CN113801951A - 一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及诊断试剂盒，特别是涉及一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组、试剂盒及其应用。本发明提供了一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组，所述引物探针组的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.90所示。采用本发明所述引物探针组能够快速、准确、高通量检测猪发病或致死病原。而且在猪发病或死亡病因未知时，或者只知晓大体临床性状如消化系统疾病但不清楚病原时，采用本发明所述引物探针组可以快速锁定是否感染可致猪死亡的病原，有利于及时准确的临床用药，避免更多的猪感染或死亡。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒，特别是涉及一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
生猪养殖业是国内畜牧业的重要组成部分，中国不仅是生猪养殖大国，也是猪肉消费大国。因此，生猪的健康高效养殖在生猪保供和猪肉安全中发挥重要作用。国内当下的生猪养殖业，猪病的形势越发复杂，混合感染的现象也越来越多,猪群疫病的防控越发棘手，每年给生猪养殖业造成的经济损失不可估量。对发病猪只快速明确病因锁定病原，有利于及时采取精准的防治干预措施，有效控制疫病在猪群的蔓延，降低生猪的发病和死亡率，这将是保障生猪养殖业健康发展的必要手段。
但实际生产中，生猪发病初期，不同病原感染引发的临床症状往往很相似，如发热、食欲减退、精神不振等表现，即使都是表现呼吸道疾病症状，引发感染的病原也不能明确是细菌还是病毒，从而无法精准下药防治。因此，亟需开发一种可快速、准确、通量检测猪发病或致死病原的方法，以及时有效控制猪群疫病发展。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组、试剂盒及其应用。采用本发明所述引物探针组能够快速、准确、通量检测猪发病或致死病原。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组，所述引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所示。
优选的，所述病原微生物包括引发猪消化系统疾病的病原微生物、引发猪神经系统疾病的病原微生物、引发猪呼吸系统疾病的病原微生物优选和引发猪皮肤病的病原微生物。
优选的，所述引发猪消化系统疾病的病原微生物包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒、A型轮状病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪霍乱或副伤寒沙门氏菌、大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、魏氏梭菌和弓形虫；所述引发猪神经系统疾病的病原微生物包括狂犬病毒、伪狂犬病毒、猪乙脑病毒和李斯特菌；所述引发猪呼吸系统疾病的病原微生物包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪炭疽杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型、猪链球菌9型、肺炎支原体和棘球蚴；所述引发猪皮肤病的病原微生物优选包括口蹄疫病毒、猪丹毒杆菌和附红细胞体。
优选的，检测猪流行性腹泻病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的PEDV-NF、核苷酸如SEQ ID No.2所示的PEDV-NR和核苷酸如SEQ ID No.3所示PEDV-NP；
检测猪传染性肠胃炎病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的TGEV-NF、核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的TGEV-NR和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的TGEV-NP；
检测A型轮状病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的PRAV-VP6F、核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的PRAV-VP6R和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示PRAV-VP6P；
检测猪瘟病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示CSFV-5UTRF、核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的CSFV-5UTRR和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的CSFV-5UTRP；
检测非洲猪瘟病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的ASFV-VP72F、核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的ASFV-VP72R和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的ASFV-VP72P；
检测猪霍乱或副伤寒沙门氏菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的STSP-hpF、核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的STSP-hpR和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的STSP-hpP
检测大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ IDNo.19所示的STEC-stx1F1、核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的STEC-stx1R1、核苷酸序列如SEQ ID No.21所示的STEC-stx1P1、核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的STEC-stx2F2、核苷酸序列如SEQ ID No.23所示的STEC-stx2R2和核苷酸序列如SEQ ID No.24所示的STEC-stx2P2；
检测肠致病性大肠杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.25所示的EPEC-eaeF、核苷酸序列如SEQ ID No.26所示的EPEC-eaeR和核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的EPEC-eaeP；
检测产肠毒素性大肠杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.28所示ETEC-eltF1、核苷酸序列如SEQ ID No.29所示的ETEC-eltR1、核苷酸序列如SEQ ID No.30所示的EPEC-eaeP1、核苷酸序列如SEQ ID No.31所示的ETEC-estpF2、核苷酸序列如SEQ IDNo.32所示的ETEC-estpR2和核苷酸序列如SEQ ID No.33所示的ETEC-estpP2；
检测魏氏梭菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.34所示Cp-cpaF、核苷酸序列如SEQ ID No.35所示的Cp-cpaR和核苷酸序列如SEQ ID No.36所示的Cp-cpaP；
检测弓形虫的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.37所示的TG-B1F、核苷酸序列如SEQ ID No.38所示的TG-B1R和核苷酸序列如SEQ ID No.39所示的TG-B1P；
检测狂犬病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.40所示的RV-NF、核苷酸序列如SEQ ID No.41所示的RV-NR和核苷酸序列如SEQ ID No.42所示的RV-NP；
检测伪狂犬病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.43所示的PRV-gEF、核苷酸序列如SEQ ID No.44所示的PRV-gER和核苷酸序列如SEQ ID No.45所示的PRV-gEP；
检测猪乙脑病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.46所示的JEV-NSF、核苷酸序列如SEQ ID No.47所示的JEV-NSR和核苷酸序列如SEQ ID No.48所示的JEV-NSP；
检测李斯特菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.49所示的Li-F、核苷酸序列如SEQ ID No.50所示的Li-R和核苷酸序列如SEQ ID No.51所示的Li-P；
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.52所示的PRRSV-NSP2F、核苷酸序列如SEQ ID No.53所示的PRRSV-NSP2R和核苷酸序列如SEQ IDNo.54所示的PRRSV-NSP2P；
检测猪圆环病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.55所示的PCV-ORF2F、核苷酸序列如SEQ ID No.56所示的PCV-ORF2R和核苷酸序列如SEQ ID No.57所示的PCV-ORF2P；
检测猪流感病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.58所示的SIV-MF、核苷酸序列如SEQ ID No.59所示的SIV-MR和核苷酸序列如SEQ ID No.60所示的SIV-MP；
检测猪炭疽杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.61所示的BA-plcRF、核苷酸序列如SEQ ID No.62所示的BA-plcRR和核苷酸序列如SEQ ID No.63所示的BA-plcRP；
检测猪多杀性巴氏杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.64所示的Pm-SodAF、核苷酸序列如SEQ ID No.65所示的Pm-SodAR和核苷酸序列如SEQ ID No.66所示的Pm-SodAP；
检测副猪嗜血杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.67所示的HP-INFBF、核苷酸序列如SEQ ID No.68所示的HP-INFBR和核苷酸序列如SEQ ID No.69所示的HP-INFBP；
检测猪链球菌2型的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.70所示的SS2-CPS2JF、核苷酸序列如SEQ ID No.71所示的SS2-CPS2JR和核苷酸序列如SEQ ID No.72所示的SS2-CPS2JP；
检测猪链球菌9型的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.73所示的SS9-CPS9HF、核苷酸序列如SEQ ID No.74所示的SS9-CPS9HR和核苷酸序列如SEQ ID No.75所示的SS9-CPS9HP；
检测肺炎支原体的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.76所示的MHP-p102F、核苷酸序列如SEQ ID No.77所示的MHP-p102R和核苷酸序列如SEQ ID No.78所示的MHP-p102P；
检测棘球蚴的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.79所示的EG/M-12sF、核苷酸序列如SEQ ID No.80所示的EG/M-12sR和核苷酸序列如SEQ ID No.81所示的EG/M-12sP；
检测口蹄疫病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.82所示的FMDV-3DF、核苷酸序列如SEQ ID No.83所示的FMDV-3DR和核苷酸序列如SEQ ID No.84所示的FMDV-3DP；
检测猪丹毒杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.85所示的ER-16sF、核苷酸序列如SEQ ID No.86所示的ER-16sR和核苷酸序列如SEQ ID No.87所示的ER-16sP；
检测附红细胞体的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.88所示的Ms-16sF、核苷酸序列如SEQ ID No.89所示的Ms-16sR和核苷酸序列如SEQ ID No.90所示的Ms-16sP。
本发明提供了一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组。
优选的，所述引物探针组中每条引物的工作浓度为0.5μmol/L，每条探针的工作浓度为0.05μmol/L。
优选的，所述试剂盒还包括Real time PCR缓冲液、Taq酶、dNTP混合液和MgCl2；所述Taq酶的工作浓度为0.03～0.1U/μL；所述dNTP混合液的工作浓度为0.1～0.4mmol/L，MgCl2的工作浓度为2～6mmol/L。
本发明提供了述引物探针组或上述试剂盒在非诊断目的的检测多种致猪死亡的病原微生物中的应用。
优选的，在检测时，PCR的反应体系以25μL计，包括DNA模板或cDNA模板0.5～1μL、TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII12.5μL、针对每种病原微生物的引物探针组各10μL和余量的ddH2O。
优选的，所述PCR的扩增程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，45个循环；降温至4℃。
有益效果：本发明提供了一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组，所述探针引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所示，采用本发明所述引物探针组能够快速、准确、高通量检测猪发病或致死病原。在猪发病或死亡病因未知时，或者只知晓大体临床性状如消化系统疾病但不清楚病原时，采用本发明所述引物探针组可以快速锁定是否感染可致猪死亡的病原，有利于及时准确的临床用药，避免更多的猪感染或死亡。
而且，本发明提供了一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒。本发明所述试剂盒具有快速、高通量、特异、敏感，操作简单、易于判读等特点，还可根据不同类型临床症状如神经系统、消化系统、呼吸系统以及皮肤等症状自由灵活组合，更为经济实用。
附图说明
图1为利用试剂盒中特异引物探针组对引发猪细菌病的常见病原微生物进行检测，其中，ΔRn表示PCR过程中探针降解的量,也就是PCR产物的量，2为李斯特菌阳性检测，3为多杀性巴氏杆菌阳性检测，5为产肠毒素性大肠杆菌的阳性检测(est)，7为肠致病性大肠杆菌的阳性检测，11为产志贺毒素性大肠杆菌的阳性检测(stx1)，12为产志贺毒素性大肠杆菌的阳性检测(stx2)；15为猪霍乱沙门菌的阳性检测，16为副猪嗜血杆菌的阳性检测，18为产肠毒素性大肠杆菌的阳性检测(elt)，22为魏氏梭菌的阳性检测，41为不加产志贺毒素性大肠杆菌模板的处理，即阴性对照。
具体实施方式
如无特殊要求，本发明所述试剂均为本领域技术人员常规购买所得即可。
本发明提供了一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组，所述探针引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所示。在本发明中，所述病原微生物优选包括引发猪消化系统疾病的病原微生物、引发猪神经系统疾病的病原微生物、引发猪呼吸系统疾病的病原微生物优选和引发猪皮肤病的病原微生物；所述引发猪消化系统疾病的病原微生物优选包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒、A型轮状病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪霍乱或副伤寒沙门氏菌、大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、魏氏梭菌和弓形虫；所述引发猪神经系统疾病的病原微生物优选包括狂犬病毒、伪狂犬病毒、猪乙脑病毒和李斯特菌；所述引发猪呼吸系统疾病的病原微生物优选包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪炭疽杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型、猪链球菌9型、肺炎支原体和棘球蚴；所述引发猪皮肤病的病原微生物优选优选包括口蹄疫病毒、猪丹毒杆菌和附红细胞体。
在本发明中，所述引物探针组的具体信息优选如表1所示；检测猪流行性腹泻病毒的引物探针组优选基于猪流行性腹泻病毒的N基因特异性设计；检测猪传染性肠胃炎病毒的引物探针组优选基于猪传染性肠胃炎病毒的N基因特异性设计；检测A型轮状病毒的引物探针组优选基于A型轮状病毒的VP6基因特异性设计；检测猪瘟病毒的引物探针组优选针对猪瘟病毒的5UTR基因特异性设计；检测非洲猪瘟病毒的引物探针组优选基于非洲猪瘟病毒的VP72基因特异性设计；检测猪霍乱或副伤寒沙门氏菌的引物探针组优选基于猪霍乱或副伤寒沙门氏菌的hp基因特异性设计；检测大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌的引物探针组优选基于大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌的stx1和stx2基因特异性设计；检测肠致病性大肠杆菌的引物探针组优选基于肠致病性大肠杆菌的eae基因特异性设计；检测产肠毒素性大肠杆菌的引物探针组优选基于产肠毒素性大肠杆菌的elt和est基因特异性设计；检测魏氏梭菌的引物探针组优选基于魏氏梭菌的cpa基因特异性设计；检测弓形虫的引物探针组优选基于弓形虫的B1基因特异性设计；检测狂犬病毒的引物探针组优选基于狂犬病毒的N基因特异性设计；检测伪狂犬病毒的引物探针组优选基于伪狂犬病毒的gE基因特异性设计；检测猪乙脑病毒的引物探针组优选基于猪乙脑病毒的NS基因特异性设计；检测李斯特菌的引物探针组优选基于李斯特菌的h1y基因特异性设计；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组优选基于猪繁殖与呼吸综合征病毒的NSP2基因特异性设计；检测猪圆环病毒的引物探针组优选基于猪圆环病毒的ORF2基因特异性设计；检测猪流感病毒的引物探针组优选基于猪流感病毒的M基因特异性设计；检测猪炭疽杆菌的引物探针组优选基于猪炭疽杆菌的plcR基因特异性设计；检测猪多杀性巴氏杆菌的引物探针组优选基于猪多杀性巴氏杆菌的SodA基因特异性设计；检测副猪嗜血杆菌的引物探针组优选基于副猪嗜血杆菌的infB基因特异性设计；检测猪链球菌2型的引物探针组优选基于猪链球菌2型的cps2J基因特异性设计；检测猪链球菌9型的引物探针组优选基于猪链球菌9型的cps9H基因特异性设计；检测肺炎支原体的引物探针组优基于肺炎支原体的p102基因特异性设计；检测棘球蚴的引物探针组优基于对棘球蚴的12srRNA特异性设计；检测口蹄疫病毒的引物探针组优基于口蹄疫病毒的3D基因特异性设计；检测猪丹毒杆菌的引物探针组优选基于猪丹毒杆菌的16srRNA特异性设计；检测附红细胞体的引物探针组优选基于附红细胞体的16srRNA特异性设计。
表1引物探针组的具体信息
本发明提供了一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组。在本发明中，所述引物探针组中每条引物的工作浓度优选为0.2～1μmol/L，更优选为0.5μmol/L，每条探针的工作浓度优选为0.02～0.2μmol/L，更优选为0.05μmol/L；所述试剂盒优选还包括Real time PCR缓冲液、Taq酶、dNTP混合液和MgCl2；所述Real time PCR缓冲液、Taq酶、dNTP混合液和MgCl2优选来源于TaKaRa TB GreenTMPremixEx TaqTMII(TaKaRa，RR820)的预混试剂；所述Taq酶的工作浓度优选为0.03～0.1U/μL，更优选为0.06～0.09U/μL；所述dNTP混合液的工作浓度优选为0.1～0.4mmol/L，更优选为0.2～0.3mmol/L；所述MgCl2的工作浓度优选为2～6mmol/L，更优选为3～5mmol/L，最优选为3.5～4.5mmol/L。本发明所述试剂盒优选为集成试剂盒。
在猪发病或死亡病因未知时，或者只知晓大体临床性状如消化系统疾病但不清楚病原时，采用本发明所述引物探针组可以快速锁定是否感染可致猪死亡的病原，有利于及时准确的临床用药，避免更多的猪感染或死亡。因此，本发明所述引物探针组或含有本发明所述引物探针组的试剂盒能够用于检测多种致猪死亡的病原微生物。
本发明提供了上述引物探针组或上述试剂盒在非诊断目的的检测多种致猪死亡的病原微生物中的应用。本发明在检测时，PCR的反应体系以25μL计，优选包括DNA模板或cDNA模板0.5～1μL、TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTM II 12.5μL、针对每种病原微生物的引物探针组各10μL和余量的ddH2O；所述PCR的扩增程序优选为：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，45个循环；降温至4℃。本发明所述试剂盒具有快速、通量、特异、敏感，操作简单、易于判读等特点，还可根据不同类型临床症状如神经系统、消化系统、呼吸系统以及皮肤等症状自由灵活组合，更为经济实用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
选择可引发生猪细菌病的常见细菌(李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产志贺毒素性大肠杆菌、猪霍乱或副伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、魏氏梭菌)，利用本发明试剂盒中特异引物探针组进行检测，以验证这些引物探针组的有效性。配制RealtimePCR反应体系：每个反应管含有不同细菌(李斯特菌、多杀性巴氏杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、产志贺毒素性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、猪霍乱或副伤寒沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、魏氏梭菌)模板DNA 1μL，TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa，RR820)12.5μL和每种细菌对应的引物探针组各10μL，ddH2O补足至25μL。产肠毒素性大肠杆菌和产志贺毒素性大肠杆菌各检测两种特异基因，以Neg(不加产志贺毒素性大肠杆菌模板的处理)为阴性对照。通过Realtime PCR仪进行PCR检测，PCR扩增反应步骤如下：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，共45个循环；降温至4℃。对检测数据进行判读，检测数据如图1所示：发现进行测试的10种探针引物组均对其特异菌种模板DNA有阳性扩增，而针对李斯特菌引物不加模板的阴性对照无阳性扩增。
应用例1
对猪场不明病因发病或死亡的猪进行病因诊断
采用DNA/RNA共提取试剂盒(天根，DP422)同时提取发病或死亡猪病灶部位组织或免疫器官的DNA和RNA，其中RNA采用Fastking一步法反转录试剂盒(天根，KR118)反转录成cDNA，然后利用本发明所述用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒对临床样品核酸进行检测，其中RNA病毒利用反转录的cDNA模板，其余利用提取的DNA模板。将配制荧光定量PCR反应体系(DNA模板或cDNA模板1μL、TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa，RR820)12.5μL和引物探针组10μL，ddH2O补足至25μL)，通过Realtime PCR仪进行PCR检测，PCR扩增反应步骤如下：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，共45个循环；降温至4℃；然后对检测数据进行判读，扩增阳性的基因所对应的非洲猪瘟病毒就是导致猪发病或死亡的病原。
应用例2
对疑似死亡或发病猪胴体进行病原检测
检测感官不正常的猪胴体，即怀疑屠宰的死亡或发病猪，采用试DNA/RNA共提取试剂盒(天根，DP422)同时提取猪胴体病灶部位组织或免疫器官的DNA和RNA，其中RNA采用Fastking一步法反转录试剂盒(天根，KR118)反转录成cDNA，然后利用本发明所述用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒对临床样品核酸进行检测，其中RNA病毒利用反转录的cDNA模板，其余利用提取的DNA模板。将配制荧光定量PCR反应体系(DNA模板或cDNA模板1μL、TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa，RR820)12.5μL和引物探针组10μL，ddH2O补足至25μL)，通过Realtime PCR仪进行PCR检测，PCR扩增反应步骤如下：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，共45个循环；降温至4℃；然后对检测数据进行判读，扩增阳性的基因所对应的魏氏梭菌就是导致猪死亡的病原。
应用例3
对出现消化系统疾病的猪进行病因诊断
采用试剂盒DNA/RNA共提取试剂盒(天根，DP422)提取出现消化系统临床症状的猪肛拭子的DNA和RNA，其中RNA采用Fastking一步法反转录试剂盒(天根，KR118)反转录成cDNA，然后利用本发明所述用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒中所包含的11种消化系统病原检测的引物探检测临床样品核酸进行检测，同时做阳性对照(猪流行性腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒、A型轮状病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪霍乱或副伤寒沙门氏菌、大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、魏氏梭菌、弓形虫11种病原微生物的阳性核酸)和阴性对照(不加模板)，其中RNA病毒利用反转录的cDNA模板，其余利用DNA模板。将配制荧光定量PCR反应体系(DNA模板或cDNA模板1μL、TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa，RR820)12.5μL和引物探针组10μL，ddH2O补足至25μL)，通过Realtime PCR仪进行PCR检测，PCR扩增反应步骤如下：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，共45个循环；降温至4℃；然后对检测数据进行判读，扩增阳性的基因所对应的产志贺毒素大肠杆菌就是导致猪发生消化系统疾病的病原。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种用于同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组、试剂盒及其应用
<160> 90
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcaaagact gaacccacta attt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgcctctgt tgttacttgg agat 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttgccatt gccacgactc ctgc 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaggtaaag gtgatgtgac aa 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acattcagcc agttgtgggt aa 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaattctca atgtaatcag 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatagccaga gaatcacaac gaa 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccatgcccat agtaggacta gcaaa 25
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcacgtcgaa ctactgacga ctgt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagccgtagt ggcgagctcc ctgggtggt 29
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
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<212> DNA
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gtatgtaaga gctgcagaac 20
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatcgataag attgat 16
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ataaagatct acaggtccta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaaagtctc gccaagtaga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acttctcgac tgcaaagacg tatg 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaaattatc ccctgagcca ctatc 25
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<211> 19
<212> DNA
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<400> 21
ctctgcaata ggtactcca 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccacatcggt gtctgttatt aacc 24
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<212> DNA
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<400> 23
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<212> DNA
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<400> 24
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<212> DNA
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<400> 26
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<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgtcatggta cgggtaa 17
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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<212> DNA
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<400> 29
caaccttgtg gtgcatgatg a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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<212> DNA
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<400> 31
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<212> DNA
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<400> 32
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<212> DNA
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<400> 34
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<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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<210> 36
<211> 25
<212> DNA
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgcaatagc tttacccatt acag 24
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atcggaagta ttagaattaa gtgc 24
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caaacgcaag gaattacggt atc 23
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caaagttagt tcaggaagga atagtct 27
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tgratacaca yttcag 16
Claims (10)
1.一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.90所示。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，所述病原微生物包括引发猪消化系统疾病的病原微生物、引发猪神经系统疾病的病原微生物、引发猪呼吸系统疾病的病原微生物优选和引发猪皮肤病的病原微生物。
3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于，所述引发猪消化系统疾病的病原微生物包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒、A型轮状病毒、猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪霍乱或副伤寒沙门氏菌、大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产肠毒素性大肠杆菌、魏氏梭菌和弓形虫；所述引发猪神经系统疾病的病原微生物包括狂犬病毒、伪狂犬病毒、猪乙脑病毒和李斯特菌；所述引发猪呼吸系统疾病的病原微生物包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪炭疽杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型、猪链球菌9型、肺炎支原体和棘球蚴；所述引发猪皮肤病的病原微生物优选包括口蹄疫病毒、猪丹毒杆菌和附红细胞体。
4.根据权利要求1～3任一项所述引物探针组，其特征在于，检测猪流行性腹泻病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的PEDV-NF、核苷酸如SEQ ID No.2所示的PEDV-NR和核苷酸如SEQ ID No.3所示PEDV-NP；
检测猪传染性肠胃炎病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的TGEV-NF、核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的TGEV-NR和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的TGEV-NP；
检测A型轮状病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的PRAV-VP6F、核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的PRAV-VP6R和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示PRAV-VP6P；
检测猪瘟病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示CSFV-5UTRF、核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的CSFV-5UTRR和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的CSFV-5UTRP；
检测非洲猪瘟病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的ASFV-VP72F、核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的ASFV-VP72R和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的ASFV-VP72P；
检测猪霍乱或副伤寒沙门氏菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的STSP-hpF、核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的STSP-hpR和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的STSP-hpP
检测大肠杆菌中产志贺毒素大肠杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的STEC-stx1F1、核苷酸序列如SEQ ID No.20所示的STEC-stx1R1、核苷酸序列如SEQID No.21所示的STEC-stx1P1、核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的STEC-stx2F2、核苷酸序列如SEQ ID No.23所示的STEC-stx2R2和核苷酸序列如SEQ ID No.24所示的STEC-stx2P2；
检测肠致病性大肠杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.25所示的EPEC-eaeF、核苷酸序列如SEQ ID No.26所示的EPEC-eaeR和核苷酸序列如SEQ ID No.27所示的EPEC-eaeP；
检测产肠毒素性大肠杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.28所示ETEC-eltF1、核苷酸序列如SEQ ID No.29所示的ETEC-eltR1、核苷酸序列如SEQ ID No.30所示的EPEC-eaeP1、核苷酸序列如SEQ ID No.31所示的ETEC-estpF2、核苷酸序列如SEQ ID No.32所示的ETEC-estpR2和核苷酸序列如SEQ ID No.33所示的ETEC-estpP2；
检测魏氏梭菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.34所示Cp-cpaF、核苷酸序列如SEQ ID No.35所示的Cp-cpaR和核苷酸序列如SEQ ID No.36所示的Cp-cpaP；
检测弓形虫的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.37所示的TG-B1F、核苷酸序列如SEQ ID No.38所示的TG-B1R和核苷酸序列如SEQ ID No.39所示的TG-B1P；
检测狂犬病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.40所示的RV-NF、核苷酸序列如SEQ ID No.41所示的RV-NR和核苷酸序列如SEQ ID No.42所示的RV-NP；
检测伪狂犬病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.43所示的PRV-gEF、核苷酸序列如SEQ ID No.44所示的PRV-gER和核苷酸序列如SEQ ID No.45所示的PRV-gEP；
检测猪乙脑病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.46所示的JEV-NSF、核苷酸序列如SEQ ID No.47所示的JEV-NSR和核苷酸序列如SEQ ID No.48所示的JEV-NSP；
检测李斯特菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.49所示的Li-F、核苷酸序列如SEQ ID No.50所示的Li-R和核苷酸序列如SEQ ID No.51所示的Li-P；
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.52所示的PRRSV-NSP2F、核苷酸序列如SEQ ID No.53所示的PRRSV-NSP2R和核苷酸序列如SEQ IDNo.54所示的PRRSV-NSP2P；
检测猪圆环病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.55所示的PCV-ORF2F、核苷酸序列如SEQ ID No.56所示的PCV-ORF2R和核苷酸序列如SEQ ID No.57所示的PCV-ORF2P；
检测猪流感病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.58所示的SIV-MF、核苷酸序列如SEQ ID No.59所示的SIV-MR和核苷酸序列如SEQ ID No.60所示的SIV-MP；
检测猪炭疽杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.61所示的BA-plcRF、核苷酸序列如SEQ ID No.62所示的BA-plcRR和核苷酸序列如SEQ ID No.63所示的BA-plcRP；
检测猪多杀性巴氏杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.64所示的Pm-SodAF、核苷酸序列如SEQ ID No.65所示的Pm-SodAR和核苷酸序列如SEQ ID No.66所示的Pm-SodAP；
检测副猪嗜血杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.67所示的HP-INFBF、核苷酸序列如SEQ ID No.68所示的HP-INFBR和核苷酸序列如SEQ ID No.69所示的HP-INFBP；
检测猪链球菌2型的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.70所示的SS2-CPS2JF、核苷酸序列如SEQ ID No.71所示的SS2-CPS2JR和核苷酸序列如SEQ ID No.72所示的SS2-CPS2JP；
检测猪链球菌9型的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.73所示的SS9-CPS9HF、核苷酸序列如SEQ ID No.74所示的SS9-CPS9HR和核苷酸序列如SEQ ID No.75所示的SS9-CPS9HP；
检测肺炎支原体的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.76所示的MHP-p102F、核苷酸序列如SEQ ID No.77所示的MHP-p102R和核苷酸序列如SEQ ID No.78所示的MHP-p102P；
检测棘球蚴的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.79所示的EG/M-12sF、核苷酸序列如SEQ ID No.80所示的EG/M-12sR和核苷酸序列如SEQ ID No.81所示的EG/M-12sP；
检测口蹄疫病毒的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.82所示的FMDV-3DF、核苷酸序列如SEQ ID No.83所示的FMDV-3DR和核苷酸序列如SEQ ID No.84所示的FMDV-3DP；
检测猪丹毒杆菌的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.85所示的ER-16sF、核苷酸序列如SEQ ID No.86所示的ER-16sR和核苷酸序列如SEQ ID No.87所示的ER-16sP；
检测附红细胞体的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.88所示的Ms-16sF、核苷酸序列如SEQ ID No.89所示的Ms-16sR和核苷酸序列如SEQ ID No.90所示的Ms-16sP。
5.一种同时检测多种致猪死亡的病原微生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的引物探针组。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述引物探针组中每条引物的工作浓度为0.2～1μmol/L，每条探针的工作浓度为0.02～0.2μmol/L。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Real time PCR缓冲液、Taq酶、dNTP混合液和MgCl2；所述Taq酶的工作浓度为0.03～0.1U/μL；所述dNTP混合液的工作浓度为0.1～0.4mmol/L，MgCl2的工作浓度为2～6mmol/L。
8.权利要求1～4任一项所述引物探针组或权利要求5～7任一项所述试剂盒在非诊断目的的检测多种致猪死亡的病原微生物中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在检测时，PCR的反应体系以25μL计，包括DNA模板或cDNA模板0.5～1μL、TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 12.5μL、针对每种病原微生物的引物探针组各10μL和余量的ddH2O。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述PCR的扩增程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，58℃退火延伸1min，45个循环；降温至4℃。
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