CN113817648B

CN113817648B - 一株博斯氏菌Ads-6及其应用

Info

Publication number: CN113817648B
Application number: CN202111196261.1A
Authority: CN
Inventors: 刘志培; 闫雷; 高喜燕; 刘缨
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113817648A

Abstract

本发明属于环境微生物技术领域。本发明提供了一株博斯氏菌(Bosea sp.)Ads‑6，该菌株Ads‑6已于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.23391，保藏中心简称为CGMCC，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的博斯氏菌属Ads‑6能以抗生素阿莫西林作为唯一的碳源、氮源和能源物质进行生长代谢，相比于简单的修饰转化、化学键断裂等，该降解方式更彻底，更环保。

Description

一株博斯氏菌Ads-6及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域。

背景技术

阿莫西林作为一种使用最广泛的抗生素，它不光在人类抗感染历史上起了非常重要的作用，近年来更是广泛应用在畜牧养殖业、渔业以及农业领域。然而，据文献报道阿莫西林在体内并不能被全部吸收或降解，约55％-90％的阿莫西林以原药或者初步代谢物的形式随尿液或者粪便排出体外，最后汇集于污水环境和土壤环境中。这不光会对水土环境带来直接的生态损害，更重要的是长期的阿莫西林积累会给环境中原有的微生物带来一种选择压力，对阿莫西林敏感的微生物生长受到抑制，而抗药微生物迅速成为优势种群，改变了原有的生态结构。与此同时，抗性基因在此时更容易形成、传播。为多重耐药菌、超级细菌的出现创造了良好的条件。抗生素、抗药菌、抗药基因三者组成一种新型的污染系统，对我们生态环境的治理提出挑战。

因此，如何有效降解或者去除污水环境中的残留抗生素是亟需解决的问题。其实近年来对于阿莫西林降解的研究也有很多，但是大多是用物理或者化学的方法对污水中的残留阿莫西林加以处理，比如光催化、芬顿氧化、纳米材料处理等。这不仅成本高昂，工业化使用也不太方便、困难重重，更重要的是这些物理、化学处理法是通过修饰转化或者化学键断裂的方式将阿莫西林原药转化为其他毒性相对较低的化合物，对生态环境的长期影响亦未可知。相比之下，微生物降解环境污染物是使用更广、历史更悠久的一种方法，如堆肥、填埋、活性污泥等都是基于微生物对有机污染物的降解利用，在环境治理方面起到了不可替代的作用。然而这些传统的微生物降解方式是以复杂的微生物菌群为功能单元，对于特定的污染物一般需要经过长期的驯化培养才能展现出降解性能，而且不能保证较高的降解效率。

传统的微生物降解法对阿莫西林的降解效率低下，周期较长。目前分离的对阿莫西林有降解效果的单菌株很少，且很多不能以阿莫西林为唯一碳、氮源进行生长代谢，降解产物不能进入明确的物质代谢循环，对阿莫西林在细菌降解过程中具体途径知之甚少。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株博斯氏菌(Bosea sp.)Ads-6，该菌株Ads-6已于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.23391，保藏中心简称为CGMCC，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

另一方面，本发明提供的博斯氏菌(Bosea sp.)Ads-6能有效降解污泥和污水中的阿莫西林。

本发明的博斯氏菌属Ads-6能以抗生素阿莫西林作为唯一的碳源、氮源和能源物质进行生长代谢，相比于简单的修饰转化、化学键断裂等，该降解方式更彻底，更环保。

附图说明

图1是菌株Ads-6基于16S rRNA基因序列的进化树图。

图2是菌株Ads-6的菌落和细胞形态图，其中A为电镜图，B为菌落图。

具体实施方式

实施例

本发明以制药厂污水处理活性污泥为分离源，分离出一株能以阿莫西林为唯一碳源、氮源和能源物质进行生长代谢的菌株Ads-6。相比以前的降解方式，该菌株并不是简单地将阿莫西林转化为某种中间产物，而是将阿莫西林作为底物基质，转化为自身生长需要的物质，进一步通过呼吸作用转化为无机物，实现了阿莫西林的矿化，进入物质代谢的循环，对环境更加友好。一方面对接下来的降解途径、降解机制研究提供了优异的菌株资源。另一方面，该菌株作为慢生根瘤菌科的一员，属于环境中常见的菌株资源，在含有阿莫西林的污水处理或者污染土壤的生物修复中，该菌的投加能起到生物强化的作用，大大提高阿莫西林的降解效率。

在本发明中，阿莫西林简写为AMX。

1.菌株Ads-6的筛选

阿莫西林降解菌株Ads-6是从2019年3月由高喜燕采集于吉林省通化市一制药厂的活性污泥中后经驯化、分离得到的，具体方法如下：

以minimal salt medium(MSM)液体培养基作为驯化培养基，MSM培养基的配置方法为：KH₂PO₄(0.5g/L),Na₂HPO₄·12H₂O(1.5g/L),NaCl(1.0g/L),MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)，微量元素贮备液(1mL/L)，微量元素储备液的配方为：MnCl₂·4H₂O(0.13g/L)，ZnCl₂(0.23g/L),CuSO4·5H₂O(0.03g/L),CoCl₂·6H₂O(0.42g/L),Na₂MoO₄·2H₂O(0.15g/L)，Al₂(SO₄)₃(0.05g/L)，CaCl₂(0.23g/L)，FeCl₃(0.2g/L)，NiCl₂·6H₂O(0.2g/L)，调节pH到7.0，适量分装到锥形瓶，121℃高温高压灭菌20min。

将混匀的活性污泥以10％的体积比接种到MSM中，加入20mg/L阿莫西林作为碳源和氮源，在富集、驯化初期额外加入50mg/L的酵母提取物提供生长因子，在160rpm，30℃条件的摇床中富集培养2周得富集培养液。

然后按1％接种量将上述得到的富集培养液接种到新的MSM培养基中，阿莫西林初始浓度调整为50mg/L，不再加入酵母提取物，同样的条件培养2周。

再以相同的方式依次转接到阿莫西林初始浓度为80mg/L，100mg/L的MSM培养基中进行驯化、富集培养。

将最后得到的富集液多次划线或涂布到LB平板上，分离单菌，获得在富集液中存活的各菌株资源。

然后将得到的菌株分别接种到试管分装的LB液体培养基中进行纯培养，经过约1-2天的培养后，菌株的生长进入对数或者稳定期，此时收集菌体，去掉上清并用超纯水洗2-3次以彻底去除残留培养基，制成OD₆₀₀为1.0左右的菌悬液，按1％的接种量接种到MSM中，加入阿莫西林100mg/L，160rpm，30℃条件的摇床中培养一周，每隔一定时间取样检测OD₆₀₀和阿莫西林含量的变化。

经过实验确认，该株菌在此过程中OD₆₀₀升高的同时，阿莫西林含量随之减少，重复试验结果一致。遂命名该菌株为Ads-6。

表1 Ads-6对阿莫西林的降解

2.菌株Ads-6的鉴定

以细菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R作为上下游引物，以菌落PCR的方法对该菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增，扩增产物送公司测序，得到序列如序列表SEQ IDNO.1所述。

根据菌株Ads-6的全基因组测序结果，其16S rRNA基因序列与上述菌落PCR得到的序列完全一致，用NCBI-blast和EzBioCloud将得到的序列结果进行在线比对，发现菌株Ads-6的16S rRNA基因序列与Bosea robiniae DSM 26672^T最为接近，其相似度达到99.22％。在系统发育进化树上，该序列也与Bosea sp.的菌株聚在一起(图1)。

菌株Ads-6在LB平板上的菌落特征(如图2)：圆形，湿润的乳白色凸起状。扫描电镜照片显示菌株Ads-6的细胞为短杆状，单生极毛。这些特征都符合慢生根瘤菌科博斯氏菌属的特征。

综合以上信息，鉴定菌株Ads-6属于博斯氏菌(Bosea sp.)，该菌株Ads-6已于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.23391，保藏中心简称为CGMCC，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

3.菌株Ads-6降解阿莫西林的特性

以MSM培养基为培养介质，0.25mmol/L的阿莫西林为唯一碳、氮源，接入1％的Ads-6菌悬液(OD₆₀₀＝1.0)，置于160rpm，30℃摇床中培养，每24h取样检测其生物量和阿莫西林含量(用HPLC检测)。实验设置三个重复，结果取其平均值，误差为三个重复实验结果的标准偏差。

表2 Ads-6对0.25mM浓度的AMX的降解

结果显示，阿莫西林在该条件下，24小时内就完全被转化，4天内被完全降解，生物量由0时刻的0.013±0涨到4天时的0.043±0.003，表明Ads-6菌株对阿莫西林有着优异的降解能力，并能利用阿莫西林进行生长代谢，实现阿莫西林的彻底降解。

菌株Ads-6在生长过程中以阿莫西林为唯一的碳、氮源实现了生长代谢，这表明，阿莫西林能被菌株Ads-6同化成为自身生存必须的核酸、蛋白质等物质，再通过自身呼吸作用转化为无机物，形成物质闭合循环。此过程相对其他降解方式如共基质代谢或者其他不彻底的修饰转化、化学键断裂等，不仅节省了其他能源物质的消耗，更避免了简单的物质转化对环境造成的二次污染。

4.菌株Ads-6降解不同初始浓度的阿莫西林

用LB液体培养基培养菌株Ads-6至指数或者稳定期，收集菌体并用超纯水洗2-3次以彻底去除残留培养基，制成OD₆₀₀在1左右的菌悬液，按1％的接种量接种到MSM培养基(无任何碳、氮源)中，添加阿莫西林浓度分别为2mM，1mM，0.5mM，0.25mM，0五个梯度，每个梯度三个生物学重复，并设置不接种菌株Ads-6情况下阿莫西林在MSM培养基中的变化作为对照。

30℃，160rpm条件的摇床中培养，每天取样检测生物量(OD₆₀₀)和阿莫西林和其他中间产物降解情况，直至生物量趋于稳定不再生长。结果表明，在对照样本中，阿莫西林也有微弱的降解，但并不影响实验组的结果。

在阿莫西林为低初始浓度(<1mM)时，菌株Ads-6的生长量随阿莫西林浓度的增加而增加，但在高浓度(≥1mM)情况下，菌株Ads-6生长到OD₆₀₀为0.66左右时趋于稳定，这可能是由于某一个降解产物在高浓度时能抑制Ads-6的生长。另外，从结果可以看出，在降解过程中，DP1和DP2也实现了从无到有，再到零的过程，这说明DP1和DP2是阿莫西林降解过程中的重要中间代谢产物。

表3 Ads-6对不同AMX起始浓度的降解

5.不同pH下菌株Ads-6对阿莫西林的降解

同上述第4步实验操作，调节初始pH分别为6，7，8三个梯度，并设置在不同pH下阿莫西林的自发降解的对照实验，同样每个梯度三个重复，阿莫西林初始浓度为0.25mM，培养条件是160rpm，30℃。结果表明阿莫西林及DP1，DP2在这个pH范围内降解速率接近，也就是说菌株Ads-6对阿莫西林的降解有较宽的pH适应范围。

表4 Ads-6在不同pH下对AMX的降解

6.不同温度下菌株Ads-6对阿莫西林的降解

同上述第4步实验操作，阿莫西林初始浓度为0.25mM，培养基pH7，培养条件为160rpm，设置20℃，30℃，40℃三个梯度，并设置不同温度下阿莫西林的自发降解实验以参考，同样每个梯度三个重复。结果表明，温度对阿莫西林的降解影响较大，在20℃时，Ads-6生长缓慢，但是仍然能够迅速将阿莫西林继续降解。40℃并不是菌株Ads-6能正常生长的温度，在此温度下，菌株Ads-6的生物量呈减少趋势，但是接种的Ads-6依然能把部分阿莫西林降解。

表5 Ads-6在不同温度下对AMX的降解

7.额外添加碳源或者氮源的情况下菌株Ads-6对阿莫西林的降解

同上述第4步实验操作，阿莫西林初始浓度为0.25mM，培养基pH7，培养条件为160rpm，30℃。但是在培养基中额外加100mg/L的酵母提取物，100mg/L的硫酸铵或者100mg/L的葡萄糖，并设置空白对照(不额外添加碳或者氮源)，同样每组实验三个重复。结果表明。额外的碳源(葡萄糖)和额外的氮源(硫酸铵)并没有促进阿莫西林的降解，Ads-6却能利用葡萄糖进行生长。而比较之下，酵母提取物能大大促进阿莫西林的降解及代谢。

表6外源碳氮对Ads-6降解AMX的影响

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株博斯氏菌Ads-6及其应用

<141> 2021-10-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1493

<212> DNA

<213> 博斯氏菌(Bosea sp.)

<400> 1

attcaatctg agagtttgat cctggctcag agcgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg 60

caagtcgaac gggcacttcg gtgctagtgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaacgtgc 120

ctttcggttc ggaataattc agggaaactt ggactaatac cggatacgcc cttcggggga 180

aagatttatc gccgaaagat cggcccgcgt ctgattagct agttggtgag gtaatggctc 240

accaaggcga cgatcagtag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca 300

cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 360

tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt tgtccgggaa 420

gataatgact gtaccggaag aataagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 480

acgaaggggg ctagcgttgc tcggaatcac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggactctt 540

aagtcggggg tgaaagccca gggctcaacc ctggaattgc cttcgatact gggagtcttg 600

agttcggaag aggttggtgg aactgcgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcgcaag 660

aacaccggtg gcgaaggcgg ccaactggtc cgaaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gccagccgtt 780

ggggagcttg ctcttcagtg gcgcagctaa cgctttaagc attccgcctg gggagtacgg 840

tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcttttgac atgtccggtt tgatcggcag 960

agatgccttt cttcagttcg gctggccgga acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgcccc tagttgccat 1080

cattcagttg ggaactctag ggggactgcc ggtgataagc cgcgaggaag gtggggatga 1140

cgtcaagtcc tcatggccct tacaggctgg gctacacacg tgctacaatg gcggtgacaa 1200

tgggcagcga aggggcgacc tggagctaat cccaaaaagc cgtctcagtt cagattgcac 1260

tctgcaactc gagtgcatga aggtggaatc gctagtaatc gtggatcagc atgccacggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg ggtttacccg 1380

aaggcgtcgc gctaaccgca aggaggcagg cgaccacggt aggctcagcg actggggtga 1440

agtcgtaaca aggtagccgt aggggaacct gcggctggat cacctccttt cta 1493

Claims

1.博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6，其保藏编号为CGMCC No.23391。

2.权利要求1所述博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6在降解阿莫西林中的应用。

3.权利要求2所述博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6在降解阿莫西林中的应用，其特征在于，所述阿莫西林为在污染土壤、污泥或污水中的阿莫西林。

4.权利要求2所述博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6在降解阿莫西林中的应用，其特征在于，所述降解的条件：阿莫西林浓度不高于1 mM。

5.权利要求2所述博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6在降解阿莫西林中的应用，其特征在于，所述降解的条件：pH为6-8。

6.权利要求2所述博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6在降解阿莫西林中的应用，其特征在于，所述降解的条件：温度为20-40℃。

7.权利要求2所述博斯氏菌 (Bosea sp.) Ads-6在降解阿莫西林中的应用，其特征在于，所述博斯氏菌Ads-6以博斯氏菌Ads-6和酵母提取物的组合物的形式的应用。