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CN113817721A - 从多孔吸附材料中提取微生物dna的试剂盒及提取方法 - Google Patents

从多孔吸附材料中提取微生物dna的试剂盒及提取方法 Download PDF

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CN113817721A CN202111227895.9A CN202111227895A CN113817721A CN 113817721 A CN113817721 A CN 113817721A CN 202111227895 A CN202111227895 A CN 202111227895A CN 113817721 A CN113817721 A CN 113817721A
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Abstract

本发明提供了一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法，该试剂盒包括解吸液、裂解液、不同直径的混合珠体、蛋白质沉淀液、DNA吸附混合物、过滤套装、洗涤液和洗脱液。试剂盒中的解吸液使用了焦磷酸钠溶液，其以与微生物细胞或核酸竞争吸附位点，从而使细胞或核酸从吸附材料上解吸出来；蛋白质沉淀液中使用了尿素和醋酸缓冲液，通过变性和酸沉淀，使蛋白质从溶液中沉淀而去除；溶液中的DNA通过DNA吸附混合物进行吸附，之后经历洗涤去杂，洗脱分离，得到的DNA。本发明提供的提取方法简单、经济，可以从多孔吸附材料中提取高质量的微生物DNA，满足现代微生物分子生物学技术操作的需要。

Description

从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
DNA提取是微生物分子生物学研究的基础，迅速高效的提取DNA是PCR扩增、测序等工作的前提。微生物种类繁多，在自然界中广泛存在，不同特性的微生物，存在于不同生境中，包括土壤、水体、动植物及各类多孔固体物质等。微生物的重要生活特征之一是吸附在固体表面或内部生长繁殖，为了研究其功能和进一步的开发应用，其DNA的提取是最关键的环节。
多孔吸附材料在自然界中广泛存在，同时许多学者合成了许多多孔吸附材料，用于生活或工业废水中污染物的微生物降解研究或高效处理。由于微生物的吸附特点和多孔吸附材料的吸附特征，在对多孔吸附材料表面或内部微生物DNA提取的过程中，吸附问题是一个公认的难题，导致无法迅速高效的提取其微生物DNA，大大限制了相关技术的研究或应用。
发明内容
本发明提供一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒及提取方法，可以简单、经济、高效的从多孔吸附材料中提取高质量的微生物DNA，满足现代微生物分子生物学技术操作的需要。
本发明的技术方案是，一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒，试剂盒中包括以下成分：
1)解吸液：焦磷酸钠溶液；
2)裂解液：Tris-HCl，EDTA，GuHCl和Triton X-100；
3)直径在0.1-3mm的不同直径的氧化锆珠；
4)蛋白质沉淀液：尿素和醋酸缓冲液；
5)DNA吸附混合物：SiO2-HCl和醋酸缓冲液；
6)过滤套装：过滤柱和离心管；
7)洗涤液和洗脱液；其中洗涤液包括无水乙醇、NaCl、Tris和EDTA，洗脱液为Tris-HCl和EDTA。
进一步地，所述解吸液焦磷酸钠溶液为100-800μmol,pH为9.0-10.5。
进一步地，所述裂解液中Tris-HCl为20-50mM、EDTA 20-50mM、GuHCl 600-1000mM和Triton X-100质量浓度为0.2％-2％，pH为9.0-10.5；
进一步地，所述3)中球体为直径分别为0.1mm、0.5mm、1mm、2mm和3mm中的一种或几种组合。
进一步地，蛋白质沉淀液pH为4.0-5.0，其中尿素为3-8M。
进一步地，DNA吸附混合物中SiO2-HCl是用HCl处理过的SiO2，其状态为混悬液；混悬液的质量分数为20％-30％，混合物的pH为3.0-5.0。
进一步地，洗涤液中含乙醇质量分数为30％-80％、NaCl 80-150mM、Tris 8-15mM和EDTA 0.8-1.5mM；洗脱液中包含Tris-HCl 8-15mM和EDTA 0.8-1.5Mm，pH为8.0。
本发明还涉及采用所述试剂盒从多孔吸附材料中提取微生物DNA的方法，具体步骤为：
S1、将不同直径的球体混合，置于离心管内，加入待提取的多孔吸附材料，再加入解吸液，旋涡震荡处理后离心，弃上清液；
S2、向S1中加入裂解液，旋涡震荡后离心，取上清液备用；
S3、向S2所得上清液中加入蛋白质沉淀液，旋涡震荡处理后离心，收集上清液备用；
S4、向S3所得上清液中加入DNA吸附混合物，旋涡震荡后静置，丢弃上层上清液，剩下的溶液混匀后加入过滤柱中并离心，丢弃过滤液；
S5、取洗涤液加入到过滤柱中混匀，离心后丢弃过滤液，再离心去洗涤液残留，最后将过滤柱静置后加入洗脱液混匀，离心，所得清液为DNA样品。
进一步地，所述多孔吸附材料为bio-beads、活性炭颗粒、活性炭复合材料、硅藻土中的一种或几种形成的复合材料。
进一步地，所述旋涡震荡的时间为1～10min；离心时间为1～10min，离心转速为10000～14000rpm。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用焦磷酸钠溶液为解吸液，与微生物细胞或核酸竞争吸附位点，从而使细胞或核酸从吸附材料上解吸出来。并通过焦磷酸钠和球体震荡的联合作用解吸吸附的细胞，不同直径的氧化锆珠对细胞的作用不同，大直径的主要作用是辅助解吸细胞，小直径的主要作用是破碎细胞。另外，多余焦磷酸通过离心及后期S4中的吸附去除。
裂解液中，Tris-HCl为缓冲液，维持pH的稳定；EDTA为二价金属离子的螯合剂，GuHCl为离液剂，通过破坏生物大分子结构中的氢键、盐桥、疏水作用等非共价键达到增溶效果；Triton X-100为非离子型表面活性剂，结合蛋白。蛋白质沉淀液中使用了尿素和醋酸缓冲液，通过变性和酸沉淀，使蛋白质从溶液中沉淀而去除。溶液中的DNA通过DNA吸附混合物而吸附，之后经历洗涤去杂，洗脱而分离出来。
本发明提供的试剂盒操作简单，提取量高，成本低，无有毒化学试剂。
附图说明
图1实施例5中的bio-beads样品，左侧为吸附之前照片，右侧为吸附之后照片。
图2不同试剂盒提取的bio-beads样品中微生物DNA的琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂)对比结果。对比1-3为经典国外进口试剂盒，对比4-5为国内常用试剂盒，M为DL2000。
图3本试剂盒提取的bio-beads样品中微生物DNA的PCR结果(25个循环)，M为DL2000，CK为空白对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒，适合于bio-beads或活性炭复合材料等样品，试剂盒中包括以下成分：
1)解吸液：焦磷酸钠溶液，300μmol,pH为9.0；
2)裂解液：Tris-HCl 25mM、EDTA 25mM、GuHCl800mM和Triton X-100 1％,pH为9.0；
3)直径分别为0.1mm，0.6g；1mm，1.0g；3mm，0.2g的氧化锆珠；
4)蛋白质沉淀液：尿素5M，加醋酸缓冲液调整至pH为4.8；
5)DNA吸附混合物：SiO2-HCl 25％，加醋酸缓冲液调整至pH为4.0；
6)过滤套装：过滤柱和离心管；
7)洗涤液和洗脱液；其中洗涤液为乙醇50％、NaCl 125mM、Tris 10mM和EDTA 1mM，洗脱液为Tris-HCl 10mM和EDTA 1mM，pH为8.0。
实施例2：
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒，适用于颗粒活性炭等样品，试剂盒中包括以下成分：
1)解吸液：焦磷酸钠溶液，400μmol,pH为10；
2)裂解液：Tris-HCl 30mM、EDTA 30mM、GuHCl800mM和Triton X-100 1％,pH为10；
3)直径分别为0.1mm，0.5g；2mm，1.0g；3mm，0.2g的氧化锆珠；
4)蛋白质沉淀液：尿素5M，醋酸缓冲液调整至沉淀液pH为4.8；
5)DNA吸附混合物：SiO2-HCl 20％，醋酸缓冲液调整至pH为4.0；
6)过滤套装：过滤柱和离心管；
7)洗涤液和洗脱液；其中洗涤液为乙醇50％、NaCl 125mM、Tris 10mM和EDTA 1mM，洗脱液为Tris-HCl 10mM和EDTA 1mM，pH为8.0。
实施例3：
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒，适合于硅藻土或有机质少的土壤等样品，试剂盒中包括以下成分：
1)解吸液：焦磷酸钠溶液，800μmol,pH为10；
2)裂解液：Tris-HCl 30mM、EDTA 30mM、GuHCl900mM和Triton X-100 0.5％,pH为10；
3)直径分别为0.1mm，0.8g；0.5mm，0.5g，2mm，0.2g的氧化锆球体；
4)蛋白质沉淀液：尿素5M，加醋酸缓冲液调整至pH为4.8；
5)DNA吸附混合物：SiO2-HCl 30％，加醋酸缓冲液调整至pH为4.0；
6)过滤套装：过滤柱和离心管；
7)洗涤液和洗脱液；其中洗涤液为乙醇80％、NaCl 100mM、Tris 8mM和EDTA0.8mM，洗脱液为Tris-HCl 15mM和EDTA 1.5mM，pH为8.0。
实施例4：
一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒，适合于有机质多的土壤等样品，试剂盒中包括以下成分：
1)解吸液：焦磷酸钠溶液，100μmol,pH为9.5；
2)裂解液：Tris-HCl 30mM、EDTA 30mM、GuHCl600mM和Triton X-100 1.5％,pH为9.5；
3)直径分别为0.1mm，0.8g；0.5mm，0.5g；2mm，0.2g的氧化锆珠；
4)蛋白质沉淀液：尿素7M、加醋酸缓冲液调整至pH为4.0；
5)DNA吸附混合物：SiO2-HCl20％，加醋酸缓冲液调整至pH为4.5；
6)过滤套装：过滤柱和离心管；
7)洗涤液和洗脱液；其中洗涤液为乙醇30％、NaCl 80mM、Tris 15mM和EDTA1.2mM，洗脱液为Tris-HCl 8mM和EDTA 0.8mM，pH为8.0。
实施例5：
采用上述试剂盒，从多孔吸附材料中提取微生物DNA的应用。
除了试剂盒外，还需要用到的主要仪器设备为涡旋震荡仪和离心机。
待处理样品：
(1)样品类型：bio-beads
(2)样品特点：多孔吸附材料，呈球形，内部为多孔结构，主要化学成分是活性炭，来自污水处理厂，用于污水高级生物处理或微生物生态学研究，如图1所示。
具体的提取方法为：
(1)将三种不同直径的氧化锆珠(0.1mm，0.6g；1mm，1.0g；3mm，0.2g)，放入2mL离心管中；
(2)取0.5gbio-beads，加入上述离心管中，然后加入850μL解吸液，将离心管放到旋涡振荡器上，中速震荡10min，然后离心(12000rpm、10min)，弃上清；
(3)在上述离心管中加入800μL裂解液；
(4)将上述离心管放到旋涡振荡器上，以最大的速率震荡5min，然后离心(12000rpm、10min)，吸取上清液到新的2mL离心管中；
(5)取250μL蛋白质沉淀液，加入到上述离心管中，旋涡震荡2min，然后离心(12000rpm、5min)，转移上清液到10mL的离心管中；
(6)取DNA吸附混合物1mL，加入到上述离心管中，旋涡震荡2min，然后静置3min；
(7)小心吸取上述离心管中的最上层的上清液500μL并丢弃，然后将剩下的溶液混匀后，取700μL到过滤柱(过滤套装)中并离心(12000rpm、2min)，丢弃过滤液。再重复上述过滤操作，直至混合液全部过滤完；
(8)取500μL洗涤液，加入到上述过滤柱中混匀，离心(12000rpm、1min)，丢弃过滤液，再离心(12000rpm、2min)，然后将过滤柱放入新的2mL离心管中，室温静置5min；
(9)取100μL洗脱液，加入到过滤柱中混匀，离心(12000rpm、1min)，获得DNA样品，-20℃下保存。
得到的DNA样品的琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂)对比结果如图2所示。用超微量分光光度计测定DNA样品的浓度和纯度见表1(各试剂盒抽取的DNA总体积均为100μL)，其中对比1-3为经典国外进口试剂盒，具体1.
Figure BDA0003314955990000061
Spin Kit for Soil(MP Bio)；2.DNeasyPowerBiofilm Kit(QIAGEN)；3.PowerSoil DNA Isolation Kit(MOBIO)。对比4-5为国内常用试剂盒，具体4.SoilPure土壤基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱)；5.Ezup柱式土壤DNA抽提试剂盒(上海生工)。M为DL2000。
结论：与其他试剂盒相比，本试剂盒抽取的DNA样品的质量较高，浓度明显高于对比的所有试剂盒，纯度满足PCR的要求。
表1各试剂盒抽取的DNA样品质量情况
试剂盒 浓度(ng/μL) 纯度(260/280)
本试剂盒 356ng/μL 1.85
对比1 172ng/μL 1.90
对比2 51ng/μL 1.80
对比3 227ng/μL 1.78
对比4 83ng/μL 1.68
对比5 68ng/μL 1.82
本试剂盒提取的bio-beads样品中微生物DNA的PCR结果(25个循环)如图3所示，其中M为DL2000，CK为空白对照。
采用本发明提供的试剂盒抽取的DNA样品，不需要纯化，可直接用于PCR扩增。
采用本发明中的试剂盒进行微生物DNA提取，在耗时上，本试剂盒提取2个样品的整个过程约47min，与进口试剂盒
Figure BDA0003314955990000062
Spin Kit for Soil(MP Bio)相比，基本相同；在质量上，浓度明显高于进口试剂盒，纯度与经典进口试剂盒基本相当；在成本上，目前耗材费用约5元/样品，常用进口试剂盒购买费用约40元/样品(按2000元/50个样品计算)，成本优势明显。

Claims (10)

1.一种从多孔吸附材料中提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括以下成分：
1）解吸液：焦磷酸钠溶液；
2）裂解液：Tris-HCl，EDTA，GuHCl和Triton X-100；
3）直径在0.1-3mm的不同直径的氧化锆珠；
4）蛋白质沉淀液：尿素和醋酸缓冲液；
5）DNA吸附混合物：SiO2-HCl和醋酸缓冲液；
6）过滤套装：过滤柱和离心管；
7）洗涤液和洗脱液；其中洗涤液包括无水乙醇、NaCl、Tris和EDTA，洗脱液为Tris-HCl和EDTA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述解吸液焦磷酸钠溶液为100-800μmol, pH为9.0-10.5。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解液中Tris-HCl为20-50mM、EDTA20-50mM、GuHCl 600-1000mM和Triton X-100质量浓度为 0.2%-2%，pH为9.0-10.5。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述3）中球体为直径分别为0.1mm、0.5mm、1mm、2mm和3mm中的一种或几种组合。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：蛋白质沉淀液pH为4.0-5.0，其中尿素为3-8M。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：DNA吸附混合物中SiO2-HCl是用HCl处理过的SiO2，其状态为混悬液；混悬液的质量分数为20%-30%，混合物的pH为3.0-5.0。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：洗涤液中含乙醇质量分数为30%-80%、NaCl 80-150mM、Tris 8-15mM和EDTA 0.8-1.5mM；洗脱液中包含Tris-HCl 8-15mM和EDTA0.8-1.5Mm，pH为8.0。
8.采用权利要求1~7任意一项所述试剂盒从多孔吸附材料中提取微生物DNA的方法，其特征在于，具体步骤为：
S1、将不同直径的球体混合，置于离心管内，加入待提取的多孔吸附材料，再加入解吸液，旋涡震荡处理后离心，弃上清液；
S2、向S1中加入裂解液，旋涡震荡后离心，取上清液备用；
S3、向S2所得上清液中加入蛋白质沉淀液，旋涡震荡处理后离心，收集上清液备用；
S4、向S3所得上清液中加入DNA吸附混合物，旋涡震荡后静置，丢弃上层上清液，剩下的溶液混匀后加入过滤柱中并将过滤柱直接进行离心，丢弃过滤液；
S5、取洗涤液加入到过滤柱中混匀，离心后丢弃过滤液，再离心去洗涤液残留，最后将过滤柱静置后加入洗脱液混匀，离心，所得清液为DNA样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述多孔吸附材料为bio-beads、活性炭颗粒、活性炭复合材料、硅藻土中的一种或几种形成的复合材料。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述旋涡震荡的时间为1~10min；离心时间为1~10min，离心转速为10000~14000rpm。
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