CN113203812A - 一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，包括以下步骤：S1、样品前处理：将土壤样品于带盖聚丙烯离心管中，用超纯水超声提取，离心取上清液过滤后待测；S2、在最佳的液相色谱仪条件下检测土壤中的丙烯酰胺，获得丙烯酰胺的线性方程、相关系数和检出限：S3、在步骤S2的实验条件下，对加标后的空白样品和粉质粘土样品进行精密度和准确度试验。本发明中，通过本方法测定土壤中丙烯酰胺的检出限为0.02mg/kg，土壤样品加标回收率为77.1％～99.5％，相对标准偏差为3.3％～9.4％，本方法具有快速准确、前处理时间短、检出限低等优点，对环境污染小，可适用于土壤样品中丙烯酰胺的检测。
Description
技术领域
本发明涉及土壤中的丙烯酰胺检测技术领域，尤其涉及一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法。
背景技术
丙烯酰胺是一种水溶性的小分子有机物，用于造纸、木材和纺织行业，其聚合物聚丙烯酰胺作为人工合成土壤改良剂广泛应用于国内外。聚丙烯酰胺本身无毒，但在土壤里会发生降解后产生有毒物质-丙烯酰胺，国际癌症研究中心(IARC)将其列为人类可能2类致癌物(ⅡA)，在人体内代谢转化为具有致癌性的环氧丙酰胺。土壤中的丙烯酰胺会直接或经由地下水通过皮肤、口腔等被人体吸收，从而引起神经中毒，运动失常。
现有技术中食品行业对丙烯酰胺的测定研究较多，环境方面利用LC-MS、HPLC、GC测定水中丙烯酰胺的方法也较多，但对土壤中丙烯酰胺含量的测定研究鲜有报道。虽然目前的研究并不能证明聚丙烯酰胺作为土壤改良剂对环境会产生负影响,但随着日益增加的施用量,以及土壤环境等因素的变化,究其是否产生公害,仍是值得关注和深入研究的问题。因此，缺少一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提到的问题和缺陷，而提出的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，包括以下步骤：
S1、样品前处理：准确称取10.00g土壤样品于50mL带盖聚丙烯离心管中，用20mL超纯水超声提取30min，8000r/min离心3min，取上清液经0.45μm水系针式滤器过滤后待测。
S2、在最佳的液相色谱仪条件下检测土壤中的丙烯酰胺：
色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm，3.5μm)；流动相甲醇：水(体积比为5：95)，流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL。
S3、在不同流动相的比例、改变流速和检测波长下通过控制变量法进行色谱分离实验，以验证最佳液相色谱条件，控制变量法下的液相色谱条件可采用以下三种方法：
第一种：固定其他液相色谱条件不变：流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流动相：甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)；
第二种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流速：0.3-0.6mL/min；
第三种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量：5μL；改变检测波长：190-400nm；
S4、在步骤S2的实验下，获得丙烯酰胺的线性方程、相关系数和检出限：
S41、准确称取纯度为99.9％为丙烯酰胺标准品到50mL容量瓶中，用超纯水溶解、稀释并定容，配制成浓度为1000μg/mL的丙烯酰胺标准溶液；然后取适量丙烯酰胺标准溶液，用超纯水稀释并定容，配制成浓度为100μg/mL丙烯酰胺标准使用液；
S42、分别取100μg/mL的丙烯酰胺标准使用液至空白超纯水中，逐级稀释配制成质量浓度为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL和5.00μg/mL的系列标准工作溶液；
S43、从低浓度到高浓度依次通过液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，以峰面积定量，得到它们的线性方程和相关系数；
S44、丙烯酰胺检出限计算：分别在10g经处理后的石英砂(代替空白土壤样品)加入40μL浓度为10μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，再用20mL超纯水超声提取30min，离心取上清液待测，按照试验方法重复测定7次，计算测定值的标准偏差S，并以3倍标准偏差计算土壤样品的检出限：
其中，检出限的计算公式为：MDL＝t(n-1,0.99)*S，
其中，MDL—方法检出限；
t—自由度为(n-1)，置信度为99％时的t分布为(n＝7，t＝3.143)；
S—n次平行测定的标准偏差；
n—样品的平行测定次数；
S5、在步骤S2的实验条件下，对空白土壤样品进行加标：空白土壤样品加入丙烯酰胺后，按照步骤S2全程序测定6次，测得空白土壤样品加标后的精密度及准确度；
S6、在步骤S2的实验条件下，对经处理后的粉质粘土进行加标：取粉质粘土样品加入丙烯酰胺后，按照步骤S2全程序测定6次，测得粉质粘土样品加标后的精密度及准确度。
作为上述技术方案的进一步描述：
在步骤S3中，控制变量法下的第一种所述流动相比例分别为甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)。
作为上述技术方案的进一步描述：
在步骤S3中，控制变量法下的第二种所述所述流速分别为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min。
作为上述技术方案的进一步描述：
在步骤S3中，控制变量法下的第三种所述检测波长分别为190nm、200nm、210nm。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，通过确定液相色谱仪的条件，建立高效液相色谱法测定土壤中丙烯酰胺的含量，结果表明：本方法测定土壤中丙烯酰胺的检出限为0.02mg/kg，粉质粘土样品的加标回收率为77.1％～99.5％，相对标准偏差为3.3％～9.4％，本方法该法具有快速准确、前处理时间短、检出限低等优点，提取剂和流动相基本上都为超纯水，对环境污染少，准确度和精密度较好，可适用于土壤中丙烯酰胺的检测分析。
2、本发明中，通过控制变量法对丙烯酰胺进行液相色谱法得到的试验结果，验证“流动相甲醇：水(体积比为5：95)，流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL”为检测土壤中丙烯酰胺的最佳液相色谱条件。
附图说明
图1示出了根据本发明实施例提供的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法下的丙烯酰胺的校准曲线示意图；
图2示出了根据本发明实施例提供的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法下的浓度为1.0μg/mL丙烯酰胺的液相色谱示意图；
图3示出了根据本发明实施例提供的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法下的粉质粘土加标2.40μg丙烯酰胺后的液相色谱示意图；
图4示出了根据本发明实施例提供的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法下的丙烯酰胺在190-400nm检测波长下的光谱扫描示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
请参阅图1-3，一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，包括以下步骤：
S1、样品前处理：准确称取10.00g土壤样品于50mL带盖聚丙烯离心管中，用20mL超纯水超声提取30min，8000r/min离心3min，取上清液经0.45μm水系针式滤器过滤后待测。
其中，由于丙烯酰胺是一种强极性、极易溶于水的化合物，故选择超纯水作为提取溶剂，通过超声提取，可以使土壤样品中的丙烯酰胺完全溶解到水中，然后高速离心，取上清液过滤，待测。
S2、在最佳的液相色谱仪条件下检测土壤中的丙烯酰胺：
色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm，3.5μm)；流动相甲醇：水(体积比为5：95)，流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL。
S3、在不同流动相的比例、改变流速和检测波长下通过控制变量法进行色谱分离实验，以验证最佳液相色谱条件，控制变量法下的液相色谱条件可采用以下三种方法：
第一种：固定其他液相色谱条件不变：流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流动相：甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)；
第二种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流速：0.3-0.6mL/min；
第三种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量：5μL；改变检测波长：190-400nm；
S4、在步骤S2的实验下，获得丙烯酰胺的线性方程、相关系数和检出限：
S41、准确称取纯度为99.9％为丙烯酰胺标准品到50mL容量瓶中，用超纯水溶解、稀释并定容，配制成浓度为1000μg/mL的丙烯酰胺标准溶液；然后取适量丙烯酰胺标准溶液，用超纯水稀释并定容，配制成浓度为100μg/mL丙烯酰胺标准使用液；
S42、分别取100μg/mL的丙烯酰胺标准使用液至空白超纯水中，逐级稀释配制成质量浓度为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL和5.00μg/mL的系列标准工作溶液；
请参阅图1，为丙烯酰胺的校准曲线示意图；
S43、从低浓度到高浓度依次通过液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，以峰面积定量，得到它们的线性方程和相关系数；
请参阅图2，为浓度为1.0μg/mL丙烯酰胺的液相色谱示意图；
S44、丙烯酰胺检出限计算：分别在10g经处理后的石英砂(代替空白土壤样品)加入40μL浓度为10μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，再用20mL超纯水超声提取30min，离心取上清液待测，按照试验方法重复测定7次，计算测定值的标准偏差S，并以3倍标准偏差计算土壤样品的检出限：
其中，检出限的计算公式为：MDL＝t(n-1,0.99)*S，
其中，MDL—方法检出限；
t—自由度为(n-1)，置信度为99％时的t分布为(n＝7，t＝3.143)；
S—n次平行测定的标准偏差；
n—样品的平行测定次数；
其中，按照《环境检测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168-2020)确定土壤丙烯酰胺的方法检出限为：0.02mg/kg；
其中，石英砂是用来模拟最干净的土壤环境，代替空白土壤样品；
S5、在步骤S2的实验条件下，对空白土壤样品进行加标：空白土壤样品加入丙烯酰胺后，按照步骤S2全程序测定6次，测得空白土壤样品加标后的精密度及准确度；
其中，空白土壤样品分别加标后按标准方法步骤全程序测定6次，空白土壤加标的测定结果如表1所示：
表1空白土壤加标的精密度和准确度结果
由表1可知，空白土壤样品中丙烯酰胺加标样品测定结果的相对标准偏差分别为4.8％、5.7％，平均加标回收率分别为91.1％、92.5％，空白加标结果符合分析测试质量控制要求。
S6、在步骤S2的实验条件下，对经处理后的粉质粘土进行加标：取粉质粘土样品加入丙烯酰胺后，按照步骤S2全程序测定6次，测得粉质粘土样品加标后的精密度及准确度。
其中，采用经处理后的粉质粘土进行加标试验，按标准方法步骤全程序测定6次，样品加标后的精密度及准确度试验结果如表2所示：
表2粉质粘土加标的精密度和准确度结果
| 样品基质 | 组分 | 本底值/μg | 加标量/μg | 测定值/μg | 平均值/μg | 平均回收率/％ | RSD％ |
| 粉质粘土 | 丙烯酰胺 | 0.00 | 2.40 | 2.03，1.92，2.23，1.92，1.92，2.38 | 2.01 | 86.1 | 9.4 |
| 粉质粘土 | 丙烯酰胺 | 0.00 | 6.00 | 5.92，5.97，5.71，5.41，5.38，5.63 | 5.67 | 94.5 | 4.4 |
| 粉质粘土 | 丙烯酰胺 | 0.00 | 30.0 | 23.6，23.0，23.3，24.2，22.3，22.3 | 23.1 | 77.1 | 3.3 |
由表2可知，土壤样品基质加标后丙烯酰胺测定结果的相对标准偏差分别为9.4％、4.4％、3.3％，平均加标回收率为86.1％、94.5％、77.1％，说明该方法具有良好的精密度及准确度，结果符合分析测试质量控制要求。
请参阅图3，为粉质粘土加标2.40μg后的丙烯酰胺的液相色谱图；
通过确定液相色谱仪的条件，建立高效液相色谱法法测定土壤中丙烯酰胺的含量，结果表明：
本方法测定土壤中丙烯酰胺的检出限为0.02mg/kg，粉质粘土样品的加标回收率为77.1％～99.5％，相对标准偏差为3.3％～9.4％；
本方法该法具有快速准确、前处理时间短、检出限低等优点，提取剂和流动相基本上都为超纯水，对环境污染少，准确度和精密度较好，可适用于土壤中丙烯酰胺的检测分析。
实施例二
通过控制变量法在不同流动相的比例、改变流速和检测波长下进行液相色谱实验，以验证最佳液相色谱条件：
在实施步骤S3时，控制变量法下的液相色谱条件可采用以下三种方法：
第一种：固定其他液相色谱条件不变：流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流动相的比例；
其中，流动相比例分别为甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)；
丙烯酰胺具有较强极性，在反相色谱柱上的保留相对较弱，可使用纯水作为流动相，但为了尽可能保护色谱柱，添加了一定比例的有机相。分别比较了以上几种流动相的比例，根据实验结果可得，在流动相为甲醇：水(5：95)条件下丙烯酰胺和样品中的干扰物能达到较好的分离度；
第二种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流速：0.3-0.6mL/min；
其中，流速分别为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min，结果表明，当流速设置为0.5mL/min时，峰形较好，具有较好的分离度；
第三种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量：5μL；改变检测波长：190-400nm；
其中，检测波长分别为190nm、200nm、210nm；对丙烯酰胺的标准溶液用DAD光谱进行扫描，根据其在190～400nm波长范围内的扫描结果，请参阅图4，丙烯酰胺的强吸收峰在190～200nm处，考虑到水和甲醇的截至波长分别为190nm和210nm，故选择210nm作为丙烯酰胺检测波长。
验证“流动相甲醇：水(体积比为5：95)，流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL”为最佳液相色谱条件。
本技术方案中土壤样品经超声提取、离心、过滤等步骤后，采用高效液相色谱法测定土壤中丙烯酰胺的含量，该方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好的特点，能够快速有效对土壤中丙烯酰胺的残留量进行测定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样品前处理：准确称取10.00g土壤样品于50mL带盖聚丙烯离心管中，用20mL超纯水超声提取30min，8000r/min离心3min，取上清液经0.45μm水系针式滤器过滤后待测。
S2、在最佳的液相色谱仪条件下检测土壤中的丙烯酰胺：
色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm，3.5μm)；流动相甲醇：水(体积比为5：95)，流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL。
S3、通过控制变量法在不同流动相的比例、改变流速和检测波长下进行色谱分离实验，以验证最佳液相色谱条件，控制变量法下的液相色谱条件可采用以下三种方法：
第一种：固定其他液相色谱条件不变：流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流动相：甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)；
第二种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL；改变流速：0.3-0.6mL/min；
第三种：固定其他液相色谱条件不变：流动相甲醇：水(体积比为5：95)；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量：5μL；改变检测波长：190-400nm；
S4、在步骤S2的实验下，获得丙烯酰胺的线性方程、相关系数和检出限：
S41、准确称取纯度为99.9％为丙烯酰胺标准品到50mL容量瓶中，用超纯水溶解、稀释并定容，配制成浓度为1000μg/mL的丙烯酰胺标准溶液；然后取适量丙烯酰胺标准溶液，用超纯水稀释并定容，配制成浓度为100μg/mL丙烯酰胺标准使用液；
S42、分别取100μg/mL的丙烯酰胺标准使用液至空白超纯水中，逐级稀释配制成质量浓度为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL和5.00μg/mL的系列标准工作溶液；
S43、从低浓度到高浓度依次通过液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，以峰面积定量，得到它们的线性方程和相关系数；
S44、丙烯酰胺检出限计算：分别在10g经处理后的石英砂(代替空白土壤样品)加入40μL浓度为10μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，再用20mL超纯水超声提取30min，离心取上清液待测，按照试验方法重复测定7次，计算测定值的标准偏差S，并以3倍标准偏差计算土壤样品的检出限：
其中，检出限的计算公式为：MDL＝t(n-1,0.99)*S，
其中，MDL—方法检出限；
t—自由度为(n-1)，置信度为99％时的t分布为(n＝7，t＝3.143)；
S—n次平行测定的标准偏差；
n—样品的平行测定次数；
S5、在步骤S2的实验条件下，对空白土壤样品进行加标：空白土壤样品加入丙烯酰胺后，按照步骤S2全程序测定6次，测得空白土壤样品加标后的精密度及准确度；
S6、在步骤S2的实验条件下，对经处理后的粉质粘土进行加标：取粉质粘土样品加入丙烯酰胺后，按照步骤S2全程序测定6次，测得粉质粘土样品加标后的精密度及准确度。
2.根据权利要求1所述的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，控制变量法下的第一种所述流动相比例分别为甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)。
3.根据权利要求1所述的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，控制变量法下的第二种所述流速分别为0.3mL/min、0.4mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种测定土壤中丙烯酰胺的检测方法，其特征在于，在步骤S3中，控制变量法下的第三种所述检测波长分别为190nm、200nm、210nm。
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