CN113444817A

CN113444817A - 一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法

Info

Publication number: CN113444817A
Application number: CN202110515789.4A
Authority: CN
Inventors: 王东澍; 王恒樑; 刘先凯; 吕宇飞; 陈刚; 冯尔玲
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-09-28

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法。本发明采用恒温扩增技术，结合CRISPR‑Cas12a蛋白高灵敏度的反式剪切特性，再通过可视化检测，建立了一种可以对炭疽芽孢杆菌快速检测的方法。与之前炭疽杆菌的检测方法相比，本发明具有特异性高，检测时间短，无需电力装置等优点，尤其适用于基层及现场检测。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法。

背景技术

蜡样芽胞杆菌群(包括炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌等)菌种之间的基因组同源性较高，差别很小，给炭疽芽胞杆菌的鉴定工作带来很大的困难。炭疽芽胞杆菌的快速检测对于炭疽病的防治以及应对炭疽芽胞生物恐怖袭击等方面都非常重要。目前炭疽芽胞杆菌的核酸检测均需要在实验室内完成，而炭疽病的高发地区通常在卫生经济条件较差的牧区，依赖于荧光定量PCR、测序仪等高精度仪器的检测方法在这些地区推广的成本较高，人员培训难度大。

CRISPR系统最初发现于生物抵抗外来核酸的防御机制，后来被用到生物细胞的基因编辑中。2017年，张锋等应用靶向RNA的CRISPR相关酶(Cas13a)建立了一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断方法(CRISPR-based diagnostic，CRISPR-Dx)(Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Lee JW,et al.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science(New York,NY)2017；356:438-42.)。最近，研究人员发现了CRISPR-Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，展现了巨大的开发空间。

炭疽病发病后，多数采用β内酰胺类和喹诺酮类抗生素(如青霉素和环丙沙星)治疗且预后良好。但是近年来，随着抗生素的应用不当，耐药菌株的数量有不断上升的趋势。研究表明，炭疽芽胞杆菌基因组中的gyrA基因或parC基因发生碱基突变后，表达的蛋白会产生单个氨基酸的变化，这种变化会导致耐环丙沙星菌株的出现。

发明内容

本发明的第一个目的是灵敏、特异且准确的检测炭疽芽胞杆菌。

本发明首先保护检测待测菌是否为炭疽芽胞杆菌的方法，具体可为方法C、方法A或方法B。

所述方法A可包括如下步骤：

(a1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述引物对甲在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点；

所述目标位点为plcR位点、CR5位点、lef位点或capB位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第226位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

(a2)完成步骤(a1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述PCR扩增产物、探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针N12的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；所述探针N12的一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团；

(a3)完成步骤(a2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果不具有荧光，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌。

所述方法B包括如下步骤：

(b1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用引物对乙进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

所述引物对乙在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有所述plcR位点、所述CR5位点、所述lef位点或所述capB位点；

(b2)完成步骤(b1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、所述探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

(b3)完成步骤(b2)后，观察荧光，进行如下判断：

所述方法C包括如下步骤：

(c1)以待测菌的基因组DNA为模板，采用所述引物对乙进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(c2)完成步骤(c1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeFITCbio、crRNA和LbCas12a蛋白；

所述探针ProbeFITCbio的核苷酸序列如SEQ ID NO:37所示；所述探针ProbeFITCbio一端标记FITC，另一端标记BIO；

(c3)完成步骤(c2)后，用HybriDetectDipsticks试纸条检测反应产物，进行如下判断：

如果质控带清晰且检测带清晰，则待测菌为炭疽芽胞杆菌或疑似为炭疽芽胞杆菌；

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌。

上述任一所述的方法中，所述crRNA根据目标位点进行选择的原则为不为炭疽芽胞杆菌的样本检测荧光强度与炭疽杆菌样本检测荧光强度的比值小于0.5的crRNA可用于检测。其中最佳的crRNA为：plcR位点为SEQ ID NO:30；CR5位为SEQ ID NO:31；lef位点为SEQ ID NO:32；capB位点为SEQ ID NO:33；gyrA位点为SEQ ID NO:34；parC位点为SEQ IDNO:35。

上述任一所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法的检测对象可为非人体或动物体的样本。

本发明的第二个目的是检测待测物质是否含有炭疽芽胞杆菌。

本发明还保护检测待测物质是否含有炭疽芽胞杆菌的方法，具体可为方法丙、方法甲或方法乙。

所述方法甲可包括如下步骤：

(a1)以待测物质的基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述目标位点为plcR位点、CR5位点、lef位点或capB位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第226位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

(a3)完成步骤(a2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测物质含有炭疽芽胞杆菌或疑似含有炭疽芽胞杆菌；

如果不具有荧光，则待测物质不含有炭疽芽胞杆菌或疑似不含有炭疽芽胞杆菌。

所述方法乙包括如下步骤：

(b1)以待测物质的基因组DNA为模板，采用引物对乙进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(b3)完成步骤(b2)后，观察荧光，进行如下判断：

所述方法丙包括如下步骤：

(c1)以待测物质的基因组DNA为模板，采用所述引物对乙进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

如果质控带清晰且检测带清晰，则待测物质含有炭疽芽胞杆菌或疑似含有炭疽芽胞杆菌；

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测物质不含有炭疽芽胞杆菌或疑似不含有炭疽芽胞杆菌。

上述任一所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法的检测对象可为非人体或动物体的样本。

上述任一所述方法A或上述任一所述方法甲中，引物对甲可为引物对1，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点。此时crRNA为crRNA1。所述引物对1由引物1和引物2组成。引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

上述任一所述方法A或上述任一所述方法甲中，引物对甲为引物对2，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点。此时crRNA为crRNA2。所述引物对2由引物3和引物4组成。引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。

上述任一所述方法A或上述任一所述方法甲中，引物对甲为引物对3，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点。此时crRNA为crRNA3。所述引物对3由引物5和引物6组成。引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。

上述任一所述方法A或上述任一所述方法甲中，引物对甲为引物对4，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点。此时crRNA为crRNA4。所述引物对4由引物7和引物8组成。引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

所述方法B、所述方法C、所述方法乙或所述方法丙中，引物对乙为引物对5，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点。此时crRNA为crRNA1。所述引物对5由引物9和引物10组成。引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。引物10的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示。crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

所述方法B、所述方法C、所述方法乙或所述方法丙中，引物对乙为引物对6，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点。此时crRNA为crRNA2。所述引物对6由引物11和引物12组成。引物11的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示。引物12的核苷酸序列如SEQ IDNO:41所示。crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。

所述方法B、所述方法C、所述方法乙或所述方法丙中，引物对乙为引物对7，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点。此时crRNA为crRNA3。所述引物对7由引物13和引物14组成。引物13的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示。引物14的核苷酸序列如SEQ IDNO:43所示。crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。

所述方法B、所述方法C、所述方法乙或所述方法丙中，引物对乙为引物对8，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点。此时crRNA为crRNA4。所述引物对8由引物15和引物16组成。引物15的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。引物16的核苷酸序列如SEQ IDNO:45所示。crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

本发明的第三个目的是检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性。

本发明保护检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的方法，可为方法H、方法D或方法F。

所述方法D包括如下步骤：

(d1)以待测炭疽芽胞杆菌的基因组DNA为模板，采用引物对丙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

所述引物对丙在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点且为耐药基因或耐药基因的一部分；

(d2)完成步骤(d1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述PCR扩增产物、探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

(d3)完成步骤(d2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

如果不具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药。

所述方法F包括如下步骤：

(f1)以待测炭疽芽胞杆菌的基因组DNA为模板，采用引物对丁进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

所述引物对丁在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有目标位点且为耐药基因或耐药基因的一部分；

(f2)完成步骤(f1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、所述探针N12、crRNA和LbCas12a蛋白；

(f3)完成步骤(f2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

如果不具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药。

所述方法H包括如下步骤：

(h1)以待测炭疽芽胞杆菌的基因组DNA为模板，采用所述引物对丁进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；

(h2)完成步骤(h1)后，制备LbCas12a反应体系，进行LbCas12a反应，得到反应产物；该LbCas12a反应体系包括所述RPA扩增产物、探针ProbeFITCbio、crRNA和LbCas12a蛋白；

(h3)完成步骤(h2)后，用HybriDetectDipsticks试纸条检测反应产物，进行如下判断：

如果质控带清晰且检测带清晰，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药。

上述任一所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

上述方法的检测对象可为非人体或动物体的样本。

上述任一所述方法D中，引物对丙为引物对11，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有gyrA位点。此时crRNA为crRNA11。gyrA位点如SEQ ID NO:5自5’末端起第254位所示。所述引物对11由引物21和引物22组成。引物21的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。引物22的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。crRNA11的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示。

上述任一所述方法D中，引物对丙为引物对12，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有parC位点。此时crRNA为crRNA12。parC位点如SEQ ID NO:6自5’末端起第219位所示。所述引物对12由引物23和引物24组成。引物23的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。引物24的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。crRNA12的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。

所述方法F或所述方法H中，引物对丁为引物对13，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有gyrA位点。此时crRNA为crRNA11。gyrA位点如SEQ ID NO:5自5’末端起第254位所示。所述引物对13由引物25和引物26组成。引物25的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示。引物26的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示。crRNA11的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示。

所述方法F或所述方法H中，引物对丁为引物对14，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有parC位点。此时crRNA为crRNA12。parC位点如SEQ ID NO:6自5’末端起第219位所示。所述引物对14由引物27和引物28组成。引物27的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示。引物28的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示。crRNA12的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。

上述任一所述耐药可为耐环丙沙星。

所述探针N12中，荧光基团可为HEX发光基团。猝灭基团可为BHQ1猝灭基团。

上述任一所述的方法中，如果样品条带明显强于蜡样芽胞杆菌对照，说明该菌是炭疽芽胞杆菌，如果样品条带同蜡样芽胞杆菌对照一致仅出现极弱的条带痕迹，说明该菌不是炭疽芽胞杆菌。

本发明还保护用于检测炭疽芽胞杆菌的试剂盒，可为N1)-N8)中的任一种。

N1)包括上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对1和上述任一所述crRNA1。

N2)包括上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对2和上述任一所述crRNA2。

N3)包括上述任一所述探针N12、上述任一所述所述引物对3和上述任一所述crRNA3。

N4)包括上述任一所述探针N12、上述任一所述所述引物对4和上述任一所述crRNA4。

N5)包括上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对5和上述任一所述crRNA1。

N6)包括上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对6和上述任一所述crRNA2。

N7)包括上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对7和上述任一所述crRNA3。

N8)包括上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对8和上述任一所述crRNA4。

上述任一所述试剂盒用于非疾病的诊断与治疗。

上述试剂盒的检测对象可为非人体或动物体的样本。

所述N1)具体可由上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对1和上述任一所述crRNA1组成。

所述N2)具体可由上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对2和上述任一所述crRNA2组成。

所述N3)具体可由上述任一所述探针N12、上述任一所述所述引物对3和上述任一所述crRNA3组成。

所述N4)具体可由上述任一所述探针N12、上述任一所述所述引物对4和上述任一所述crRNA4组成。

所述N5)具体可由上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对5和上述任一所述crRNA1组成。

所述N6)具体可由上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对6和上述任一所述crRNA2组成。

所述N7)具体可由上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对7和上述任一所述crRNA3组成。

所述N8)具体可由上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对8和上述任一所述crRNA4组成。

本发明还保护用于检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的试剂盒，可为X1)-X4)中的任一种。

X1)包括上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对11和上述任一所述crRNA11。

X2)包括上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对12和上述任一所述crRNA12。

X3)包括上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对13和上述任一所述crRNA11。

X4)包括上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对14和上述任一所述crRNA12。

上述任一所述试剂盒用于非疾病的诊断与治疗。

上述试剂盒的检测对象可为非人体或动物体的样本。

所述X1)具体可由上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对11和上述任一所述crRNA11组成。

所述X2)具体可由上述任一所述探针N12、上述任一所述引物对12和上述任一所述crRNA12组成。

所述X3)具体可由上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对13和上述任一所述crRNA11组成。

所述X4)具体可由上述任一所述探针ProbeFITCbio、上述任一所述引物对14和上述任一所述crRNA12组成。

上述任一所述进行PCR扩增的体系为50μl，包括25μl ExTaq(TaKaRaExTaq^TMVersion 2.0试剂盒中的组件)、2μl浓度为10μM的上游引物水溶液、2μl浓度为10μM的下游引物水溶液、模板和水。

进行PCR扩增的条件为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。

PCR扩增后LbCas12a反应体系具体可为20μl，由2μl PCR扩增产物、2μl探针N12、1μl crRNA(10μM)、1μl LbCas12a蛋白溶液(浓度为0.15mg/mL)、2μl NEBuffer^TM 3(NEB公司)和12μlNuclease-free water组成。进行LbCas12a反应的条件具体可为37℃反应120min。

所述进行RPA扩增的RPA扩增体系具体可为50μl，包括2.4μl浓度为10μM的上游引物水溶液、2.4μl浓度为10μM的下游引物水溶液、2.3μldNTPs(10mM each)、25μl2×Reaction Buffer、5μl10×Probe E-mix、2.5μl20×Core Reaction Mix、2.5μl280mMMgOAc、2μl模板和水。

进行RPA扩增的程序具体可为：37℃反应40min。

所述LbCas12a反应体系具体可为20μl，由2μlRPA扩增产物、2μl探针(浓度为10μM)、1μl crRNA(10μM)、1μl LbCas12a蛋白溶液(浓度为0.15mg/mL)、2μl NEBuffer^TM 3(NEB公司)和12μlNuclease-free water组成。

进行LbCas12a反应的条件具体可为37℃反应60min。

探针N12的末端经HEX发光基团和BHQ1猝灭基团修饰，HEX荧光检测条件是激发波长是535nm，检测波长是553nm。

上述任一所述荧光为去除背景荧光强度的荧光。用无菌水的RPA产物加入Cas12a反应系统，得出的结果即为背景荧光强度。

上述任一所述用HybriDetectDipsticks试纸条检测反应产物具体可为：将Cas12a反应产物滴加到HybriDetectDipsticks试纸条上，室温反应5min；将试纸条放到HybriDetectAssay Buffer中，2min后将试纸条取出立即观察。

广泛存在于蜡样芽胞杆菌染色体中的plcR基因，在炭疽芽孢杆菌中发生了无义突变，成为区分炭疽芽胞杆菌和其他蜡样芽胞杆菌群成员的重要标志。本发明对比了炭疽芽胞杆菌(Ba)、蜡样芽胞杆菌(Bc)和苏云金芽胞杆菌(Bt)总共1992个菌株的基因组序列，发现了plcR基因和CRISPR5基因上两个单核苷酸多态性(SNP)位点，并对这两个SNP位点进行检测。为了增加检测方法的特异性，本研究同时选用炭疽杆菌两个大质粒上lef(pXO1)和capB(pXO2)基因作为检测靶点。另外，利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)技术对检测位点进行扩增，既缩短了反应时间，又实现了在和体温类似的条件下完成检测。为了指导临床病例中抗生素的合理使用，将CRISPR-Cas12a检测系统应用到临床标本的耐药性检测。选取与环丙沙星耐药性有关的gyrA基因和parC基因作为检测位点，实现了临床标本的耐药性可视化检测。

本发明采用CRISPR-Cas12a系统、PCR(或重组酶聚合酶扩增技术或横向流动试纸条法)，实现了炭疽芽胞杆菌的检测，同时实现了对炭疽芽胞杆菌耐药基因检测。该方法与其他方法相比，优点和创新点如下：

(1)重组酶聚合酶扩增的整个反应过程在37℃下完成，不需要任何电力设备，可以适用于室外操作，尤其是在偏远牧区发生炭疽区域性流行时，完成对炭疽芽胞杆菌的鉴定工作；

(2)总反应时间控制在2h以内，达到快速检测的要求；

(3)检测炭疽芽胞杆菌具有较高的特异性和灵敏度；

(4)通过横向流动试纸条法(FLD)，实现了肉眼的可视化检测，方便快捷，准确可靠；

(5)采用可视化的方法对炭疽芽胞杆菌的环丙沙星耐药菌株检测，能更加方便快捷的指导临床治疗工作。

本方法简单便携，非常适合现场及临床标本的快速检测。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为炭疽芽胞杆菌检测原理。

图2为检测位点筛选。

图3为plcR、lef、capB和CR5检测位点的筛选结果。

图4为基于CRISPR系统结合PCR方法区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌。

图5为基于CRISPR系统结合RPA方法区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌。

图6基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合横向流动试纸条(LFD)方法的检测原理。

图7为基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合横向流动试纸条(LFD)方法区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌。

图8为基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合横向流动试纸条(LFD)方法检测炭疽芽胞杆菌的特异性。

图9为基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合横向流动试纸条(LFD)方法检测炭疽芽胞杆菌的灵敏度。

图10为gyrA和parC检测位点筛选结果。

图11为耐药基因gyrA和parC检测结果。

图12为基于CRISPR系统结合RPA方法和横向流动试纸条法区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

CRISPR-LbCas12a蛋白表达质粒pET28TEV-LbCpf1(环形)的核苷酸序列如SEQ IDNO:17所示。

实施例1、基于CRISPR-Cas12a系统利用普通PCR扩增技术结合荧光检测方法对炭疽芽胞杆菌plcR、lef、capB和CRISPR5(CR5)检测条件的筛选

一、实验设计

1、检测基因的选择及使用的菌株

通过比对NCBI上1992个炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌菌株的基因组数据(包括完全测序和不同水平组装的基因序列)，发现plcR和CRISPR5(简称CR5)两个可以用来区分的SNP位点：plcR基因第640个碱基，炭疽芽胞杆菌是T，而蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌是G；CRISPR5基因第771个碱基炭疽芽胞杆菌是C，蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌是A。选取炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis str.Ames；NCBIAccession:NC_003997)染色体上的两个位点plcR和CR5进行检测。

为了提高检测的特异性，同时选取毒力质粒pXO1上的lef位点(NCBIAccession:NC_007322(147062-149491))和毒力质粒pXO2上的capB(NCBIAccession：NC_007322(55599-56993))位点进行检测。

全基因合成包含plcR基因SNP的质粒plcR(T)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的plcR基因NC_003997.1(5081085-5081942)全基因合成后插入到pUC19载体上)和质粒plcR(G)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的plcR基因NC_003997.1(5081085-5081942)第640位碱基由T突变为G(T640G)，全基因合成后插入克隆到pUC19载体上)，用来筛选plcR检测条件。全基因合成包含CR5基因SNP的质粒CR5(G)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的BA_5524基因NC_003997.1(5014709-5015614)，全基因合成后插入克隆到pUC19载体上)和CR5(T)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的BA_5524基因NC_003997.1(5014709-5015614)第771位碱基由G突变为T(G771T)，全基因合成后插入克隆到pUC19载体上)，用来筛选CR5检测条件。

炭疽芽胞杆菌A16(记载于如下文献中：Wang H，Liu X，Feng E，et al.Curing thePlasmid pXO2 from Bacillus anthracis A16 Using Plasmid Incompatibility[J].Current Microbiology，2011，62(3):703-709.)和蜡样芽胞杆菌BC307(中国医学细菌保藏管理中心的产品，编号为CMCC(B)63317；NCBI Accession:GCA_009799965.1)用来筛选lef和capB检测条件。

检测原理见图1。

2、检测位点筛选

plcR和CR5位点：针对SNP位点检测中，因为crRNA与靶基因结合的前六个碱基是“种子区域”，这六个碱基中任何一个碱基的变化都会大大降低CRISPR-Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，本实施例采用穷举法针对靶位点的正反链，根据PAM序列与SNP的相对位置，分别设计了12对PCR引物及对应的12条crRNA，全基因合成包含SNP位点的质粒用做筛选底物。

lef和capB位点：在检测lef和capB位点时，由于它们都位于炭疽芽胞杆菌的毒力质粒上，而炭疽芽胞杆菌的近源菌株(如蜡样芽胞杆菌或苏云金芽胞杆菌)中不存在这两个基因，所以在炭疽芽胞杆菌中可以检测到，而在蜡样芽胞杆菌中无法检出。理论上，这两个基因中PAM序列(TTTN)后17个碱基都可以作为靶位点来检测，本研究从基因中挑取5个位点进行筛选，分别设计了5对PCR引物及对应的5条crRNA，炭疽芽胞杆菌(A16)和蜡样芽胞杆菌(BC307)基因组筛选底物。

检测位点筛选原理见图2(a为SNP位点筛选靶基因，b为SNP位点筛选互补链，c为非SNP位点筛选靶基因)。

3、引物设计

plcR和CR5位点：针对特定核苷酸位点检测需在检测位点前引入PAM(TTTN)序列(Chen JS，Ma E，Harrington LB，et al.CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity.Science(New York，NY)2018；360:436-9.)，根据SNP位点周边序列，设计了12对引物，分别将PAM序列加入引物，引物设计中序列变化见表1，plcR位点的筛选引物见表2，CR5位点的筛选引物见表3。

lef和capB位点：挑选了5个筛选位点，其中，用于lef的靶标核苷酸序列依次如SEQID NO:7－11所示，用于capB的靶标核苷酸序列如SEQ ID NO:12－16所示，各设计5对PCR引物。lef位点的筛选引物见表4，capB位点的筛选引物见表5。

表1.plcR和CR5位点PCR扩增引物中序列变化

表2

注：粗体为PAM序列，下划线为crRNA通用序列。

表3

注：粗体为PAM序列，下划线为crRNA通用序列。

表4

注：下划线为crRNA通用序列。

表5

注：下划线为crRNA通用序列。

4、crRNA设计

plcR和CR5位点：设计检测plcR、CR5位点对应的crRNA，上游选取19nt通用序列(AAUUUCUACUGUUGUAGAU；Zetsche B，Gootenberg JS，Abudayyeh OO，et al.Cpf1 is asingle RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell 2015；163:759-71.)，下游序列截取PAM序列后17nt，组成crRNA。根据PAM序列与SNP位点的相对位置，分别设计了12条crRNA。plcR位点的crRNA见表2，CR5位点的crRNA见表3。

lef和capB位点：根据lef基因和capB基因中的5个筛选位点，分别设计了5条crRNA。lef位点的crRNA见表4，capB位点的crRNA见表5。

5、荧光探针设计

设计经荧光发光基团和猝灭基团修饰的单链DNA探针包含12个碱基，5’端用HEX标记，3’端用BHQ1标记(Li SY，Cheng QX，Wang JM，et al.CRISPR-Cas12a-assisted nucleicacid detection.Cell discovery 2018；4:20.)。探针序列见表6。

表6

引物名称	核苷酸序列(5’-3’)及其在序列表中的位置	说明
			HEX-N12-BHQ1	HEX-GAGACCGACCTG-BHQ1(SEQ ID NO:36)	荧光检测用探针
ProbeFITCbio	FITC-GAGACCGACCTG-BIO(SEQ ID NO:37)	横向流动试纸条用探针

二、实验步骤

1、全基因合成的包含SNP位点质粒(20ng/μl)作为检测plcR和CR5位点的筛选底物，炭疽芽胞杆菌A16基因组(0.5×10⁴aM)和BC307基因组(0.5×10⁴aM)作为lef和capB位点的筛选底物，无菌水作为试剂空白，进行PCR扩增。PCR扩增采用TaKaRaExTaq^TM Version 2.0试剂盒进行。

反应体系为50μl，具体见表7。

表7

组分	加入量(μl)
		水	19
ExTaq	25
		上游引物(10μM)	2
下游引物(10μM)	2
		质粒或基因组	2

反应条件：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。

2、靶标DNA的检测

CRISPR-LbCas12a蛋白表达质粒pET28TEV-LbCpf1为上海吐露港公司的产品，LbCas12a蛋白表达纯化后浓度为0.15mg/ml。crRNA，单链DNA探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成，Nuclease-free water选用上海索莱宝生物科技有限公司DEPC处理水，缓冲液选用New England Biolabs(NEB)公司NEBuffer^TM 3。

将2μl PCR扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应体系。反应总体系为20μl，具体见表8。

表8

	加入量(μl)
		Nuclease-free water	12
NEBuffer<sup>TM</sup> 3	2
		LbCas12a nuclease	1
单链DNA探针	2
		crRNA(10μM)	1
PCR产物	2

37℃反应120min。每隔12min检测荧光探针发出的荧光强度。

当Cas12a蛋白和crRNA，PCR扩增产物结合成三元复合体时，具有反式剪切活性，能够切断末端标记的单链DNA探针，发出荧光。本方法中单链DNA探针末端经HEX发光基团和BHQ1猝灭基团修饰，HEX荧光检测条件是激发波长是535nm，检测波长是553nm。

3、实验结果

计算不同时间plcR(T)荧光强度与plcR(G)荧光强度的倍数，从中挑取倍数最大检测点作为筛选检测点(共12个筛选点)，得出相对plcR(T)的质粒荧光强度均数的百分比作图(见图3)。

从12个筛选点中挑出差异最明显的，作为plcR位点的检测条件。当检测plcR靶基因互补链，SNP位点位于PAM序列后第六位碱基时，即crRNA-RT6的检测结果差异最明显，crRNA-RT6及对应的PCR扩增引物更适合检测plcR位点。核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

对CR5位点筛选，当检测靶基因互补链，SNP位点位于PAM序列后第三位碱基时，即crRNA-RG3的检测结果差异最明显，crRNA-RG3和对应的PCR引物更适合检测CR5位点。核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

对lef位点筛选，当检测靶基因是lef1时，即crRNA1的检测结果差异最明显，引导crRNA1及对应的PCR引物更适合检测lef位点。核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

对capB位点筛选，当检测靶基因是capB3时，即crRNA3的检测结果差异最明显，引导crRNA3及PCR扩增引物更适合检测capB位点。核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优化后的最佳引物序列见表9。

表9

注：下划线为PAM序列。

最佳crRNA序列见表10。

表10

注：下划线为通用序列。

实施例2、基于CRISPR-Cas12a系统、普通PCR扩增技术结合荧光检测方法检测炭疽芽胞杆菌

1、分别提取炭疽芽胞杆菌A16和蜡样芽胞杆菌BC307的基因组DNA。

2、以炭疽芽胞杆菌A16基因组(0.5×10⁴aM)作为plcR、lef、capB和CR5位点的检测底物，BC307基因组(0.5×10⁴aM)作为对照，无菌水作为试剂空白，采用筛选引物进行PCR扩增，扩增引物序列见表9。

将2μl PCR扩增产物加入到LbCas12a系统反应，检测60min时HEX的荧光强度。具体检测方法参考实施例1，crRNA序列见表10。

3、用荧光检测仪器分别测定炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌在检测plcR、lef、capB和CR5位点时的荧光强度。另外，用无菌水的PCR扩增产物加入LbCas12a反应系统，得出的结果作为背景荧光强度。然后经过去除背景荧光强度的检测结果用GraphPadPrism7.0分析作图。

检测结果见图4。

结果表明，针对plcR、lef、capB和CR5位点的检测中，炭疽芽胞杆菌的荧光强度均明显高于蜡样芽胞杆菌。因为设计的crRNA能与炭疽芽胞杆菌的PCR扩增产物完全匹配，能够形成完整Cas12a/crRNA/dsDNA三元复合体完成对单链DNA探针的反式剪切，产生强荧光。而该crRNA不能与蜡样芽胞杆菌PCR扩增产物完全匹配，不能形成完整的三元复合体，所以不能切割单链DNA探针或切割效率降低，产生的荧光明显弱于炭疽芽胞杆菌。

上述结果表明，当传统微生物学方法无法判断未知菌是炭疽芽胞杆菌还是蜡样芽胞杆菌等近源菌时，通过对plcR、lef、capB和CR5位点的检测，蜡样芽胞杆菌为对照，如果各位点荧光强度明显高于对照组，即可判断未知菌是炭疽芽胞杆菌。

实施例3、基于CRISPR-Cas12a系统、RPA扩增技术结合荧光检测方法检测炭疽芽胞杆菌

1、实验设计

为了实现缩短检测时间并实现无电化检测，用RPA替代传统PCR方法扩增检测位点。RPA引物设计原则依据

DNA Amplification KitsAssay Design Manual。

设计炭疽芽胞杆菌plcR、lef、capB和CR5位点的RPA扩增引物见表11。

表11

注：下划线为PAM序列。

设计plcR和CR5位点RPA扩增引物时，需要将PAM序列引入到引物中。为了提高扩增速度和反应的灵敏度，缩短扩增产物长度在90bp-150bp之间，引物GC含量在20％-60％之间，引物长度为32bp-38bp，并且引物之间无明显的互补序列和回文序列。

2、实验步骤

(1)靶标DNA的RPA扩增

分别提取炭疽芽胞杆菌A16和蜡样芽胞杆菌BC307的基因组DNA。

炭疽芽胞杆菌A16基因组(0.5×10⁴aM)作为plcR、lef、capB和CR5位点的检测底物，BC307基因组(0.5×10⁴aM)作为对照，无菌水作为试剂空白，进行RPA扩增，得到RPA扩增产物。

RPA采用

exo试剂盒和dNTPs(Thermo Scientific^TM dNTP Mix(10mMeach))进行。反应体系为50μl，见表12。

表12

37℃反应40min。

(2)靶标DNA的荧光检测

将2μl RPA扩增产物加入Cas12a反应体系，37℃反应60min，然后检测各位点探针发出的荧光强度，激发波长是535nm，检测波长是553nm。

具体检测方法参考实施例1。

3、实验结果

用荧光检测仪器分别测定炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌在plcR、lef、capB和CR5位点的荧光强度，另外，用无菌水的RPA产物加入Cas12a反应系统，得出的结果作为背景荧光强度。经过去除背景荧光强度的检测结果用GraphPadPrism7.0分析作图。

检测结果见图5。

结果表明，针对plcR、lef、capB和CR5位点的检测中，炭疽芽胞杆菌的荧光强度均明显高于蜡样芽胞杆菌。因为设计的crRNA能与炭疽芽胞杆菌的RPA扩增产物完全匹配，能够形成完整Cas12a/crRNA/dsDNA三元复合体完成对单链DNA探针的反式剪切，产生强荧光。而crRNA不能与蜡样芽胞杆菌RPA扩增产物完全匹配，不能形成完整的三元复合体，所以不能切割单链DNA探针或切割效率降低，产生的荧光明显弱于炭疽芽胞杆菌。

上述结果表明，当传统微生物学方法无法判断未知菌是炭疽芽胞杆菌时，通过对plcR、lef、capB和CR5位点检测，蜡样芽胞杆菌做为对照，如果各位点荧光强度高于对照组，即可判断未知菌是炭疽芽胞杆菌。

实施例4、基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合横向流动试纸条(LFD)方法检测炭疽芽胞杆菌

1、实验设计

为了实现检测结果的可视化，采用横向流动试纸条技术，通过观察测试区是否出现条带来鉴定炭疽芽胞杆菌。检测选用TwistDx^TM Limited公司HybriDetect试剂盒，设计包含12个碱基的单链DNA探针ProbeFITCbio，5’端用FITC标记，3’端用Bio标记(Li SY，ChengQX，Wang JM，et al.CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection.Cell discovery2018；4:20.；TwistDXMileniaHybri试剂盒使用说明)。

横向流动试纸条(LFD)检测原理见图6。

2、实验步骤

(1)靶标DNA的RPA扩增

同实施例3步骤2中(1)。

(2)靶标DNA的LFD法检测

将2μl RPA扩增产物和试纸条法检测用探针ProbeFITCbio加入Cas12a反应体系，37℃反应60min，得到Cas12a反应产物。

检测参数同实施例3步骤2中(2)。

(3)将10μl Cas12a反应产物滴加到HybriDetectDipsticks试纸条上，室温反应5min；将试纸条放到100μl HybriDetectAssay Buffer中，2min后将试纸条取出立即观察。

3、实验结果

检测结果见图7。结果表明，plcR、lef、capB和CR5位点的检测试纸条质控带清晰可见，检测区炭疽芽胞杆菌可见清晰的条带，蜡样芽胞杆菌在检测区仅出现极弱的条带痕迹。对比发现，炭疽芽胞杆菌的样品条带明显强于蜡样芽胞杆菌。

上述结果表明，鉴定炭疽芽胞杆菌时，如果样品条带明显强于蜡样芽胞杆菌对照，说明该菌是炭疽芽胞杆菌，如果样品条带同蜡样芽胞杆菌对照一致仅出现极弱的条带痕迹，说明该菌不是炭疽芽胞杆菌。

实施例5、基于CRISPR-Cas12a系统检测炭疽芽胞杆菌的特异性

待测菌株为炭疽芽胞杆菌A16、蜡样芽孢杆菌Bc307、蜡样芽胞杆菌HN001(王玉莲,田万红,喻钢,等.蜡样芽孢杆菌蔗糖代谢差异分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2015(6):429-430.)、苏云金芽胞杆菌LM1212(Liu G,Deng C,Song L,et al.Draft GenomeSequence of Bacillus thuringiensis Strain LM1212,Isolated from the Cadaver ofan Oryctes gigas Larva in Madagascar[J].Genome Announcements,2014,2(3).)、枯草芽胞杆菌BS168(徐朝阳、张显、徐美娟、杨套伟、饶志明.耐盐性谷氨酰胺酶在Bacillussubtilis 168中的整合表达[J].食品与生物技术学报,2020,v.39；No.243(06):28-35.)、金黄色葡萄球菌ATCC49521(美国模式培养物集存库ATCC49521,王学连.金黄色葡萄球菌表面蛋白表达及菌体检测方法初步建立[D].2013.)或大肠杆菌DH5a。

1、采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的产品，产品目录号为DP302)提取待测菌株的核酸。测定各待测菌株的核酸浓度，并稀释到0.5×10⁴aM。

2、取2μl待测菌株的核酸或无菌水(作为试剂背景值)进行RPA扩增。将2μl RPA扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应体系，37℃反应60min。每隔12min检测荧光探针发出的荧光强度。

检测参数同实施例3步骤2中(2)。

3、经过去除背景荧光强度的检测结果用Graph Pad Prism7.0分析作图。

检测结果见图8。结果表明，炭疽芽胞杆菌A16的荧光强度均远高于其它菌株的荧光强度，即只有检测炭疽芽胞杆菌A16时才会产生强荧光，在检测非炭疽芽胞杆菌时，不会产生荧光。本方法检测炭疽芽胞杆菌具有很高的特异性。

实施例6、基于CRISPR-Cas12a系统检测炭疽芽胞杆菌的灵敏度

炭疽芽胞杆菌减毒株A16Q1(pXO1^-)(Wang D,Gao Z,Wang H,et al.Curing BothVirulent Mega-Plasmids from Bacillus anthracis Wild-Type Strain A16Simultaneously Using Plasmid Incompatibility[J].Journal of Microbiology&Biotechnology,2015,25(10).)用于检测capB(pXO2)位点。炭疽芽胞杆菌减毒株A16PI2(pXO2^-)(Wang H,Liu X,Feng E,et al.Curing the Plasmid pXO2 from Bacillusanthracis A16 Using Plasmid Incompatibility[J].Current Microbiology,2011,62(3):703-709.)用于检测plcR(染色体)、lef(pXO1)和CR5(染色体)位点。

1、将待测菌株(炭疽芽胞杆菌减毒株A16Q1(pXO1^-)或炭疽芽胞杆菌减毒株A16PI2(pXO2^-))的单克隆接种至5ml LB液体培养基，37℃、220rpm培养24h，得到菌液1。

2、将5μl菌液1转移至5ml LB液体培养基，37℃、220rpm培养4h，得到菌液2。

3、取无菌EP管(规格为1.5ml)，加入1ml菌液2，10000rpm离心5min；弃上清，用无菌水洗涤沉淀2次；之后用1ml无菌水重悬，得到菌液3(稀释度为1×10⁰)。

4、向200μl菌液3中加入1800μl无菌水，得到稀释度为1×10^-1的菌液a、稀释度为1×10^-2的菌液b、稀释度为1×10^-3的菌液c、稀释度为1×10^-4的菌液d、稀释度为1×10^-5的菌液e、稀释度为1×10^-6的菌液f和稀释度为1×10^-7的菌液g，依次为第1管—第8管。

5、将500μl菌液(菌液3、菌液a、菌液b、菌液c、菌液d、菌液e、菌液f或菌液g)涂布LB固体培养基，37℃培养24h，选取菌落数为100-200CFU的标本计数，同一稀释倍数下计算菌落均数，然后根据稀释倍数计数出各管的菌液浓度。

6、取200μl菌液(菌液3、菌液a、菌液b、菌液c、菌液d、菌液e、菌液f或菌液g)，置于沸水中10min(用于裂解细菌)，得到裂解菌液；之后取2μl裂解菌液或无菌水(作为空白)进行RPA扩增。将2μl RPA扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应体系，37℃反应60min，检测荧光探针发出的荧光强度。检测参数同实施例3步骤2中(2)。

7、将炭疽芽胞杆菌A16的单克隆接种至5ml LB液体培养基，37℃、220rpm培养24h，得到菌液甲。

8、采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌液甲的基因组核酸，然后用iQuant^TMNGS-BR dsDNA Assay Kit荧光法核酸定量试剂盒测定基因组核酸浓度，倍比稀释后，每管取2μl基因组核酸或无菌水(作为空白)进行RPA扩增。将2μl RPA扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应体系，37℃反应60min，检测荧光探针发出的荧光强度。检测参数同实施例3步骤2中(2)。

各管菌液浓度及基因组核酸浓度见表13。

表13

检测结果见图9和表14。结果表明，对菌液的检测，RPA结合荧光检测中，plcR位点灵敏度为1.3×10⁴CFU/mL(图9中a)，lef位点灵敏度为1.3×10⁴CFU/mL(图9中c)，capB位点灵敏度为4×10⁶CFU/mL(图9中e)，CR5位点灵敏度为1.3×10⁶CFU/mL(图9中g)。而采用RPA结合横向流动试纸条检测中，plcR位点灵敏度为1.3×10⁵CFU/mL(图9中b)，lef位点灵敏度为1.3×10⁵CFU/mL(图9中d)，capB位点灵敏度为4×10⁶CFU/mL(图9中f)，CR5位点灵敏度为1.3×10⁶CFU/mL(图9中h)。对基因组的检测，RPA结合荧光检测中，plcR位点灵敏度为1.5×10^- ¹aM(图9中i)，lef位点灵敏度为1.5×10⁰aM(图9中j)，capB位点灵敏度为1.5×10^-1aM(图9中k)，CR5位点灵敏度为1.5×10⁰aM(图9中l)。

表14

实施例7、基于CRISPR-Cas12a系统利用普通PCR扩增技术结合荧光检测方法对炭疽芽胞杆菌耐药基因(如gyrA基因、parC基因)检测条件筛选

一、实验设计

1、检测基因选择及使用的菌株

已有研究表明，炭疽芽胞杆菌gyrA基因的第254个碱基发生突变(C→T)或者parC基因的242个碱基发生突变(C→T)，会产生对环丙沙星的耐药性(Price，Lance B.；Vogler，Amy；Pearson，Talima；Busch，Joseph D.；Schupp，James M.；Keim，Paul(2003)：In vitroselection and characterization of Bacillus anthracis mutants with high-levelresistance to ciprofloxacin.In Antimicrobial agents and chemotherapy 47(7)，pp.2362–2365.DOI：10.1128/aac.47.7.2362-2365.2003)。因此，本实施例选取炭疽芽胞杆菌gyrA基因和parC基因进行检测。

全基因合成包含gyrA基因SNP的质粒gyrA(C)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的gyrA基因NC_003997.1(6595-9066))全基因合成后插入克隆到pUC19载体上)和gyrA(T)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的gyrA基因NC_003997.1(6595-9066))第254位碱基由C突变为T(C254T)，全基因合成后插入克隆到pUC19载体上)，用于筛选gyrA检测条件。

全基因合成包含parC基因SNP的质粒parC(C)(炭疽芽胞杆菌Ames株基因组上的parC基因NC_003997.1(3362578-3365001))全基因合成后插入到pUC19载体上)和parC(T)(Ames株基因组上的parC基因NC_003997.1(3362578-3365001)第242位碱基由C突变为T(C242T)，全基因合成后插入到pUC19载体上)，用于筛选parC检测条件。

2、检测位点筛选

gyrA和parC基因：针对SNP位点检测中，因为crRNA与靶基因结合的前六个碱基是“种子区域”，这个六个碱基中任何一个碱基的变化都会大大降低CRISPR-Cas12a系统对单链DNA的反式剪切活性，采用穷举法针对靶位点的正反链，根据PAM序列与SNP的相对位置，分别设计了12对PCR引物及对应的12条crRNA，全基因合成包含SNP位点的质粒用做筛选底物。

3、引物设计

针对特定核苷酸位点检测需在检测位点前引入PAM(TTTN)序列，根据SNP位点周边序列，设计了18对引物，分别将PAM序列加入引物中。引物设计中序列变化见表15。gyrA位点的筛选引物见表16，parC位点的筛选引物见表17。

表15.gyrA和parC位点PCR扩增引物设计中序列变化

表16

注：粗体为PAM序列，下划线为crRNA通用序列。

表17

注：下划线为crRNA通用序列。

4、crRNA设计：

设计检测gyrA和parC位点对应的crRNA，上游选取19nt通用序列，下游序列截取PAM序列后17nt，组成crRNA。根据PAM序列与SNP位点的相对位置，分别设计了12条crRNA。gyrA位点的crRNA见表16，parC位点的crRNA见表17。

5、荧光探针设计：

设计经荧光发光基团和猝灭基团修饰的单链DNA探针，包含12个碱基，5’端用HEX标记，3’端用BHQ1标记。

探针序列见表6。

二、实验步骤

1、全基因合成的包含SNP位点质粒(20ng/μl)作为检测gyrA和parC位点的筛选底物，无菌水作为试剂空白，进行PCR扩增。

2、将2μl PCR扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应体系，37℃反应120min。每隔12min检测荧光探针发出的荧光强度。具体检测方法参考实施例1。

三、实验结果

计算不同时间的gyrA(T)荧光强度与gyrA(C)荧光强度的倍数，从中挑取倍数最大检测点作为筛选检测点(共12个筛选点)，得出相对gyrA(T)的质粒荧光强度均数的百分比作图。

检测结果见图10。从12个筛选点中挑出差异最明显的，作为gyrA位点的检测条件。当检测gyrA靶基因互补链，SNP位点位于PAM序列后第二位碱基时，即crRNA-RT2的检测结果差异最明显，crRNA-RT2及对应的PCR扩增引物更适合检测gyrA位点。核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。

对parC位点筛选，当检测靶基因，SNP位点位于PAM序列后第五位碱基时，即crRNA-T5的检测结果差异最明显，crRNA-T5和对应的PCR引物更适合检测CR5位点。核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本实验中筛选出的crRNA及引物将用于后续检测中，优化后的最佳引物序列见表9，最佳crRNA序列见表10。

实施例8、基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合荧光检测方法对炭疽芽胞杆菌耐药基因(gyrA和parC)进行检测

一、实验设计

为了缩短检测时间，临床标本炭疽芽胞杆菌耐药基因的快速检测，本研究用RPA替代传统PCR方法扩增检测位点。RPA引物设计原则同实施例3中1。

设计炭疽芽胞杆菌耐药基因gyrA和parC的RPA扩增引物见表11。

二、实验步骤

取炭疽芽胞杆菌A16基因组(作为阴性标本)、全基因合成的包含SNP位点质粒gyrA(T)、parC(T)(20ng/μl)(作为阳性标本)或无菌水(作为空白)进行RPA扩增。

取2μl RPA产物加入到LbCas12a系统反应，检测60min时HEX的荧光强度。具体检测方法同实施例3中2。

三、实验结果

用荧光检测仪器分别测定合成质粒和基因组在检测gyrA和parC位点时的荧光强度。经过去除背景荧光强度的检测结果用GraphPadPrism7.0分析作图。

检测结果见图11。在检测gyrA基因时，SNP位点为T的荧光强度远高于环丙沙星敏感菌株A16的结果，在检测parC基因时，SNP位点为T的荧光强度远高于环丙沙星敏感菌株A16的结果。根据荧光强度变化，当用抗生素敏感菌株A16做阴性对照时，如果检测结果远高于阴性对照，则该菌株为抗生素耐药菌株。根据荧光强度的差异，就可以判断出炭疽芽胞杆菌的耐药性。

实施例9、基于CRISPR-Cas12a系统利用RPA扩增技术结合横向流动试纸条(LFD)方法对炭疽芽胞杆菌gyrA和parC位点进行检测

一、实验步骤

1、取炭疽芽胞杆菌A16基因组(作为阴性标本)、全基因合成的包含SNP位点质粒gyrA(T)、parC(T)(20ng/μl)(作为阳性标本)或无菌水(作为空白)进行RPA扩增。

2、将2μl RPA扩增产物和试纸条法检测用探针ProbeFITCbio加入Cas12a反应体系，37℃反应60min，得到Cas12a反应产物。

检测参数同实施例3步骤2中(2)。

3、将10μl Cas12a反应产物滴加到HybriDetectDipsticks试纸条上，室温反应5min；将试纸条放到100μl HybriDetectAssay Buffer中，2min后将试纸条取出立即观察。

二、实验结果

检测结果见图12。结果表明，阳性标本检测试纸条质控带清晰可见，检测区可见清晰的条带，而阴性对照在检测区仅出现极弱的条带痕迹。对比发现，当耐药基因检测位点发生突变时，样品条带明显强于抗生素敏感菌株。该实验结果表明，检测炭疽芽胞杆菌耐药基因时，如果样品条带明显强于阴性对照菌株时，说明被检测菌株在检测位点发生突变，已产生耐药性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法

<160> 49

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 488

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（219）…（219）

<223> m为a或c

<400> 1

ttatttcttc attcttttta taattgattc ttttaatgta tggtttccta atatatcgaa 60

aaagaagtaa gctttttcgt aagcatcttc aatttctgct ctatcacact ctagcttttc 120

taggcattca acttttcgat agtataactg tccaatcaat gtcatactat taatttgaca 180

cgatagttca atagctttat ttgcatgaca aagcgcttmt tcgtattgat tgtccaagta 240

taatgctttt gcatgattat gtctcacctt cacatcaaac tctttattat catgtaatac 300

ttctaattgc tttaatatat tttcatataa ctcaatactc ttcttaaaat ggccattttc 360

agcgtaaatg tttgcaattg cgttttcaat atacaggttc tgatatacat ctattcctgc 420

caattgttga ttgagcaatt tctttaattc taaaatgcaa tattcgtaat caattttttt 480

caatatgt 488

<210> 2

<211> 470

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（226）…（226）

<223> n为g 或 t

<400> 2

tgttattgca acttttttct cgaaattgag tatttttata taaaaataaa aaaatcagct 60

ctcctagtga gaactgattt tttcactttc ttattcttgt gaagaagaac tattagatga 120

ttctgtagaa ccatttgttg atttttcttc tttcttcggt tcttcttttt tgtcactagt 180

cgaaccgctt gttgatttct cttctttttg agacttatct tctgtnttac tttctggtgt 240

cgtgctcgtt gacttctctt ctttttgaga tttgtcatca gcttttttac cagaggcatt 300

cgttgccttt gcagcacctg catcagcttt aatttctgct actgatttat ttaagtagcg 360

ctcagggttc acagccacgt tgtctttacg tacttcaaag tgaacgtgag aacctgcttc 420

tttattcatt gcacttaaac cggattttcc taatacttca ccttgtacaa 470

<210> 3

<211> 400

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tattcatatt ttcatacaaa taaattttat tgtacaaggt acttccaatg gattgatgta 60

ataaagcatc aatattttga atatcccttt tatactgctt tcttacatca agattaattg 120

acggactatc aattaaccct cctgtatctt gcaacctttg attaatatca tatggttgaa 180

tatcaagttt cagctttttt aaaaactctt tttctttttc agataaagga ttactactat 240

ccacctgtat tctatttaaa agctcttttt cttcttcaga taaagaatca cgaatatcaa 300

tttgtagctt ttttaaaaac tctttttcct cagtagataa aaaatcacta ctatcaattt 360

gtattctttt tagaagctct ttttcttctt gagataaaga 400

<210> 4

<211> 400

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ttggagctag attactatat ccaaaatcat ccacacgttc ccaaatacgt aatgttgatg 60

agggatcatt cgctgcaaaa ccatttacga agaacgcagg cttagattgg tcagcaaaac 120

gtgtaattct cattgctcct ggatccggat gagcattcaa cataccacgg aatgctgttt 180

cctcatcaat cccaagagcc tctgctaccg ctaaagcaag cgatgcatta tctgggaaga 240

ccatgtaatc aaattttcgt aagaattctt ctgaaattct agaattatcc gcaacaatca 300

cttttgtatt tctctcttct gcaacctctt taaagtaatc caagtattca ctttcaatag 360

tgactaaatg tccattatat ggaatggtag cagtgaaagc 400

<210> 5

<211> 490

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（254）…（254）

<223> k为c 或 t

<400> 5

atgtcagaca atcaacaaca agcacgaatt cgagaaatta atattagcca tgaaatgcgt 60

acctcatttt tagattacgc aatgagtgtt atcgtatctc gtgcattacc agatgttcgt 120

gatggattaa aacctgtgca tcgtagggtt ttatatgcga tgaatgattt aggaattacg 180

gctgataaag cgtataaaaa atcagcacgt attgttggtg aagtaatcgg taagtatcac 240

cctcatggtg attkagctgt ttatgaaacg atggtacgta tggcgcaaga tttcagtcaa 300

cgttatatgc ttgttgatgg gcatggtaac tttggatctg tcgatggaga ttcagcggca 360

gcaatgcgtt atacagaagc aagaatgtct aaaatctcta tggaattaat acgtgatatt 420

tcaaaaaata caattgatta tcaagataac tatgatggtt ctgaaagaga gccgattgtg 480

ttaccagcgc 490

<210> 6

<211> 490

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<222>（219）…（219）

<223> k为c 或 t

<400> 6

cctcccgctt gaagacgtgt taggtgaccg ctttgcacgt tatagtaaat atattattca 60

agatcgcgca cttccagatg cgcgtgacgg cttaaaacca gtacaaagac gtattttata 120

ttctatgtat gtagaaggaa acgtacatga taaagcgttc cgtaagtcgg ctaaaacagt 180

cggtaacgtt attggtaact atcacccgca cggtgattkc tctgtatatg aagcgatggt 240

acgtttaagt caaacttgga aagtacgtaa tgttttagtt gagatgcatg gtaataatgg 300

tagtgttgac ggggatccgg cagcagcaat gcgttatacg gaagcccgat tatcaccaat 360

tgcatctgag ttattacgtg atcttgataa agaaacagta gaattcgtat ctaattttga 420

tgatacgagt gaagaaccgg ttgttttacc agcagcgttc ccgaacttat tagtgaacgg 480

atctacagga 490

<210> 7

<211> 122

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gcatcaatat tttgaatatc ccttttatac tgctttctta catcaagatt aattgacgga 60

ctatcaatta accctcctgt atcttgcaac ctttgattaa tatcatatgg ttgaatatca 120

ag 122

<210> 8

<211> 152

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cgatgctgtg gctcgatata atatgcaaaa gctttcgcaa atacttcttg tacctcattg 60

ctattttgtt ccaagaattc tacagaaaag tctgtgggat gttccttaag ctgattagta 120

aataaaagat cttgtccatc tgaatcagat gc 152

<210> 9

<211> 184

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ctcgagtatc tggtgataat tggattctcc atttcaaacg ctcattatct aatgcaggcc 60

tttcatttat atcaacaatc atatagttac tagaaatact atatttgaaa ttttttttga 120

attcattgaa aatacctcta ttaattttag tattatcagt ggaatcaact aaatccgcac 180

ctag 184

<210> 10

<211> 117

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

agtggaatca actaaatccg cacctagggt tgctgtaagg ttattgatat tcatattttc 60

atacaaataa attttattgt acaaggtact tccaatggat tgatgtaata aagcatc 117

<210> 11

<211> 145

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

atcggtaaaa acaaatcttc cattaccatc aactaagtaa tttgttacct tttttataag 60

atcactttga atattatttt tccattcatt caatattaaa taagcacttt ctacaatatt 120

ggatgcatat ctattatgca cgttg 145

<210> 12

<211> 128

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

atgtttactc gaattgggat agaattgagc cttttctgat ggcaacgttg ttcccatata 60

ccataaataa tcaaaaacac tgtacatata cctattatga agatcatctg tattaatccc 120

ttcctgct 128

<210> 13

<211> 146

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

agttccaata ctcttgcgtt ggaatatctc ctttttcaaa agcacttgta ataggtgcag 60

tcgtttctcc aatcgcaata actatttccg ctttaatata tggcaaaaca tccctagcaa 120

actgctcagt acgatcaacg cggtca 146

<210> 14

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

gcattcaaca taccacggaa tgctgtttcc tcatcaatcc caagagcctc tgctaccgct 60

aaagcaagcg atgcattatc tgggaagacc atg 93

<210> 15

<211> 111

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

ccaatatatc attcgcgcag atgtaccagt tgttttccct acagtcttat atttcgcttc 60

ttgtacaaca cctgtaatta gtcttgtaac ggtagattta cctcgaattc c 111

<210> 16

<211> 192

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

ctgatggcaa cgttgttccc atataccata aataatcaaa aacactgtac atatacctat 60

tatgaagatc atctgtatta atcccttcct gcttttcgat ttcttgctta ttaagatatt 120

tcgacttaag tagagtcgtt gataccaatt aaaaattagg tggttccctg catatacaac 180

accgaattca tc 192

<210> 17

<211> 9097

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgtcctcgt actaccatca ccatcaccat 5100

cacgattacg atatcccaac gaccgaaaac ctgtattttc agggcgccat ggatccggaa 5160

ttcatgctga agaacgtggg catcgacaga ctggatgtgg agaagggcag aaagaacatg 5220

agcaagctgg agaagttcac caactgctac agcctgagca agaccctgag attcaaggcc 5280

atccccgtgg gaaaaaccca ggagaacatc gacaacaaga gactgctggt ggaggacgaa 5340

aagagagccg aggactacaa gggcgtgaag aagctgctgg acagatacta cctgagcttc 5400

atcaacgacg tgctgcacag catcaagctg aagaacctga acaactacat cagcctgttc 5460

agaaagaaga ccagaaccga gaaggagaac aaggagctgg agaacctgga gatcaacctg 5520

agaaaggaga tcgccaaggc cttcaaggga aacgagggct acaagagcct gttcaagaag 5580

gacatcatcg agaccatcct gcccgagttc ctggatgaca aggacgagat cgccctggtg 5640

aacagcttca acggcttcac caccgctttc accggcttct tcgacaacag agagaacatg 5700

ttcagcgagg aggccaagtc tacaagcatc gccttcagat gcatcaacga gaacctgacc 5760

agatacatca gcaacatgga catcttcgag aaggtggacg ccatcttcga caagcacgag 5820

gtgcaggaga tcaaggagaa gatcctgaac agcgactacg acgtggagga cttcttcgag 5880

ggcgagttct tcaacttcgt gctgacccag gaaggcatcg acgtgtacaa cgccatcatc 5940

ggcggatttg tgacagagag cggcgagaaa atcaagggcc tgaacgagta catcaacctg 6000

tacaaccaga agaccaagca gaagctgccc aagttcaagc ccctgtacaa gcaggtgctg 6060

agcgacagag agagcctgag cttctatggc gagggctaca ccagcgatga agaggtgctg 6120

gaggtgttca gaaacaccct gaacaagaac agcgagatct tcagcagcat caagaagctg 6180

gagaagctgt tcaagaactt cgacgagtac agcagcgccg gcatctttgt gaaaaacggc 6240

cccgctatca gcacaatcag caaggacatc ttcggcgagt ggaacgtgat cagagacaag 6300

tggaacgccg agtacgacga catccacctg aagaagaagg ccgtggtgac cgagaaatac 6360

gaggacgaca gaagaaagag cttcaagaag atcggcagct tcagcctgga acagctgcaa 6420

gagtacgctg acgctgacct gagcgttgtg gagaagctga aggagatcat catccagaag 6480

gtggacgaga tctacaaggt gtacggcagc agcgagaaac ttttcgacgc cgacttcgtg 6540

cttgagaaga gcctgaagaa gaacgatgcc gtggtggcca tcatgaagga cctgctggac 6600

agcgtgaaga gcttcgagaa ctacatcaag gccttcttcg gcgaaggcaa ggagaccaac 6660

agagacgaga gcttctacgg cgacttcgtg ctggcttacg acatcctgct gaaggtggac 6720

cacatctacg acgccatcag aaactacgtg acccagaagc cctacagcaa ggacaagttc 6780

aagctgtact tccagaaccc ccagtttatg ggcggatggg acaaggataa ggagaccgac 6840

tacagagcca ccatcctgag atacggcagc aagtactacc tggccatcat ggacaagaag 6900

tacgccaagt gcctgcagaa gatcgacaag gacgacgtga acggcaacta cgagaagatc 6960

aactacaagc tgctgcccgg ccctaataaa atgctgccca aggtgttctt cagcaagaag 7020

tggatggcct actacaaccc cagcgaggac atccagaaga tctacaagaa cggcaccttc 7080

aagaagggcg acatgttcaa cctgaacgac tgccacaagc tgatcgactt cttcaaggac 7140

agcatcagca gataccccaa gtggagcaac gcctacgact tcaacttcag cgagaccgag 7200

aagtacaagg acatcgccgg cttctacaga gaagtggagg agcagggata caaggtgagc 7260

ttcgagagcg ccagcaagaa ggaggtggac aagctggtgg aagagggcaa gctgtacatg 7320

ttccagatct acaacaagga cttcagcgac aagtctcacg gaacccccaa tctgcacacc 7380

atgtacttca agctgctgtt cgacgagaac aaccacggcc agatcagact ttctggaggc 7440

gctgaactgt tcatgagaag agccagcctg aagaaggaag agctggtggt gcatcctgcc 7500

aatagcccca tcgctaacaa gaaccccgac aaccccaaga aaaccaccac cctgagctac 7560

gacgtgtaca aggacaagag attcagcgag gaccagtacg agctgcatat ccccatcgcc 7620

atcaacaagt gccccaagaa catcttcaag atcaacaccg aggtgagagt gctgctgaag 7680

cacgacgaca acccctacgt gatcggcatt gacagaggcg agagaaacct gctgtacatc 7740

gtggtggtgg acggcaaggg aaacatcgtg gagcagtaca gcctgaacga gatcatcaac 7800

aacttcaacg gcatcagaat caagaccgac taccacagcc tgctggacaa gaaggagaag 7860

gagagattcg aggccagaca gaactggacc agcatcgaga acatcaagga gctgaaggcc 7920

ggctacatta gccaggtggt gcacaagatc tgcgagctgg tggagaagta cgatgccgtg 7980

atcgctctgg aggatctgaa cagcggcttc aagaacagca gagtgaaggt ggagaagcag 8040

gtgtaccaga agttcgagaa gatgctgatc gacaagctga actacatggt ggacaagaag 8100

agcaacccct gtgctacagg cggagctctg aagggatacc agatcaccaa caagttcgag 8160

agcttcaaga gcatgagcac ccagaacggc ttcatcttct acatccccgc ctggctgaca 8220

tctaagatcg accctagcac cggctttgtg aacctgctga agaccaagta caccagcatc 8280

gccgacagca agaagttcat cagcagcttc gacagaatca tgtacgtgcc cgaggaggac 8340

ctgtttgaat ttgccctgga ctacaagaac ttcagcagaa ccgacgccga ctacatcaag 8400

aagtggaagc tgtacagcta cggcaacaga atcagaatct tcagaaaccc caagaagaac 8460

aacgtgttcg actgggagga ggtgtgtctg acaagcgcct acaaggagct gttcaacaag 8520

tacggcatca actaccagca gggcgacatt agagccctgc tgtgcgaaca gagcgacaag 8580

gccttctaca gcagcttcat ggccctgatg agcctgatgc tgcagatgag aaacagcatc 8640

accggcagaa ccgacgtgga cttccttatc agccccgtga aaaacagcga cggcatcttc 8700

tacgacagca gaaactacga ggcccaggag aatgctatcc tgcccaagaa tgccgatgct 8760

aacggcgctt acaacatcgc cagaaaggtg ctttgggcca tcggccagtt taagaaggcc 8820

gaggacgaga agctggacaa ggtgaagatc gccatcagca acaaggagtg gctggagtat 8880

gctcagacca gcgtgaaaca ctgagcggcc gctttcgaat ctagagcctg cagtctcgag 8940

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 9000

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 9060

aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggat 9097

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

agctttattt gcatgacttt gcgctt 26

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

gagtttgatg tgaaggtgag acataatcat gc 32

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

caacgagcac gacaccagat tttaa 25

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

atcagctctc ctagtgagaa ctgatt 26

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

aaagcatcaa tattttgaat atccctttta tactgc 36

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

cttgatattc aaccatatga tattaatcaa aggttgc 37

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

gcattcaaca taccacggaa tgctg 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

catggtcttc ccagataatg catcg 25

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

ccatacgtac catcgtttca taaatttct 29

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

atcgtagggt tttatatgcg atgaatgatt tagg 34

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

ggtaactatc acccgcattt tgatt 25

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

caacactacc attattacca tgcatctcaa c 31

<210> 30

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

aauuucuacu guuguagauc gcuuauucgu auugau 36

<210> 31

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

aauuucuacu guuguagaua acacagaaga uaaguc 36

<210> 32

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

aauuucuacu guuguagauu uacaucaaga uuaauu 36

<210> 33

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

aauuucuacu guuguagauc ucaucaaucc caagag 36

<210> 34

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

aauuucuacu guuguagauu aaaucaccau gagggu 36

<210> 35

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 35

aauuucuacu guuguagaug auuucucugu auauga 36

<210> 36

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 36

gagaccgacc tg 12

<210> 37

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 37

gagaccgacc tg 12

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 38

gttcaatagc tttatttgca tgactttgcg ctt 33

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 39

agagtttgat gtgaaggtga gacataatca tgc 33

<210> 40

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 40

gcatcaatat tttgaatatc ccttttatac tgc 33

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 41

cttgatattc aaccatatga tattaatcaa agg 33

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 42

ccggatgagc attcaacata ccacggaatg ctg 33

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 43

ttgattacat ggtcttccca gataatgcat cgc 33

<210> 44

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 44

gagaagtcaa cgagcacgac accagatttt aa 32

<210> 45

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 45

gtgaagaaga actattagat gattctgtag aac 33

<210> 46

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 46

tgcgccatac gtaccatcgt ttcataaatt tct 33

<210> 47

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 47

aatgatttag gaattacggc tgataaagcg tat 33

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 48

acgttattgg taactatcac ccgcattttg att 33

<210> 49

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 49

ctgccggatc cccgtcaaca ctaccattat tac 33

Claims

1.检测待测菌是否为炭疽芽胞杆菌的方法，为方法C、方法A或方法B；

所述方法C包括如下步骤：

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；

所述方法A包括如下步骤：

所述目标位点为plcR位点、CR5位点、lef位点或capB位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第226位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

(a3)完成步骤(a2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果不具有荧光，则待测菌不为炭疽芽胞杆菌或疑似不为炭疽芽胞杆菌；

所述方法B包括如下步骤：

(b3)完成步骤(b2)后，观察荧光，进行如下判断：

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

2.检测待测物质是否含有炭疽芽胞杆菌的方法，为方法丙、方法甲或方法乙；

所述方法丙包括如下步骤：

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测物质不含有炭疽芽胞杆菌或疑似不含有炭疽芽胞杆菌；

所述方法甲包括如下步骤：

所述目标位点为plcR位点、CR5位点、lef位点或capB位点；

所述plcR位点如SEQ ID NO:1自5’末端起第219位所示；

所述CR5位点如SEQ ID NO:2自5’末端起第226位所示；

所述lef位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第103-119位所示；

所述capB位点如SEQ ID NO:3自5’末端起第182-198位所示；

(a3)完成步骤(a2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果不具有荧光，则待测物质不含有炭疽芽胞杆菌或疑似不含有炭疽芽胞杆菌；

所述方法乙包括如下步骤：

(b3)完成步骤(b2)后，观察荧光，进行如下判断：

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法A或方法甲中，

引物对甲为引物对1，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点；此时crRNA为crRNA1；所述引物对1由引物1和引物2组成；引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

引物对甲为引物对2，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点；此时crRNA为crRNA2；所述引物对2由引物3和引物4组成；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；

引物对甲为引物对3，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点；此时crRNA为crRNA3；所述引物对3由引物5和引物6组成；引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；

引物对甲为引物对4，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点；此时crRNA为crRNA4；所述引物对4由引物7和引物8组成；引物7的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；引物8的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法B、所述方法C、所述方法乙或所述方法丙中，

引物对乙为引物对5，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有plcR位点；此时crRNA为crRNA1；所述引物对5由引物9和引物10组成；引物9的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示；引物10的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示；crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

引物对乙为引物对6，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有CR5位点；此时crRNA为crRNA2；所述引物对6由引物11和引物12组成；引物11的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示；引物12的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示；crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示；

引物对乙为引物对7，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有lef位点；此时crRNA为crRNA3；所述引物对7由引物13和引物14组成；引物13的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示；引物14的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示；crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；

引物对乙为引物对8，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有capB位点；此时crRNA为crRNA4；所述引物对8由引物15和引物16组成；引物15的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示；引物16的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示。

5.检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的方法，为方法H、方法D或方法F；

所述方法H包括如下步骤：

如果质控带清晰且检测带清晰，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

如果质控带清晰且检测带不清晰，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药；

所述方法D包括如下步骤：

(d3)完成步骤(d2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

如果不具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药；

所述方法F包括如下步骤：

(f3)完成步骤(f2)后，观察荧光，进行如下判断：

如果具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌耐药；

如果不具有荧光，则待测炭疽芽胞杆菌不耐药；

所述方法用于非疾病的诊断与治疗。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法D中，

引物对丙为引物对11，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有gyrA位点；此时crRNA为crRNA11；gyrA位点如SEQ ID NO:5自5’末端起第254位所示；所述引物对11由引物21和引物22组成；引物21的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；引物22的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；crRNA11的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示；

引物对丙为引物对12，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有parC位点；此时crRNA为crRNA12；parC位点如SEQ ID NO:6自5’末端起第219位所示；所述引物对12由引物23和引物24组成；引物23的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；引物24的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；crRNA12的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法F或所述方法H中，

引物对丁为引物对13，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有gyrA位点；此时crRNA为crRNA11；gyrA位点如SEQ ID NO:5自5’末端起第254位所示；所述引物对13由引物25和引物26组成；引物25的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；引物26的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示；crRNA11的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示；

引物对丁为引物对14，其在炭疽芽胞杆菌基因组上的靶序列含有parC位点；此时crRNA为crRNA12；parC位点如SEQ ID NO:6自5’末端起第219位所示；所述引物对14由引物27和引物28组成；引物27的核苷酸序列如SEQ ID NO:48所示；引物28的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示；crRNA12的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。

8.如权利要求5至7任一所述的方法，其特征在于：所述耐药为耐环丙沙星。

9.用于检测炭疽芽胞杆菌的试剂盒，为N1)-N8)中的任一种：

N1)包括权利要求1所述探针N12、权利要求3所述引物对1和所述crRNA1；

N2)包括权利要求1所述探针N12、权利要求3所述引物对2和所述crRNA2；

N3)包括权利要求1所述探针N12、权利要求3所述引物对3和所述crRNA3；

N4)包括权利要求1所述探针N12、权利要求3所述引物对4和所述crRNA4；

N5)包括权利要求1所述探针ProbeFITCbio、权利要求4所述引物对5和所述crRNA1；

N6)包括权利要求1所述探针ProbeFITCbio、权利要求4所述引物对6和所述crRNA2；

N7)包括权利要求1所述探针ProbeFITCbio、权利要求4所述引物对7和所述crRNA3；

N8)包括权利要求1所述探针ProbeFITCbio、权利要求4所述引物对8和所述crRNA4；

所述试剂盒用于非疾病的诊断与治疗。

10.用于检测待测炭疽芽胞杆菌耐药性的试剂盒，为X1)-X4)中的任一种：

X1)包括权利要求5所述探针N12、权利要求6所述引物对11和所述crRNA11；

X2)包括权利要求5所述探针N12、权利要求6所述引物对12和所述crRNA12；

X3)包括权利要求5所述探针ProbeFITCbio、权利要求7所述引物对13和所述crRNA11；

X4)包括权利要求5所述探针ProbeFITCbio、权利要求7所述引物对14和所述crRNA12；

所述试剂盒用于非疾病的诊断与治疗。