CN113801814A - 一种促进气体发酵微生物生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进气体发酵微生物生长的方法，其包括如下步骤：S1.将表面活性剂和培养基超声共混，然后向其中加入含氟烷基化合物，并超声，得到全氟化碳纳米乳液；S2.将菌体悬浊液接种到所述全氟化碳纳米乳液中，同时通入混合气体，得到前驱体；S3.将所述前驱体在摇床中培养；其中，所述前驱体中气泡的直径为2.0‑4.2mm，且气泡总体积小于40ml。在此条件下进行培养，微生物对气体的利用率高，可以更加快速的进行生长代谢，可以更加快速的获取菌体及产物。相较于传统培养系统，添加传质材料可以促进气体传质，气体的消耗量小，成本较低。

Description

一种促进气体发酵微生物生长的方法

技术领域

本发明属于微生物培养领域，具体涉及促进气体发酵微生物生长的方法。

背景技术

随着前沿技术对于废物资源化的不断探索，人们对于污水的认知从“待处理的废物”逐渐转变为“资源的载体”。污水中含有的大量有机污染物质，如果假设典型生活污水的化学需氧量(COD)为500mg/l，则其蕴含的潜在能量17.7-28.7kJ/g COD，而对于该基准浓度污水，实际处理能耗需求约为0.45kW·h/m³，相当于3.20kJ/g的COD。这表明污水中所蕴含的有机化学能是对其进行处理所需能耗的近5倍，具有巨大的应用潜力。

利用微生物电化学进行污水处理产氢或者活性污泥厌氧发酵产氢，可以在进行污染物去除的同时从中获取氢能，实现废物的资源化、能源化。基于可再生能源电辅助产氢/生物电催化产氢/生物电刺激产氢，实现回收利用污水中的有机物/能量。与此同时，会产生如二氧化碳、甲烷、氢气等气体。其中甲烷及二氧化碳作为温室气体，过量排放会造成气候变化加剧，全球各地不断出现极端天气，造成巨大经济损失。我国制定了节能减排的目标，需要进行碳减排及对二氧化碳的固定。厌氧发酵产气和微生物电化学产氢有气体纯度不高、存在二氧化碳等气体的问题，因此价值不高，且难以进行下一步利用。其次，某些工业生产过程，如石油精炼、炼钢、合成氨、煤制甲醇等，能够直接或通过燃烧向大气排放大量以二氧化碳和氢气为主的废气；另一方面，难以生物降解的木质纤维素类物质，可以通过热化学的方式先转化为合成气，即氢气、一氧化碳和二氧化碳的混合物，再进一步处理实现资源的利用。

气体发酵是利用微生物的代谢活动，以气体为底物，满足自身生长需求的同时合成有机物。气体发酵微生物是指利用气体为能源物质进行代谢活动的自养微生物，这类微生物在进行合成发酵的过程中，需要能源物质(电子供体)和碳源，如氢气、一氧化碳、甲烷等，厌氧发酵产气、合成气和微生物电化学产氢则刚好能满足气体发酵微生物的需求，且能达到利用清洁能源来生物降解污水中的污染物，并产生高价值的药物/燃料/蛋白的目标。

传统对于氢气等气体的利用主要是进行燃烧和化工合成等，如氢气用作合成氨、合成甲醇、合成盐酸的原料，冶金用还原剂，石油炼制中加氢脱硫剂等；甲烷可用于合成氨、尿素和炭黑，还可用于、乙烯、甲醛、二硫化碳、硝基甲烷、氢氰酸和1,4-丁二醇等。相对于利用化学方法对这些气体进行处理，生物催化剂具有反应条件温和、反应特异性高、对硫化物耐受度高、无需调控特定气体比例等优点，近年来受到特别的关注。但是环境条件下，合成气在水中的溶解度很有限，如氢气，即使是过饱和状态，溶解度也只有0.79mmol/l左右。因此，气体传质效率偏低一直是合成气发酵过程及其用于生产高价值化学品的瓶颈。

全氟化碳，又称为全氟溶剂或氟溶剂，是碳原子上的氢原子全部被氟原子取代的烷烃、醚和胺。在现有报道中，全氟化碳是一种极好的气体溶剂，能溶解大量的氢气、氧气、氮气和二氧化碳等。文献(Dissolving Gases in FLUTEC Liquids(F2 Chemicals Ltd,2005))报道显示：与直接将气体溶解在水溶液中相比，氢气和二氧化碳在全氟化碳中溶解度提高了一个数量级。并且，全氟化碳具有化学惰性，在溶解气体的过程中并不会直接与气体分子实际结合，显示出优秀的气体载体的作用。然而，纯全氟化碳密度非常高，从1.7到2.0g/cm³不等，当应用于低剪切、温和混合系统时，要么完全沉降到底部，要么只部分分散成大粒径的液滴，导致其对于气体传质效果的增强效率很低。

并且，气体与液体之间的传质受气体扩散系数的影响。基于Lemlich模型并构建经验公式，可知气体扩散系数受气泡直径及气泡稳定性的影响，稳定且直径小的气泡气体扩散系数小。气体传质系数小的气泡会阻隔液体与气体的接触，从而抑制气体的传质。

因此，亟需找到一种技术来克服上述全氟化碳在培养气体发酵微生物生长方面的缺陷。

发明内容

本发明针对以上技术问题，公开了一种促进气体发酵微生物生长的方法，能有效地提升气体传质效率，从而促进合成气发酵过程更为顺利地进行。其主要是将菌体悬浊液接种到全氟化碳乳液中，并同时通入混合气体，在该环境下对气体发酵微生物进行持续培养。令人意外地发现，该方法能极大地促进气体发酵微生物的生长，从而使其有机物合成行为大大加快。

采用可生物相容的含烷氧基链段的聚合物类表面活性剂超声处理全氟化碳水溶液，通过乳化，制得全氟化碳纳米乳剂，使全氟化碳以纳米级的微粒形式分散于水溶液之中。与纯全氟化碳溶剂相比，全氟化碳纳米乳剂具有更微小的纳米级颗粒粒径、更大的液液界面面积，且与微生物之间形成的非特异性键，能够极大提高合成气在微生物发酵培养体系中的溶解度，提高气体传质效率，克服合成气发酵的瓶颈。

本发明旨在提供一种促进气体发酵微生物生长的方法，其是通过如下技术方案得以实现的。

一种促进气体发酵微生物生长的方法，其包括如下步骤：

S1.将表面活性剂和培养基超声共混，然后向其中加入含氟烷基化合物，并超声，得到全氟化碳纳米乳液；

S2.将菌体悬浊液接种到所述全氟化碳纳米乳液中，同时通入混合气体，得到前驱体；

S3.将所述前驱体在摇床中培养；

其中，所述前驱体中气泡的直径为2-4.2mm，且气泡总体积小于40ml。

本发明的一些实施例中，所述气泡的具体直径可以但不限于为：2、2.5、3、3.5、4、4.2mm；所述气泡总体积可以但不限于为40、35、30、25、20ml。

在上述前驱体制备过程中，全氟化碳纳米乳液作为一种表面活性剂，在充分摇晃的情况下会形成很多气泡。接种了菌体悬浊液后，在密闭体系内培养微生物。混合气体主要集中在与上部顶空部分，故气泡的存在状态，对气体传质及微生物的生长有显著的影响：加入全氟化碳纳米乳液且气泡直径较大时，传质效果好，从而前驱体的环境能够促进微生物生长并提高产物产量；反之则会有抑制作用。其次，气泡分隔了上层气体和液面，气泡总体积越小气体与液体之间的接触也就越容易，从而促进气体的传质，故形成气泡总体积的理想状态是小于40ml。

气泡直径与液体流速及曝气孔直径相关，液体流速越大气泡直径越小，曝气孔越小气泡直径越小。添加全氟化碳纳米乳液时，要避免剧烈摇晃，且采用大直径(大于2mm)容器缓慢转移，形成的气泡数量少且直径大。用带针头(直径0.6mm)的注射器快速加入，添加结束后并激烈摇匀，则会形成直径较小的气泡，且气泡数量也较多，从而形成气泡直径在2.0-4.2mm的理想状态。

进一步地，所述混合气体选自氮气、氩气、氧气、二氧化碳、一氧化碳、氢气的一种或多种。

进一步地，所述培养基的成分包括卤化物、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、亚硫酸盐、上述成分的水合物、微量元素中的一种或多种。

进一步地，所述菌体悬浊液的OD600值为0.05-1。

进一步地，所述表面活性剂选自含烷氧基链段的聚合物类表面活性剂。

进一步地，所述含氟烷基化合物选自全氟萘烷、十四氟己烷、十二氟环己烷、十六氟庚烷、十二氟戊烷、十氟戊烷、七氟丙烷的一种或多种。

进一步地，所述全氟化碳纳米乳液的颗粒平均粒径为200-300nm。

进一步地，所述菌体为杀虫贪铜菌。

杀虫贪铜菌接种在全氟化碳纳米乳液中，在特定的气压下，有效提高生长效率，同时起到生物固碳的作用，并获得高价值的代谢产物聚-β-羟丁酸(PHB)。

进一步地，所述培养的温度为30-37℃；所述培养的转速为100-300rpm；所述培养的时间为48-120h；所述培养的pH值为6.5-7.5。

进一步地，所述混合气体中，氢气的分数为20-50vt％。

优选地，该混合气体中要包括氢气和氧气，从而保证微生物能给进行好氧呼吸，并且有足够的能源物质。优选地，通入的混合气体所产生的压力在100-200kPa。

本发明具有以下有益效果：

1.在此条件下进行培养，微生物对气体的利用率高，可以更加快速的进行生长代谢，可以更加快速的获取菌体及产物。

2.相较于传统培养系统，添加传质材料可以促进气体传质，气体的消耗量小，成本较低。

附图说明

图1示出了实施例1的全氟化碳纳米乳液的颗粒平均粒径分布图。

图2a-c，分别示出了实施例1、对比例1-2的培养完成的前驱体的外观图。

图3示出了实施例1、对比例1-2的OD600值和所产生的PHB。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。

本发明实施例所述的菌体，采用杀虫贪铜菌；

本发明实施例所述的表面活性剂，为含烷氧基链段的聚合物类表面活性剂，为采购自巴斯夫的Pluronic系列产品。

本发明实施例和对比例所述的全氟化碳纳米乳液的颗粒粒径的测试方法，采用纳米粒度及表面电位测试仪进行测定。

本发明实施例和对比例所述的气泡的直径的测试方法，采用ImageJ软件对实物图片进行测定；

本发明实施例和对比例所述的气泡总体积的测试方法，采用ImageJ软件对实物图片进行测定。

本发明实施例1-3中所述的培养基pH为6.8，培养基的成分和浓度如下表1所述。

表1培养基的成分和浓度

上述微量元素，其成分和浓度如下表2所述。

表2微量元素的成分和浓度

成分	浓度(g/l)
		HCl	0.1
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	15
		MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	2.4
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.4
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.48

实施例1

一种促进气体发酵微生物生长的方法，其包括如下步骤：

S1.将表面活性剂Pluronic F68和50ml的培养基(其中，Pluronic F68为培养基的2.8wt％)，用超声波清洗机进行超声共混30min，使得表面活性剂完全溶解；然后向其中分别移取2250μl的全氟萘烷和2250μl的十四氟己烷，并用超声波清洗机进行超声共混30min，得到全氟化碳纳米乳液，此时测得的全氟化碳纳米乳液的颗粒平均粒径约为254nm，所得粒径测试结果如图1所示；

S2.将培养基培养杀虫贪铜菌20h，获得中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再离心倒去上清液。如此步骤重复三次，菌体分散于培养基，获得菌体悬浊液；

设定2组平行实验：将厌氧瓶盖上橡胶塞及铝封，在灭菌锅中121℃下，灭菌20min，向菌悬液中加入全氟化碳纳米乳液，混合均匀，然后将45ml的含全氟化碳纳米乳液的菌悬液接种到厌氧瓶中，同时通入混合气体(混合气体各个气体的体积比为：N₂:H₂:O₂:CO₂＝49:37:7:7)使厌氧瓶中压强在0.3MPa左右，得到前驱体，前驱体中气泡的直径为2mm，且气泡总体积为30ml。

S3.将所述前驱体在摇床中，30℃恒温，转速为100rpm，pH值为6.5下，培养72h。

实施例2

一种促进气体发酵微生物生长的方法，其包括如下步骤：

S1.将表面活性剂Pluronic F68和30ml的培养基(其中，Pluronic F68为培养基的2.9wt％)，用超声波清洗机进行超声共混30min，使得表面活性剂完全溶解；然后向其中分别移取1350μl的全氟萘烷和1350μl的十四氟己烷，并用超声波清洗机进行超声共混20min，得到全氟化碳纳米乳液，此时测得的全氟化碳纳米乳液的颗粒平均粒径约为280nm；

S2.将培养基培养杀虫贪铜菌22h，获得中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再离心倒去上清液。如此步骤重复三次，菌体分散于培养基，获得菌体悬浊液；

设定2组平行实验：将厌氧瓶盖上橡胶塞及铝封，在灭菌锅中121℃下，灭菌20min，向菌悬液中加入全氟化碳纳米乳液，混合均匀，然后将50ml的含全氟化碳纳米乳液的菌悬液接种到厌氧瓶中，同时通入混合气体(混合气体各个气体的体积比为：N₂:H₂:O₂:CO₂＝40:40:10:10)使厌氧瓶中压强在0.3MPa左右，得到前驱体，前驱体中气泡的直径为4.2mm，且气泡总体积为40ml。

S3.将所述前驱体在摇床中，32℃恒温，转速为300rpm，pH值为7.5下，培养96h。

实施例3

一种促进气体发酵微生物生长的方法，其包括如下步骤：

S1.将表面活性剂Pluronic F68和20ml的培养基(其中，Pluronic F68为培养基的3.0wt％)，用超声波清洗机进行超声共混30min，使得表面活性剂完全溶解；然后向其中分别移取900μl的全氟萘烷和900μl的十四氟己烷，并用超声波清洗机进行超声共混35min，得到全氟化碳纳米乳液，此时测得的全氟化碳纳米乳液的颗粒平均粒径约为250nm；

S2.将培养基培养杀虫贪铜菌20h，获得中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再离心倒去上清液。如此步骤重复三次，菌体分散于培养基，获得菌体悬浊液；

设定2组平行实验：将厌氧瓶盖上橡胶塞及铝封，在灭菌锅中121℃下，灭菌20min，向菌悬液中加入全氟化碳纳米乳液，混合均匀，然后将45ml的含全氟化碳纳米乳液的菌悬液接种到厌氧瓶中，同时通入混合气体(混合气体各个气体的体积比为：N₂:H₂:O₂:CO₂＝45:40:8:7)使厌氧瓶中压强在0.4MPa左右，得到前驱体，前驱体中气泡的直径为3.5mm，且气泡总体积为35ml。

S3.将所述前驱体在摇床中，35℃恒温，转速为200rpm，pH值为7.0下，培养120h。

对比例1

S1.将培养基培养杀虫贪铜菌20h，获得中间体，然后离心，倒去上清液，再利用25×PBS清洗，然后再离心倒去上清液。如此步骤重复三次，菌体分散于培养基，获得菌体悬浊液；

设定2组平行实验：将厌氧瓶盖上橡胶塞及铝封，在灭菌锅中121℃下，灭菌20min，然后将45ml菌悬液接种到厌氧瓶中，同时通入混合气体(混合气体的组成为：N₂:H₂:O₂:CO₂＝49:37:7:7)使厌氧瓶中压强在0.3MPa左右，得到前驱体；

S2.将所述前驱体在摇床中，30℃恒温，转速为100rpm，pH值为6.5下，培养72h。前驱体中无气泡。

对比例2

对比例2与实施例1的所用物质和操作方法均相同，唯一不同在于，在前驱体制备过程中，稍微增加对全氟化碳纳米乳液的摇晃力度，使得前驱体中气泡的直径为1.1mm，且气泡总体积为60ml。

测试例

将上述实施例1、对比例1-2的培养完成的前驱体的厌氧瓶打开，利用菌液测定OD600值表征微生物生长，同时取2ml菌液离心、消解，利用液相色谱仪测定PHB表征产物产量。

其中，实施例1、对比例1-2的培养完成的前驱体的外观图如图2a-c所示。从图2a-c中可以看出，实施例1中的气泡直径和总体积适中；对比例1中由于未加入表面活性剂，故没有气泡产生；对比例2中由于加入表面活性剂后有剧烈摇晃，因此气泡的直径较小、总体积最大。

实施例1、对比例1-2的培养完成的前驱体的所测得的OD600和PHB结果图，如图3所示。

从图3中可以看出，实施例1加入表面活性剂且控制气泡适中，微生物生长状况及产物PHB产量都是最佳的；对比例1中未添加表面活性剂，微生物正常生长下PHB产量为12.8mg/l；而对比例2中由于气泡直径小且总体积过多，传质系数小，反而极大地阻碍了微生物的生长及产物合成。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述促进气体发酵微生物生长的方法包括如下步骤：

S1.将表面活性剂和培养基超声共混，然后向其中加入含氟烷基化合物，并超声，得到全氟化碳纳米乳液；

S2.将菌体悬浊液接种到所述全氟化碳纳米乳液中，同时通入混合气体，得到前驱体；

S3.将所述前驱体在摇床中培养；

其中，所述前驱体中气泡的直径为2-4.2mm，且气泡总体积小于40ml。

2.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述混合气体选自氮气、氩气、氧气、二氧化碳、一氧化碳、氢气的一种或多种。

3.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述培养基的成分包括卤化物、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、亚硫酸盐、上述成分的水合物、微量元素中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述菌体悬浊液的OD600值为0.05-1。

5.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自含烷氧基链段的聚合物类表面活性剂。

6.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述含氟烷基化合物选自全氟萘烷、十四氟己烷、十二氟环己烷、十六氟庚烷、十二氟戊烷、十氟戊烷、七氟丙烷的一种或多种。

7.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述全氟化碳纳米乳液的颗粒平均粒径为200-300nm。

8.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述菌体为杀虫贪铜菌。

9.根据权利要求1所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述培养的温度为30-37℃；所述培养的转速为100-300rpm；所述培养的时间为48-120h；所述培养的pH值为6.5-7.5。

10.根据权利要求2所述促进气体发酵微生物生长的方法，其特征在于，所述混合气体中，氢气的分数为20-50vt％。

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