CN113876626A

CN113876626A - 一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物及其在化妆品中的应用

Info

Publication number: CN113876626A
Application number: CN202111271004.XA
Authority: CN
Inventors: 曹崇江; 尧岚; 程抒劼
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN113876626B

Abstract

本发明公开了一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，包括金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷，所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为(0.01～1):(0.01～4)，且金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比＞1:1。组合物不仅对蓝光诱导损伤的角质形成细胞具有保护作用，而且可促进蓝光照射后皮肤角质形成细胞的增殖和迁移，改善蓝光引起的皮肤屏障修复的延迟，从而促进肌肤受损屏障的修复。本发明还公开了所述的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷在制备化妆品中的应用，所述的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷与其他活性成分及辅料制成化妆品，有助于皮肤屏障内在的自我修复，具有保湿舒缓修复功效。

Description

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物及其在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于医学美容护肤产品技术领域，涉及一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物及其在化妆品中的应用，具体涉及一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的含有金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的组合物及其在制备化妆品中的应用。

背景技术

蓝光是波长为400-500nm的高能量可见光线，它不仅存在于太阳光中，也可以由各种人工光源如LED灯、荧光灯、白炽灯、电视、平板电脑和智能手机中的各种显示器产生。人们使用手机及电脑等电子设备的频率越来越高，甚至产生了屏幕依赖，这些屏幕发出的蓝光会对眼睛、生物节律和皮肤产生影响。迄今为止，已有研究表明，蓝光会导致皮肤产生氧化应激和炎症因子，延迟皮肤屏障的修复，影响皮肤屏障稳态，还可进一步导致色素沉着。尽管也有越来越多的研究表明波长453nm蓝光在慢性炎症性皮肤病中的治疗效果，但其对人类正常健康皮肤却会产生不利的影响，表现为屏障破坏后24小时较高的TEWL(经皮失水率)和色素沉着的增加。蓝光会影响正常健康皮肤的皮肤屏障稳态，从而影响正常的表皮屏障功能。

皮肤由表皮层、真皮层和皮下组织构成，表皮是人体抵御外界伤害的主要屏障，又由基底层、棘层、颗粒层和最外面的角质层构成。角质层主要由角质细胞、细胞间脂质及皮脂膜3部分构成，一般会用“砖泥结构”来比喻皮肤屏障的功能。角质层中的角质细胞构成“砖块”，细胞间脂质构成“灰浆”，细胞间脂质填充在层层叠叠的角质细胞中构成的“砖泥结构”维持着人体正常的表皮屏障功能。气候干燥、紫外线照射、衰老等都会影响皮肤的屏障功能，维持和修复表皮屏障功能不仅有助于预防和治疗皮肤疾病，还能够缓解皮肤疾病诱发进一步的感染和慢性炎症。角质形成细胞(keratinocytos)是构成表皮的主要细胞，位于表皮基底层的角质形成细胞具有增殖、迁移和分化的能力，能不断分裂产生新的角质形成细胞，并从基底层向上迁移，逐步分化成熟，依次形成棘层、颗粒层和角质层。在皮肤屏障修复这一复杂过程中角质形成细胞起着非常重要的作用，蓝光所导致的角质形成细胞增殖与迁移能力的降低，会影响正常皮肤屏障的修复。

植物来源活性成分对预防上述蓝光造成的皮肤损伤具有重要意义，因为它们通常具有较低毒性，并且可多种成分协同作用，例如抗氧化和修复活性。敏感性皮肤的发病机制尚不明确，诱发因素和临床表现个体差异大。目前认为其机制主要为皮肤屏障功能降低，针对这一皮肤问题，国内外主要集中于应用医学护肤品修复和改善受损的皮肤屏障。

目前，市面上宣称抗蓝光的组合物及其护肤品，多从吸收蓝光和抗光老化的角度出发，研究蓝光对表皮屏障稳态的产品相对较少。因此，亟需通过细胞实验筛选出对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有有效保护作用的活性成分，并将其安全的应用到护肤品中达到修复蓝光损伤肌肤屏障的效果。

发明内容

本发明旨在提供一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的活性成分及其组合物，该组合物可显著减少蓝光诱生的ROS和改善蓝光导致的角质形成细胞迁移能力的减弱，促进角质形成细胞的迁移，从而促进受损屏障的修复；将该组合物应用于护肤化妆品中可有效缓解蓝光导致的皮肤屏障修复延迟、皮肤干燥等问题。

本发明的技术方案如下：

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，所述的组合物包括金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷，所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为(0.01～1):(0.01～4)，且金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比＞1:1。

优选的，所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为1:1.5～1:5。

更优选的，所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为1:1.5～1:4。

金耳(Tremella aurantialba)，又称黄金银耳，是一种珍贵的食药用真菌，《中国药用真菌》记载金耳药性温中带寒，味甘，胶质细腻、具有润滑皮肤等功效。金耳多糖是金耳的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗辐射、抗氧化、保湿、抗炎等功效，而金耳作为食用菌中的稀有珍贵菌种，主要应用在食品领域，而在化妆品中的研究应用较少，与蓝光相关的研究基本没有，因此金耳粗多糖在未来化妆品原料中的应用具有广阔的市场前景。所述的金耳粗多糖是通过以下方法制备得到的：

步骤(1)、将新鲜金耳子实体烘干后粉碎，按照料液比1:15(g:mL或kg:L)加入95％乙醇常温搅拌24h，抽滤，滤饼烘干，得到脱脂干粉；

步骤(2)、将脱脂干粉加入去离子水，搅拌至脱脂干粉溶胀，调节pH＝5.5～6.5，在温度45～55℃下，加入纤维素酶和果胶酶，45～55℃保温酶解30～45min；再于75～80℃水提1h，冷却，离心，取上清液，蒸发浓缩，加无水乙醇浓度至75～80％，4℃醇沉24h，离心，取沉淀，干燥，即得金耳粗多糖。

所述的的纤维素酶的用量为脱脂干粉的6％wt，纤维素酶的酶活为22U/mg；所述的果胶酶的用量为脱脂干粉的4％wt，果胶酶的酶活为31.3U/mg。

葡糖基橙皮苷(Glucosyl Hesperidin)具有较好的水溶性，其橙皮苷是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物，是柑橘果皮和果肉的重要成分，其含量可达柑橘幼鲜果重的1.4％。

发明人通过研究发现金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷均对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有一定的保护作用，均可通过促进角质形成细胞的增殖和迁移能力，通过保护皮肤细胞免受来自数字设备的人工蓝光的影响，从而改善皮肤屏障功能。将金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷两者按照特定比例组合，创造性的发现具有协同功效。在具体实施方式中，于总量一致的情况下，两者组合使用的效果显著优于单独使用的效果。

本发明的另一个目的在于提供所述的对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷在制备化妆品中的应用。

一种化妆品，它是以本发明所述的对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷为主要活性成分，与辅料制成的；其中，对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷占化妆品总质量的0.1％～4％。

优选的，依据化妆品肤感，对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷占化妆品总质量的0.1％～3％。

优选的，所述的辅料为：溶剂、增稠剂、防腐剂、pH调节剂、保湿剂、皮肤调理剂、柔润剂、促渗剂、螯合剂、乳化剂、精油、香精、色素中的至少一种。

具体的，所述的溶剂可以选自去离子水。

所述的增稠剂可以选自卡波姆。

所述的防腐剂选自对羟基苯乙酮和1,2-己二醇中的至少一种。

所述的pH调节剂可以选自精氨酸。

所述的保湿剂可以选自甘油、透明质酸钠、甜菜碱、海藻糖、泛醇、聚谷氨酸、神经酰胺中的至少一种。

所述的乳化剂可以选自鲸蜡硬脂醇(和)鲸蜡硬脂基葡糖苷、氢化卵磷脂中的至少一种。

所述的柔润剂选自霍霍巴籽油、异壬酸异壬酯、氢化聚癸烯、辛酸/癸酸甘油三酯、聚二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇中的至少一种。

所述的螯合剂可以选自EDTA二钠。

优选的，所述的化妆品含有以下活性成分中的至少一种：透明质酸钠、尿囊素、聚谷氨酸、神经酰胺、虾青素、海藻糖、泛醇、甜菜碱、甘草酸二钾、生育酚乙酸酯、抗坏血酸葡糖苷、马齿苋提取物、枸杞果提取物、人参根提取物、茯苓提取物、绿茶提取物、珍珠粉。

所述的化妆品为柔肤水、面膜、精华液、眼霜、眼膜、护肤凝胶、护肤乳液、面霜、喷雾剂。

一种眼霜，它是由包括以下质量百分比的成分制成的：甘油3～8％、卡波姆0.1～0.3％、透明质酸钠0.01～0.1％、对羟基苯乙酮0.1～1％、EDTA二钠0.01～0.1％、鲸蜡硬脂醇(和)鲸蜡硬脂基葡糖苷1～4％、霍霍巴籽油0.1～3％、异壬酸异壬酯0.2～2％、氢化聚癸烯0.2～2％、鲸蜡硬脂醇0.1～2.5％、聚二甲基硅氧烷0.1～2.5％、氢化卵磷脂0.5～3％、辛酸/癸酸甘油三酯0.1～2％、尿囊素0.01～0.1％、甜菜碱0.4～2％、海藻糖0.4～2％、生育酚乙酸酯0.1～2％、泛醇0.1～1％、神经酰胺0.1～1％、聚谷氨酸0.01～0.1％、甘草酸二钾0.04～0.2％、对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷0.1～4％、1,2-己二醇0.1～1％、pH调节剂调节pH至5.5～6.5，加去离子水至100％。

本发明所述的另一个目的是提供一种所述的眼霜的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、将鲸蜡硬脂醇(和)鲸蜡硬脂基葡糖苷、霍霍巴籽油、异壬酸异壬酯、氢化聚癸烯、鲸蜡硬脂醇、聚二甲基硅氧烷、氢化卵磷脂、辛酸/癸酸甘油三酯混合加热至75～80℃，形成油相；

步骤(2)、将甘油、卡波姆、透明质酸钠、对羟基苯乙酮、尿囊素、EDTA二钠加入至去离子水中，加热至70～75℃，搅拌分散至完全溶解，形成水相；

步骤(3)、将油相缓慢加入至水相中使其与水相混合，在温度65～70℃、转速3000rpm下均质4min左右；

步骤(4)、降温至50℃，加入甜菜碱、海藻糖、泛醇、聚谷氨酸、甘草酸二钾、生育酚乙酸酯、神经酰胺、金耳粗多糖和/或葡糖基橙皮苷，充分搅拌均匀后加入1,2-己二醇，采用pH调节剂调节pH至5.5～6.5；静置冷却，即得眼霜。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)、本发明组合物将金耳粗多糖复配具有较强抗氧化作用的葡糖基橙皮苷，金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷二者协同作用，能显著改善蓝光导致的细胞活性和增殖能力降低，减少蓝光诱生的ROS，同时促进角质形成细胞的迁移。该组合物可以保护细胞免受人工蓝光的损伤，从而有助于防止电子设备屏幕上人工蓝光照射产生的皮肤损伤。

(2)、本发明组合物可与其他活性成分和辅料搭配，制备相关产品。在此组合物的基础上添加具有消炎舒缓修复功效的泛醇、甘草酸二钾和具有保湿锁水功效的透明质酸钠、聚谷氨酸、神经酰胺、海藻糖、甜菜碱及具有抗氧化作用的生育酚乙酸酯，该配方制备的产品能够有效促进角质形成细胞的增殖和再生，从而促进受损肌肤屏障的愈合，有显著的保湿修复功效。此外，与现有市售添加了许多化学性防腐剂(如尼泊金酯类)的保湿修复产品相比，本发明通过对羟基苯乙酮和1,2-己二醇复配防腐，成分精简，长时间使用不刺激皮肤，安全温和舒缓，可广泛应用于皮肤屏障受损的后续护理，适合所有肤质人群使用。

(3)、本发明化妆品制备工艺简单，易于重现，适合于大规模的工业化生产，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为葡萄糖标准曲线。

图2为蛋白质标准曲线。

图3为活性成分对蓝光照射皮肤角质形成细胞活力的影响；其中，“****”表示蓝光组(LED-BL组)的空白对照与对照组(Control组)的空白对照相比，具有显著性差异(P＜0.0001)；蓝光组中，“**”表示处理1,2,3与空白对照具有显著性差异(P＜0.01)，“****”表示处理4,5,6,7与空白对照具有显著性差异(P＜0.0001)，“**”表示处理6与处理2具有显著性差异(P＜0.01)，“*”表示处理6与处理3,4具有显著性差异(P＜0.1)。

图4表示活性成分对蓝光照射角质形成细胞内ROS生成水平的影响；其中，“****”表示空白对照1和空白对照2具有显著性差异(P＜0.0001)；“****”表示空白对照2和处理1,2,3具有显著性差异(P＜0.0001)；“**”表示处理3和处理2具有显著性差异(P＜0.01)；“****”表示处理3和处理1具有显著性差异(P＜0.0001)。

图5为活性成分对蓝光照射角质形成细胞迁移能力的影响；其中，“****”表示空白对照1和空白对照2具有显著性差异(P＜0.0001)；“****”表示空白对照2和处理1,2,3具有显著性差异(P＜0.0001)；“**”表示处理3和处理1,2具有显著性差异(P＜0.01)。

图6为眼霜体外(25℃+RH80％)保湿实验结果。

图7为眼霜体外(25℃+RH40％)保湿实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。显然，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。

实施例1

金耳粗多糖的制备方法如下：

步骤(1)、将新鲜金耳子实体烘干后粉碎，得到金耳干燥粉末，按照料液比1:15(g:mL或kg:L)加入95％乙醇常温搅拌24h进行脱脂，抽滤，滤饼烘干，得到脱脂干粉；

步骤(2)、将步骤(1)得到的脱脂干粉加入去离子水，搅拌至干粉溶胀后，加适量1mol/L NaOH调节pH＝5.5，加热升温至50℃，加入纤维素酶和果胶酶(纤维素酶的酶活是22U/mg；果胶酶的酶活是31.3U/mg；纤维素酶的用量为脱脂干粉的6％wt；果胶酶的用量为脱脂干粉的4％wt)，50℃保温酶解30min；再于80℃水提1h，冷却后离心，取上清液，旋转蒸发浓缩，加入无水乙醇浓度至75％，4℃醇沉24h，离心，取沉淀，干燥后即得金耳粗多糖。

测定金耳粗多糖中总糖和蛋白质含量

(1)总糖含量的测定

分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL浓度为0.1mg/mL葡萄糖溶液置具塞试管中，用蒸馏水补至1mL，然后分别加入1mL 5％苯酚和5mL浓H₂SO₄，摇匀，室温静置30min后，于490nm处测定各葡萄糖浓度的吸光度值，绘制标准曲线(图1)，以水按同样显色处理作为空白对照，葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标。

取金耳粗多糖，用蒸馏水配制成浓度为1mg/mL的样品液，吸取0.5mL 1mg/mL的样品液置具塞试管中，用蒸馏水补至1mL，然后分别加入1mL 5％苯酚和5mL浓H₂SO₄，摇匀，室温静置30min后，于490nm处测定葡萄糖浓度的吸光度值，依据标准曲线计算总糖含量。

(2)蛋白质含量的测定

准确吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准牛血清蛋白溶液于10mL具塞试管中，用蒸馏水补至1mL，再分别加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分摇匀，室温放置10min，于波长595nm处测定吸光度值，绘制标准曲线(图2)，以水按同样显色处理作为空白对照，蛋白质质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标。

取金耳粗多糖，用蒸馏水配制成浓度为1mg/mL的样品液，取0.5mL样品液加蒸馏水补足至1mL，再分别加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液(10mg考马斯亮蓝+5mL95％乙醇+10mL85％磷酸，加蒸馏水至100mL)，充分摇匀，室温放置10min，于波长595nm处测定吸光度值，测吸光度值并计算蛋白含量。

由表1可知，金耳粗多糖中总糖含量为93.66％，蛋白质含量为6.60％。

表1.金耳粗多糖中总糖和蛋白质含量

实施例2

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，由金耳粗多糖(实施例1)和葡糖基橙皮苷按照质量比为1:1组成。

实施例3

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，由金耳粗多糖(实施例1)和葡糖基橙皮苷按照质量比为2:3组成。

实施例4

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，由金耳粗多糖(实施例1)和葡糖基橙皮苷按照质量比为3:7组成。

实施例5

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，由金耳粗多糖(实施例1)和葡糖基橙皮苷按照质量比为1:4组成。

实施例6

一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，由金耳粗多糖(实施例1)和葡糖基橙皮苷按照质量比为1:5组成。

实施例7

按照表2配方分别制备眼霜，制备方法如下：

步骤(1)、将鲸蜡硬脂醇(和)鲸蜡硬脂基葡糖苷、霍霍巴籽油、异壬酸异壬酯、氢化聚癸烯、鲸蜡硬脂醇、聚二甲基硅氧烷、氢化卵磷脂、辛酸/癸酸甘油三酯混合加热至75～80℃，形成油相(B相)，待用；

步骤(2)、将甘油、卡波姆、透明质酸钠、对羟基苯乙酮、尿囊素、EDTA二钠加入至去离子水中，加热至70-75℃，搅拌分散至完全溶解，形成水相(A相)，待用；

步骤(3)、将B相缓慢加入至A相中使其与A相混合，在温度70℃、转速3000rpm下均质4min左右；

步骤(4)、降温至50℃，加入C相组分即甜菜碱、海藻糖、泛醇、聚谷氨酸、甘草酸二钾、生育酚乙酸酯、神经酰胺、金耳粗多糖和/或葡糖基橙皮苷，充分搅拌均匀后加入D相成分即1,2-己二醇和精氨酸，调节pH至6.03；

步骤(5)、将步骤(4)所得膏霜静置冷却，装瓶。

表2眼霜的配方

注：配方1不含抗蓝光组合物，为空白对照；配方2、3、4、5含抗蓝光组合物，金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比分别为2:3、3:7、1:4、1:5；配方6只含金耳粗多糖；配方7只含葡糖基橙皮苷。

为了更好地说明本发明的优点，下面给出本发明提供技术方案的实验效果：考察金耳粗多糖、葡糖基橙皮苷以及两者组合对蓝光损伤细胞的保护效果、对HaCaT细胞活性、ROS的产生、细胞迁移能力的影响。

一、活性成分对蓝光照射皮肤角质形成细胞活力的影响

选取对数期生长的角质形成细胞(HaCaT细胞)，消化及离心、计数后，用含10％胎牛血清的MEM培养基稀释成5×10⁴/mL的浓度，接种在96孔细胞培养板上，每孔100μL。在5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养24h(保证细胞已贴壁)，此后，弃去96孔板内的培养基，加入含不同样品的10％胎牛血清的MEM完全培养基(处理1：金耳粗多糖，培养基中终浓度0.04％；处理2：葡糖基橙皮苷，培养基中终浓度0.04％；处理3：实施例2组合物，培养基中终浓度0.04％；处理4：实施例3组合物，培养基中终浓度0.04％；处理5：实施例4组合物，培养基中终浓度0.04％；处理6：实施例5组合物，培养基中终浓度0.04％；处理7：实施例6组合物，培养基中终浓度0.04％；以10％胎牛血清的MEM完全培养基为空白对照)，每组设置5个平行。即HaCaT细胞均用药物预处理(加药后放入培养箱，在培养箱37℃，5％CO₂中孵育)24h后，弃去培养基，加入PBS缓冲液，在距离孔板15cm的上方用LED蓝光灯(450nm，100mw/cm²)照射1h。照射后立即用含10％胎牛血清的MEM完全培养基代替，在受控加湿培养箱(37℃，5％CO₂)中孵育24h，弃去孔内培养基，每孔加入100μL含10％胎牛血清的MEM完全培养基和20μLMTT(MTT浓度为5mg/mL，采用PBS缓冲液配制)，继续培养4h；终止培养，每孔加入150μL二甲基亚砜，室温放置1h，使结晶物充分溶解；用酶标仪测定570nm波长处各孔的吸光值(OD值)。

同时设置不进行蓝光照射的对照组(即Control组)，用样品预处理24h后，弃去培养基，加入PBS缓冲液，避光培养1h，其他处理均与LED-BL组相同。

设置培养液对照孔以调零，培养液对照孔不含细胞，其他均与测定孔保持一致。

取5个平行孔的平均OD值，按照以下公式计算细胞活性(％)：

表3.活性成分对蓝光照射皮肤角质形成细胞活力的影响结果

由图3和表3可知，蓝光组中，处理1、2、3、4、5、6、7的细胞活性显著高于空白对照组的细胞活性，说明金耳粗多糖、葡糖基橙皮苷以及两者组合均能提高蓝光照射下的细胞活性，且处理4、5、6、7的细胞活性又显著高于处理1、2、3的细胞活性，由此可知，金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷为质量比1:1.5～1:5，具体当两者质量比为2:3、3:7、1:4、1:5组合对细胞活性具有更为显著的改善效果。

二、活性成分对蓝光照射角质形成细胞内ROS生成水平的影响

选取对数期生长的角质形成细胞，消化及离心、计数后，用含10％胎牛血清的MEM培养基稀释成5×10⁴/mL的浓度，接种在6孔细胞培养板上，每孔2mL；在5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养24h，此后，弃去6孔板内的培养基，加入含不同样品的10％胎牛血清的MEM完全培养基(处理1：金耳粗多糖，培养基中终浓度0.04％；处理2：葡糖基橙皮苷，培养基中终浓度0.04％；处理3：实施例5组合物，培养基中终浓度0.04％；以10％胎牛血清的完全MEM培养基为空白对照，空白对照1不进行蓝光照射，空白对照2进行蓝光照射)对细胞预处理24h，之后用LED蓝光灯(450nm，100mw/cm²)照射1h。照射后每孔立即加入1mL含活性氧荧光探针DCFH-DA(10μM/L)的无血清MEM基础培养基，孵育30min后，使用荧光显微镜拍摄图片，对细胞内的活性氧(ROS)进行荧光定量，分别检测空白对照1、2和处理1、2、3对角质形成细胞在蓝光下的活性氧生成量的影响。

表4.活性成分对蓝光照射角质形成细胞内ROS生成水平的影响结果

样品	空白对照1	空白对照2	处理1	处理2	处理3
						活性氧生成量	2.888±0.291	51.999±2.217	38.971±1.365	33.109±2.399	25.256±1.452

由图4和表4可知，处理1、2、3的活性氧生成量均显著小于空白对照2的活性氧生成量百分比，且处理3的活性氧生成量又显著小于处理1、2的活性氧生成量，说明金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷相互协同增效，从而有效减少蓝光辐射下产生的活性氧，以有效减弱蓝光对皮肤的损伤。

三、活性成分对蓝光照射角质形成细胞迁移能力的影响

将HaCaT细胞以1.0×10⁵/mL的浓度接种于6孔细胞培养板(培养基：含10％胎牛血清的MEM完全培养基)，每孔2mL；在5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养至细胞融合率为100％，之后用200μL枪头进行细胞划痕，划痕后用LED蓝光灯(450nm，100mw/cm²)照射1h，之后将含1％胎牛血清的MEM基础培养基(处理1：金耳粗多糖，培养基中终浓度0.04％；处理2：葡糖基橙皮苷，培养基中终浓度0.04％；处理3：实施例5组合物，培养基中终浓度0.04％，以含1％胎牛血清的MEM基础培养基为空白对照，空白对照1划痕后不进行蓝光照射，空白对照2进行蓝光照射)分别与细胞共同孵育24h，在0h和24h于显微镜下观察并拍照(0h对应原面积，24h对应划痕后面积)，用软件Image J计算细胞迁移率，公式为：

细胞迁移率＝(原面积－划痕后面积)/原面积×100％

表5.活性成分对蓝光照射角质形成细胞迁移能力的影响结果

由图5和表5可知，处理1、2、3的细胞迁移能力均显著高于空白对照1、2的细胞迁移能力，且处理3的细胞迁移能力显著高于处理1、2的细胞迁移能力，进一步说明金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷可相互协同增效，有效促进蓝光照射后细胞的迁移，从而改善皮肤屏障的修复能力。

四、产品的感官理化指标和体外保湿试验

(1)、产品的感官理化指标

按化妆品常规实验方法对实施例7制得的眼霜(以配方2为例)进行感官及稳定性测试。

结果如下表6所示，眼霜(以配方2为例)的感官及稳定性试验均符合要求，质量稳定。

表6.眼霜的感官及稳定性试验结果

(2)、产品的体外保湿实验

体外保湿实验在25℃恒温环境下进行，相对湿度分别为80％和40％，前8小时，每2小时测定一次，最后于24小时测试一次。

空烧杯称重得M₁，适量眼霜涂抹于烧杯底部称重得M₂，将烧杯放入稳定的恒温恒湿箱(25℃+RH80％；25℃+RH40％)，隔一定时间取出烧杯，称重得M₃，计算水分损失率，按以下公式：

表7.眼霜体外保湿(25℃+RH80％)24h水分损失率

样品	24h水分损失率(％)
		配方1	16.579
配方2	10.430
		配方3	11.286
配方4	12.089
		配方5	12.796
配方6	12.140
		配方7	13.095

表8.眼霜体外保湿(25℃+RH40％)24h水分损失率

样品	24h水分损失率(％)
		配方1	66.417
配方2	52.939
		配方3	55.186
配方4	57.697
		配方5	59.266
配方6	58.186
		配方7	59.904

由图6、图7、表7和表8可知，配方2、3、4、5、6、7的体外保湿效果显著高于配方1的体外保湿效果，说明添加该组合物中任意一种或两种成分均具有较好的保湿效果。同时配方2、3、4的保湿效果又优于配方6、7。由此可知，在金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为1:1.5～1:4时，将葡糖基橙皮苷与金耳粗多糖复配形成组合物所制备的化妆品产品具有更为显著的保湿能力。

实验结果表明，在添加百分比一致的情况下，二者按比例混合使用，优于单独使用的效果，即组合物的效果更为显著。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，其特征在于：所述的组合物包括金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷，所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为(0.01～1):(0.01～4)，且金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比＞1:1。

2.根据权利要求1所述的对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，其特征在于：所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为1:1.5～1:5。

3.根据权利要求2所述的对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，其特征在于：所述的金耳粗多糖和葡糖基橙皮苷的质量比为1:1.5～1:4。

4.根据权利要求1、2或3所述的对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物，其特征在于：所述的金耳粗多糖是通过以下方法制备得到的：

5.权利要求1所述的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷在制备化妆品中的应用。

6.一种化妆品，其特征在于：它是以权利要求1所述的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷为主要活性成分，与辅料制成的；其中，对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷占化妆品总质量的0.1％～4％，优选为0.1％～3％。

7.根据权利要求6所述的化妆品，其特征在于：所述的辅料为：溶剂、增稠剂、防腐剂、pH调节剂、保湿剂、皮肤调理剂、柔润剂、促渗剂、螯合剂、乳化剂、精油、香精、色素中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的化妆品，其特征在于：所述的化妆品含有以下活性成分中的至少一种：透明质酸钠、尿囊素、聚谷氨酸、神经酰胺、虾青素、海藻糖、泛醇、甜菜碱、甘草酸二钾、生育酚乙酸酯、抗坏血酸葡糖苷、马齿苋提取物、枸杞果提取物、人参根提取物、茯苓提取物、绿茶提取物、珍珠粉。

9.根据权利要求6所述的化妆品，其特征在于：所述的化妆品为柔肤水、面膜、精华液、眼霜、眼膜、护肤凝胶、护肤乳液、面霜、喷雾剂。

10.一种眼霜，其特征在于：它是由包括以下质量百分比的成分制成的：甘油3～8％、卡波姆0.1～0.3％、透明质酸钠0.01～0.1％、对羟基苯乙酮0.1～1％、EDTA二钠0.01～0.1％、鲸蜡硬脂醇(和)鲸蜡硬脂基葡糖苷1～4％、霍霍巴籽油0.1～3％、异壬酸异壬酯0.2～2％、氢化聚癸烯0.2～2％、鲸蜡硬脂醇0.1～2.5％、聚二甲基硅氧烷0.1～2.5％、氢化卵磷脂0.5～3％、辛酸/癸酸甘油三酯0.1～2％、尿囊素0.01～0.1％、甜菜碱0.4～2％、海藻糖0.4～2％、生育酚乙酸酯0.1～2％、泛醇0.1～1％、神经酰胺0.1～1％、聚谷氨酸0.01～0.1％、甘草酸二钾0.04～0.2％、权利要求1所述的对蓝光诱导皮肤细胞损伤具有保护作用的组合物或金耳粗多糖或葡糖基橙皮苷0.1～4％、1,2-己二醇0.1～1％、pH调节剂调节pH至5.5～6.5，加去离子水至100％。