Q13291|SLAF1_HUMAN Signaling lymphocytic activationmolecule OS＝Homo sapiens OX＝9606GN＝SLAMF1 PE＝1SV＝1

MDPKGLLSLTFVLFLSLAFGASYGTGGRMMNCPKILRQLGSKVLLPLTYERINKSMNKSIHIVVTMAKSLENSVENKIVSLDPSEAGPPRYLGDRYKFYLENLTLGIRESRKEDEGWYLMTLEKNVSVQRFCLQLRLYEQVSTPEIKVLNKTQENGTCTLILGCTVEKGDHVAYSWSEKAGTHPLNPANSSHLLSLTLGPQHADNIYICTVSNPISNNSQTFSPWPGCRTDPSETKPWAVYAGLLGGVIMILIMVVILQLRRRGKTNHYQTTVEKKSLTIYAQVQKPGPLQKKLDSFPAQDPCTTIYVAATEPVPESVQETNSITVYASVTLPES。

本发明的有益效果包括：SLAMF1在肿瘤特异性ILCs(TILCs)上选择性地表达，并在CRC患者的血液中观察到更高水平的SLAMF1+ILCs。高SLAMF1组直肠癌患者的存活率明显高于低SLAMF1组，这表明SLAMF1是CRC中的抗肿瘤生物标志物。通过所述生物标志物，能够有效对CRC进行诊断、预防、治疗、预后评估及生存率预测等。

附图说明

图1：scRNAseq分析显示正常黏膜可见ILC1s、ILC3s、ILC3s/NKs，但未见ILC2s。

A.4例正常粘膜16145个ILCs UMAP图。其中，细胞的颜色根据特定的数据集来定义。

B.根据供体来源进行着色的UMAP。

C.根据细胞内可变表达基因的表达水平的平均值对每个捐赠者的6个聚类进行无监督分层聚类。根据样本与特定子集的关系，对每个样本进行着色。

D.热图展示542个通过Wilcoxon秩和检验区分三组ILCs的基因(nmC0-3:256基因,nmC4：97基因,nmC5：189基因)。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值<0.05对基因排列。基因表达强度用颜色显示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框里是指特定的ILCs亚群的转录组信息。

E.根据可变表达基因的平均表达水平，对每个样本的3种ILCs聚类进行主成分分析(PCA)。

F.占(E)每个PC总信息的20％的基因在各ILCs亚群的分布。

G.列表展示在各ILCs组间有表达差异的总基因列表中前10个表达基因，编码转录因子、分泌蛋白和细胞膜标记的前10个表达基因。基因符号和注释根据公共数据库中检索。基因是按p值大小排列的。

H.根据扁桃体ILCs基因特征，在单细胞水平上对3组ILCs基因表达组进行模块评分。

图2：scRNA-seq分析显示CRC组织中存在肿瘤特异性的ILC1s样和ILC2s亚群。

A.4例患者CRC组织15101例肿瘤特异性ILCs(TILCs)的UMAP图。根据定义的不同细胞群，细胞显示不同的颜色。

B.UMAP图中不同的供体用不同的颜色展示。

C.根据可变基因表达水平的均值对每个捐赠者的4个聚类进行无监督分层聚类。

D.对982个基因(TILCs C0中有463个，TILCs C1中有100个，TILCs C2中有314个，TILCs C3中有105个)进行热图分析，并用Wilcoxon秩和检验区分肿瘤组织中4个TILCs亚群。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色显示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框识别特定的TILCs亚群的转录组。

E.基于可变表达基因的平均表达水平对每个样本的4个TILCs亚群进行主成分分析(PCA)。

F.对(E)中每个PC总贡献的20％的基因展示出来，并用不同颜色区分它们在各亚群的分布。

G.列表显示在TILCs组间具有显著差异的总基因列表中按p值大小排名最前的前10个表达基因，编码转录因子、分泌蛋白和细胞膜标记的前10个表达基因。基因符号和注释从公共数据库中检索。

H.在单细胞水平上，根据扁桃体ILCs基因特征对4个TILCs亚群进行模块评分。

图3：肿瘤组织特异性ILCs亚群特征。

A.41,603例正常血液、CRC血液和CRC组织的ILCs UMAP图。根据不同定义的亚群对细胞标记不同的颜色。

B.基于可变表达基因的平均表达水平，对每个供体的正常血液、CRC血液和CRC组织ILCs进行无监督层次聚类。

C.热图展示采用Wilcoxon秩和检验中，899个(44个在正常血液中，70个在CRC血液中，775个在CRC组织中)用于区分三个组织的基因。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色展示，根据z分数分布从-2.5(紫色)到2.5(黄色)进行打分。方框识别特定的ILCs亚群的转录组特征。

D.基于变表达基因的平均表达水平，在子集水平上对每个供体的正常血液ILCs(nbILCs)、CRC血液ILCs(cbILCs)和CRC组织ILCs(TILCs)进行无监督层次聚类。

E.Venn图表示来自正常血液、CRC血液、正常粘膜和CRC组织的4个ILC1s亚群的基因交集。

F.Venn图表示正常血液、CRC血液和CRC组织中3个ILC2s亚群的基因交集。

图4：CRC中ILCs特异性基因特征。

A.正常黏膜和CRC组织31,246个ILCs的UMAP图。根据定义的细胞群对细胞显示不同的颜色。

B.基于可变表达基因的平均表达水平，对每个供体的正常粘膜和CRC组织的ILCs进行无监督分层聚类。

C.用热图显示采用Wilcoxon秩和检验区分两个器官的331个基因(CRC肿瘤中266个，正常粘膜中51个)。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色显示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框内为特定的ILCs亚群的转录组信息。

D.正常血液和CRC血液中26,502个ILCs的UMAP图。细胞根据定义的数据集进行不同颜色着色。

E.基于可变表达基因的平均表达水平，对每个供体的正常血液和CRC血液ILCs进行无监督分层聚类。

F.用热图显示采用Wilcoxon秩和检验区分两个器官的254个基因(CRC血233个，正常血23个)。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色表示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框识别特定的ILCs亚群的转录组信息。

G.Venn图表示正常血液与CRC血液、正常黏膜与CRC组织之间的基因交集。

H.FeaturePlot展示SLAMF1在正常血液、CRC血液、正常粘膜和肿瘤组织中每个ILCs的相对表达水平。

图5：SLAMF1是CRC的一个生物标志物。

A.代表性流式细胞术分析图展示TILC1s样亚群的表面TIGIT表达情况。

B.流式细胞术分析正常黏膜(8-16例)和CRC组织(7-16例)的ILCs亚群。数据显示了所示ILCs亚群在总ILCs中的比例。

C.TCGA中CRC患者中不同IL-33表达分组的总体生存Kaplan-Meier曲线。采用比例风险Cox模型获得患者分层的最佳截止点，并通过对数秩检验计算p值。IL-33-high组(n＝192)；IL-33-low组(n＝91)。

D.流式细胞术分析健康献血者(n＝18)和CRC患者(n＝16)血液ILCs亚群。

E.FACS代表图展示SLAMF1在ILCs表面表达的情况。

F.流式细胞术分析SLAMF1在正常黏膜(n＝7)和CRC组织(n＝7)ILCs的表达情况。数据显示SLAMF1+ILCs占总ILCs的比例。

G.流式细胞术分析SLAMF1在健康献血者(n＝14)和CRC患者(n＝5)总血ILCs中的表达。数据显示在总ILCs中SLAMF1+细胞的比例。

H.TCGA分析CRC患者中按SLAMF1表达水平分组的Kaplan-Meier曲线。采用比例风险Cox模型获得患者分组的最佳截止点，并通过对数秩检验计算p值。SLAMF1-high组(n＝73)；SLAMF1-low组(n＝20)。

(B)、(D)采用杜恩多重比较检验进行Kruskal-Wallis检验，p值采用benjamin-hochberg方法进行调整。(F)、(G)采用非参数t检验的Mann-Whitney检验。

*p-value<0.05；**p-value<0.01；***p-value<0.001；****p-value<0.0001.

图6：该研究实验设计

A.从健康献血者或结直肠癌(CRC)患者的血液、邻近正常粘膜和CRC组织中分离的ILCs进行单细胞转录组分析工作流程。

B.对被定义为谱系标志物阴性(Lin-)和CD127阳性(CD127+)的人ILCs的设门策略。SSC，侧向散射；FSC：前向角散射。

C.组织中CD45+淋巴细胞中ILCs的百分比(左)。关于ILCs比例和样本数量的统计(右)。所示数据为均数±标准差，p值为Mann-Whitney检验和非参数t检验。ns,不显著。****p值<0.0001。

D.图表总结本研究的scRNAseq数据情况。包括正常的血液(n＝4)，CRC血液(n＝3)，相邻的正常粘膜(n＝4)，和CRC组织(n＝4)的总细胞数，每个组织可检测到的基因数，每个组织中每个细胞检测到基因，每个样本所捕获的细胞，每样品检测到的总基因，每个样本中每个细胞检测到的平均基因。#＝数目。

图7：基于已知特征或基因对正常粘膜ILCs亚群的分布。

A.nmILCs中IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、PTGDR2、KIT、RORC、NCR1、NCR2、KLRF1相对表达的FeaturePlot，以彩色虚线分隔，如图7A所示。

B.在单细胞水平上分别用人空肠(回肠)ILC1s、ILC3s、NK细胞和脾脏的ILC2s特征基因列表对6个nmILCs细胞群进行评分(Yudanin et al.,2019)。

C.每个nmILCs细胞中CD5相对表达的FeaturePlot，用彩色虚线分隔，如图所示。

图8：辅助定义肿瘤组织ILCs亚群的细胞标志物。

FeaturePlot展示TILCs中IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、PTGDR2、KIT、RORC、NCR1、NCR2和KLRF1的相对表达水平，彩色虚线用于区分各ILCs亚群，如图所示。

图9：正常黏膜和CRC组织的ILC3s亚群特征。

A.15701个正常粘膜ILC3s的UMAP图。根据细胞所属的细胞群对细胞着色。

B.UMAP中不同颜色指示不同的供体。

C.基于不同表达基因的平均表达水平，对每个捐赠者的4个nmILC3s簇进行无监督层次聚类。

D.使用Wilcoxon秩和检验筛选出区分nmILC3s细胞群的316个基因(0：74个基因，1：85个基因，2：48个基因，3：109个基因)并用热图展示出来。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色表示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框识别特定的ILCs亚群的转录组特征基因。

E.列表显示各ILCs组间具有显著差异的总基因列表中按p值大小排名最前的前10个表达基因，编码转录因子、分泌蛋白和细胞膜标记的前10个表达基因。基因符号和注释从公共数据库中检索。

F.UMAP展示肿瘤组织中9260个ILC3s细胞。不同颜色代表细胞属于不同的细胞群。

G.UMAP展示不同来源的个体，并用不同颜色表示。

H.基于可变表达基因的平均表达水平，对每个供体的CRC组织的ILC3s进行无监督分层聚类。

I.用热图显示采用Wilcoxon秩和检验区分肿瘤组织的ILC3s的420个基因(0，98个基因；1，106个基因；2，49个基因；3，167个基因)。细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色表示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框识别特定的ILCs亚群的转录组信息。

J.列表显示在ILCs组间具有显著差异的总基因列表中按p值大小排名前10的表达基因，编码转录因子、分泌蛋白和细胞膜标记的前10个表达基因。基因符号和注释从公共数据库中检索。

图10：scRNAseq定义了健康献血者血液中的ILC1s、ILC2s和ILC3s。

A.19,603个健康血液ILCs的UMAP图。根据细胞所属的细胞群对细胞着色。

B.UMAP中不同颜色指示不同的供体。

C.基于不同表达基因的平均表达水平，对每个捐赠者的4个nbILCs进行无监督分层聚类。

D.用热图显示采用Wilcoxon秩和检验区分正常血液组织的ILCs的356个基因(nbC0,90；nbC1,191；nbC2，75个基因)细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色表示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框识别特定的ILCs亚群的转录组信息。

E.根据可变表达基因的平均表达水平，对每个样本的3种ILCs聚类进行主成分分析。

F.占(E)每个PC总信息的20％的基因在各ILCs亚群的分布。

G.列表显示各ILCs组间具有显著差异的总基因列表中按p值大小排名前10的表达基因，编码转录因子、分泌蛋白和细胞膜标记的前10个表达基因。基因符号和注释从公共数据库中检索。

H.在单细胞水平上，根据扁桃体ILCs基因特征对3个ILCs亚群进行模块评分。

I.FeaturePlot展示nbILCs中IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、PTGDR2、KIT、RORC、NCR1、NCR2、KLRF1的相对表达水平，用彩色虚线分隔，如图所示。

图11：scRNAseq定义了CRC患者血液中的ILC1s、ILC2s和ILC3s。

A.6,899个CRC患者血液ILCs的UMAP图。根据细胞所属的细胞群对细胞着色。

B.UMAP中不同颜色指示不同的供体。

C.基于不同表达基因的平均表达水平，对每个捐赠者的3个cbILCs进行无监督分层聚类。

D.用热图显示采用Wilcoxon秩和检验区分正常血液组织的ILCs的359个基因(cbC0,143；cbC1,81；cbC2，135个基因)细胞以列表示，基因以行表示，按调整后的p值(<0.05)排列。基因表达用颜色表示，以z分数分布为基础，从-2.5(紫色)到2.5(黄色)。方框识别特定的ILCs亚群的转录组信息。

E.根据可变表达基因的平均表达水平，对每个样本的3种ILCs聚类进行主成分分析。

F.占(E)每个PC总信息的20％的基因在各ILCs亚群的分布。

G.列表显示各ILCs组间具有显著差异的总基因列表中按p值大小排名前10的表达基因，编码转录因子、分泌蛋白和细胞膜标记的前10个表达基因。基因符号和注释从公共数据库中检索。

H.在单细胞水平上，根据扁桃体ILCs基因特征对3个ILCs亚群进行模块评分。

I.FeaturePlot展示cbILCs中IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、PTGDR2、KIT、RORC、NCR1、NCR2、KLRF1的相对表达水平，用彩色虚线分隔，如图所示。

J.CRC患者血液中ILCs RNA速度通过规则网格上的高斯平滑投射在UMAP图形上。

图12：不同组织间AQP3、HPGD、TLE4和PRDM1的表达模式。

FeaturePlot展示AQP3、HPGD、TLE4、PRDM1在正常血液、CRC患者血液、正常黏膜及肿瘤组织中的相对表达水平。

具体实施方式

以下结合实施例和附图进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附权利要求书及等同内容为保护范围。

实施例1健康的肠道包含ILC1s、IL3Cs和ILCs/NK，但没有ILC2s。

1、材料与方法

(1.1)临床样本收集

scRNAseq的健康血液样本来自于接受常规结肠镜检查的个体，这些体检者通常身体健康，没有其他相关病史，如炎症性肠病(IBD)或CRC。

(1.2)人淋巴细胞的分离

手术后立即准备新鲜肠组织。去除脂肪组织和可见血管。使用PBS对样品进行称重和清洗，然后切成小块。正常组织在10mL新鲜制备的内皮淋巴细胞溶液(含有5mM EDTA，15mM HEPES，10％FBS，1mM DTT的PBS)中孵育，在37℃下1小时，在200rpm时摇动。CRC组织在37℃下用10mL新鲜准备的含65mM DTT的PBS中晃动洗涤15分钟。孵育结束后，组织块用PBS冲洗两次，并在37℃下进行酶消化1小时。消化液主要为：含0.38μg/mL胶原蛋白酶VIII，0.1mg/mL DNase I，100U/ml青霉素，100mg/mL链霉素，及10％FBS的RPMI 1640。然后，消化后组织用手大力摇动5分钟，然后用21口径的注射器进行机械分离。由此产生的细胞悬浮液使用100μm孔径的细胞滤网进行过滤到一个新的50mL锥形管。使用PBS将体积补齐到30mL。然后，细胞以1800rpm的离心5分钟。去除上清，并用含10％FBS的RMPI 1640悬浮。使用Ficoll进行密度梯度离心，结束离心后使用PBS重悬。

外周血单核细胞(PBMC)是从在Ficoll密度梯度上离心的人类血液样本中获得的。简单地说，血液在PBS中与2％的FBS等量混合，并在Ficoll密度梯度上轻轻分层。在1000x g下离心25分钟，制动为0的情况下进行离心。吸取中间层的细胞，然后在PBS中重新悬浮在2％的FBS中，供使用。

(1.3)去除污染细胞

使用R包SingleR(Aran et al.,2019)默认参数，参考Human Primary Cell AtlasData作为参考数据集，使用“label.main”中的细胞类型信息，对每个细胞进行细胞类型注释。由于数据集不包括人类ILCs数据集，并且鉴于ILCs和细胞或NK细胞之间的相似性，本发明保留了标记为NK和T细胞类型的细胞。去除少于200个细胞的小群集，以消除黏连体。某些个体特有的具有强特异性NK细胞特征的细胞群被认为是真正的NK细胞污染，并从下游分析中去除。

(1.4)分选ILCs细胞

使用PBS重悬新鲜制备的细胞，并用细胞死活染料于4℃孵育10min。使用包含10％的小鼠血清，40％Brillilant Stain缓冲液的FAC缓冲液(包含2％FBS,2mM EDTA的PBS)重悬细胞。使用Fc封闭抗体封闭10min，并加入含抗人CD45，CD127,CD117，CRTH2，及谱系抗体(TCRΥδ,TCRαβ,CD3,CD19,CD14,CD16,CD94,CD123,CD34,CD303和FcεRI)于室温孵育30min。结束孵育后，用FACS缓冲液洗涤，并离心细胞。收集好的细胞使用FACS重悬，并使用BD FACSAria III仪器进行分选活的ILCs。

2、实验结果

本发明通过研究成对的CRC组织和相邻的黏膜组织(用作对照)样本，并比较来自患者的血液和年龄匹配的健康供血者的血液(图6A)，剖析ILCs在CRC中的作用。Lin-CD127+ILCs在正常黏膜和CRC组织中含量比血液中高，这符合已知的ILCs组织保留特性(Gasteiger et al.,2015)(图6B-C)。在CRC组织中的ILCs含量显著低于正常黏膜，但在正常组和CRC组的血液样本中，ILCs含量占比相似(图6B-C)。

实施例2本发明对CRC患者的血液样本、健康血液、正常黏膜和CRC组织样本中的58，000个ILCs进行了单细胞转录组测序(scRNAseq)(图6D)。

1、材料与方法

(1.1)单细胞RNA测序

纯化的ILCs被重新悬浮在含0.04％BSA的PBS中，并保持在冰上。对细胞计数，细胞密度调整到10X Genomics公司的v3试剂盒建议的浓度，并用于文库构建。使用晶能公司的Illumina平台(NovaSeq 6000)进行文库测序，测序深度约为每个细胞90，000个读长。

(1.2)原始序列比对，质控和归一化

使用FastQC软件v0.11.9

(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)对原始测序读长进行质量控制。使用bcl2fastq2转换软件v2.20将bcl文件中的测序数据转换为FASTQ格式(https://support.illumina.com/downloads/bcl2fastq-conversion-software-v2-20.html)。使用Cell Ranger Single Cell Software Suite v.2.2软件的标准流程和默认参数对测序数据进行处理，比对和总结唯一分子标识符(UMI)。简而言之，本发明使用Cell Ranger Count标准流程将FASTQ序列与GRch38基因组进行比对。根据碱基判定评分过滤掉低质量的测序读长，将细胞条形码和唯一分子标识符分配给每个读长。使用Cell Ranger aggr标准流程的默认参数对单细胞测序数据进行归一化，以获得同一测序深度的数据。含有基因特征和细胞特征的矩阵用于后续分析。

在Seurat分析的质量控制期间，对原始UMI计数矩阵进行了过滤，以去除少于三个细胞的基因、基因少于200个的细胞、具有4000多个基因的细胞以及线粒体基因比例较高的细胞(超过8％)。然后，通过全局缩放方法对生成的矩阵进行规范化，使用缩放因子(默认情况下为10，000)进行转换，并在Seurat中使用"LogNormalize"函数进行对数数据转换，以便进行下游分析。

2、实验结果

对CRC患者正常黏膜的ILCs异质性和16,145个来自结肠肿瘤癌旁结肠组织的Lin-CD127+ILCs一同评估(图6D)。在统一流形逼近与投影(UMAP)分析中，细胞在二维的投影显示分离为六个不同的细胞群：正常黏膜细胞群(nmC)0到nmC5(图1A)。nmC4和nmC5这两个细胞群包含来自所有供体的细胞，表明这两个ILCs群体没有供体特异性的转录组谱(图1B-C)。相比之下，从nmC0到nmC3的大多数细胞都是单个供体特异性的(图1B-C)。

实施例3层次聚类

1、材料与方法

(1.1)无监督分层聚类

计算每个细胞群中单个细胞的基因表达值。仅使用之前选定的作为可变特征的基因。本发明使用Heatmap.plus包绘制无监督的聚类图谱。欧几里得距离是为所有细胞群中的基因计算的。对于正常粘膜，只有0-4聚类的细胞群用于分析。

(1.2)降维和聚类

使用Seurat的"FindVariableGenes"功能筛选出前2000个基因(Stuart et al.,2019)，并用于主要成分分析(PCA)。对于正常粘膜中的ILCs，本发明保留了前40个主成分。对于正常血液、CRC血液和肿瘤组织，本发明保留了前20个PC。聚类采用"FindClusters"功能进行识别，该算法基于在Seurat中实现的最近邻域模块化的优化，并采统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation andprojection,UMAP)算法进行可视化。对于不同个体及不同组织的比较，使用"merge"函数合并单个Seurat对象。对于供体和组织数据的可视化，在Seurat中使用"DimPlot"函数进行绘图时，使用组织和供者的信息来用“group.by”进行呈现。

(1.3)差异表达分析

本发明使用Seurat中的“FindAllMarkers”功能来鉴定样品中每个簇之间基因的差异表达。使用非参数Wilcoxon秩和检验，并基于Bonferroni校正，获取数据集中的所有基因用于比较的p值，和调整后的p值。本发明使用以下参数计算表达值的对数倍数变化(logFC)，并获得每个簇的所有可变基因的p值：min.pct＝0.05，min.diff.pct＝0.1，logfc.threshold＝0.25。基因的对数转换和按比例缩放的表达值用于生成热图。

(1.4)主成分分析

根据每个聚类的可变基因的平均表达值进行主成分分析。绘制出对PC1及PC2或者PC1及PC3贡献前20的基因权重。对于正常粘膜的ILCs，去除0-4聚类中非主要个体来源的ILCs亚群进行主成分分析。对PC1及PC2或者PC1及PC3贡献最大的前20个基因用图表展示出来。

(1.5)使用ILCs基因特征对样本进行评分

来自扁桃体的ILCs及NK基因特征由Bjorklund et al.等人定义(Bjorklund etal.,2016)。空肠(回肠)的ILC1s及ILC3s基因特征及脾脏的ILC2s特征来自于Yudanin及合作者的研究发现(Yudanin et al.,2019)。使用Seurat的“AddModuleScore”对每个ILCs进行模块评分。简而言之，计算每个细胞中的平均基因表达值，并减去对照基因在所有细胞中的表达值。对照基因是从所有基因中随机选取的。对于肿瘤组织中的ILC3s进行评分时使用癌旁组织ILC3s的差异表达基因作为基因列表。小提琴图用于呈现每个亚群的基因模块评分。

2、实验结果

利用层次聚类(图1C)和基因标记热图(图1D)、主要成分分析(PCA)(图1E-F)、表达最高的10个基因分析(图1G)和模块评分分析(图1H)，本发明将nmC0至nmC5的基因标记与先前描述的人类ILCs亚群(Bjorklundetal.,2016)的转录组标记进行比较。

排名前10个高表达基因中，nmC0至nmC3具有带有ILC3s的共同转录组特征：REL、KIT、CXCL8、IL4l1和IL1R1。其中，REL可以通过ILC3s中的IL22启动子位点编码NF-κB家族原癌基因信号(Victor et al.,2017)(图1F-G)。nmC4的特点是：编码溶细胞性颗粒膜蛋白(Medley et al.,1996)的NKG7，编码CD94，在T和NK细胞中作为驱动基因表达的KLRD1，与GNLY，GZMK，XCL2和CCL4等共同构成最高表达的基因，这是扁桃体NK细胞和ILC3s共同的整体特征。因此，nmC4被确定为ILC3s/NK亚群。nmC5类似于ILC1s：T细胞标记(CD3D、CD3G和CD3E)的表达水平较高，如前所述(Bjorklund et al.,2016；Ercolano et al.,2020；Robinette et al.,2015)，控制ILCs发育的转录因子(IKZF3、BCL11B、PRDM1和ID3)和NK/ILC1s细胞功能细胞因子(GZMM、IFNG、IL32、CCL4和CCL5)(图1F-G)。这些细胞注释由已知ILCs的选择性表达标志物进一步确定，例如IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、KIT、RORC、NCR1、NCR2和KLRF1(图7A)。本发明发现nmC5和先前报告的健康肠道ILC1s(Yudanin etal.,2019)之间存在差异，可能是因为本发明使用的门控策略并未排除CD5+细胞(图7B-C)。因此，由Lin-CD127+的scRNAseq谱图定义的正常肠道黏膜包含ILC1s、ILC3s和ILCs/NK，但不含ILC2s，这与缺乏PTGDR2基因表达相一致(图7A)。

实施例4CRC患者中存在肿瘤ILC1s样和ILC2s亚群。

本发明调查了来自CRC肿瘤患者的15，101ILCs(下称为肠道TILCs)的组成和多样性。UMAP分析确定了四个不同的细胞群：TILCs C0到C3(图2A)。与正常黏膜观察到的情况相反，未观察到巨大的批量效应，每个细胞群都存在于所有样品中(图2B-C)。根据应用于普通黏膜细胞群的方式(图1)，将TILCs C0分配(assignments)给ILC3s，这与其KIT、CXCL8、NFIL3和IL4l1的过表达一致，如nmC0-3。TILCs C1类似于ILC1s，并且与nmC5类似，显示编码T细胞分子8(CD3D、CD3G)分泌的效应子(CCL4、IFNG)和ILCs相关转录因子(IKZF3、PRDM1和BCL11B)的基因的差异表达。正常黏膜中不存在其他两个亚群，TILCs C2和TILCs C3。TILCsC2细胞对应于另一个ILC1s子集(下称TILC1s样子集)，其特征是基因编码抑制和共刺激性标记(TIGIT、CTLA4、TNFRSF18和TNFRSF4)的基因表达富集。TILCs C3细胞(定义为ILC2s，下称TILC2s)高表达ILC2s发育所需的基因编码转录因子(GATA3，RORA和ZBTB16)和ILC2s反应性细胞因子受体基因(IL1RL1和IL17RB)(图2D-H)。已知ILCs标记的选择性表达，例如IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、KIT、RORC、NCR1、NCR2和KLRF1为这些分配(assignments)提供支持(图8)。特别是在ILC2s中发现了PTGDR2和更高级别的GATA3表达(图8)。因此，与正常黏膜ILCs一样，肠道TILCs形成包含四个不同亚群的异质性亚群：TILCs C0(类似ILC3s)、TILCsC1(类似ILC1s)、TILCs C2(类似ILC1s的新型亚群)和TILCs C3(类似ILC2s)。

实施例5正常粘膜和肿瘤组织ILC3s细胞群批次效应校正。

肿瘤组织中的ILC3s细胞群和正常粘膜中的ILC3s和ILC3s/NK群均进行进一步分群，用于下游聚类。使用Seurat标准工作流的"IntegrateData"功能根据检测到的锚点纠正不同病人间的批次效应。

肿瘤组织ILC3s异质性似乎小于正常黏膜。因此，本发明重点关注nmC0-3、nmC4和TILCs C0，在应用批效应校正后，采用与上述相同的分析流程比较正常黏膜ILCs和肠道TILCs之间的ILC3s异质性(图9)。在两种组织的ILC3s中发现了四个不同的亚群(图9A-I)，包括可能未成熟的SELL表达亚群，以及在人扁桃体也存在的富含HLA编码记录的亚群(图9E和J)。正常黏膜ILC3s的每个亚群在肿瘤组织中都有对应的细胞群(图9K)。鉴于正常黏膜和肠道TILCs在ILC3s的异质性重叠，本发明可以得出结论，CRC不影响ILC3s亚群的异质性。因此，肠道TILCs与nmILCs的区别在于出现TILC2s亚群和第二个类似TILC1s的亚群。

实施例6血液ILCs异质性在CRC中是稳定的。

本发明通过研究健康个体和CRC患者血液ILCs的差异，寻找这种疾病的潜在生物标志物。本发明对来自健康供体的19，603个ILCs的UMAP分析显示三个不同的细胞群(下称nbC0、nbC1和nbC2)(图10A-C)。基于CD3D、CD3E、CD3G、NK/ILC1s细胞效应蛋白(CCL5、GZMK、GZMM和GZMA)和ILCs转录因子(BCL11B、PRDM1和IKZF3)的上调，认为nbC0对应于ILC1s(图10D-H)。nbC1被确定为ILC3s，其特征是ILC3s转录因子(MAFF、RUNX3)和共刺激标记(TNFRSF4，TNFRSF18)。nbC2显示ILC2s特征性(GATA3，RORA)基因和编码调控受体(KLRB1，KLRG1)基因的上调(图10D-H)。这些分配得到了已知ILCs的标记的选择性表达的支持，例如IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、PTGDR2、KIT、RORC、NCR1和KLRF1(图10I)。

实施例7 scRNAseq定义了CRC患者血液中的ILC1s、ILC2s和ILC3s。

1、材料与方法

(1.1)RNA速度评估

根据单细胞测序数据bam文件中剪接和未剪接RNA转入本的情况，来对单细胞测序数据中基因表达的动态变化进行分析，以评估RNA速度。使用R包veloycyto.R对每个基因的RNA速度值及嵌入的RNA速度参数进行计算(La Manno et al.,2018)(https://github.com/velocyto-team/velocyto.R)。RNA速度通过规则网格上的高斯平滑投射在UMAP图形上。

2、实验结果

本实施例根据来自CRC供体的6，899个血ILCs的UMAP图谱进一步确定了三个亚群(下称cbC0、cbC1和cbC2)(图11A-C)。驱动基因、十大基因和模块分数特征突出了cbILCs与nbILCs的相似性(图11D-H)。cbC0与nbC1一样，具有ILC3s谱图，富集MAFF、RUNX3、TNFRSF18、NCR1和KIT。cbC1被确定为ILC2s，因为其与nbC2一样，表达高水平的GATA3、RORA、KLRB1、KLRG1和PTGDR2。cbILC2s，则与nbC0相同，在ILC1s标记的基因中也有富集：CD3D、CD3G、CD3E、CCL5、GZMK、GZMM、GZMA、BCL11B、PRDM1、IKZF3和TBX21(图11D-H)。IL7R、GATA3、NCR3、EOMES、TBX21、PTGDR2、KIT、RORC、NCR1和KLRF1的选择性表达也支持这些分配(图11I)。然而，尽管cbILCs亚群与nbILCs亚群相似，但RNA速度分析预测，只有在CRC肿瘤血液的条件下，ILC1s可能转化为ILC3s(图11J)。总之，健康供体和CRC患者的血液ILCs形成了含有ILC1s、ILC2s和ILC3s亚群的异质亚群。

实施例8 CRC特异性TILC1s新亚群的鉴定

肿瘤组织ILCs含有两个在正常黏膜的ILCs中不存在的亚群，其转录组特征类似于ILC2s和ILC1s(图1A和H，图2A和H)。本发明通过将41，603个ILCs分组到单个整体分析中，研究了这两个肿瘤组织特异性细胞群与健康血液和来自CRC患者血液的ILCs亚群的相关性。这篇分析揭示了ILCs之间的器官特异性印记，两种血样(前文所提的健康血液和CRC肿瘤患者的血液)之间存在重叠(图3A)，而TILCs则单独聚类。nbILCs和cbILCs在基因特征上具有高度相似性，这与TILCs(图3B-C)有显著差异。本发明进一步分析了来自CRC组织、正常血液和CRC血液样本中已定义的ILCs亚群之间的关系。尽管此亚群具有核心ILC1s转录特征，但类似TILC1s的亚群似乎与其他细胞群(尤其是TILC1s)存在分离(图3D)。同样，另一TILCs特定亚群TILC2s与血液中的其他TILCs和ILC2s聚集。在血液中，每个nbILCs都与相应的cbILCs亚群聚集(图3D)。本发明通过创建维恩图(图3E和F)比较它们的整个转录组特征，来评价肿瘤特异性的ILCs是否与正常血液或CRC血液中对应的细胞共享更多的基因。与nbILC1s(共有34个基因)相比，TILC1s样亚群和cbILC1s(共有57个基因)共享的基因更多(图3E)。TILC2s与cbILC2s和nbILC2s共享基因的数量相近，分别是39个和34个(图3F)。

实施例9 CRC中的ILCs特异性标记

本发明通过将正常黏膜和肿瘤组织中的31，246个ILCs细胞聚集在一起，来寻找ILCs的肿瘤特异性组织特征。这两个组织有一些共同的ILCs亚群，但UMAP突出了两个组织之间的转变，表明其在转录水平上存在差异(图4A)。无监督层次聚类还显示，组织来源特征比ILCs亚群标记特征更强(图4B-C)。对26，502个ILCs细胞进行UMAP分析显示，nbILCs和cbILCs有相似的分离模式(图4D)；根据无监督层次聚类分析，血液样本来源的两个亚群根据健康状况进行分类，揭示了它们之间转录组的差异性(图4E-F)。结果发现，相比对照组，一个基因(AQP3)在正常血液和正常黏膜中上调，四个基因(SLAMF1，HPGD，TLE4和PRDM1)在CRC血液和肠道TILCs中上调(图4G)。这五个目的基因的特征图证实了肠道TILCs中SLAMF1、HPGD、TLE4和PRDM1的特征性上调，和AQP3的下调(图4H和11)。SLAMF1(信号淋巴细胞激活分子家族成员1或CD150)，编码参与激活T细胞、B细胞和NK细胞的蛋白(Gordiienko et al.,2019)，是肿瘤中上调的主要表面蛋白基因。该基因在cbILC2s、TILC2s和TILC1s样的亚群表达，但在健康对照组中仅有12个弱表达(图4H)，这表明ILCs细胞表面的SLAMF1表达可以区分健康个体和CRC患者。

实施例10 SLAMF1是CRC的生物标志物

1、材料与方法

(1.1)流式细胞术检测ILCs

同分选ILCs细胞进行染色一样，新鲜制备的细胞使用死活染料染色和Fc抗体进行封闭后，进行表面抗体染色。使用抗体混合物(抗谱系抗体混合物，加CD45，CD127,CD117,CRTH2,CD5,TIGIT及SLAMF1)室温染色30min。CRC病人血液来源的PBMC，癌旁及肿瘤样本用于同时染色，健康捐献者的PBMC用于对照。染色好的细胞置于4℃，并在BD Symphony仪器进行流式检测。使用FlowJo软件对流式数据进行分析。统计分析用非参数非配对t检验的“曼-惠特尼秩和检验”，或者多恩多重比较的“Kruskal-Walis”检验。多重比较的p值使用Benjamini-Hochberg方法进行矫正。*p-value<0.05,**p-value<0.01,***p-value<0.001,****p-value<0.0001。

(1.2)TCGA分析

使用TCGAbiolinks软件包下载原发性肿瘤和临床注释的RNAseq数据。卡普兰-迈尔曲线使用R包survminer绘制。为了将表达水平拆分为两组，给出最低p值的表达量为截止值。通过Cox比例风险模型获得患者分层的最佳截止点，并通过对数秩检验计算出图中显示的p值。

2、实验结果

本发明通过流式细胞测定证实，相对于正常癌旁组织，CRC患者肿瘤组织中ILC1s亚群的扩增以ILC3s亚群的减少为代价(图5A-B)。

本发明还观察到肿瘤中存在一种新型的TIGIT+TILC1s-样细胞和TILC2s亚群，但在正常组织中不存在(图5A-B)，与scRNAseq数据(图1)一致。癌症基因组图谱(TCGA)的患者数据显示，肿瘤中激活ILC2s的细胞因子IL33的高表达与CRC患者更长的存活时间有关，这表明TILC2s可能预示着CRC患者预后良好(图5C)。与肠道ILCs的发现相反，在CRC患者和健康供者血液中，每个ILCs亚群占总ILCs的频率相似(图5D)。

在肿瘤中表达SLAMF1表面分子的ILCs数量比在癌旁组织中多，事实上癌旁组织几乎不表达SLAMF1(图5E和F)。相反，健康供体的血液ILCs表达SLAMF1，在CRC患者血液中发现表达SLAMF1的ILCs比例也很高(图5G)。通过研究癌症患者的临床结果，本发明进一步探索了SLAMF1在CRC疾病发展和进展中的潜在作用。SLAMF1高表达的直肠癌患者存活率远高于SLAMF1低表达的患者(图5H)，有力提示SLAMF1是CRC的抗肿瘤生物标志物。

讨论

在过去十年中，辅助性ILCs已成为预防病原体、组织重塑和维持内稳态的关键(Vivier et al.,2018)。而辅助性ILCs对癌症的贡献却知之甚少，因为它们可能促进肿瘤相关炎症，或相反表现出抗肿瘤特性，具体取决于肿瘤的微观环境。

本发明通过构建健康状态和CRC患者的Lin-CD127+细胞的单细胞转录图谱来研究辅助性ILCs在人类肠道中的异质性。这种无偏倚的辅助性ILCs表征不同于另一项最新研究提供的肠道ILCs转录因子分析；该转录因子分析中，这些细胞通过CD103、CD300LF和CD196细胞表面标记进行流式细胞分选测定后再进行转录组谱分析(Cella et al.,2019)。此文进一步揭示，健康的肠道含有ILC1s，ILC3s，一个ILC3s/NK群体，但没有ILC2s。有趣的是，除了肺和脂肪组织(Trabanelli et al.,2018)外ILC2s几乎完全不存在健康人体组织(与已有报道的小鼠实验相反)。本发明在CRC患者中检测到肿瘤浸润性TILC2s。与现有文献公开的相似，即在乳腺癌(Salimi et al.,2018)、胃癌(Salimi et al.,2018)、胰腺癌(Moralet al.,2020)和膀胱癌患者尿液中也观察到TILC2s(Chevalier et al.,2017)。已有报道的数据显示在一个模型中，ILC2s通过IL-33依赖通路(Chevalier et al.,2017；Moral etal.,2020；Saranchova et al.,2016)浸润肿瘤，并通过促进溶细胞性CD8+T细胞反应来介导肿瘤免疫监视。IL-33在结肠直肠肿瘤(Cui et al.,2015)中过度表达，在低级别腺癌和早期结直肠肿瘤(Mertz et al.,2016)中经常观察到高水平的IL-33。IL-33高表达的结肠癌患者的存活率高于IL-33低表达患者(图5C)，表明TILC2s可能预示着CRC的良好预后。因此，非常有必要进一步研究TILC2s在CRC和其他癌症适应症的抗肿瘤免疫作用。

本发明发现了一个额外的辅助样ILC1s亚群，命名为TILC1s样TIGIT+(TILCs-likeTIGIT+)，其仅存在于CRC患者的肿瘤中，但血液中不存在。TILC1s样TIGIT+的转录谱比其他任何ILCs的转录谱更类似于ILC1s基因特征，但它们与TILC1s分离，这表明它们与"常规"肠道TILC1s有明显区别。ILC1s样细胞被称为"中间ILC1s"(inTILC1s)，在甲基胆碱(MCA)诱导肿瘤，以及实验性RM-1和B16F10肺转移的小鼠模型(Gao et al.,2017)中也进行了描述。在人类中，在实体肿瘤和癌症患者的腹膜和胸膜腔积液中发现了类似CD56-CD16+ILC1s样细胞(Levi et al.,2015)，并且这些细胞的细胞毒性功能在急性髓系白血病(Salome etal.,2019)的供者外周血中发生变化。肿瘤内inTILC1s可能由TGF-β信号信号驱动的NK细胞分化产生，这种现象称为ILCs可塑性(Cortez et al.,2016；Gao et al.,2017)。在人源化小鼠实验中已经证实，TGF-β信号转导使ILC3s转化为ILC1s，并且在人肠道(Cella et al.,2019)中已鉴定出过渡性ILC3s-ILC1s亚群。在本发明的肠道ILCs数据集中未观察到此类现象，并且测试的算法均无法确定TILC1s样TIGIT+与另一个反映可能分化的肠道ILCs子集之间的相关性(数据未显示)。因此，TILC1s样TIGIT+在CRC肿瘤中出现的机制仍有待确定。本发明观察到CRC患者血液中的ILC1s对ILC3s在可塑性，但在健康供体中则没有，这表明可能存在驱动ILC1ss-ILC3ss可塑性的可溶性信号，如持续的IL-23水平(Koh et al.,2019)。这种ILC1s-ILCs可塑性在CRC患者血液中的生物学相关性尚不清楚。

InTILC1s和ILC1s产生大量的TNF-α，研究发现这对控制致癌物无效，甚至可能促进小鼠模型肿瘤转移(Gao et al.,2017)。在人类中，CD56+CD16-ILC1s-样细胞表达亲血管生成因子VEGF，这也可能有利于肿瘤生长(Levi et al.,2015)。在CRC患者中，肿瘤组织内ILC1s的比例比正常黏膜组织内高，并且随着肿瘤的进展，ILC1s以ILC3s为代价而增加(Ikeda et al.,2020)这些结果提示，ILC1s水平高可能预示癌症预后不良。TILC1s样亚群相对于经典TILC1s在CRC肿瘤中的特定生物学功能问题仍待进一步解决，因为TILC1s样细胞具有高水平的PD1和TIGIT，并且可能通过抗PD1和抗TIGIT免疫疗法突然释放。

本发明对所有捐赠者的正常黏膜中三个亚群(ILC3s、ILC3s/NK和ILC1s)特征进行了描述。在ILC3s亚群中观察到了供体特异性效应，表明微生物群可能存在ILC3s印记。有趣的是，CRC肿瘤的ILC3s水平要低得多，并且表现出这种明显的供体特异性的丧失。CRC经常与肿瘤免疫失调相关，这涉及了微生物群组分的巨大变化(Feng et al.,2015；Liang etal.,2017；Nakatsu et al.,2015；Yazici et al.,2017；Yu et al.,2017)。ILC3s是肠道屏障完整性和免疫稳态的主要调节细胞。因此，促进CRC患者ILC3s的重定殖和多样化可能对治疗有所裨益。增加微生物多样性也可能提高LC3异质性。

本发明还定义了健康肠道黏膜的ILC3s/NK细胞亚群，这些细胞在CRC患者肿瘤组织中不存在。这些细胞具有与ILC3s和NK细胞相同的转录功能。它们与ILC3s的不同之处主要在NKG7、KLRD1(CD94)、GNLY、GZMK、XCL2和CCL4的表达。这个ILC3s/NK亚群的生物作用及其与“经典”ILC3s之间的关联仍有待研究。

SLAMF1是CRC患者的TILCs和血液ILCs中转录水平更高的唯一细胞表面标记物。与健康供体相比，CDC患者的肿瘤和血液中表面表达SLAMF1的ILCs出现频率也更高。SLAMF1是一种单链I型跨膜受体，其细胞质尾部(Gordiienko et al.,2019)中带有两个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)。SLAMF1是一种自配体，也是麻疹病毒的微生物受体，并且作为细菌受体参与消除革兰阴性细菌(Gordiienko et al.,2019)。SLAMF1在除NK细胞以外的几乎所有造血细胞表达，尤其是具有活化表型的造血细胞，并在细胞激活时上调。血液中，大部分ILCs表面表示的SLAMF1处于稳定状态，但在正常肠道黏膜的ILCs上未观察到该种表达。相比之下，SLAMF1在CRC患者的TILCs中表达，这表明肿瘤床的TILCs比癌旁组织黏膜中更活跃。然而，辅助类ILCs表面表达SLAMF1对这些细胞的生物学影响仍有待研究。高水平SLAMF1与CRC患者更高的生存率有关。因此，本发明的结果表明，SLAMF1是CRC的抗肿瘤生物标志物。

ILCs可以控制免疫治疗的各个方面，已成为癌症免疫的组织特异性调节靶点。由于ILCs和T细胞在人类癌症中共存，并且有共同的刺激和抑制途径，因此针对抗癌ILCs的免疫治疗策略可能与针对T细胞的策略同样重要。本发明的研究结果表明，CRC中存在TILCs亚群，所以ILCs是肿瘤微环境的一部分。可以推测它们可调节肿瘤床免疫力，或者对肿瘤细胞有直接影响。ILCs在不同组织来源、不同激活状态的癌症中是否存在更多的肿瘤特异性亚群，对癌症起到促进还是抑制作用仍有待进一步研究。

基因注释

转录因子相关基因根据4个转录因子相关的数据库：JASPAR(Khan et al.,2018)

(http://jaspar.genereg.net/),DBD(Wilson et al.,2008)

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(http://www.fiserlab.org/tf2dna_db/)。细胞膜表面及分泌蛋白基因根据The人类蛋白质图谱(Uhlen et al.,2015)(https://www.proteinatlas.org/humanproteome/ tissue/secretome)进行注释。

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Met Asp Pro Lys Gly Leu Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Phe Leu Ser

1 5 10 15

Leu Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys

20 25 30

Pro Lys Ile Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr

35 40 45

Tyr Glu Arg Ile Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser Ile His Ile Val Val

50 55 60

Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys Ile Val Ser

65 70 75 80

Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr

85 90 95

Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly Ile Arg Glu Ser Arg Lys

100 105 110

Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val

115 120 125

Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro

130 135 140

Glu Ile Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu

145 150 155 160

Ile Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp His Val Ala Tyr Ser Trp

165 170 175

Ser Glu Lys Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His

180 185 190

Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn Ile Tyr Ile

195 200 205

Cys Thr Val Ser Asn Pro Ile Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro

210 215 220

Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro Trp Ala Val

225 230 235 240

Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly Val Ile Met Ile Leu Ile Met Val Val

245 250 255

Ile Leu Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn His Tyr Gln Thr Thr

260 265 270

Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr Ile Tyr Ala Gln Val Gln Lys Pro Gly

275 280 285

Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln Asp Pro Cys Thr

290 295 300

Thr Ile Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val Gln Glu

305 310 315 320

Thr Asn Ser Ile Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser

325 330 335

Claims (6)

1.SLAMF1制备结肠直肠癌生物标志物试剂的应用，其特征在于，所述应用以SLAMF1作为靶点制备结肠直肠癌的发生和/或转移的诊断试剂，或制备预测结肠直肠癌生存时间的试剂，或制备结肠直肠癌预后评价试剂；来自结肠直肠癌患者的ILCs包含两个额外的肿瘤特异性ILCs亚群TILCs：肿瘤特异性ILC1s样亚群和ILC2s亚群；SLAMF1在TILCs上选择性地表达，在结肠直肠癌患者的血液中表达SLAMF1的水平更高。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是以SLAMF1的免疫原免疫动物制备抗体；和/或，以SLAMF1为靶点制备免疫细胞、蛋白和/或小分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，测定所述生物标志物的样品是获自所述患者的肿瘤组织、肠道组织或血液的样品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述SLAMF1的水平是在蛋白质水平上确定的；或，所述SLAMF1的水平是在核酸水平上确定的。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，当所述SLAMF1的水平在蛋白质水平上确定时，所述SLAMF1的水平通过免疫组织化学确定；

当所述SLAMF1的水平在核酸水平上确定时，所述SLAMF1的水平通过对编码所述SLAMF1的mRNA进行定量确定。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SLAMF1的水平越高，所述患者拥有长的生存时间的概率越高。