CN113811617A - 用于蛋白质组学剖析及表征的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于在单细胞水平上鉴定和表征不同细胞类型的蛋白质，特别是细胞表面蛋白质的方法和系统。还提供了用于通过细胞的蛋白质表达谱来区分细胞的方法和系统。另外，提供了以超高通量定量和表征单细胞中的蛋白质的方法和系统。本文所提供的方法和系统能够灵敏地剖析单细胞的蛋白质组中的所有表位。

Description

用于蛋白质组学剖析及表征的方法和系统

技术领域

本发明整体涉及细胞的蛋白质表达模式的鉴定、表征和剖析，或者细胞的蛋白质组学分析，并且更具体地涉及使用可以用于自动化系统中的独特的加上条形码的核苷酸引物在单细胞中进行蛋白质组学分析。

相关申请

本申请要求以下美国临时申请的优先权：2019年4月4日提交的名称为‘Method,System And Apparatus For Antibody Tag Priming And Genomic Dna Bridge’的U.S.S.N.62/829,291；2019年4月2日提交的名称为‘A Complete Solution For HightThroughput Single Cell Sequencing’的U.S.S.N.62/828,386；2019年4月2日提交的名称为‘Analytical Methods To Identify Tumor Heteregeneity’的U.S.S.N.62/828,416；2019年4月2日提交的名称为‘Method and Apparatus for Universal base librarypreparation’的U.S.S.N.62/828,420；以及2019年4月4日提交的名称为‘Method andApparatus for Fusion in DNA and RNA’的U.S.S.N.62/829,358，所有这些临时申请均以引用方式并入本文。

背景技术

蛋白质是包括细胞代谢、结构动力学和信息处理在内的细胞功能的主要效应物。蛋白质是细胞的物理结构单元，构成了细胞质量的大部分并且执行大多数细胞功能，包括细胞结构动力学、代谢和信息处理。它们是将热力学势能转化为生命系统能量的分子机器。因此，测量蛋白质表达和修饰对于获得细胞状态和功能的准确反映非常重要。当在单细胞水平上测量蛋白质时，常见的挑战是大多数细胞系统是异质的，含有大量在分子上不同的细胞。例如，厘米大小的组织体积可以含有数十亿个细胞，每个细胞具有其自身独特的蛋白质表达和修饰谱；此外，这种潜在的细胞异质性可能对整个系统具有重要影响，诸如在发育、免疫系统的调节、癌症进展和治疗反应方面。对于像这样的异质系统，用于单细胞中的高通量蛋白质剖析的方法是必需的。

以高通量对单细胞中的蛋白质进行剖析需要灵敏且快速的方法。用荧光标记的抗体进行的流式细胞术数十年来一直是生物学的基石，因为该技术可以灵敏地对数百万个单细胞中的蛋白质进行剖析。通过用不同颜色的染料标记抗体，可以对数十种蛋白质进行多重剖析。通过用质量标签交换染料并使用质谱仪读出，可以将多重分析增加到超过一百种抗体。然而，尽管这些方法在不断提高灵敏度和多重分析能力，但它们仍然远不能表征单细胞中的整个蛋白质组，对于人来说，蛋白质组包含>20,000蛋白质和>100,000个表位。能够灵敏地剖析蛋白质组中的所有表位的系统将极有价值，因为它免去了对选择靶向哪些蛋白质的需要。然而，采用染料和质量标签的现有方法不能扩展到全蛋白质组分析的水平，并且就大量细胞计数法而言，在分析期间破坏转录组使得从同一单细胞同时获得蛋白质组和转录组的测量结果具有挑战性。(参见Shahi,P.、Kim,S.、Haliburton,J.等人，Abseq:Ultrahigh-throughput single cell protein profiling with droplet microf luidicbarcoding.Sci Rep 7,44447(2017).https://doi.org/10.1038/sre p44447)。

因此，在单细胞水平上表征不同细胞类型的蛋白质(特别是细胞表面蛋白质)的需要是显而易见的。还需要通过细胞的蛋白质表达谱来区分细胞。此外，还需要以超高通量检测和定量单细胞中的蛋白质。问题是，由于来自信号的读出中存在不是由细胞造成的噪声量，因此在单细胞水平上对蛋白质的定量表征具有挑战性。这里提供的本发明解决了这些未满足的需求。

发明内容

本文描述和要求保护的发明具有多个属性和实施方案，包括但不限于在本发明内容中阐述或描述或引用的那些属性和实施方案。本文描述和要求保护的发明不限于本发明内容中识别的特征或实施方案，或受这些特征或实施方案的限制，这些特征或实施方案仅出于说明而非限制的目的包括在内。

在第一方面，本发明的实施方案涉及确定和表征单细胞的蛋白质表达模式的方法。

一个示例性实施方案包括以下步骤：将侧接有PCR引发位点的条形码序列缀合到抗体上，其中条形码序列对抗体具有特异性；使用所述条形码缀合的抗体进行细胞鉴定步骤；划分或分离单独的细胞并且将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；将经包封的细胞与液滴中的蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；提供一个或多个核酸扩增引物组，其中引物组中的一个或多个引物包含与抗体相关联的条形码识别序列；进行核酸扩增反应以产生一个或多个扩增子；提供亲和试剂，该亲和试剂包含与引物组的一种或多种核酸引物的条形码识别序列互补的核酸序列，其中包含与条形码识别序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的扩增产物在足以使亲和试剂与靶核酸结合的条件下接触，以形成亲和试剂结合的靶核酸；以及通过对扩增子的条形码测序来确定一种或多种蛋白质的身份并且对所述一种或多种蛋白质进行表征。

另一个实施方案包括确定和表征单细胞的蛋白质表达模式的方法，该方法包括以下步骤(不受次序约束)：将侧接有PCR引发位点的条形码序列缀合到抗体上，其中条形码序列对抗体具有特异性；使用所述条形码缀合的抗体进行细胞鉴定步骤；划分或分离单独的细胞并且将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；将经包封的细胞与液滴中的蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；提供靶向细胞中存在的核酸的一个或多个核酸扩增引物组，其中引物组中的一个或多个引物包含与抗体相关联的条形码识别序列；提供靶向细胞中存在的核酸的一个或多个核酸扩增引物组，其中引物组的一个或多个引物包含对于每个细胞独特的条形码识别序列；任选地，进行逆转录聚合酶步骤；进行核酸扩增反应以产生一个或多个扩增子；提供亲和试剂，该亲和试剂包含与引物组的一种或多种核酸引物的条形码识别序列互补的核酸序列，其中包含与条形码识别序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的扩增产物在足以使亲和试剂与靶核酸结合的条件下接触，以形成亲和试剂结合的靶核酸；以及通过对扩增子的条形码测序来确定一种或多种蛋白质的身份并且对所述一种或多种蛋白质进行表征。

在一个示例性具体实施中，反向引物包含以下核酸序列：CTCAACACGGGAAACCTCAC(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，正向引物包含以下核酸序列：CGCTCCACCAACTAAGAACG(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，反向引物包含以下核酸序列：TTCCCTCTACACACTGC(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，正向引物包含以下核酸序列：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，反向引物包含以下核酸序列：CCCGAGTAGCTGGGA TTACA(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，正向引物包含以下核酸序列：CCTGAGGTCAGGAGTTC(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，正向条形码引物包含以下核酸序列：GTACTCGCAGTAGTCCGCTCCACCAACTAAGAACG(SEQ ID NO:)。在一个示例性具体实施中，反向条形码引物包含以下核酸序列：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTAAGTGCTGATCTTGGATGTGACG(SEQ ID NO:)。

另一个示例性实施方案包括添加与抗体连接的条形码识别序列，该方法包括以下步骤(不受次序约束)：进行靶gDNA的加条形码PCR反应，其中使用a)含有细胞条形码序列和PCR柄的引物；b)含有与靶基因组DNA互补的序列和PCR柄的引物，所述引物与含有所述细胞条形码的所述引物互补，和c)反向引物，所述反向引物包含与所述靶基因组DNA互补的序列、抗体标签序列、第二PCR柄，并且可以包含独特分子标签，以产生包含细胞条形码、靶DNA序列、在5’端和3’端均具有PCR柄的抗体标签的扩增子；以及使用第一引物进行文库创建PCR反应，所述第一引物包含测序衔接子、样品索引以及与所述扩增子上产生的所述两个PCR柄互补的序列，以产生包含测序衔接子、双或单样品索引、细胞条形码、靶DNA序列、抗体标签并且可以包含独特分子标签的文库。

另一个示例性实施方案涉及用于添加与抗体连接的条形码识别序列的方法，该方法包括以下步骤(不受次序约束)：进行靶gDNA的加条形码PCR反应，其中使用a)含有细胞条形码序列和PCR柄的引物；b)含有与靶基因组DNA互补的序列和PCR柄的引物，所述引物与含有所述细胞条形码的所述引物互补，和c)反向引物，所述反向引物包含与所述靶基因组DNA互补的序列、抗体标签序列、第二PCR柄，并且可以包含独特分子标签，以产生扩增子，所述扩增子包含细胞条形码、靶DNA序列、在5’端和3’端均具有PCR柄的抗体标签、第一读段序列、第一细胞条形码、恒定区1、第二细胞条形码、恒定区2、正向引物序列、长度为“n”的插入序列、包含与所述靶基因组DNA互补的序列的反向引物、独特分子标识符、抗体标签序列、第二独特分子标识符、第二读段序列；以及使用第一引物和第二引物进行文库创建PCR反应，所述第一引物包含测序衔接子、样品索引以及与在包含P5序列和第二读段序列的扩增子上产生的两个PCR柄互补的序列，所述第二引物包含第二读段序列、索引序列和P7序列，以产生包含测序衔接子、双或单样品索引、细胞条形码、靶DNA序列、抗体标签并且可以包含独特分子标签的文库。

在一个示例性具体实施中，该方法还包括制备可以基于细胞条形码配对的抗体文库和DNA文库。

在一个示例性具体实施中，该方法还包括制备可以基于细胞条形码配对的抗体文库和RNA文库。

在一个示例性具体实施中，该方法还包括制备可以基于细胞条形码配对的抗体文库、DNA文库和RNA文库。

附图说明

图1是在一些实施方案中使用的方法的示意图。在该附图中，使用以下名称：A-tag＝抗体标签；CBC＝细胞条形码；const1＝恒定区1；const2＝恒定区2；并且Index＝样品索引。

图2示出了来自染色细胞，KG-1细胞和Raji细胞的等量混合物的抗体文库的HSDNA芯片数据图。上图示出了来自使用2uL靶向LINE1的530bp扩增子(包含衔接子)的抗体文库1(管1-4)的结果(图2A)。下图示出了来自使用2uL靶向LINE1的530bp扩增子(包含衔接子)的抗体文库2(管5-8)的结果(图2B)。

图3示出了来自染色细胞，KG-1细胞和Raji细胞的等量混合物的对应DNA文库的HSDNA芯片数据图。上图示出了来自使用2uL靶向急性髓性白血病中常见的突变的50扩增子组的DNA文库1(管1-4)的结果。下图示出了来自使用2uL靶向急性髓性白血病中常见的突变的50扩增子组的DNA文库2(管5-8)的结果。

图4是示出在修剪细胞条形码和抗体标签之后扩增子与LINE1的比对的图。具有细胞条形码和抗体标签两者的读段中的99.4％与LINE1比对。

图5是示出扩增子在hg19上的分布的数据表。来自抗体文库的1098个配对读段与hg19比对。读段与具有不同长度的每个染色体比对。

图6是其中使用来自抗体文库的配对读段的子样品来分析抗体检出的表。基于标签序列，细胞对于CD34、CD19或这两者是阳性的。输入反应的细胞是等比例混合的KG-1和Raji，其中KG-1细胞对于CD34是阳性的，并且Raji细胞对于CD19是阳性的。大多数抗体在细胞条形码之间是独特的，如用来自染色细胞的经测序的单细胞抗体文库应当观察到的。

具体实施方式

现在将参考以下章节描述本发明的各个方面，以下章节将被理解为仅通过说明的方式提供而不构成对本发明范围的限制。

“互补性”是指核酸形成氢键或通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型与另一核酸序列杂交的能力。如本文所用，“杂交”是指分子在低、中或高度严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、双重化或杂交，包括当所述序列存在于复杂混合物(例如，总细胞)DNA或RNA中时。参见例如Ausubel等人,Current Protocols In MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1993。如果多核苷酸的特定位置处的核苷酸能够与反平行DNA或RNA链中相同位置处的核苷酸形成沃森-克里克配对，则所述多核苷酸和DNA或RNA分子在所述位置处彼此互补。当每个分子中足够数量的相应位置被可以彼此杂交或退火以影响所需过程的核苷酸占据时，多核苷酸和DNA或RNA分子彼此“基本互补”。互补序列是能够在严格条件下退火以提供用作互补链的合成起点的3'-末端的序列。

本领域已知的“同一性”是两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定。在本领域中，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，如通过这些序列的串之间的匹配所确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法来计算，所述方法包括但不限于在Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.编,Academic Press,New York,1993；ComputerAnalysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M StocktonPress,New York,1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.,Siam J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些。此外，可以从使用Vector NTI Suite 8.0(Informax,Frederick,Md.)的AlignX组件的默认设置产生的氨基酸和核苷酸序列比对中获得同一性百分比值。确定同一性的优选方法被设计成在测试的序列之间提供最大匹配。确定同一性和相似性的方法编入公开可用的计算机程序中。确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,S.,等人,NCBINLM NIH Bethesda,Md.20894:Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。众所周知的史密斯沃特曼算法(Smith Waterman algorithm)也可用于确定同一性。

术语“扩增”、“扩增反应”及其变型通常是指核酸分子(称为模板核酸分子)的至少一部分凭借其被复制或拷贝到至少一个另外的核酸分子中的任何动作或过程。额外的核酸分子任选地包括与模板核酸分子的至少一些部分基本上相同或基本上互补的序列。模板核酸分子可以是单链或双链的，并且另外的核酸分子可以独立地是单链或双链的。在一些实施方案中，扩增包括用于产生核酸分子的至少一些部分的至少一个拷贝或产生与核酸分子的至少一些部分互补的核酸序列的至少一个拷贝的模板依赖性体外酶催化反应。扩增任选地包括核酸分子的线性或指数复制。在一些实施方案中，使用等温条件执行这种扩增；在其他实施方案中，这种扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是包括在单个扩增反应中同时扩增多个靶序列的多重扩增。至少一些靶序列可以位于包括在单个扩增反应中的相同核酸分子或不同靶核酸分子上。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或组合扩增基于DNA和RNA的核酸的至少一些部分。扩增反应可以包括单链或双链核酸底物，并且可以进一步包括本领域普通技术人员已知的任何扩增过程。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。在本发明中，使用术语核酸的“合成”和“扩增”。本发明中的核酸合成是指核酸从用作合成起点的寡核苷酸伸长或延伸。如果不仅这种合成而且其他核酸的形成以及这种形成的核酸的伸长或延伸反应连续发生，则这一系列反应统称为扩增。通过所采用的扩增技术产生的多核酸通常称为“扩增子”或“扩增产物”。

多种核酸聚合酶可用于本文提供的某些实施方案中使用的扩增反应中，包括可催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。这种核苷酸聚合可以模板依赖性方式发生。这些聚合酶可包括但不限于天然存在的聚合酶及其任何亚基和截短物、突变体聚合酶、变体聚合酶、重组、融合或以其他方式工程化的聚合酶、化学修饰的聚合酶、合成分子或组装体，以及其保留催化这种聚合的能力的任何类似物、衍生物或片段。任选地，聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变体聚合酶，所述突变涉及用其他氨基酸替换一个或多个氨基酸、从聚合酶中插入或删除一个或多个氨基酸、或连接两个或更多个聚合酶的部分。通常，聚合酶包含一个或多个活性位点，在所述位点处可以发生核苷酸结合和/或对核苷酸聚合的催化。一些示例性的聚合酶包括但不限于DNA聚合酶和RNA聚合酶。如本文所用，术语“聚合酶”及其变体还包括融合蛋白，所述融合蛋白包含至少两个相互连接的部分，其中第一部分包含可催化核苷酸聚合成核酸链的肽并连接至包含第二多肽的第二部分。在一些实施方案中，第二多肽可包括报告酶或加工性增强结构域。任选地，聚合酶可以具有5'核酸外切酶活性或末端转移酶活性。在一些实施方案中，聚合酶可以任选地被重新激活，例如通过使用热量、化学物质或将新的量的聚合酶重新添加至反应混合物中。在一些实施方案中，聚合酶可以包括热启动聚合酶或基于适体的聚合酶，其任选地可以被重新激活。

术语“靶引物”或“靶特异性引物”及其变型是指与结合位点序列互补的引物。靶引物通常是单链或双链多核苷酸，通常是寡核苷酸，其包括至少一个与靶核酸序列至少部分互补的序列。

“正向引物结合位点”和“反向引物结合位点”是指模板DNA和/或扩增子上正向和反向引物所结合的区域。引物用于界定在扩增期间呈指数扩增的原始模板多核苷酸的区域。在一些实施方案中，额外引物可以与正向引物和/或反向引物的5'的区域结合。在使用此类额外引物的情况下，正向引物结合位点和/或反向引物结合位点可涵盖这些额外引物的结合区以及引物本身的结合区。例如，在一些实施方案中，所述方法可以使用一个或多个与位于正向和/或反向引物结合区的5'的区域结合的额外引物。例如，在WO0028082中公开了这种方法，其公开了“置换引物”或“外引物”的用途。

“条形码”核酸识别序列可以掺入核酸引物中或连接至引物以使得独立测序和识别能够经由条形码彼此关联，该条形码涉及源自存在于相同样品内的分子的信息和识别。有许多技术可以用于将条形码附着至离散实体内的核酸。例如，可以首先扩增靶核酸，然后将其片段化成较短的片段，也可以不这样做。可以将这些分子与含有条形码的离散实体(例如液滴)结合。然后可以使用例如重叠延伸剪接术将条形码附着至分子。在该方法中，初始靶分子可以具有添加的“衔接子”序列，这些序列是引物可以合成到其上的具有已知序列的分子。当与条形码结合时，可以使用与衔接子序列和条形码序列互补的引物，使得靶核酸和条形码两者的产物扩增子可以彼此退火，并且经由延伸反应(诸如DNA聚合)延伸到彼此上，从而产生包含附着至条形码序列的靶核酸的双链产物。替代性地，扩增该靶标的引物自身可以加上条形码，使得在退火并且延伸到靶标上时，产生的扩增子具有掺入其中的条形码序列。该扩增子可以与许多扩增策略一起应用，包括使用PCR的特异性扩增或使用例如MDA的非特异性扩增。可以用于将条形码附着至核酸的替代性酶促反应是连接，包括平端连接或粘端连接。在该方法中，将DNA条形码与靶核酸和连接酶一起孵育，导致条形码与靶标连接。核酸的末端可以根据连接的需要通过多种技术进行修饰，包括通过使用用连接酶或片段引入的衔接子，以使得能够加大对添加到分子末端的条形码的数量的控制。

条形码序列可以另外掺入微流体珠粒中，以便用相同的序列标签装饰该珠粒。可将此类标记的珠粒插入微流体液滴中，并通过液滴PCR扩增，用唯一的珠粒条形码标记每个靶扩增子。此类条形码可用于识别源于扩增子群的特定液滴。当将包含单个单独细胞的微流体液滴与另一个含有标记珠粒的微流体液滴组合时，可以使用这种方案。在收集和组合多个微流体液滴后，扩增子测序结果允许将每个产物分配给唯一的微流体液滴。在一个典型的具体实施中，我们使用Mission Bio Tapestri^TM珠粒上的条形码来标记，然后识别每个液滴的扩增子内容。条形码的用途描述于Abate,A.等人于2018年3月29日提交的题为‘Sequencing of Nucleic Acids via Barcoding in Discrete Entities’的美国专利申请序列号15/940,850中，所述申请通过引用并入本文。

在一些实施方案中，将条形码引入珠粒(诸如固体聚合物珠粒或水凝胶珠粒)表面上的离散实体(例如微滴)中可能是有利的。这些珠粒可以使用多种技术合成。例如，使用混合-分裂技术，可以合成具有相同随机条形码序列的许多拷贝的珠粒。这可以通过例如产生多个包括DNA能够在其上合成的位点的珠粒来实现。可以将珠粒分成四个集合，并且将每个集合与将向其中添加碱基(诸如A、T、G或C)的缓冲液混合。通过将群体分成四个亚群，每个亚群可以具有添加到其表面的碱基中的一种。该反应能够以使得仅添加单一碱基而不添加另外的碱基的方式完成。可以将来自所有四个亚群的珠粒合并并混合在一起，然后第二次分成四个群体。在该分开步骤中，可以将来自前四个群体的珠粒随机地混合在一起。然后可以将它们添加到四种不同的溶液中，在每个珠粒的表面上添加另一种随机的碱基。可以重复该过程，以便在珠粒的表面上产生长度约等于群体被分裂和混合的次数的序列。例如，如果这样做10次，将得到这样的珠粒群体：其中每个珠粒都具有在其表面上合成的相同随机10碱基序列的许多拷贝。每个珠粒上的序列将由在每个混合-分裂循环中该珠粒所终止处的反应器特定序列决定。

条形码还可以包含‘唯一识别序列’(UMI)。UMI是具有可用于识别和/或区分与UMI缀合的一个或多个第一分子与一个或多个第二分子的序列的核酸。UMI通常很短，例如长度约为5至20个碱基，并且可以与一种或多种感兴趣的靶分子或其扩增产物缀合。UMI可以是单链或双链的。在一些实施方案中，核酸条形码序列和UMI两者都被并入核酸靶分子或其扩增产物中。通常，UMI用于区分群体或群组内相似类型的分子，而核酸条形码序列用于区分群体或分子群组。在使用UMI和核酸条形码序列两者的一些实施方案中，UMI的序列长度比核酸条形码序更短。

当用于指两个或更多个核酸序列时，如本文所用的术语“同一性”和“相同的”及其变体是指两个或更多个序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列相似性。在两个或更多个同源序列的情形中，序列或其子序列的同一性或同源性百分比指示所有单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)相同(即约70％同一性，优选地75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性)。当在比较窗口上进行最大对应性的比较和比对时，同一性百分比可以在规定的区域内，或者如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用下文描述的默认参数或通过手动比对和目视检查所测量的指定区域内。当在氨基酸水平或核苷酸水平上有至少85％同一性时，序列被称为“基本相同”。优选地，同一性存在于长度为至少约25、50或100个残基的区域内，或跨越至少一个比较序列的全长。确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的典型算法是BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)中。其他方法包括Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)和Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)等的算法。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其互补物在严格杂交条件下彼此杂交。

术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸的生物聚合物，并且除非上下文另有说明，否则包括修饰的和未修饰的核苷酸，以及DNA和RNA两者，以及修饰的核酸骨架。例如，在某些实施方案中，核酸是肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。通常，本文所描述的方法使用DNA作为核酸模板以执行扩增。然而，其核苷酸被来自天然DNA或RNA的人工衍生物或修饰的核酸替换的核酸也包括在本发明的核酸中，只要其用作用于合成互补链的模板。本发明的核酸通常含于生物样品中。生物样品包括动物、植物或微生物组织、细胞、培养物和分泌物，或其提取物。在某些方面，生物样品包括细胞内寄生基因组DNA或RNA，例如病毒或支原体。核酸可以源自含于所述生物样品中的核酸。例如，基因组DNA或从mRNA合成的cDNA，或基于源自生物样品的核酸扩增的核酸优选用于所描述的方法中。除非另有说明，每当表示寡核苷酸序列时，应理解核苷酸呈从左到右的5'至3'顺序，“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。寡核苷酸被称为具有“5'端”和“3'端”，因为单核苷酸通常通过将一个核苷酸的5'磷酸或等效基团连接至其相邻核苷酸的3'羟基或等效基团上，任选地通过磷酸二酯或其他合适的键合而反应形成寡核苷酸。

模板核酸是在核酸扩增技术中充当用于合成互补链的模板的核酸。具有与模板互补的核苷酸序列的互补链具有与模板对应的链的含义，但两者之间的关系仅是相对的。也就是说，根据本文所描述的方法，合成为互补链的链可以再次充当模板。也就是说，互补链可以成为模板。在某些实施方案中，模板源自生物样品，例如植物、动物、病毒、微生物、细菌、真菌等。在某些实施方案中，动物是哺乳动物，例如人类患者。模板核酸通常包含一种或多种靶核酸。示例性实施方案中的靶核酸可包含可根据本公开扩增或合成的任何单链或双链核酸序列，包括怀疑或预期存在于样品中的任何核酸序列。

本文实施方案中使用的引物和寡核苷酸包含核苷酸。核苷酸包含任何化合物，包括但不限于任何天然存在的核苷酸或其类似物，其可以选择性地结合聚合酶或被聚合酶聚合。通常，但不是必须地，核苷酸与聚合酶的选择性结合之后是核苷酸被聚合酶聚合成核酸链；然而，有时核苷酸可能会从聚合酶解离而不会并入核酸链中，此事件在本文中称为“非生产性”事件。此类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸，还包括任何类似物，无论其结构如何，其可以选择性地结合聚合酶或被聚合酶聚合。虽然天然存在的核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸部分，但本公开的核苷酸可包括缺少任何一种、一些或所有此类部分的化合物。例如，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施方案中，磷链可连接至糖环的任何碳，例如5'碳。磷链可以通过中间的O或S连接至糖。在一个实施方案中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P和O的磷酸基团的一部分。在另一实施方案中，链中的磷原子可以与中间的O、NH、S、亚甲基、取代的亚甲基、亚乙基、取代的亚乙基、CNH₂、C(O)、C(CH₂)、CH₂CH₂或C(OH)CH₂R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)连接在一起。在一个实施方案中，链中的磷原子可以具有含O、BH3或S的侧基。在磷链中，具有除O之外的侧基的磷原子可以是取代的磷酸基团。在磷链中，具有除O之外的中间原子的磷原子可以是取代的磷酸基团。核苷酸类似物的一些实例描述于Xu的美国专利号7,405,281中。

在一些实施方案中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“标记的核苷酸”；标记的核苷酸的标记在本文中称为“核苷酸标记”。在一些实施方案中，标记可以是连接到末端磷酸基团(即，离糖最远的磷酸基团)的荧光部分(例如，染料)、发光部分等的形式。可用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括但不限于核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、多磷酸核糖核苷酸、多磷酸脱氧核糖核苷酸、修饰的多磷酸核糖核苷酸、修饰的多磷酸脱氧核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、金属核苷、膦酸核苷和修饰的磷酸-糖骨架核苷酸、上述化合物的类似物、衍生物或变体等。在一些实施方案中，核苷酸可包含非氧部分，例如硫代或硼烷部分，以代替桥接核苷酸的α磷酸和糖、或核苷酸的α和β磷酸、或核苷酸的β和γ磷酸、或核苷酸的任何其他两种磷酸之间、或其任意组合的氧部分。“核苷酸5'-三磷酸”是指在5'位置处具有三磷酸酯基的核苷酸，有时也表示为“NTP”、或“dNTP”和“ddNTP”，以特别指出核糖的结构特征。三磷酸酯基可以包括对各种氧的硫取代，例如α-硫代核苷酸5'-三磷酸。有关核酸化学的综述，参见：Shabarova,Z.和Bogdanov,A.Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,VCH,New York,1994。

可以利用任何核酸扩增方法，诸如基于PCR的测定，例如定量PCR(qPCR)，或者可以使用恒温扩增来检测存在于离散实体或者其一种或多种组分(例如包封在其中的细胞)中的某些感兴趣的核酸(例如基因)的存在。此类测定可应用于微流体装置或其一部分或任何其他合适位置内的离散实体。此类扩增或基于PCR的测定的条件可以包括随时间推移检测核酸扩增，并且可以以一种或多种方式变化。

可以添加到微滴中的扩增/PCR引物的数量可以变化。可以添加到微滴中的扩增引物或PCR引物的数量可以在下列范围内：约1个至约500个或更多个引物，例如约2个至100个引物、约2个至10个引物、约10个至20个引物、约20个至30个引物、约30个至40个引物、约40个至50个引物、约50个至60个引物、约60个至70个引物、约70个至80个引物、约80个至90个引物、约90个至100个引物、约100个至150个引物、约150个至200个引物、约200个至250个引物、约250个至300个引物、约300个至350个引物、约350个至400个引物、约400个至450个引物、约450个至500个引物，或者约500个引物或更多个引物。

引物组的一个或两个引物可以包含条形码序列。在一些实施方案中，一个或两个引物包含条形码序列和唯一分子标识符(unique molecular identifier；UMI)。在使用UMI和核酸条形码序列两者的一些实施方案中，在并入核酸条形码序列之前将UMI并入靶核酸或其扩增产物中。在使用UMI和核酸条形码序列两者的一些实施方案中，在将UMI并入靶核酸或其扩增产物之后，将核酸条形码序列并入UMI或其扩增产物中。

引物组中的一个或两个引物还可以附着或缀合至亲和试剂。在一些实施方案中，例如，单独的细胞被隔离在离散实体(例如液滴)中。这些细胞可以被裂解并且它们的核酸被加上条形码。该过程可以在具有独特条形码序列的离散实体中的大量单细胞上进行，从而使得随后能够通过条形码对混合序列读段进行解卷积以获得单细胞信息。该方法提供了一种将源自大量单细胞的核酸组合在一起的方式。此外，亲和试剂(诸如抗体)可以与核酸标记(例如包含条形码的寡核苷酸)缀合，这些核酸标记可以用于识别抗体类型，例如抗体的靶特异性。然后这些试剂可以用于结合细胞内或细胞上的蛋白质，从而使由亲和试剂携带的核酸与它们所结合的细胞缔合。然后，这些细胞可以通过如本文所述的加条形码工作流程进行处理，以将条形码附着至亲和试剂上的核酸标记。接着可以使用文库制备、测序和生物信息学技术，根据细胞/离散实体条形码将序列分组。可以结合或识别生物样品或者其部分或组分(诸如蛋白质、分子或其复合物)的任何合适的亲和试剂都可以与这些方法结合使用。亲和试剂可以用核酸序列进行标记，这涉及它们的同一性，例如抗体的靶特异性，从而允许使用本文所述的加条形码和测序方法对其进行检测和定量。示例性亲和试剂可以包括例如抗体、抗体片段、Fab、scFv、肽、药物等，或者它们的组合。亲和试剂(例如抗体)可以由一种或多种生物体表达或者使用生物合成技术(诸如噬菌体、mRNA或核糖体展示)提供。亲和试剂也可以经由化学方式或生物化学方式产生，诸如通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NETS)的化学键合、点击化学或链霉亲和素-生物素相互作用。寡核苷酸-亲和试剂缀合物还可以通过以下方式产生：将寡核苷酸附着至亲和试剂，并且将额外的寡核苷酸杂交、连接和/或经由聚合酶延伸至先前缀合的寡核苷酸，或者以其他方式与先前缀合的寡核苷酸连接。用核酸标记亲和试剂的优点是其允许生物样品的高度多重分析。例如，可以将识别样品中的多种靶标(每种都用其自身的核酸序列标记)的抗体或结合试剂的大混合物混合在一起。然后，可以使该混合物与样品反应，并使其接受如本文所述的加条形码工作流程，以重新获得关于结合哪些试剂、它们的量以及这在样品中的不同实体之间(诸如在单细胞之间)如何变化的信息。上述方法可以应用于多种分子靶标，包括含有细胞、肽、蛋白质、大分子、大分子复合物等中的一者或多者的样品。可以对样品进行常规处理以便分析，诸如固定和透化，从而有助于亲和试剂的结合。为了获得高度准确的定量，也可以使用本文所述的独特分子标识符(UMI)技术，以便对亲和试剂分子进行准确计数。这能够以多种方式实现，包括通过在缀合之前、期间或之后将UMI合成到附着于每种亲和试剂的标记上，或者当使用所述试剂时通过微流体方式附着UMI。类似的产生条形码的方法(例如，使用应用于单细胞测序和本文所述的组合条形码技术)适用于亲和试剂技术。这些技术使得能够分析多种生物样品中的蛋白质和/或表位，以进行例如蛋白质和其他实体中的表位或翻译后修饰的作图或者进行单细胞蛋白质组学分析。例如，使用本文所述的方法，可以产生标记的亲和试剂的文库，这些试剂检测生物体蛋白质组中所有蛋白质中的表位、用试剂标记那些表位，并且应用本文所述的加条形码和测序技术对与这些表位相关联的标记进行检测和准确定量。

引物可以含有用于一种或多种感兴趣的核酸(例如一种或多种感兴趣的基因)的引物。添加的用于感兴趣基因的引物的数量可以是约1个至500个，例如约1个至10个引物、约10个至20个引物、约20个至30个引物、约30个至40个引物、约40个至50个引物、约50个至60个引物、约60个至70个引物、约70个至80个引物、约80个至90个引物、约90个至100个引物、约100个至150个引物、约150个至200个引物、约200个至250个引物、约250个至300个引物、约300个至350个引物、约350个至400个引物、约400个至450个引物、约450个至500个引物，或者约500个引物或更多个引物。引物和/或试剂可以在一个步骤中或在一个以上步骤中添加至离散实体，例如微滴。例如，可以在两个或更多个步骤、三个或更多个步骤、四个或更多个步骤或五个或更多个步骤中添加引物。无论引物是在一个步骤中还是一个以上步骤中添加，其都可以在添加裂解剂之后、在添加裂解剂之前或与添加裂解剂同时添加。当在添加裂解剂之前或之后添加时，可以在与添加裂解剂分开的步骤中添加PCR引物。在一些实施方案中，离散实体(例如微滴)可以在添加PCR试剂之前经历稀释步骤和/或酶灭活步骤。此类方法的示例性实施方案描述于PCT公开号WO 2014/028378中，其公开内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。

用于扩增靶核酸的引物组通常包括与靶核酸或其互补物互补的正向引物和反向引物。在一些实施方案中，可以在单个扩增反应中使用多个靶标特异性引物对执行扩增，其中每个引物对包括正向靶标特异性引物和反向靶标特异性引物，其中每个引物包括至少一个与样品中的相应靶序列基本上互补或基本相同的序列，并且每个引物对具有不同的相应靶序列。因此，本文中的某些方法用于检测或识别来自单细胞样品的多个靶序列。

在一些具体实施中，用亲和试剂包被固体载体、珠粒等。亲和试剂包括但不限于对靶分子具有特异性结合亲和力的抗原、抗体或适体。亲和试剂与单细胞实体内的一个或多个靶标结合。亲和试剂通常被可检测地标记(例如，用荧光团)。亲和试剂有时用独特的条形码、寡核苷酸序列或UMI来标记。

在一些具体实施中，RT/PCR聚合酶反应和扩增例如在反应混合物中进行、被添加到反应混合物中，或者被添加到反应混合物的一部分中。

在一个特定的具体实施中，固体载体含有多种亲和试剂，每种亲和试剂对不同的靶分子具有特异性。结合特定靶分子的亲和试剂共同用相同的寡核苷酸序列标记，使得对不同靶标具有不同结合亲和力的亲和分子用不同的寡核苷酸序列标记。以这种方式，单个靶实体内的靶分子在这些具体实施中被区别标记。

抗体标签、基因组DNA桥和蛋白质组学

本文的一些实施方案的第一目的是提供大量单细胞中蛋白质的灵敏、准确和全面的表征。

本文提供的某些方法利用特异性抗体来检测感兴趣的表位。在一些实施方案中，抗体用序列标签来标记，所述序列标签可以用微流体加条形码和DNA测序来读出。本文使用该具体实施和相关具体实施在单细胞水平上表征不同细胞类型的细胞表面蛋白质。

在一些实施方案中，条形码身份由其完整的核碱基序列编码，并且因此赋予远远超过使用荧光的常规方法所能实现的组合标签空间。十个碱基的适度标签长度提供超过一百万个独特序列，足以标记针对人蛋白质组中的每个表位的抗体。实际上，用这种方法时，对多重分析的限制不是独特标签序列的可用性，而是可以检测多重反应中的感兴趣表位的特异性抗体的可用性。

在一些具体实施中，细胞与针对不同靶表位的抗体结合，如在常规免疫染色中那样，只不过抗体是用条形码来标记的。

在实施过程中，当抗体结合其靶标时，抗体条形码标签随其携带，从而允许推断抗体的存在和细胞的存在。在一些具体实施中，对抗体条形码标签计数提供了对细胞中存在的不同表位的估计。

其他实施方案的具体实施用于通过特定细胞的蛋白质表达谱来区分这些特定细胞。本文提供的带DNA标签的抗体的一些实施方案具有剖析单细胞中的蛋白质的多个优点。

这些具体实施的主要优点是能够扩增低丰度标签以使它们可通过测序检测。一些具体实施中的另一个优点是能够将分子指数用于定量结果。一些具体实施还具有基本上无限的多重分析能力。

一些实施方案利用具有替代性化学品的固体珠粒，其中待使用的引物在溶液中并且含有允许与引物杂交的嵌入的PCR退火序列或“柄”。在一些具体实施中，所述柄是靶序列上游的特异性尾5’，并且该柄与珠粒加上条形码的寡核苷酸互补并充当PCR延伸桥以将靶扩增子连接至珠粒条形码文库引物序列。这些固体珠粒可以含有能够相对于引物上的PCR柄退火的引物。

一个具体实施方案是一种用于添加与抗体连接的条形码识别序列的方法，该方法包括以下步骤：i)靶gDNA与a)正向引物和b)反向引物的初始杂交，所述正向引物包含与细胞条形码相邻的第一读段序列，以及柄序列，所述反向引物包含与靶基因组DNA互补的序列，该序列可以包含独特分子标签；并且该序列与第二柄序列相邻，以及进行PCR反应。所得的扩增子包含PCR柄序列，该PCR柄序列与细胞条形码序列相邻，该PCR柄序列附着至正向引物序列，该正向引物序列与长度为“n”的插入序列相邻，该插入序列与包含与靶基因组DNA互补的序列的反向引物相邻，所述反向引物任选地包含独特分子标签、抗体标签序列和第二PCR柄。在一些实施方案中通常使用附加的文库创建PCR步骤来进一步连接索引和识别序列(参见例如图1)。

抗体文库可以从抗体染色的细胞产生，并且这些文库可以通过测序来鉴定和表征。

在另一个方面，本文提供的一些具体实施可以用于检测和表征单细胞中的DNA和蛋白质表达模式。

在另一个方面，本文提供的一些具体实施可以用于检测和表征单细胞中的RNA和蛋白质表达模式。

在另一个方面，本文提供的一些具体实施可以用于检测和表征单细胞中的DNA、RNA和蛋白质表达模式。

在一些具体实施中，靶核酸序列可以基于长度和序列用于识别独特抗体标签。

在一些具体实施中，本文所述的某些亲和试剂加条形码技术可以用于检测和定量蛋白质-蛋白质相互作用。例如，相互作用的蛋白质可以用核酸序列来标记并且彼此反应。如果蛋白质通过例如彼此结合而相互作用，则它们的相关标记定位于结合的复合物，而不相互作用的蛋白质将保持彼此不结合。

然后可以将样品隔离在离散实体(诸如微流体液滴)中，并且进行融合扩增/PCR或用核酸标记加条形码。在蛋白质相互作用的情况下，给定的条形码组将含有包括两种相互作用的蛋白质的标记的核酸，因为那些核酸将终止于相同的区室中并且用相同的条形码序列来加上条形码。相比之下，不相互作用的蛋白质将在统计学上终止于不同的区室中，因此在测序后将不会聚类到相同的条形码组中。这允许通过根据条形码将数据聚类并且检测组中所有亲和试剂标记来识别相互作用的蛋白质。

本发明的某些实施方案提供了用于连接和扩增与蛋白质(诸如抗体、酶、受体等)缀合的核酸的方法。一个示例性方法包括：(a)在足以使多种蛋白质相互作用的条件下孵育核酸条形码序列缀合的蛋白质的群体，使相互作用的蛋白质上的核酸条形码序列彼此接近；(b)将核酸条形码序列缀合的蛋白质的群体包封在多个离散实体中，使得相互作用的蛋白质(如果存在)被共同包封；(c)使用微流体装置将所述多个第一离散实体之一的离散实体内容物与试剂混合，所述试剂足以扩增和连接所述相互作用的蛋白质(如果存在)上的核酸条形码序列；以及(d)使所述离散实体经受足以扩增和连接所述相互作用的蛋白质(如果存在)上的核酸条形码序列的条件。

一些实施方案利用具有替代性化学品的固体珠粒，其中待使用的引物在溶液中并且含有允许与引物杂交的嵌入的PCR退火序列或“柄”。在一些具体实施中，所述柄是靶序列上游的特异性尾5’，并且该柄与珠粒加上条形码的寡核苷酸互补并充当PCR延伸桥以将靶扩增子连接至珠粒条形码文库引物序列。这些固体珠粒可以含有能够相对于引物上的PCR柄退火的引物。

本发明的其他方面可以在以下实施方案中描述：

1.一种设备或系统，其用于执行本文所描述的方法。

2.一种组合物或反应混合物，其用于执行本文所描述的方法。

3.一种抗体文库，其通过本文所描述的方法产生。

4.一种基因组文库，其通过本文所描述的方法产生。

5.一种转录组文库，其根据本文所描述的方法产生。

6.一种抗体文库、基因组和转录组文库，其根据本文所描述的方法产生。

7.一种试剂盒，其用于执行本文所描述的方法。

8.一种细胞群，其通过本文所描述的方法来选择。

9.一种用于分子剖析的系统，其用于执行本文的方法。

10.一种用于制备抗体文库和DNA文库的方法，所述抗体文库和DNA文库可以基于细胞条形码来配对。

11.一种用于制备抗体文库和RNA文库的方法，所述抗体文库和RNA文库可以基于细胞条形码来配对。

12.一种用于制备抗体文库、DNA文库和RNA文库的方法，所述抗体文库、DNA文库和RNA文库可以基于细胞条形码来配对。

包括以下实施例以进行说明而非限制。

实施例I

抗体标签引发和基因组DNA桥

本发明所公开的实施方案整体涉及在单细胞聚合酶链反应(PCR)期间使用抗体标签作为引物，导致仅在细胞存在下产生扩增子。其中，本发明所公开的实施方案提供了蛋白质组学分析的替代性方法，其可以用于最小化背景噪声。

在一些具体实施中，细胞蛋白质组的分析和表征通过以下方式来进行：首先将侧接有PCR引发位点的抗体标签缀合到抗体上。这些抗体标签由对该抗体具有特异性的DNA序列组成。将这些缀合抗体用于对细胞染色，然后使细胞运行通过Tapestri^TM平台。当细胞被分成液滴时，其相应的抗体也是如此。在其中gDNA或RNA靶标被扩增的加条形码PCR期间，抗体标签也被扩增。然后将这些扩增子制成文库用于测序。在含有珠粒但不含细胞的液滴中，已从细胞解离的任何抗体仍可以被扩增并且被分配细胞条形码。如果测序运行的一部分被背景噪声占据，则在分析期间必须将这些读数从数据集中过滤掉。

在本实施例中，我们使用来自细胞的DNA作为靶核酸，并且抗体上的寡核苷酸是引物。该方法独特地消除了从已从细胞解离的抗体扩增抗体标签的需要，因此使测序读段效率最大化。

在根据本公开的一个实施方案的示例性方法中，所述抗体可以与侧接PCR柄和反向基因特异性引物的抗体标签(5’-PCR柄反向–抗体标签–基因特异性反向引物–3’)缀合。这些抗体标签将仍由对该抗体具有特异性的DNA序列组成。在某些实施方案中，相应的基因特异性正向引物(5’-PCR柄正向–基因特异性正向引物–3’)被包含在加条形码PCR中所使用的正向引物混合物中。该正向混合物可以附着于珠粒或存在于溶液中。该正向引物的PCR柄可以根据所用的化学品而改变(参见图1)。

在细胞染色和裂解之后，在加条形码PCR期间，只有在存在核酸(gDNA或RNA)时，抗体标签引物才会杂交和延伸。该延伸可以通过DNA聚合酶或逆转录酶进行。相应的正向引物将在DNA拷贝或cDNA上引发，然后通过抗体标签序列延伸。该循环产生含有抗体标签的扩增子，所述抗体标签具有文库制备所需的PCR柄。如果液滴中不存在gDNA或RNA，则抗体标签引物不会延伸。因此，只有包含珠粒和细胞的液滴才将由抗体标签产生文库。

用这种方法时，读段1可以通过细胞条形码、正向引物和扩增子测序，而读段2可以通过抗体标签、反向引物和扩增子测序。只有存在细胞的液滴才将产生具有细胞条形码和抗体标签的扩增子，其可以在文库PCR中进一步扩增。这将使来自不含细胞的液滴的噪声最小化。

假定Tapestri^TM乳液(约350pL)内有约100个拷贝的抗体标签附着于单细胞(二倍体基因组)，引物和模板的浓度在用于多重PCR的范围内。

在一个实施方案中，可以基于抗体的拷贝和流行率来选择抗体标签的基因特异性引发位点。例如，可以为高度流行的抗体选择单拷贝基因靶标。对于其他抗体，可以选择具有多个拷贝的靶标来增加引发位点，诸如18s、LINE1或ALU。由于这些靶标的拷贝是已知的，所以它们可以用于归一化所得的测序数据。就18s而言，由于真核生物内的高度同源性，设计了对人、小鼠和大鼠通用的抗体标签引物。

这些基因特异性引发位点也可以被设计用于抗体标签，因此扩增子将含有基因组的可变区。当对扩增子测序时，可变区可以用作区分PCR拷贝的分子标签。例如，在使用ALU115引物和LINE1引物的情况下，每个单倍体分别有约100,000个拷贝和约7000个拷贝。随着抗体在这些不同位点引发，产生的扩增子可以具有可变序列。这些可变序列可以针对每个抗体标签折叠，以产生独特的抗体读段。

在一个实施方案中，使用以下基因特异性引物。

18s-每个单倍体基因组400个拷贝

反向：CTCAACACGGGAAACCTCAC(SEQ ID NO:)

正向：CGCTCCACCAACTAAGAACG(SEQ ID NO:)

LINE1-每个单倍体基因组约7000个拷贝

反向：TTCCCTCTACACACTGC(SEQ ID NO:)

正向：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC(SEQ ID NO:)

ALU115-每个单倍体基因组约100,000个拷贝

反向：CCCGAGTAGCTGGGATTACA(SEQ ID NO:)

正向：CCTGAGGTCAGGAGTTC(SEQ ID NO:)

加条形码引物：

反向引物：5'-PCR柄反向-抗体标签-基因特异性反向引物-3’

正向引物：5'-PCR柄正向-基因特异性正向引物-3’

示例的18s加条形码引物：

反向引物：

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTAAGTGCTGATCTTGGATGTGACG(SEQ IDNO:)

TCTCAACACGGGAAACCTCAC(SEQ ID NO:)

正向引物：GTACTCGCAGTAGTCCGCTCCACCAACTAAGAACG(SEQ ID NO:)

测序读段：

读段1＝细胞条形码+PCR柄+基因特异性正向引物+插入序列

读段2＝抗体标签+基因特异性反向引物+插入序列

表1–测序结果

表1示出，使用抗体标签作为人基因组中LINE1的引发位点产生的单细胞文库产生了其两个测序读段可以与预期靶序列配对和比对的读段。这些比对的文库具有预期的结构。

本文引用或提及的所有专利、出版物、科学文章、网站以及其他文件和材料表明了本发明所属领域的技术人员的技能水平，并且每个这样的引用文件和材料据此通过引用并入，其程度与将其整体通过引用单独并入或在本文整体阐述的程度相同。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学文章、网站、电子可用信息和其他参考材料或文件的任何和所有材料及信息实际并入本说明书中的权利。

本文描述的具体方法和组合物代表了优选的实施方案并且是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。考虑到本说明书，本领域技术人员将想到其他目的、方面和实施方案，并且涵盖在由权利要求书的范围限定的本发明的精神内。对本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文说明性地描述的本发明可以适当地在不存在本文未具体公开为必要条件的任何一个或多个要素或者一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，在本文的每个实例中，在本发明的实施方案或实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可以用说明书中的其他两个术语中的任何一个来替换。此外，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地而非限制地解读。本文说明性描述的方法和过程可以按不同的步骤顺序适当地实践，并且其不必限于本文或在权利要求书中所指示的步骤顺序。应该指出，如本文和在所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。在任何情况下，本专利都不应被解释为限于本文具体公开的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下，本专利都不应被解释为受任何审查员或专利商标局的任何其他官员或雇员做出的任何陈述的限制，除非在申请人的书面答复中具体地并且不带有限制或保留地明确地采用这种陈述。

所采用的术语和表述作为说明性而非限制性的术语使用，并且不希望在此类术语和表述的使用中排除所示出和描述的特征的任何等价物或其部分，但应当认识到，在要求保护的本发明的范围内，多种修改是可能的。因此，将理解的是，虽然本发明通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开，但是对本文公开的概念的修改和变化可以由本领域技术人员采取，并且此类修改和变化被认为是在由所附权利要求限定的本发明的范围内。

在本文已经宽泛地并一般地描述了本发明。落入一般性公开内容内的每个较窄的种类和亚属分组也构成本发明的一部分。这包括具有附带条件或否定限制的本发明的一般性描述，从而从种属中去除任何主题，而不管删除的材料在本文中是否进行了具体叙述。

其他实施方案在以下权利要求书内。此外，在根据马库什群组(Markush group)描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，因此也根据马库什组的任何单个成员或成员子组来描述本发明。

Claims (20)

1.一种测定和表征单细胞的蛋白质表达模式的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将侧接有PCR引发位点的条形码序列缀合到抗体上，其中条形码序列对抗体具有特异性；

b)使用所述条形码缀合的抗体进行细胞鉴定步骤；

c)划分或分离单独的细胞并且将一个或多个单独的细胞包封在包含蛋白酶的反应混合物中；

d)将经包封的细胞与液滴中的所述蛋白酶一起孵育以产生细胞裂解物；

e)提供靶向细胞中存在的核酸的一个或多个核酸扩增引物组，其中引物组中的一个或多个引物包含与抗体相关联的条形码识别序列；

f)提供靶向细胞中存在的核酸的一个或多个核酸扩增引物组，其中引物组的一个或多个引物包含对于每个细胞独特的条形码识别序列；

g)进行核酸扩增反应以产生一个或多个扩增子；

h)提供包含与引物组的多个核酸引物中的一个核酸引物的识别条形码序列互补的核酸序列的亲和试剂，其中包含与所述识别条形码序列互补的所述核酸序列的所述亲和试剂能够与包含条形码识别序列的核酸扩增引物组结合；

i)使亲和试剂与包含一个或多个靶核酸序列的扩增子的所述扩增产物在足以使所述亲和试剂与所述靶核酸结合以形成亲和试剂结合的靶核酸的条件下接触；以及

j)通过对扩增子的条形码测序来确定一种或多种蛋白质的身份并且对所述一种或多种蛋白质进行表征。

2.如权利要求1所述的方法，其中反向引物包含以下核酸序列：CTCAACACGGGAAACCTCAC(SEQ ID NO:)。

3.如权利要求1所述的方法，其中正向引物包含以下核酸序列：CGCTCCACCAACTAAGAACG(SEQ ID NO:)。

4.如权利要求1所述的方法，其中反向引物包含以下核酸序列：TTCCCTCTACACACTGC(SEQ ID NO:)。

5.如权利要求1所述的方法，其中正向引物包含以下核酸序列：ACACCTATTCCAAAATTGACCAC(SEQ ID NO:)。

6.如权利要求1所述的方法，其中反向引物包含以下核酸序列：CCCGAGTAGCTGGGATTACA(SEQ ID NO:)。

7.如权利要求1所述的方法，其中正向引物包含以下核酸序列：CCTGAGGTCAGGAGTTC(SEQ ID NO:)。

8.如权利要求1所述的方法，其中正向条形码引物包含以下核酸序列：GTACTCGCAGTAGTCCGCTCCACCAACTAAGAACG(SEQ ID NO:)。

9.如权利要求1所述的方法，其中反向条形码引物包含以下核酸序列：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTAAGTGCTGATCTTGGATGTGACG(SEQ ID NO:)。

10.一种用于添加与抗体连接的条形码识别序列的方法，所述方法包括以下步骤：

i)进行靶gDNA的加条形码PCR反应，其中使用a)含有细胞条形码序列和PCR柄的引物；b)含有与靶基因组DNA互补的序列和PCR柄的引物，所述引物与含有所述细胞条形码的所述引物互补，和c)反向引物，所述反向引物包含与所述靶基因组DNA互补的序列、抗体标签序列、第二PCR柄，并且可以包含独特分子标签，以产生包含细胞条形码、靶DNA序列、在5’端和3’端均具有PCR柄的抗体标签的扩增子；以及

ii)使用第一引物进行文库创建PCR反应，所述第一引物包含测序衔接子、样品索引以及与所述扩增子上产生的所述两个PCR柄互补的序列，以产生包含测序衔接子、双或单样品索引、细胞条形码、靶DNA序列、抗体标签并且可以包含独特分子标签的文库。

11.一种用于添加与抗体连接的条形码识别序列的方法，所述方法包括以下步骤：

i)进行靶gDNA的加条形码PCR反应，其中使用a)含有细胞条形码序列和PCR柄的引物；b)含有与靶基因组DNA互补的序列和PCR柄的引物，所述引物与含有所述细胞条形码的所述引物互补，和c)反向引物，所述反向引物包含与所述靶基因组DNA互补的序列、抗体标签序列、第二PCR柄，并且可以包含独特分子标签，以产生扩增子，所述扩增子包含细胞条形码、靶DNA序列、在5’端和3’端均具有PCR柄的抗体标签、第一读段序列、第一细胞条形码、恒定区1、第二细胞条形码、恒定区2、正向引物序列、长度为“n”的插入序列、包含与所述靶基因组DNA互补的序列的反向引物、独特分子标识符、抗体标签序列、第二独特分子标识符、第二读段序列；以及

ii)使用第一引物和第二引物进行文库创建PCR反应，所述第一引物包含测序衔接子、样品索引以及与在包含P5序列和第二读段序列的扩增子上产生的两个PCR柄互补的序列，所述第二引物包含第二读段序列、索引序列和P7序列，以产生包含测序衔接子、双或单样品索引、细胞条形码、靶DNA序列、抗体标签并且可以包含独特分子标签的文库。

12.根据权利要求1所述的方法，其包括进行逆转录以产生逆转录产物。

13.根据权利要求1所述的方法，其包括在核酸扩增步骤之前进行逆转录以产生逆转录产物。

14.根据权利要求1所述的方法，其包括对所述RNA进行逆转录以产生逆转录产物并且扩增所述逆转录产物，其中进行逆转录和扩增发生在单个步骤中。

15.根据权利要求1所述的方法，其还包括进行扩增产物的核酸测序反应。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和试剂包括珠粒等。

17.根据权利要求1所述的方法，其包括测定和表征一种或多种细胞表面蛋白质的表达。

18.根据权利要求1所述的方法，其还包括制备可以基于所述细胞条形码来配对的抗体文库和DNA文库。

19.根据权利要求1所述的方法，其还包括制备可以基于所述细胞条形码来配对的抗体文库和RNA文库。

20.根据权利要求1所述的方法，其还包括制备可以基于所述细胞条形码来配对的抗体文库、DNA文库和RNA文库。

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