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CN113801231B - 抗dog-1抗体或其抗原结合片段及其用途 - Google Patents

抗dog-1抗体或其抗原结合片段及其用途 Download PDF

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CN113801231B CN202110962262.6A CN202110962262A CN113801231B CN 113801231 B CN113801231 B CN 113801231B CN 202110962262 A CN202110962262 A CN 202110962262A CN 113801231 B CN113801231 B CN 113801231B
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李文婷
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West China Hospital of Sichuan University
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Abstract

本发明提供了具有改善功效的抗体、方法、组合物和制品，广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。本发明提供了与抗DOG‑1抗体或其抗原结合片段，编码抗DOG‑1抗体的核酸分子，用于表达抗4‑1BB抗体的载体和宿主细胞。本发明进一步提供了本发明公开的抗DOG‑1抗体在制备用于检测、治疗和/或预防肿瘤的药物和/或检测试剂中的应用。

Description

抗DOG-1抗体或其抗原结合片段及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种抗DOG-1抗体或其抗原结合片段及其用途。
背景技术
DOG1(Discovered on Gastrointestinal stromal tumor-1)，是一种钙离子激活的氯离子通道蛋白，又名ANO1、TAOS2、ORAOV2和TMEM16A等，参与细胞膜电位、体液分泌、嗅觉形成、神经冲动传导与平滑肌收缩等生理过程。在肿瘤中，DOG1异常高表达。研究表明，DOG1在胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)中普遍高表达，阳性率高达99％。DOG1还高表达于多种消化道肿瘤，包括食管鳞状细胞癌、胃腺癌、肺腺癌、平滑肌瘤等，而正常组织中表达量极低。
此外，一项由1840名GIST患者组成的大样本临床实验证实，DOG1作为GIST的诊断分子靶标其准确率超过传统的c-KIT靶标，目前DOG1已被广泛应用于GIST的诊断此外。
胃肠道间质瘤GIST是最常见的胃肠道间质来源肿瘤。GIST被认为起源于Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal，ICC)或者干细胞前体。大多数患者存在KIT突变，少部分患者存在PDGFRA突变。上述突变导致非配体依赖的受体酪氨酸激酶(ReceptorTyrosine Kinases，RTK)持续活化，导致肿瘤快速进展。也存在无上述突变的野生型肿瘤，发生与增殖机理不清。胃肠道间质瘤对化疗不敏感，手术切除是目前的首选治疗方案。近年来，随着靶向药物发展，对于体积较大难以手术患者，可使用靶向药物治疗。伊马替尼(Imatinib mesylate，Gleevec)是一种小分子抑制剂，能有效抑制KIT酪氨酸激酶受体，具有对抗KIT、PDFGFRA的活性，是目前治疗手术不可切除GIST的一线临床靶向药物。其他小分子靶向药物如苏尼替尼(Sunitinib，Sutent)等，目前被用于经伊马替尼治疗失败后GIST患者的替代治疗药物。但上述药物在临床应用中会很快产生耐药性。综上所述，在结肠癌与间质瘤的靶向治疗过程中，肿瘤存在快速耐药现象，因此继续开发新型靶向药物具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗DOG-1抗体或其抗原结合片段，编码抗DOG-1抗体的核酸分子，用于表达抗DOG-1抗体的载体和宿主细胞。本发明还提供了抗DOG-1抗体在制备用于检测、治疗和/或预防肿瘤的药物和/或检测试剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了一种能够特异性结合DOG-1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)下述3个重链可变区(VH)互补决定区(CDR)：
(i)VH CDR1，其具有如SEQ ID NO：1所示的VH中含有的CDR1的序列，或者与所述VH中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其具有如SEQ ID NO：1所示的VH中含有的CDR2的序列，或者与所述VH中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和
(iii)VH CDR3，其具有如SEQ ID NO：1所示的VH中含有的CDR3的序列，或者与所述VH中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：
(iv)VL CDR1，其具有如SEQ ID NO：2所示的VL中含有的CDR1的序列，或者与所述VL中含有的CDR1的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(v)VL CDR2，其具有如SEQ ID NO：2所示的VL中含有的CDR2的序列，或者与所述VL中含有的CDR2的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和
(vi)VL CDR3，其具有如SEQ ID NO：2所示的VL中含有的CDR3的序列，或者与所述VL中含有的CDR3的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些优选的实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
在某些优选的实施方案中，所述重链可变区(VH)中含有的3个CDR和/或所述轻链可变区(VL)中含有的3个CDR，由Kabat编号系统定义。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段或者包含：
(a)下述3个重链可变区(VH)CDR：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO：3，或与SEQ ID NO：3相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个或4个氨基酸的置换)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO：4，或与SEQ ID NO：4相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换)的序列；和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO：5，或与SEQ ID NO：5相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个或7个氨基酸的置换)的序列；
和/或
(b)下述3个轻链可变区(VL)CDR：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO：6，或与SEQ ID NO：6相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个或7个氨基酸的置换)的序列；
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO：7，或与SEQ ID NO：7相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个或2个氨基酸的置换)的序列；和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO：8，或与SEQ ID NO：8相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸的置换)的序列；
其中，所述重链可变区(VH)CDR和所述轻链可变区(VL)CDR由Kabat编号系统定义。
在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的构架区(FR)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含来源于鼠免疫球蛋白的重链可变区(VH)构架区(FR)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含来源于鼠免疫球蛋白的轻链可变区(VL)构架区(FR)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含来源于人免疫球蛋白的重链可变区(VH)构架区(FR)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含来源于人免疫球蛋白的轻链可变区(VL)构架区(FR)。
在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区FR和/或轻链可变区FR可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基，例如所述重链构架区FR和/或轻链构架区FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的鼠源氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人免疫球蛋白的框架区(例如，人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区)，所述框架区任选地包含一个或多个从人源残基至鼠源残基的突变。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或者包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO：1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
或
(iii)与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO：2所示的序列；
(v)与SEQ ID NO：2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
或
(vi)与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。
在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。在某些优选的实施方案中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的保守置换。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链包含人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)；
和/或
本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链包含人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区是鼠IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些优选的实施方案中，所述重链恒定区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，优选地，所述重链恒定区是人IgG1或IgG4重链恒定区。
在某些优选的实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区，优选为，鼠κ轻链恒定区或者人κ轻链恒定区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗原结合片段选自scFv、Fa b、Fa b’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)。
在另一些方面，本发明还提供了一种缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂。
在某些优选的实施方案中，所述缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)。
在某些优选的实施方案中，所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素。
在本发明中，合适的治疗剂的非限制性实例包括，抗代谢物、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰基酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝分裂剂。
在某些优选的实施方案中，抗体-药物缀合物(ADC)或其可药用盐或溶剂化合物包含抗DOG-1抗体和一种或多种小分子毒素，包括但不限于小分子药物，诸如喜树碱衍生物、加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)或其衍生物、美登木素生物碱(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatin)、澳瑞他汀、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些药物具有细胞毒活性的片段。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述治疗剂缀合。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过可裂解的接头(例如肽接头、二硫化物或腙接头)与所述治疗剂缀合。
在另一些方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了一种的分离的核酸分子，其包含编码抗体重链可变区的核酸分子，和/或编码抗体轻链可变区的核酸分子，其中，
所述编码抗体重链可变区的核酸分子具有选自下列的序列：
(a)如SEQ ID NO：9的核苷酸序列，或(b)与(a)所述的核苷酸序列基本上相同的序列(例如，与(a)所述的核苷酸序列相比，具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的序列，或具有一个或更多个核苷酸取代的序列)；
所述编码抗体轻链可变区的核酸分子具有选自下列的序列：(a)如SEQ ID NO：50或52所示的核苷酸序列，或(b)与(a)所述的核苷酸序列基本上相同的序列(例如，与(a)所述的核苷酸序列相比，具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的序列，或具有一个或更多个核苷酸取代的序列)。
在某些优选的实施方案中，所述编码抗体重链可变区的核酸分子具有如SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列，以及所述编码抗体轻链可变区的核酸分子具有如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含如SEQ IDNO：9所示的编码抗体重链可变区的核酸分子，和/或如SEQ ID NO：10所示的编码抗体轻链可变区的核酸分子。
在另一些方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一些方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。
在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHOS、CHO DG44)。
在另一些方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在另一些方面，本发明提供了用于制备抗DOG-1抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分并从宿主细胞分离抗体或抗原结合部分。
在另一些方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些优选的实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。
在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如另外的免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒、化学治疗剂、抗血管生成药物、抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂等。
在某些优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于治疗感染的药物，例如抗病毒剂、抗真菌剂、抗细菌剂、免疫刺激剂等。
在另一些方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
在另一些方面，本发明提供了如本文所公开的抗DOG-1抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的药物中的用途。
在另一些方面，本发明提供了如本文所公开的抗DOG-1抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的诊断剂的用途。
在某些优选的实施例中，所述肿瘤选自实体瘤。
在某些优选的实施例中，所述肿瘤选自消化道肿瘤。
在某些优选的实施例中，所述肿瘤为DOG-1阳性的肿瘤。
在某些优选的实施例中，所述肿瘤选自食管癌、胃肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖细胞癌、骨癌、皮肤癌、胸腺癌、胆管癌、黑素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、白血病或癌症的转移性、难治性或复发性病灶。
以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1表面等离子共振检测HX-DOG1001抗体与人源DOG-1的亲和力；
图2流式细胞术检测HX-DOG1001抗体与多种肿瘤细胞系的结合力；
图3流式细胞术比较HX-DOG1001抗体与商业化抗体SP31对人胃肠道间质瘤细胞GIST882的结合力；
图4HX-DOG1001抗体对石蜡包埋的正常组织以及不同肿瘤组织的染色效果对比。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sam brook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1、抗DOG-1抗体的产生
1.1抗DOG-1抗体的筛选
(1)将人DOG-1胞外域抗原(Genbank：NP_060513.5所示序列第1-301位多肽片段，由XXX公司制备)50μg以完全弗氏佐剂充分乳化后，利用多点免疫方式免疫雄性Balb/C小鼠，免疫周期为2-3周一次。
(2)在第三次免疫后第10天，取尾静脉血，用ELISA法测试血浆抗DOG-1抗体滴度，然后融合前3天对产生抗DOG-1抗体滴度最高的小鼠加强免疫一次。
(3)3天后处死小鼠并取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞株融合。
(4)混合2×108个Sp2/0细胞与2×108个脾细胞在50％聚乙二醇(分子量为1450)和5％二甲基亚砜(DMSO)溶液中融合。
(5)用HAT筛选培养基(DMEM培养基，含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.1mM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μg胸苷)调整脾脏细胞数至5×105/mL，加入96孔培养板孔内(每孔0.3mL)，置于37℃，5％CO2培养箱内进行培养。
(6)培养10天后，采用高通量ELISA筛选法检测上清中抗体与DOG-1抗原高亲和结合的克隆。
(7)然后将上述单克隆抗体的孔内融合细胞进行亚克隆。
(8)再通过竞争ELISA的方法，以此筛选出竞争结合DOG-1的阳性孔，获得杂交瘤细胞株。
(9)继续培养产生特异性抗体的克隆。当细胞密度达到约5×105个细胞/mL时，用无血清培养基替换该培养基。培养三天后，将培养过的培养基离心，以收集培养物上清液进一步纯化抗体。最终获得待测试的纯化的杂交瘤细胞株对应的单克隆抗体。
1.2HX-DOG1001抗体的序列分析
按照上述方法制备得到了1株特异性结合DOG-1的抗体，命名为HX-DOG1001。抗体的VH和VL序列如表1所示。进一步使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，PublicHealth Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了筛选得到的HX-DOG1001抗体的CDR序列，具体如表2所示。
表1：HX-DOG1001抗体轻重链可变区氨基酸序列
Figure GDA0003719158090000141
表2：HX-DOG1001抗体CDR的序列
Figure GDA0003719158090000142
Figure GDA0003719158090000151
实施例2、表面等离子共振法(SPR)检测抗体的抗原亲和活性
利用Biacore T200仪器(GE Healthcare公司)进行抗体的抗原亲和力测定。
1.计算抗原偶联Ru
根据Rmax＝(MWanalyte/MWligand)×RL×Sm，实际偶联量为RL的1.5倍。算出适宜检测HX-DOG1001抗体的抗原偶联量为1557Ru；
2.偶联操作：偶联缓冲液缓为1×HBS-EP Buffer，50mM NaOH作为清洗液。使用pH为4.5的醋酸钠溶液配制Her2蛋白至10μg/ml。选择氨基偶联，在Target level中输入1557Ru，将抗原样品、NaOH、乙醇胺、EDC、NSH、空试管根据提示放到样品盘中相应的位置，点击开始；
3.样品检测
用1×HBS-EP Buffer将样品稀释至32nM、16nM、8nM、4nM、2nM、1nM、0.5nM、0.25nM。13,000rpm/min，离心3min；所有的样品均设置一个重复。
Kinetics/Affinity选项中的Flow pat选2-1；Regeneration选择2。点击下一步，Contact time为180s；解离时间设置为4800s；再生条件：1：Gly 2.0 15s；2：Gly 2.0 15s。重复检测的样品间隔开设置三个0浓度，及3个start up。
选取适宜的浓度对应响应单位变化曲线，HX-DOG1001抗体利用1：1计算模型进行拟合。进行动力学分析。
对HX-DOG1001抗体的检测结果如表3所示，其亲和力检测图谱如图1所示。
表3使用表面等离子体共振进行的DOG1抗体对DOG1蛋白的完全动力学结合亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
HX-DOG1001 7.266E+9 22.44 3.088E-9
上述结果表明，本发明制备的HX-DOG1001抗体对人DOG-1的亲和力为3.088×10-9M，能够很好的结合人DOG-1抗原。
实施例3、流式细胞术检测抗体与肿瘤细胞表面DOG-1的结合
(1)分别复苏人胃肠道间质瘤细胞系GIST-882、人结肠癌细胞系HT29和HCT116、人肝癌细胞系HepG2和HCC LM3、人食管癌细胞系Kyse180和Eca109以及人胃癌细胞系MGC803和NCI-N87；
(2)取上述对数生长期细胞用胰酶消化，加含血清培养基终止，1000rpm/min离心3min，收集细胞；
(3)将各细胞系均分成2组，分别为阴性对照组、实验组，每组细胞数目为106个；
(4)每组细胞经1×PBS洗三次后，1000rpm/min离心3min，弃去上清。
(5)阴性对照组加入PBS 100μL，实验组加入HX-DOG1001 1μg/100μL PBS，冰上孵育30min；用1×PBS清洗细胞3次，1000rpm/min离心3min；阴性对照组和实验组以1：100的比例稀释二抗(Fluorescein(FITC)–conjugated Affinipure Goat Anti-Human IgG(H+L),SA00003-12,Proteintech)，100μL/组，冰上孵育30min；在用1×PBS清洗细胞3次，1000rpm/min离心3min；最后加入500μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。
流式细胞术检测HX-DOG1与多种肿瘤细胞表面DOG-1的实验结果如图2所示，其中黑色为阴性对照组，灰色为实验组。结果表明，本申请制备的HX-DOG1001抗体能够和包括胃肠道间质瘤、结肠癌、肝癌、食管癌、胃癌等多种肿瘤细胞表面DOG-1结合，具有很大的多癌种检测和治疗潜力。
实施例4、流式细胞术对比HX-DOG1001抗体与商业化抗体的结合力
以人胃肠道间质瘤细胞GIST882为例，对比本申请制备的HX-DOG1001抗体和商业化抗体SP31的结合力差异。
复苏细胞，用胰酶消化，1000rpm/min离心3min，收集对数生长期细胞；将细胞均分成3组，分别为阴性对照组、阳性对照组、实验组，每组细胞数目为106个；每组细胞经1×PBS洗三次后，1000rpm/min离心3min，弃去上清。阴性对照组加入PBS 100μL，阳性对照组加入商业化DOG-1抗体SP31(Abcam，货号ab64085)1μg/100μL PBS，实验组加入HX-DOG1001001 1μg/100μL PBS，冰上孵育30min；用1×PBS清洗细胞3次，1000rpm/min离心3min；阴性对照组加入PBS 100μL，冰上孵育30min；阳性对照组和实验组以1：100的比例稀释二抗(FITC-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),货号SA00003-2,Proteintech；Fluorescein(FITC)–conjugated Affinipure Goat Anti-Human IgG(H+L),货号SA00003-12,Proteintech)，100μL/组，冰上孵育30min；再用1×PBS清洗细胞3次，1000rpm/min离心3min。最后，加入500μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。
图4中显示了通过流式细胞术检测的HX-DOG1001和SP31与表达DOG1的GIST882细胞的结合的比较结果，其中图4-A为SP31抗体的检测结果，图4-B为HX-DOG001抗体的检测结果，灰色为抗体组，黑色为阴性对照组。以对照组<1％的标准设置门M2，如表4所示，商业化抗体SP31和本申请HX-DOG001抗体的阳性率分别为21.67％和19.62％。
表4使用流式细胞术比较本申请抗体和商业化抗体与DOG1的结合
Figure GDA0003719158090000181
上述结果表明，HX-DOG1001与GIST882细胞表面DOG-1具有良好的结合效力，其结合力与商业化抗体SP31相当。
实施例5、DOG-1抗体检测石蜡包埋组织中DOG-1的免疫组化实验
1.样本准备
选取胃肠间质瘤、结肠间质瘤、食管鳞状细胞癌、结肠癌、食管腺癌等癌症组织和正常肝、结肠、胃组织为对象进行免疫组化实验。
2.组织芯片染色
2.1石蜡组织芯片脱蜡：将组织芯片放入烘箱中，温度设定为65℃，烘蜡1小时。组织芯片烘烤完毕后，从烘箱中取出，进行脱蜡。
脱蜡过程如下：
组织芯片浸没在二甲苯中，浸泡10min，重复3次；
组织芯片依次浸没在无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇和60％乙醇中，各5分钟；
用纯水冲洗组织芯片3次，每次3min。
2.2抗原修复
组织芯片浸没在柠檬酸修复液中，放入微波炉；
微波炉，中火，加热10min；
时间到后，停止加热，组织芯片继续浸没在柠檬酸修复液中开始，冷却35min；
2.3内源性过氧化物阻断
TBST缓冲液冲洗组织芯片3次，每次3min；
片子浸没在过氧化物阻断剂中10min；
2.4一抗孵育
TBST缓冲液冲洗组织芯片3次，每次3min；
纯水冲洗组织芯片3次，每次3min；
用10％正常血清(TBST稀释)，封闭组织芯片2小时；
加入按1：100稀释的一抗(0.8mg/mL HX-DOG1001 TBST稀释)，放入湿盒中，置于4℃冰箱过夜孵育；
2.5显色
从冰箱中取出湿盒，室温放置30min，使湿盒中的组织芯片恢复至室温，取出组织芯片，TBST缓冲液冲洗组织芯片3次，每次3min；
加入按1：100稀释二抗(羊抗人IgG-HRP，SE101，Solarbio，TBST稀释)，室温孵育1h；TBST缓冲液冲洗组织芯片3次，每次3min；
从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mL DAB缓冲液+1mL DAB加色原液进行配制；
在片子上滴加稀释后的DAB，孵育5-10分钟(按照实际情况，染色变成棕色，不再加深即可)；
纯水冲洗5min；
2.6细胞核染色
将组织芯片浸没在苏木素中1min；
接着将组织芯片浸没在1％的盐酸酒精溶液中10秒；立即用纯水冲洗组织芯片2min；
2.7晾干和固定
将片子放入65℃烘箱中晾干至片子没有水分；
用中性树胶封片。
3.结果判定：
阳性细胞标准根据显色程度分为：
阴性(0)：肿瘤细胞无特异性棕色染色；
弱阳性(1+)：肿瘤细胞膜、浆见淡棕色的特异性染色；
中度阳性(2+)：肿瘤细胞膜、浆内见较深棕黄色的特异性染色；
强阳性(3+)：肿瘤细胞膜、浆内见大量深褐色的特异性染色。
图4显示了HX-DOG1001作为一抗检测组织中DOG-1的免疫组化染色结果。结果表明，胃间质瘤、结肠间质瘤、食管鳞状细胞癌、结肠腺癌、肝细胞癌、食管腺癌均为中度至强阳性染色，正常肝、结肠、胃组织为阴性至弱阳性染色。本发明抗体特异性好，阳性信号强，能够较好应用于癌症的检测。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (13)

1.一种抗DOG-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段能够特异性结合DOG-1，所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：1所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗DOG-1抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗DOG-1抗体为全长抗体，包括人抗体恒定区，所述人抗体恒定区的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恒定区及其常规变体，所述人抗体恒定区的轻链恒定区选自人抗体κ或λ链恒定及其常规变体。
4.根据权利要求1所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段选自ScFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、双抗体(diabody)、双特异性抗体和多特异性抗体。
5.根据权利要求1所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，所述可检测的标记为酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素。
6.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5任一项所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段；
所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；
所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
7.一种载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸分子，所述载体为克隆载体或表达载体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体。
9.一种制备权利要求1-5任一所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段的方法，包括，在允许所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
10.一种药物组合物，其含有权利要求1-5任一所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段、或权利要求7所述的载体、或权利要求8所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
11.一种缀合物，其包含权利要求1-5任一所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗DOG-1抗体或其抗原结合片段的治疗剂；所述治疗剂选自细胞毒素或放射性同位素；所述细胞毒素选自喜树碱衍生物、加利车霉素、美登素或其衍生物、多拉司他汀、澳瑞他汀、单端孢霉素。
12.权利要求1-5任一项所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的核酸分子或权利要求10所述的药物组合物或权利要求11所述的缀合物用于制备抑制受试者中的肿瘤细胞生长、转移的药物的用途；
所述肿瘤为DOG-1阳性的肿瘤。
13.一种试剂盒，包括权利要求1-5任一项所述的抗DOG-1抗体或其抗原结合片段或权利要求8的药物组合物或权利要求9的缀合物。
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