CN113201478B - 一株分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun-36及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun‑36及其应用。本发明所述的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis Gxun‑36，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61616。本发明的菌株能够分泌铁载体，并可抑制植物病原菌，还对尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病的防治效果好。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun-36及其应用。
背景技术
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC4)引起的最严重的真菌土传病害，其发生范围广泛，易于流行且难以防治。香蕉枯萎病被称为“香蕉癌症”或“香蕉艾滋病”。目前农业生产中常使用的防治香蕉枯萎病的方法有化学防治、选育抗病品种以及生物防治。化学防治虽能够在短期内起到一定的防控效果，但由于该病为土传病害，还未能找到有效的化学药剂进行持续防控，而且长期施加农药可能会导致病原菌产生抗药性，进而影响作物的产量和质量。选育抗病品种理论上虽是防治香蕉枯萎病的最优方法。但是在实际应用中，由于病原菌致病因素复杂多变，选育的抗病品种的品质不稳定，很有可能失去其抗病性，因此并未达到预期的抗病效果。生物防治具有研发周期相对短及环境友好等优点，是目前香蕉枯萎病防治中研究热点之一。而筛选更多效果好、易培养的拮抗菌是香蕉枯病生物防治的基础工作，具有重要意义。但目前筛选过程中存在筛选效率低、防效不稳定、菌株定殖困难等系列问题。前人研究表明，可分泌铁载体的细菌通过与植物病原菌竞争铁离子，而且还可以分泌吩嗪、表面活性剂、羊毛硫抗生素等活性物质，从而抑制病原菌生长。现有技术中已经筛选到一些既能分泌铁载体，又可以防治病原菌的菌株，但并未见报道既能分泌铁载体，又对尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病的防治效果好的暹罗芽孢杆菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种既能分泌铁载体，又对尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病的防治效果好的暹罗芽孢杆菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun-36，所述暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis Gxun-36，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61616。
本发明还提供了所述的暹罗芽孢杆菌Gxun-36在制备抑制植物病原菌产品方面的应用。
作为优选，所述植物病原菌包括：尖孢镰刀菌四号生理小种Fusarium oxysporumf.sp.cubense race 4,FOC4、香蕉炭疽病Colletotrichum mu-sae、小麦平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana、假禾谷镰刀菌Fusarium pseudo graminearum、烟草赤星菌Alternaria alternata、烟草靶斑病菌Rhizoctonia solani、萝卜黑心病原菌Plectosphaerella cucumerina中的一种或多种。
本发明还提供了所述的暹罗芽孢杆菌Gxun-36在制备防治病原菌引起的植物病害产品中的应用。
作为优选，所述病原菌为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4,FOC4；
所述植物为香蕉；
所述病害为香蕉枯萎病。
作为优选，所述暹罗芽孢杆菌Gxun-36在防治尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病时的方法为：将暹罗芽孢杆菌Gxun-36的发酵液对香蕉进行灌根处理即可。
作为优选，所述发酵液中菌体的浓度为1×106～108cfu/mL。
作为优选，所述发酵液的用量为18～22mL/株。
本发明提供了一株能分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun-36，本发明的Gxun-36菌株对尖孢镰刀菌的抑菌率为74.45％，还能有效抑制香蕉炭疽病Colletotrichum mu-sae、小麦平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana、假禾谷镰刀菌Fusarium pseudo graminearum、烟草赤星菌Alternaria alternata、烟草靶斑病菌Rhizoctonia solani、萝卜黑心病原菌Plectosphaerella cucumerina。本发明的Gxun-36菌株对尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病的防效可达84.21％。
附图说明
图1为拮抗菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果图(其中A为菌株Gxun-1的抑制效果、B为Gxun-4菌株的抑制效果、C为Gxun-18菌株的抑制效果、D为Gxun-36菌株的抑制效果、E为Gxun-45菌株的抑制效果)。
图2为尖孢镰刀菌对Gxun-36菌株菌丝形态的影响图(其中左图为未感染尖孢镰刀菌的Gxun-36菌株的菌丝形态，右图为感染尖孢镰刀菌的Gxun-36菌株的菌丝形态)。
图3为Gxun-36菌株的菌落形态图。
图4为Gxun-36菌株的革兰氏染色结果图。
图5为各个处理香蕉苗球茎纵剖面褐变程度图(其中左边两个为对照组香蕉苗球茎剖面褐变情况，右边两个为加入Gxun-36菌株处理香蕉苗球茎剖面褐变情况)。
保藏说明
暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis Gxun-36，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61616。
具体实施方式
本发明实施例中的尖孢镰刀菌四号生理小种Fusarium oxysporum f.sp.cubenserace 4，FOC4、香蕉炭疽病Colletotrichum mu-sae、小麦平脐蠕孢菌Bipolarissorokiniana、假禾谷镰刀菌Fusarium pseudo graminearum、烟草赤星菌Alternariaalternata、烟草靶斑病菌Rhizoctonia solani、萝卜黑心病原菌Plectosphaerellacucumerina均由广西农科院植物保护研究所提供。
本发明实施例中所述的CAS双层平板培养基包括如下浓度的组分：
上层培养基为KMB固体培养基：K2HPO4 2.5 g/L、MgSO4·7H2O 2.5g/L、酪蛋白氨基酸5g/L、丙三醇15mL/L、琼脂20g/L；
下层培养基为CAS固体培养基：CAS 1mmol/L、FeCl3 0.1 mmol/L、CTAB 4mmol/L、琼脂2％(m/v)。
所述CAS双层平板培养基的pH为7.0±0.2。
本发明实施例中所述的LB平板培养基包括如下浓度的组分：胰蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L。
所述LB固体培养基的pH为7.0。
本发明实施例中所述的LB液体培养基包括如下浓度的组分：胰蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，NaCl 10g/L。
所述LB液体培养基的pH为7.0。
本发明实施例中所述的PDA平板培养基包括如下浓度的组分：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L。
所述PDA培养基的pH为7.0。
本发明实施例中所述的NA平板培养基包括如下浓度的组分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L。
所述NA培养基的pH为7.2。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1菌株的分离、鉴定
将采集于广西金穗集团农场香蕉根际的土壤分别稀释10-1、10-2、10-3三个梯度，每个浓度吸取100μL分别涂布于PDA、LB、NA平板培养基上，分离单菌落。将分离得到菌株点样至CAS双层平板培养基上，30℃培养48h，根据平板上颜色的变化及光圈直径大小，筛选出分泌铁载体较强的菌株。
以尖孢镰刀菌四号生理小种为指示菌，对分离筛选到的菌株进行拮抗活性筛选。首先将尖孢镰刀菌接种到PDA平板培养基，30℃培养条件下培养7d。再用灭菌的打孔器打成5mm的圆形菌饼，再次接种到PDA平板培养基中央，在距离中央2.5cm处点接筛选出的拮抗菌株的菌液，每个培养基对称选取四个点，以只接尖孢镰刀菌的PDA平板作为对照，每组设置三个重复，28℃恒温培养7d。观察拮抗菌株对病原菌的抑制效果并计算抑菌率。抑菌结果见图1，抑菌率见表1。
抑菌率＝(对照组靶标菌落平均直径-实验组菌落靶标平均直径)/对照组靶标菌落平均直径×100％。
选择对尖孢镰刀菌抑菌效果最好的接抗菌观察接种尖孢镰刀菌后对其菌丝形态的变化，以未接尖孢镰刀菌的菌丝图作为对照。结果见如图2所示。
采用上述相同的抑菌实验方法，测定Gxun-36拮抗菌株对香蕉炭疽病Colletotrichum mu-sae、小麦平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana、假禾谷镰刀菌Fusarium pseudo graminearum、烟草赤星菌Alternaria alternata、烟草靶斑病菌Rhizoctonia solani、萝卜黑心病原菌Plectosphaerella cucumerina的抑菌活性，以对应的病原菌为靶标，以只接病原菌的平板为对照。每组设置三个重复，28℃恒温培养7d。观察Gxun-36对其他病原菌的抑菌活性，计算抑菌率。结果见表2。
将Gxun-36菌株在LB平板培养基上划线，28℃培养24h，观察记录菌落形态、颜色以及透明度等特征。结果如图3所示。
将Gxun-36菌株进行革兰氏染色和生理生化鉴定。革兰氏染色结果如图3所示，生理生化结果如表4所示。
提取Gxun-36菌株基因组DNA，进行16S rDNA序列扩增，得到扩增产物。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后送至上海生工生物工程股份有限公司测序。将测序结果在NCBI进行序列比对，MEGA6.0软件Neighbor-joining法，构建菌株系统发育树，鉴定菌种的种属关系。
结果：经PDA、LB、NA平板筛选，得到60株可分泌铁载体的菌株，经CAS双层平板培养基上复筛后筛选得到5株对FOC4拮抗效果较强的菌株。
表1 5株菌株对FOC4的抑菌效果
| 处理 | 菌落直径 | 抑菌率％ |
| Gxun-1 | 2.90±0.38c | 62.05±1.71b |
| Gxun-4 | 2.65±0.46c | 65.40±1.36b |
| Gxun-18 | 5.20±0.38b | 31.95±1.94c |
| Gxun-36 | 1.95±0.27d | 74.45±1.28a |
| Gxun-45 | 2.80±0.38c | 63.35±1.70b |
| 对照 | 7.65±0.46a | - |
表2菌株Gxun-36对五株植物病原真菌抑菌活性
| 病原真菌 | 抑菌率％ |
| 香蕉炭疽病(Colletotrichum mu-sae) | 77.71±1.41b |
| 小麦平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana) | 80.96±1.74a |
| 假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudo graminearum) | 73.18±0.84c |
| 烟草赤星菌(Alternaria alternata) | 64.85±0.32d |
| 烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani) | 73.10±1.55c |
| 萝卜黑心病原菌(Plectosphaerella cucumerina) | 74.39±1.44b |
表3菌株Gxun-36的生理生化特征
| 项目 | Gxun-36菌株 | 项目 | Gxun-36菌株 |
| 革兰氏染色 | + | 卵磷脂酶 | + |
| 果糖利用 | + | 硝酸盐还原 | - |
| 葡萄糖利用 | + | MR试验 | - |
| 木糖利用 | + | 氧化酶试验 | + |
| 耐盐实验 | 7.5％ | 尿素酶产生 | - |
| V-P试验 | - | 精氨酸双水解 | - |
| 明胶液化 | + | 硫化氢产生 | - |
所述“+”表示阳性；“-”表示阴性。
综合菌株Gxun-36的形态特征、革兰氏染色、生理生化特征及16S rDNA基因序列，最终鉴定为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis。
实施例2
将3片叶龄的香蕉苗移栽至以灭菌土与蛭石为基质的花盆中，待移栽定殖10d后，选取长势基本一致的香蕉苗，进行分组，共分成2组，分别为对照组、处理组，每组3个重复。将2组香蕉苗进行伤根处理后，对照组灌根接种20mL香蕉枯萎病尖孢镰刀菌四号生理小种孢子悬液；处理组灌根接种20mL香蕉枯萎病尖孢镰刀菌四号生理小种孢子悬液+20mLGxun-36发酵液。灌根处理7d后再次向对照组和处理组分别灌根20mL的无菌水和Gxun-36发酵液。距第一次灌根接种30d后，观察记录香蕉苗发病情况，计算各组发病指数和防效情况。结果如图5所示。
所述发病指数(％)＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数值)×100；
防治效果(％)＝(CK病情指数﹣处理病情指数)/CK病情指数×100。
病级的确定根据香蕉苗球茎纵剖面褐变程度确定：0级:球茎纵剖面无褐变出现；1级：球茎纵剖面褐变面积≤25％；3级：25％＜球茎纵剖面褐变面积≤50％；5级：50％＜球茎纵剖面褐变面积≤75％；7级：球茎纵剖面褐变面积＞75％。
所述香蕉枯萎病尖孢镰刀菌四号生理小种孢子悬液的制备方法为：将尖尖孢镰刀菌四号生理小种菌丝块接种到PDA平板上，在PDA平板上培养7天，以4～5mL的无菌水洗脱孢子得到孢子液，将上述的孢子液加入至200mL的无菌YPD液体培养基中，置于摇床中28℃，180r/min，震荡培养96h，用4层无菌纱布过滤培养液，无菌水调整孢子菌悬液的浓度，即得孢子悬液。孢子悬液的菌体浓度为：1×107CFU/mL。
所述Gxun-36发酵液的制备方法为：挑取固体平板单菌落接种到装有100mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，置于30℃、220r/min振荡培养2d，即得发酵液。
Gxun-36发酵液中的菌体浓度为：1×107cfu/mL。
图5显示：对照组1香蕉苗球茎测剖面褐变情况明显，病情指数达到90.48％，而菌株Gxun-36处理组香蕉苗病情指数为14.29％，防治效果可达84.21％。
综上，本发明提供了一株能分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun-36，本发明的Gxun-36菌株对尖孢镰刀菌的抑菌率为74.45％，还能有效抑制香蕉炭疽病Colletotrichum mu-sae、小麦平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana、假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum、烟草赤星菌Alternaria alternata、烟草靶斑病菌Rhizoctonia solani、萝卜黑心病原菌Plectosphaerella cucumerina。本发明的Gxun-36菌株对尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病的防效可达84.21％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一株分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis ）Gxun-36，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌Gxun-36，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年4月23日，保藏编号为GDMCC No：61616。
2.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌Gxun-36在制备抑制植物病原菌产品方面的应用；
所述植物病原菌包括：尖孢镰刀菌四号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.cubenserace 4, FOC4）、香蕉炭疽病（Colletotrichum mu-sae）、小麦平脐蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）、假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudo graminearum）、烟草赤星菌（Alternariaalternata）、烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）、萝卜黑心病原菌（Plectosphaerellacucumerina）中的一种或多种。
3.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌Gxun-36在制备防治病原菌引起的植物病害产品中的应用；
所述病原菌为尖孢镰刀菌四号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.cubense race4, FOC4）；
所述植物为香蕉；
所述病害为香蕉枯萎病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌Gxun-36在防治尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病时的方法为：将暹罗芽孢杆菌Gxun-36的发酵液对香蕉进行灌根处理即可。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液中菌体的浓度为1×106~108cfu/mL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵液的用量为18~22mL/株。
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