CN113564107A - 一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法，在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加干细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝素钠和前列腺素E2对间充质干细胞进行培养。干细胞生长因子及肝素钠可提高细胞的干性，成纤维细胞生长因子、前列腺素E2和肝素钠可提高间充质干细胞的激活Treg细胞活性的能力，从而达到减少细胞聚集增强间充质干细胞治疗各种疾病的效果。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法。
背景技术
间充质干细胞广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，也可从胎儿脐血中分离得到，此外还存在于胎盘，羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中。间充质干细胞具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，间充质干细胞不仅能够向多种组织和细胞分化，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定。
1995年间充质干细胞首次应用于临床应用，2012年Osiris公司申报间充质干细胞作为药品上市得到加拿大FDA的批准，间充质干细胞的临床应用达到一个历史性高度。间充质干细胞目前已顶替胎盘干细胞而成为生物医学研究中首选的种子细胞，并被广泛应用于各种疾病的基础及临床研究。10至20年后，干细胞将会成为一种基本的医疗技术，帮助人们解决现在无法克服的疾病。
干细胞进行疾病的治疗，目前全球范围内已有10家企业的干细胞注射液已经上市，目前已经进入了临床使用阶段。目前国内已有多家企业已申报临床试验并已经通过审批，目前进入临床I，II期试验。申请号为202010351332.X的中国专利《脐带间充质干细胞在制备促进Treg的药物中的应用》采用脐带进行间充质干细胞的分离，并注射裸鼠体内，验证脐带间充质干细胞对裸鼠胸腺发育的影响及发育机制探索，证明脐带间充质干细胞可提高Treg细胞水平，但此实验中细胞的培养采用的是传统的分离及血清培养，验证的是脐带间充质干细胞本身的作用。目前国内外研究中，采用间充质干细胞进行多种免疫疾病的治疗，但是其培养的方法尚停留于传统的血清培养，或者无血清培养可提高其使用安全性，但是在提高间充质干细胞的Treg激活方面鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中间充质干细胞激活Treg细胞的能力较弱的情况，本发明提供了间充质干细胞的培养方法，通过该培养方法可以提高间充质干细胞激活Treg细胞的能力，有助于间充质干细胞治疗疾病的有效性。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法，在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子、抗凝剂和不饱和脂肪酸。
优选地，所述基础培养液为含有10%胎牛血清的aMEM培养液。
优选地，所述生长因子选自干细胞生长因子或成纤维细胞生长因子中的至少一种。
优选地，所述抗凝剂选自肝素钠；所述不饱和脂肪酸选自前列腺素E2。
优选地，在基础培养液中添加生长因子、抗凝剂和不饱和脂肪酸的方式如下：
（1）在P0代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加干细胞生长因子及肝素钠；
（2）在P1-P3代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加干细胞生长因子及成纤维细胞生长因子；
（3）在P4，P5 代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加了成纤维细胞生长因子、抗凝剂和不饱和脂肪酸。
上述培养过程的步骤（1）中干细胞生长因子的添加可以促进干细胞原代中细胞的干性，肝素钠的添加预防干细胞后期生长粘连成团，增加原代细胞的获得率。步骤（2）中干细胞生长因子的添加可以促进干细胞原代中细胞的干性防止间充质干细胞体外复制性衰老。步骤（3）中生长因子及前列腺素E2的添加可以提高干细胞的干性及提高Treg细胞活性，肝素钠的添加可以预防干细胞后期生长粘连成团，获得单细胞悬液。
优选地，步骤（1）中干细胞生长因子和肝素钠的浓度均为1ng/mL-30ng/mL，例如1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL、25ng/mL、26ng/mL、27ng/mL、28ng/mL、29ng/mL或30ng/mL。
优选地，步骤（2）中干细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的浓度均为1ng/mL-30ng/mL。例如1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL、25ng/mL、26ng/mL、27ng/mL、28ng/mL、29ng/mL或30ng/mL。
优选地，步骤（3）中成纤维细胞生长因子、前列腺E2和肝素钠的浓度均为1ng/mL-30ng/mL。例如1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL、25ng/mL、26ng/mL、27ng/mL、28ng/mL、29ng/mL或30ng/mL。
本发明提供一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞，所述提高Treg细胞活性的间充质干细胞由上述培养方法培养而成。
本发明提供一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞制剂，包含上述提高Treg细胞活性的间充质干细胞。
优选地，所述提高Treg细胞活性的间充质干细胞制剂还包含药学上可接受的辅料、载体或添加剂中的至少一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法，通过采用阶段性加入细胞因子可有效的增强间充质干细胞激活Treg细胞活性的能力，其中干细胞生长因子及肝素钠可提高细胞的干性，成纤维细胞生长因子、前列腺素E2和肝素钠可提高间充质干细胞的激活Treg细胞活性的能力，从而达到减少细胞聚集增强间充质干细胞治疗各种疾病的效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的间充质干细胞形态；
图2为不同条件下Treg细胞激活情况。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
清洗脐带组织，75%酒精浸泡5-10分钟后采用PBS漂洗3-5次，将脐带剪成约3cm的条状，剪开脐静脉和动脉，剥离脐带华通氏胶，剪成约1cm3组织块，分为诱导组和未处理组，诱导组加入培养液培养，培养液中添加10ng/mL干细胞生长因子，10ng/mL肝素钠，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养，培养至第五天，显微镜下观察有细胞爬出后，进行半量换液，此后每3天换液，细胞增殖至融合度80%时进行细胞的消化及传代。
传代的P0间充质干细胞消化离心后获得P1代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，培养液中添加10ng/mL干细胞生长因子，10ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加10ng/mL干细胞生长因子，10ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加10ng/mL干细胞生长因子，10ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加10ng/mL成纤维细胞生长因子，10ng/mL前列腺素E2，10ng/mL肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞，加入加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加10ng/mL成纤维细胞生长因子，10ng/mL前列腺素E2，10ng/mL肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得间充质干细胞。
对比例
本对比例与实施例1的区别在于：P0代间充质干细胞的培养过程中培养液未添加10ng/mL干细胞生长因子，10ng/mL肝素钠；P0-P3代间充质干细胞的培养过程中培养液中未添加10ng/mL干细胞生长因子，10ng/mL成纤维细胞生长因子；P4-P5代间充质干细胞的培养过程中培养液中未添加10ng/mL成纤维细胞生长因子，10ng/mL前列腺素E2，10ng/mL肝素钠。
图1为实施例1制备的间充质干细胞形态，由图可知细胞成长梭形，贴壁生长，符合间充质干细胞的基本形态。
表1 实施例1与对比例中细胞的表面分子的表达情况
| 项目 | CD90 | CD73 | CD105 | CD14 | CD19 | CD45 | CD34 | HLA-DR |
| 实施例1 | 99.3% | 99.3% | 99.3% | 1.12% | 0.92% | 1.31% | 0.31% | 0.57% |
| 对比例 | 98.2% | 97.8% | 96.3% | 0.98% | 0.67% | 1.20% | 0.78% | 0.38% |
| 标准 | ≥95% | ≥95% | ≥95% | 〈2% | 〈2% | 〈2% | 〈2% | 〈2% |
表1为实施例1中组合因子诱导后与对比例中细胞的表面分子的表达情况，处理前后的间充质干细胞表面分子检测结果均符合国际细胞治疗协会的要求，CD73，CD90，CD105均高于95%，CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR的均低于2%，说明在组合因子诱导支持细胞的表面分子表达。
图2为不同条件下Treg细胞激活情况，PBMC组为免疫细胞单独培养组，Treg细胞的比例为3.5%，UC组为对比例脐带间充质干细胞与免疫细胞共培养组，Treg细胞的比例为13.5%，UC-因子组为实施例1组合因子处理后的脐带间充质干细胞与免疫细胞共培养组，Treg细胞的比例为25%，从三组由图可知间充质干细胞的免疫调控结果，组合因子诱导后的间充质干细胞的与免疫细胞共同培养，可抑制TH1，TH17细胞的增殖，促进TH2，Treg细胞的分化。说明组合因子诱导后的间充质干细胞可激活Treg细胞。
实施例2
清洗脐带组织，75%酒精浸泡5-10分钟后采用PBS漂洗3-5次，将脐带剪成约3cm的条状，剪开脐静脉和动脉，剥离脐带华通氏胶，剪成约1cm3组织块，分为诱导组和未处理组，诱导组加入培养液培养，培养液中添加1ng/mL干细胞生长因子，1ng/mL肝素钠，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养，培养至第五天，显微镜下观察有细胞爬出后，进行半量换液，此后每3天换液，细胞增殖至融合度80%时进行细胞的消化及传代。
传代的P0间充质干细胞消化离心后获得P1代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，培养液中添加1ng/mL干细胞生长因子，1ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加1ng/mL干细胞生长因子，1ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加1ng/mL干细胞生长因子，1ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加1ng/mL成纤维细胞生长因子，1ng/mL前列腺素E2，1ng/mL肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞，加入加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加1ng/mL成纤维细胞生长因子，1ng/mL前列腺素E2，1ng/mL肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得间充质干细胞。
实施例3
清洗脐带组织，75%酒精浸泡5-10分钟后采用PBS漂洗3-5次，将脐带剪成约3cm的条状，剪开脐静脉和动脉，剥离脐带华通氏胶，剪成约1cm3组织块，分为诱导组和未处理组，诱导组加入培养液培养，培养液中添加30ng/mL干细胞生长因子，30ng/mL肝素钠，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养，培养至第五天，显微镜下观察有细胞爬出后，进行半量换液，此后每3天换液，细胞增殖至融合度80%时进行细胞的消化及传代。
传代的P0间充质干细胞消化离心后获得P1代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液，培养液中添加30ng/mL干细胞生长因子，30ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P2代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加30ng/mL干细胞生长因子，30ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P3代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加30ng/mL干细胞生长因子，30ng/mL成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P4代间充质干细胞，加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加30ng/mL成纤维细胞生长因子，30ng/mL前列腺素E2，30ng/mL肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得P5代间充质干细胞，加入加入含有10%胎牛血清的aMEM培养液中培养，培养液中添加30ng/mL成纤维细胞生长因子，30ng/mL前列腺素E2，30ng/mL肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
培养3天后待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，离心后获得间充质干细胞。
实施例4
本实施例提供一种Treg细胞活性的间充质干细胞，所述提高Treg细胞活性的间充质干细胞由上述实施例1的培养方法培养而成。
实施例5
本实施例提供一种Treg细胞活性的间充质干细胞制剂，所述提高Treg细胞活性的间充质干细胞制剂包含上述实施例2的提高Treg细胞活性的间充质干细胞。
在一些实施例中，所述提高Treg细胞活性的间充质干细胞制剂还包含药学上可接受的辅料、载体或添加剂中的至少一种。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子、抗凝剂和不饱和脂肪酸。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述基础培养液为含有10%胎牛血清的aMEM培养液。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述生长因子选自干细胞生长因子或成纤维细胞生长因子中的至少一种。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述抗凝剂选自肝素钠；所述不饱和脂肪酸选自前列腺素E2。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在基础培养液中添加生长因子、抗凝剂和不饱和脂肪酸的方式如下：
（1）在P0代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加干细胞生长因子及肝素钠；
（2）在P1-P3代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加干细胞生长因子及成纤维细胞生长因子；
（3）在P4，P5 代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加成纤维细胞生长因子、抗凝剂和不饱和脂肪酸。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中干细胞生长因子和肝素钠的浓度均为1ng/mL-30ng/mL。
7.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中干细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的浓度均为1ng/mL-30ng/mL。
8.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中成纤维细胞生长因子、前列腺E2和肝素钠的浓度均为1ng/mL-30ng/mL。
9.一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞，其特征在于，所述提高Treg细胞活性的间充质干细胞由权利要求1-8任一所述的培养方法培养而成。
10.一种提高Treg细胞活性的间充质干细胞制剂，其特征在于，包含权利要求9所述的提高Treg细胞活性的间充质干细胞。
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