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CN113176404A - 一种全血样本多指标联检的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种全血样本多指标联检的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN113176404A
CN113176404A CN202110399683.2A CN202110399683A CN113176404A CN 113176404 A CN113176404 A CN 113176404A CN 202110399683 A CN202110399683 A CN 202110399683A CN 113176404 A CN113176404 A CN 113176404A
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reagent
blood sample
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徐兵
杨宝君
王昱琳
马永波
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Beijing Gaugene Biological Technology Co ltd
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Abstract

本申请涉及临床免疫分析的技术领域，具体公开了一种全血样本多指标联检的试剂盒及其使用方法。试剂盒包括用于将全血样本中的红细胞破碎的溶血剂、含有抗体包被的磁性荧光编码微球的R1试剂和含有荧光标记抗体/抗原的R2试剂，以及缓冲液和校准品；所述磁性荧光编码微球是具有编码和解码性能的微球；所述溶血剂为含有表面活性剂的缓冲液，所述荧光标记抗体是与磁性荧光编码微球表面抗体所配对的抗体。本申请的试剂盒可用于全血样本的多指标联检，其具有检测灵敏度高、一次免疫反应可以同时检测多个指标的优点。

Description

一种全血样本多指标联检的试剂盒及其使用方法
技术领域
本申请涉及临床免疫分析的技术领域，更具体地说，它涉及一种全血样本多指标联检的试剂盒及其使用方法。
背景技术
在临床免疫分析领域，所采用的样本一般包括全血样本、血浆样本和血清样本；通过分析样本中各种靶标，如抗原、抗体以及各种靶标物质等等来实现最终的分析目的。其中的血浆样本、血清样本都需要进行制备，以去除全血中的各类细胞(如白血病、红细胞、血小板，以及血浆纤维蛋白等)。而其中的全血样本作为分析试样，和血浆样本、血清样本相比，具有以下优势：一方面，全血样本无需进行样本的制备，从而能够达到快速检测分析的临床需求；另一方面全血样本消除了制备过程中存在的潜在污染和传染的风险。因此，临床检测中更青睐于采用全血样本进行相关靶标物质的分析检测。
此外，为了进一步加快检测分析速度，常采用多靶标的同时检测分析，即：一次反应实现多指标检测。多靶标的同时检测分析方法的优势在于：检测速度比一次单项目检测快；此外，对于重症患者和婴幼儿，用较少的血量样本即可实现多指标项目的检测。
临床炎症相关指标和发热病人的全血中的各类白细胞的比例指标是重要的分析指标，与此同时，还需要配合检测分析一些相关靶标，比如常规的感染四项，以诊断病人是病毒感染，还是细菌感染(细菌感染时，血常规检测中白细胞总数常常高于10×109个/L，中性粒细胞的比例超过70％；病毒感染时，白细胞总数通常变化不大，但是淋巴细胞一般可超过30％)。
而其他炎症指标，如C反应蛋白(CRP)是急性相反应蛋白之一，细菌感染时，CRP可呈中等或高等程度的升高；由于细菌感染引起的全身炎症反应，使得降钙素原(PCT)的浓度在早期炎症反应的2-3h内即可升高，且PCT的浓度与感染严重程度成正相关；白介素6含量升高的时间持久性显著，且远长于CRP和PCT含量升高的时间持久性，因此可用于早期辅助诊断急性感染。血清淀粉样蛋白A(SAA)是肝脏产生的一种急性时相反应蛋白，当人体有急性炎症损伤的时候，SAA浓度就会显著的增高，并在4-6h之内升高到正常值的1000倍以上；且无论是病毒感染，或是细菌感染，还是原虫感染，SAA都会在短时间内明显的升高，当炎症控制后SAA又会迅速的降低，所以SAA是反映人体炎症较为敏感的指标之一。
其中的CRP和SAA主要是采用增强型免疫比浊的方法测试血清或全血；而由于灵敏度的要求，PCT和IL-6基本都是以血清样本检测，并配合全血样本的白细胞分类检测。因此开发一种高灵敏的全血样本的多指标检测方法是意义非凡的。在临床上，一些标志物的检测是需要在短时间内快速获得检测结果的(如心肌性能指标)，以便进行下一步的紧急干预。而对于婴幼儿和重症患者等，当需要对这类患者进行多指标检测分析时，是难以获得检测所需血量的。
在相关技术中，可以采用编码微球的方式测试血清样本中PCT、CRP、IL-6、SAA等指标，其采用四种编码荧光微球连接特异抗体，并以生物素化的对应抗体作为检测抗体，但是这类方法不能以全血为检测样本来检测其中相关指标的含量。对血清样本中标志物的检测分析有多种方法，如增强型免疫比浊方法、辉光免疫化学发光方法、闪光型免疫化学发光方法、酶联免疫法以及均相免疫分析等，都不能以全血为检测样本进行相关标志物的检测分析。这类方法无法消除红细胞及其碎片带来的本底干扰，检测结果中常出现明显的假阳性。而免疫侧向层析通过沉降垫分离细胞而实现全血分析，但是该方法的灵敏度较低，并且不能同时检测多指标，不能满足临床自动化以及灵敏度的要求。
此外，相关技术中，有用于全血的酶联免疫稀释液，基于该酶联免疫稀释液并采用酶联免疫分析方法检测分析相关标志物。但是该方法是固相免疫分析方法，其存在灵敏度低、假阳性的问题。
因此，获得一种全血的、多指标、高灵敏度的检测方法具有重要意义。
发明内容
为了能够高灵敏度的对全血样本的多指标进行检测分析，本申请提供一种全血样本多指标联检的试剂盒及检测方法。
第一方面，本申请提供一种全血样本多指标联检的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种全血样本多指标联检的试剂盒，包括用于将全血样本中的红细胞破碎的溶血剂、含有抗体包被的磁性荧光编码微球的R1试剂、含有荧光标记抗体的R2试剂、缓冲液和校准品；
其中，所述抗体包被的磁性荧光编码微球是将特异靶标的抗体偶联在磁性荧光编码微球，所述抗体包被的磁性荧光编码微球为包被多种特异抗体的多种微球混合物，即每一种不同荧光强度的微球包被一种特异性抗体；所述荧光标记抗体是于配对抗体标记荧光标记物，所述荧光标记抗体为多种特异抗体标记的荧光物质的混合物；所述校准品为复合校准品，包含多个靶标的校准品；所述多种特异性抗体是与磁性荧光编码微球配对的特异性抗体；所述溶血剂是含有具备溶解血液中红细胞的表面活性剂或盐类物质。
在对全血中的物质进行检测时，每一种检测物质为一个检测指标；采用本申请的试剂盒能够实现对多种指标的同时检测分析。其中的R1试剂是将不同抗体(此处的抗体也可以是抗原)分别和不同的磁性荧光编码微球连接后得到。其中不同的磁性荧光编码微球的荧光强度不同，以不同的荧光强度识别不同的检测指标，从而实现对不同检测指标编码的目的。即，当全血样本中的不同检测指标结合各自对应的磁性荧光编码微球(基于抗原抗体间的特异性结合)后，能够在后期检测时根据磁性荧光编码微球的荧光强度的大小来实现对不同检测指标的分别编码。同时制备R2试剂：将不同抗体或者抗原和荧光标记物连接，从而能够在后期通过荧光强度来检测某一指标的含量，以实现某一检测指标的定量分析。
本申请的试剂盒，其模式一首先利用溶血剂将全血样本中的红细胞和白细胞等细胞内的杂质破碎，使得溶血后全血样本中含有待检测的不同指标物以及细胞碎片。样本中对应指标的抗原(该抗原即为检测指标)同时和抗体包被的磁性荧光编码微球、荧光标记抗体连接，形成抗体包被的磁性荧光编码微球-抗原-荧光标抗体复合物；然后通过磁分离技术将抗体包被的磁性荧光编码微球-抗原-荧光标抗体复合物和细胞碎片分离，以实现采用全血样本检测时，即使初始样本中有红细胞、白细胞等细胞的存在也不会影响最终的检测结果。模式二全血样本中，对应指标的抗原(该抗原即为检测指标)同时和抗体包被的磁性荧光编码微球、荧光标记抗体连接，形成抗体包被的磁性荧光编码微球-抗原-荧光标抗体复合物，利用溶血剂将全血样本中的红细胞和白细胞等细胞内的杂质破碎，然后通过磁分离技术将抗体包被的磁性荧光编码微球-抗原-荧光标抗体复合物和细胞碎片分离，以实现采用全血样本检测时，即使初始样本中有红细胞、白细胞等细胞的存在也不会影响最终的检测结果。此外，采用本申请的试剂盒进样全血样本的多指标联检时，与化学发光原理相似，均是磁性微球在液相中进行反应，具有化学发光检测方法本身具有高灵敏度的检测优势，因此，本申请的检测试剂盒能够实现全血样本的多指标的高灵敏度检测。
优选的，所述磁性荧光编码微球采用包括以下步骤的方法制备得到：
I、磁颗粒微球制备：
I-I、配制预溶液：将环己烷、正己烷与纳米四氧化三铁甲苯溶液混合均匀备用；
I-II、分别称取粒径不同的磁颗粒微球，于不同粒径的磁颗粒微球中分别加入预溶液，超声分散并搅拌后，得到含有不同粒径的磁颗粒微球的溶液；
II、磁性编码微球的制备：
II-I、配制不同浓度的量子点溶液；
II-II、将上述含有不同粒径的磁颗粒微球的溶液分别加入到上述不同浓度的量子点溶液中，在60～90℃的温度下搅拌8～16h，随后迅速冷却至室温，并分别经过滤、洗涤后干燥，得到不同量子点浓度、不同粒径的磁性编码微球；
III、功能团包裹
III-I、将上述不同粒径的磁性编码微球溶于无水乙醇中，超声分散后，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌10～14h；随后经过滤、洗涤后得包裹硅烷层的磁性荧光编码微球；
III-II、将上述包裹硅烷层的磁性荧光编码微球溶于无水乙醇中，加入丁二酸酐，室温搅拌后经过滤、洗涤后干燥，得含有羧基官能团的磁性荧光编码微球。
本申请选用自制得到的磁性荧光编码微球，以实现在检测设备上使得不同的检测指标分别分布在不同区域，进而实现不同检测指标的有效分离；其次，本申请的磁性荧光编码微球，同时具备磁性吸附的特性，为后期的红细胞、白细胞碎片的去除做准备。
优选的，所述溶血剂是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂或氯化铵中的一种。
本申请所选择的溶血剂，其能够将全血样本中的细胞破碎即可，其主要作用于细胞膜，使得细胞膜被破坏，以实现破碎细胞的作用。
优选的，所述溶血剂为含有表面活性剂的盐缓冲液，所述表面活性剂选自tween20、tween 80和曲拉通-100中的任意一种。
上述的溶血剂具有优异的破碎细胞的效果；破碎细胞快且其不影响后期的目标组分(即靶标)的检测。
优选的，所述表面活性剂在缓冲液中的添加量为0.05％～0.15％。
优选的，所述溶血剂为含有曲拉通-100的磷酸盐缓冲液。
进一步优选的，所述曲拉通-100的添加量为磷酸盐缓冲液体积的0.05％。
优选的，所述溶血剂的pH为6～8。
免疫反应一般都在接近中性条件下进行，强酸强碱不利于免疫反应及蛋白稳定性。而本申请采用pH6～8范围内的溶血剂处理全血时，即可达到使得免疫反应顺利进行的区间，不会对后续的免疫检测反应造成影响，因此溶血剂的pH范围可以选为6～8。
优选的，所述R1试剂由包括以下步骤的方法制备得到：
将一种磁性荧光编码微球和磁性微球活化剂置于缓冲液A中，以将所述磁性荧光编码微球活化；随后加入任意一种抗体以将抗体包被在磁性荧光编码微球上；然后加入缓冲液B静置处理，制备得到含有其中一种抗体包被的磁性荧光编码微球的溶液；
随后以上述的步骤逐一制备得到其他含有某一待检测指标对应的抗体包被的磁性编码微球的溶液即可；
后续将多种联合检测项目对应的多种含有抗体包被的编码微球的溶液混合在一起，即得到R1试剂。
在制备R1试剂时，要根据具体的联合检测项目进行相应的制备。由于本申请的试剂盒是用于全血样本的多项联检，因此待检测指标至少是两个。在R1试剂中，含有的抗体包被的磁性荧光编码微球至少有两种。在具体制备R1试剂的过程中，举例来说，若进行的是全血样本的两项联检，则需要选择两种检测指标分别对应的抗体(即有两种抗体)，随后任意选择两种磁性荧光编码微球，将一种抗体包被在其中一种磁性荧光编码微球上，将另一种抗体包被在另一种磁性荧光编码微球上，最后将两种包被抗体的磁性荧光编码微球的溶液混合即制备得到R1试剂。需要对几种指标联检，就分别制备几种抗体包被的磁性荧光编码微球，将其混合即为R1试剂。
优选的，将活化后的磁性荧光编码微球和抗体加入至缓冲液B后，其静置处理的温度为20～25℃，静置处理的时间为0.5～1.5h。
通过采用上述技术方案，使得抗体能够有效负载在磁性荧光编码微球上。
优选的，所述R1试剂中抗体包被的磁性荧光编码微球的含量为0.4～0.6mg/mL。
通过采用上述技术方案，在该浓度下，抗体包被的磁性荧光编码微球能够长期稳定存在。
优选的，所述缓冲液A为2-吗啉乙磺酸溶液。
优选的，所述缓冲液B选自BSA磷酸盐缓冲液、酪蛋白的磷酸盐缓冲液中的任意一种。
所述R2试剂由包括以下步骤的方法制备得到：以交联剂将一种抗体和荧光标记物于缓冲液C内交联，得到一种含有荧光标记抗体的溶液；
随后以上述的步骤逐一制备得到其他含有某一待检测指标对应的荧光标记抗体的溶液即可；
后续将多种含有联合检测项目对应的荧光标记抗体的溶液混合在一起，即得到R2试剂。
优选的，所述荧光标记物选自藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)中的任意一种。
荧光标记物一般以藻红蛋白为常见，不限于藻红蛋白，还可以是异硫氰酸荧光素(FITC)。荧光标记物的使用主要的目的在于，对待检测指标做荧光标记，随后通过荧光信号的强弱计算对应的待检测指标的浓度值，实现高灵敏度检测的要求。
优选的，所述荧光物为藻红蛋白(PE)。
优选的，所述缓冲液为pH6-8的盐离子缓冲液。
进一步优选的，所述缓冲液为pH7.4 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。
优选的，R2试剂中所述荧光标记抗体的浓度为0.3～0.8μg/mL。
通过采用上述技术方案，在该浓度下，所述荧光标记抗体能够长期稳定存在。
优选的，所述全血样本中配对抗体的靶标为2～14种。
优选的，所述抗体选自降钙素原、白介素6、心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、N末端B型钠尿肽前体、脂蛋白相关磷脂酶A2、心型脂肪酸结合蛋白、黄体生成素、孕酮分别对应的抗体中的至少两种。
在进行全血样本中的多指标联检时，可以根据实际的检测分析需求选择将不同的指标同时进行检测分析。其中，可以将降钙素原(PCT)和白介素6(IL-6)联检，对应的抗体可以是PCT抗体和IL-6抗体；也可以将心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端B型钠尿肽前体(NT-pro-BNP)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA 2)及心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)联检，对应的抗体可以是cTn I抗体、MYO抗体、CK-MB抗体、NT-pro-BNP抗体、Lp-PLA 2抗体及H-FABP抗体；还可以将黄体生成素(LH)和孕酮(P)进行联检，对应的抗体可以是LH抗体和P抗体。
优选的，所述靶标为和炎症相关的降钙素原(PCT)、白介素6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和肝素结合蛋白(HBP)这5种。
本申请的试剂盒能够对多种不同的检测指标进行联检，其应用范围广泛，能够用于多种组合指标的同时检测分析。
第二方面，本申请提供一种上述多指标联检的试剂盒的使用方法，采用如下的技术方案：
一种上述多指标联检的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
根据待检测指标，分别准备R1试剂和R2试剂；
取全血样本，加入所述溶血剂溶血，再加入R1试剂和R2试剂并进行反应，分离后弃液相，将固相进行检测；
或所述使用方法包括以下步骤：
根据待检测指标，分别准备R1试剂和R2试剂；
取全血样本，加入R1试剂和R2试剂并进行反应，然后加入所述溶血剂溶血，再分离后弃液相，将固相进行检测。在使用本申请的试剂盒进行全血样本中的多指标检测分析时，最终可以采用流式细胞仪进行样本检测。其反应模式可以为两种。在此以检测一种指标为例来说明两种不同的反应模式。
反应模式一：将能够和待检测的指标(即抗原)特异性结合的抗体标记在磁性荧光编码微球上，作为捕获因子A。全血样本用溶血剂稀释，大量红细胞破碎，将得到的含有破碎细胞的全血样本作为样本使用S。另外一种能够和待检测指标(即抗原)特异结合的抗体被标记在荧光标记物上作为示踪因子A’。将三者混合后，A-S-A’形成一个典型的夹心法免疫分析模式。用磁力吸附磁性荧光编码微球，并在洗涤后清除未结合的A’。将最终得到的固相用于最终的检测。
反应模式二：将能够和待检测的指标(即抗原)特异性结合的抗体标记在磁性荧光编码微球上，作为捕获因子A。全血样本作为样本使用S。另外一种能够和待检测指标(即抗原)特异结合的抗体被标记在荧光标记物上作为示踪因子A’。A-S-A’形成一个典型的夹心法免疫分析模式，加入溶血剂，破坏血细胞，用磁力吸附磁性荧光编码微球，洗涤后清除未结合的A’及破碎的血细胞。将最终得到的固相用于最终检测。
对于上述得到的固相分别用流式细胞分析仪检测反应结果，在FSC-SSC(前向散射-侧向散射)散点图上圈出磁性荧光编码微球，分析所圈定不同编码微球的荧光信号强度，即为对应检测指标的浓度。其中，虽然通过磁分离将大部分细胞碎片去除，但是还是有部分细胞碎片的残留。这部分细胞脆片的残留会在采用流式细胞仪检测时通过圈门界定去除，所以破碎的血细胞以及全血中的粘连物不影响最终检测分析的结果，其影响因素能够通过圈门消除。
多指标检测时，不同的指标能够通过磁性荧光编码微球的编码进行区分，即可实现多指标联检的要求。以两种指标的检测为例进行说明，选择两种磁性荧光编码微球，分别为磁性荧光编码微球A和磁性荧光编码微球B；分别偶联两个待检测指标(即抗原)对应的特异性结合抗体，得到两种捕获因子：捕获因子A和捕获因子B。全血样本用溶血剂处理后作为样本S。分别用两个待检测指标(即抗原)对应的特异性结合抗体偶联荧光标记物，作为示踪物A’和B’。A/B+S+A’/B’进行孵育反应，磁力吸附洗涤后，上机检测。由于采用磁力吸附A和B，经夹心反应后结合的示踪抗体会留下来，而未结合的示踪抗体会被清洗掉，上机检测后，在FSC-SSC散点图上形成一个磁性编码微球的聚类，其不受抗体、抗原、示踪物的影响。将该聚类圈门后，会在解码通道上出现独立的两个聚类峰，分别代表磁性荧光编码微球A(负载有待检测指标A)和磁性荧光编码微球B(负载有待检测指标B)，即解码两个项目，分别圈门出A聚类和B聚类，并在信号通道分别显示各自的荧光强度，实现两个靶标的浓度检测分析。
磁性荧光编码微球所含磁性与磁颗粒免疫化学发光一样，便于自动化处理洗涤，而所含有的荧光信号是实现不同项目的编码，通过同种荧光染料或量子点等的不同浓度，确定磁性荧光编码微球在荧光解码通道的位置，还可以通过双染料或量子点实现双信号的解码，实现更多项目的同时检测和解码分析，如常见的血清检测细胞因子，一般为6因子、7因子、甚至14因子同时检测分析。
优选的，S3中，于全血样本中加入所述溶血剂后，使得所述溶血剂的添加量为添加溶血剂后溶液总体积的10％～90％。
于全血样本中添加有上述含量的溶血剂后，均能实现将全血样本中的红细胞(以及白细胞)有效破碎，以避免完整细胞对后期实验结果和实验灵敏度的影响。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请的试剂盒，利用溶血剂将全血样本中的红细胞膜破碎，并在后期通过磁分离技术去除细胞碎片及洗涤除去未结合荧光标记抗体，最终得到磁性荧光编码微球-抗体-抗原-荧光标记物的复合物，随后通过流式细胞仪检测，以实现全血样本中多指标的高灵敏度联检。
附图说明
图1是联检分析全血样本中的PCT和IL-6时流式细胞仪区分并圈出的细胞碎片群和目标测试群的结果图；
图2是联检分析全血样本中的PCT和IL-6时通过编码通道区分目标测试群时区分出的具体检测指标分别为PCT和IL-6的结果图；
图3是联检分析全血样本中的cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP六指标时流式细胞仪区分并圈出的细胞碎片群和目标测试群的结果图；
图4是联检分析全血样本中的cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP六指标时通过编码通道区分目标测试群时区分出的具体检测指标分别为cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP时的结果图；
图5是联检分析全血样本中的LH和P双指标时流式细胞仪区分并圈出的细胞碎片群和目标测试群的结果图；
图6是联检分析全血样本中的LH和P双指标时通过编码通道区分目标测试群时区分出的具体检测指标分别为LH和P时的结果图；
图7是对比例中联检分析全血样本中的cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP六指标时流式细胞仪区分并圈出的细胞碎片群和目标测试群的结果图；
图8是对比例中联检分析全血样本中的cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP六指标时通过编码通道区分目标测试群时区分出的具体检测指标分别为cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP时的结果图。
具体实施方式
相关的利用荧光编码微球对相关指标进行检测时，难以实现以全血为检测样本并同时对多指标的高灵敏度的联检。因此，在将该类方法用于多指标检测时，存在耗时长、检测灵敏度低、假阳性的情况。尤其是全血样本来自婴儿或者重症患者时，针对较多的检测指标，难以一次性获得足够的检测所需的全血样本，因此，为多指标、高灵敏度的联检带来重重困难。
基于上述背景，本申请提出一种全血样本中多指标联检的试剂盒及其使用方法。
一种全血样本中多指标联检的试剂盒，包括用于将全血样本中的红细胞破碎的溶血剂、含有抗体包被的磁性荧光编码微球的R1试剂和含有荧光标记抗体的R2试剂；
其中，所述抗体包被的磁性荧光编码微球是将对应的抗体包被在磁性荧光编码微球上后获得，所述荧光标记抗体是于相应的抗体上标记荧光标记物后获得；抗体为多种，磁性荧光编码微球为多种，一种磁性荧光编码微球对应包被一种抗体，则对应的抗体包被的磁性荧光编码微球为多种，荧光标记抗体为多种；
所述溶血剂为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液，所述表面活性剂选自tween 20、tween 80和曲拉通-100中的任意一种。
本申请中所选择的溶血剂主要是依靠表面活性剂降低缓冲液的表面张力，并改变溶液的增溶性能；而表面活性剂对于细胞的作用在于改变细胞膜的通透性；而将表面活性剂添加至磷酸盐缓冲液中时，能够最终实现优异的细胞破碎的效果：细胞破碎高效且完全。此外，本申请的溶血剂不仅能够破碎全血样本中的红细胞，还能够破碎白细胞等存在于全血中的细胞。并且其破碎效果能够满足后期的检测需求。
R1试剂是以包括以下步骤的方法制备得到：
将一种磁性荧光编码微球和磁性微球活化剂置于缓冲液A中，以将所述磁性荧光编码微球活化；随后加入任意一种抗体以将抗体包被在磁性荧光编码微球上；然后加入缓冲液B静置处理，制备得到其中一种抗体包被的磁性荧光编码微球。
随后以上述的步骤逐一制备得到其他待检测指标对应的抗体包被的磁性编码微球即可；
后续将多种联合检测项目对应的多种含有不同抗体包被的编码微球的溶液混合在一起得到对应试剂R1。
其中的缓冲液A可以是2-吗啉乙磺酸缓冲液，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度可以是0.05～0.15mol/L。
缓冲液B可以是1％BSA磷酸盐缓冲液，也可以是酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
静置处理时的温度可以是20～25℃，还可以是21～24℃，还可以是22～23℃；具体可以为20.5℃，21.5℃，22.5℃，23.5℃，24.5℃。静置处理的时间可以为0.5～1.5h，还可以为0.75～1.25h，还可以是0.9～1.1h；具体可以是0.6h，0.8h，1.0h，1.2h，1.4h。
采用上述方法制备得到含有不同抗体包被的磁性荧光编码微球的R1试剂；在最后，以缓冲液B调节得到的抗体包被的磁性荧光编码微球在溶液中的终浓度，其终浓度可以为0.4～0.6mg/mL，具体可以是0.45mg/mL，0.5mg/mL，0.55mg/mL。
R2试剂是以包括以下步骤的方法制备得到：
以交联剂将一种抗体和荧光标记物于缓冲液C内交联，得到一种荧光标记抗体；随后以上述的步骤逐一制备得到其他含有不同待检测指标对应的荧光标记抗体的溶液即可；
后续将多种联合检测项目对应的多种荧光标记抗体混合在一起，即得到R2试剂。
以缓冲液C调节荧光标记抗体在溶液中的终浓度可以为0.3～0.8μg/mL，具体可以是0.41μg/mL，0.52μg/mL，0.61μg/mL，0.69μg/mL，0.73μg/mL。
需要说明的是，在本申请中，只要一种磁性荧光编码微球对应编码一种待检测指标即可。不同的磁性荧光编码微球能够将不同的检测指标编码并在检测时解码即可。
此外，本申请的试剂盒中还包括校准品，用于制备和对应待检测指标相关的标准曲线。
一种上述全血样本的多指标联检的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：根据待检测指标，分别准备R1试剂和R2试剂；
取全血样本，加入所述溶血剂溶血，再加入R1试剂和R2试剂并进行反应，分离后弃液相，将固相进行检测。
其中，表面活性剂的添加量可以是磷酸盐缓冲液体积的0.05％～0.15％；也可以是磷酸盐缓冲液体积的0.075％～0.125％，还可以是磷酸盐缓冲液体积的0.08％～0.11％。具体可以是0.06％、0.09％、0.13％中的任意一种添加比例。
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请中用到的原料信息如表1所示。
表1
Figure BDA0003019945510000121
Figure BDA0003019945510000131
通过本申请的试剂盒制备得到的样本，采用北京指真生物科技有限公司自产的产品型号为CytoPOC的流式细胞仪进行检测分析。
制备例
磁性荧光编码微球的制备
磁性荧光编码微球的制备方法包括以下步骤：
I、磁颗粒微球制备：
I-I、配制预溶液：将环己烷、正己烷与纳米四氧化三铁甲苯溶液混合均匀备用；其中，环己烷、正己烷与纳米四氧化三铁甲苯溶液的体积比为：20:20:16，纳米四氧化三铁甲苯溶液中纳米四氧化三铁的浓度为5mg/mL。
I-II、分别称取粒径不同的聚苯乙烯介孔微球，分别加入预溶液，超声分散，室温机械搅拌，随即得到粒径不同的磁颗粒微球；其中，聚苯乙烯介孔微球的粒径分别为：3μm和5μm。
II、磁性编码微球的制备：
II-I、配制不同浓度的量子点QDS700溶液；其中，量子点QDS700溶液的体积份数分别为：1/3000、2/3000、4/3000、8/3000、16/3000，32/3000。
II-II、取不同粒径的磁颗粒微球50mg分别加入到上述不同浓度的量子点溶液中，在80℃的条件下机械搅拌12h，随后迅速冷却至室温，然后将冷却液经定性滤纸过滤后用无水乙醇洗涤，最后再60℃的添加下干燥24h，得到不同量子点浓度、不同粒径的磁性荧光编码微球。这里不限制磁颗粒微球和量子点QDS700浓度之间的添加关系，不同量子点QDS700浓度的溶液可以任意和以上两种粒径的磁颗粒微球混合。本申请所说的不同种类的磁性荧光编码微球的不同之处在于每种磁性荧光编码微球的荧光强度不同。
III、功能团包裹
III-I、将上述不同粒径的磁性荧光编码微球20mg溶于20mL无水乙醇中，经超声分散后，加入40μL3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后机械搅拌12h；随后将搅拌后的溶液经定性滤纸过滤、无水乙醇洗涤后得包裹硅烷层的磁性荧光编码微球；
III-II、将上述包裹硅烷层的磁性荧光编码微球溶于20mL无水乙醇中，加入0.5g丁二酸酐，室温机械搅拌12h，随后将机械搅拌后的溶液经定性滤纸过滤、无水乙醇洗涤后在60℃的条件下干燥24h，即得表面具有羧基官能团的磁性荧光编码微球。
实施例
不同种类的溶血剂对溶血时间的影响
配制含有不同表面活性剂的有溶血效果的溶血剂
取三份0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液，于三份磷酸盐缓冲液中分别加入不同的表面活性剂，其中添加的表面活性剂分别为磷酸盐缓冲液体积0.1％的tween20、0.1％tween80和0.1％曲拉通-100，并分别命名为溶液1，溶液2，溶液3。随后加入不同比例的全血样本后测试溶血时间，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003019945510000141
如表2所示，含有曲拉通X-100的溶血剂在处理不同量的全血样本时，在100s内即可实现完全溶血，其能够快速充分溶血。而其中，当于全血中加入含有曲拉通X-100的溶血剂时，且当全血占加入溶血剂后总体积的10％(即溶血剂的添加量为添加溶血剂后溶液总体积的90％)时，溶血时间最短，仅为3s，因此在后续的实验中选择溶液3作为溶血剂进行相关实验。
此外，表1的数据结果表明：溶血剂的占比越大，溶血速度越快，如有更高的溶血时间的要求，则可以通过提高表面活性剂添加量来加快溶血速度。这里含有0.1％曲拉通X-100的溶血剂已经能够使用要求：其能够完全溶血、溶血速度快且溶血后不影响后期检测的灵敏度。
实施例1全血样本中降钙素原(PCT)、白介素6(IL-6)双指标联检试剂盒一种全血样本中多指标联检的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、抗体包被的磁性荧光编码微球的制备
在0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液中，用EDC将5.0μm的磁性荧光编码微球活化后，将PCT抗体固定在磁性荧光编码微球A1的表面，随后加入1％BSA磷酸盐缓冲液在室温处理1h，即得到PCT抗体包被的磁性荧光编码微球。
用同样的方法将IL-6抗体包被在另一种磁性荧光编码微球B1上，最终得到IL-6抗体包被的磁性荧光编码微球，并用pH7.2含1％BSA和0.5％牛血清的磷酸盐缓冲液将PCT抗体包被的磁性荧光编码微球和IL-6抗体包被的磁性荧光编码微球分别配制为浓度均为0.5mg/mL的溶液，并混合后即为R1试剂。
其中，磁性荧光编码微球A1和磁性荧光编码微球B1的区别在于两种磁性荧光编码微球的荧光强度不同。
S2、荧光标记抗体的制备
将PCT抗体通过戊二醛与藻红蛋白(PE)连接，得到PE标记PCT抗体；
将IL-6抗体通过戊二醛与藻红蛋白(PE)连接，得到PE标记IL-6抗体；用pH7.2含蛋白磷酸盐缓冲液将PE标记PCT抗体及PE标记IL-6抗体分别按浓度0.5μg/mL和0.4μg/mL配制成溶液并混合，即为R2试剂。
S3、取全血样本加入溶血剂，其中，溶血剂是于0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中加入磷酸盐缓冲液体积0.1％的曲拉通-100后获得的溶液3；于全血样本中添加溶血剂后，全血样本占加入溶血剂后液体总体积的60％。加入包被PCT抗体磁性荧光编码微球和包被IL-6抗体磁性荧光编码微球，同时加入PE标记PCT抗体及PE标记IL-6抗体进行反应20min。然后经磁分离后留固相，最后将获得的固相清洗后加入PBS用流式细胞仪测试。
测试结果见图1-2及表3。图1的结果表明，在联检分析全血样本中的PCT和IL-6时，将检测样品加入流式细胞仪后，流式细胞仪能够明确区分并圈出碎片群(即细胞碎片群，包括红细胞碎片和白细胞碎片等)和目标群(即含有待检测指标的PCT和IL-6)。随后在图2的结果中，通过编码通道能够显著区分出目标群中的不同的具体检测指标，分别为PCT和IL-6。
表3
Figure BDA0003019945510000161
表3中的数据表明：全血检测中PCT、IL-6项目联合检测曲线、检测灵敏度以及线性均满足试剂使用目标。PCT检测时将PCT含量和荧光强度用五参数进行拟合，相关系数R1 2为0.9962；IL-6检测时将IL-6含量和荧光强度用五参数拟合，相关系数为：R2 2＝0.9999。
不同pH值的溶血剂处理样本对PCT、IL-6检测的影响常规抗原抗体反应的pH基本时在6～8范围内，配制含0.1％曲拉通X-100的0.02mol/L磷酸盐缓冲液，pH分别是6.0，7.4和8.0，全血样本(有5组，分别是样本A～样本E)与溶血剂的体积比按1:1处理，后采用上述的方法测定样本中PCT的含量，测试结果见表4。
表4
Figure BDA0003019945510000162
表4中结果显示在溶血剂在pH6-8范围内，处理全血，未对后续的免疫检测反应造成影响，因此溶血剂的pH范围可以选在6～8。
实施例2全血样本中心肌肌钙蛋白I(cTn I)、肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端B型钠尿肽前体(NT-pro-BNP)、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA 2)及心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)六指标联检试剂盒
一种全血样本中多指标联检的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、抗体包被的磁性荧光编码微球的制备
在0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液中，用EDC将5.0μm的磁性荧光编码微球活化后，将cTn I抗体固定在磁性荧光编码微球A2的表面，随后用1％BSA磷酸盐缓冲液在室温条件下处理1h，即得到包被cTn I抗体磁性荧光编码微球。用相同的方法得到分别包被MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP抗体的磁性荧光编码微球(编码不同)，并用pH7.2含蛋白磷酸盐缓冲液将上述包被有不同抗体的磁性荧光编码微球均配制成浓度0.5mg/mL的混合液，即为R1试剂。
其中，不同磁性荧光编码微球的区别在于各磁性荧光编码微球的荧光强度不同。
S2、荧光标记抗体的制备
将cTn I抗体通过戊二醛与藻红蛋白(PE)连接，得到PE标记cTn I抗体，随后以上述方法依次获得PE标记MYO抗体，PE标记CK-MB抗体，PE标记NT-pro-BNP抗体，PE标记Lp-PLA2抗体，PE标记H-FABP抗体，用pH7.2含蛋白磷酸盐缓冲液将上述PE标记抗体分别配制成浓度为0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.3μg/mL、0.8μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL的混合溶液，混合后即为R2试剂。
S3、取全血样本，加入包被cTn I抗体的磁性荧光编码微球、包被MYO抗体的磁性荧光编码微球、包被CK-MB抗体的磁性荧光编码微球、包被NT-pro-BNP抗体的磁性荧光编码微球、包被Lp-PLA 2抗体的磁性荧光编码微球、以及包被H-FABP抗体的磁性荧光编码微球，同时加入PE标记cTn I抗体、PE标记MYO抗体、PE标记MYO抗体、PE标记CK-MB抗体、PE标记NT-pro-BNP抗体、PE标记Lp-PLA 2抗体以及PE标记H-FABP抗体后进行反应20min。加入100μL的溶血剂，其中，溶血剂是于0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中加入磷酸盐缓冲液体积0.1％的曲拉通-100后获得的溶液3。然后经磁分离后留固相，最后将获得的固相清洗后加入PBS用流式细胞仪测试。
测试结果见图3-4及表5。图3的结果表明，在联检分析全血样本中的cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2及H-FABP时，将检测样品加入流式细胞仪后，流式细胞仪能够明确区分并圈出碎片群(即细胞碎片群，包括红细胞碎片和白细胞碎片等)和目标群(即含有待检测指标的cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2和H-FABP)。随后在图4的结果中，通过编码通道能够显著区分出目标群中的不同的具体检测指标，分别为cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2和H-FABP。
表5
Figure BDA0003019945510000181
Figure BDA0003019945510000191
表5中的数据表明：全血检测中cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2和H-FABP的六项目联合检测曲线、检测灵敏度以及线性均满足试剂使用目标。经五参数拟合后各项目含量(cTn I、MYO、CK-MB、NT-pro-BNP、Lp-PLA 2和H-FABP)和荧光强度之间相关系数R2分别为：0.9992、0.9991、0.9998、0.9995、0.9998、0.9996。
实施例3全血样本中促黄体生成素(LH)和孕酮(P)双指标联检试剂盒
一种全血样本中多指标联检的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、抗体包被的磁性荧光编码微球的制备
在0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液中，用EDC将5.0μm的磁性荧光编码微球活化后，将LH抗体固定在磁性荧光编码微球A3的表面，随后用1％BSA磷酸盐缓冲液在室温处理1h，即得到包被LH抗体磁性荧光编码微球，用同样的方法将P抗体包被在另一种磁性荧光编码微球B3上，并用pH7.2含蛋白磷酸盐缓冲液分别将包被LH抗体磁性荧光编码微球及包被P抗体磁性荧光编码微球均配制为浓度0.5mg/mL的混合溶液后再混合，得到R1试剂。
S2、荧光标记抗体/抗原的制备
将LH抗体及P抗原通过戊二醛与藻红蛋白(PE)连接，得到PE标记LH抗体及PE标记P抗原，用pH7.2含蛋白磷酸盐缓冲液将PE标记LH抗体和PE标记P抗原配成浓度分别为0.8μg/mL和0.1μg/mL的混合溶液，将两种混合液混合后即得到R2试剂。
S3、取全血样本，加入包被LH抗体的磁性荧光编码微球和包被P抗体的磁性荧光编码微球，同时加入PE标记LH抗体和PE标记P抗体后进行反应15min。加入溶血剂100μL，溶血剂是于0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中加入磷酸盐缓冲液体积0.1％的曲拉通-100后获得的溶液3；然后经磁分离后留固相，最后将获得的固相，清洗后加入PBS用流式细胞仪测试。
测试结果见图5-6及表6。图5的结果表明，在联检分析全血样本中的LH和P时，将检测样品加入流式细胞仪后，流式细胞仪能够明确区分并圈出碎片群(即细胞碎片群，包括红细胞碎片和白细胞碎片等)和目标群(即含有待检测指标的LH和P)。随后在图6的结果中，通过编码通道能够显著区分出目标群中的不同的具体检测指标，分别为LH和P。
表6
Figure BDA0003019945510000201
表6中的数据表明：全血检测中LH和P的双项目联合检测曲线、检测灵敏度以及线性均满足试剂使用目标。其中，LH和P的含量和荧光强度之间经五参数拟合后的曲线相关系数R2分别为：0.9998和0.9913。
对比例
本对比例和实施例2的区别在于，全血样本加入磁性荧光编码微球及PE标记抗体反应后，加入溶血剂后直接测试，不进行磁分离操作(即最终破碎的细胞碎片不去除)。
经测试后发现目标磁性荧光编码微球被细胞碎片黏连成各种大小的黏连体，如图7所示的散点图，将所有的点圈门，如图8所示可以区分出不同的检测指标，但是有一定的细胞碎片混杂在低值编码微球群里，会给后期的分析带来干扰，因此不采用此种直接测试的模式。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种全血样本多指标联检的试剂盒，其特征在于，包括用于将全血样本中的红细胞破碎的溶血剂、含有抗体包被的磁性荧光编码微球的R1试剂、含有荧光标记抗体的R2试剂、缓冲液和校准品；
其中，所述抗体包被的磁性荧光编码微球是将特异靶标的抗体偶联在磁性荧光编码微球，所述抗体包被的磁性荧光编码微球为包被多种特异抗体的多种微球混合物，即每一种不同荧光强度的微球包被一种特异性抗体；所述荧光标记抗体是于配对抗体标记荧光标记物，所述荧光标记抗体为多种特异抗体标记的荧光物质的混合物；所述校准品为复合校准品，包含多个靶标的校准品；所述多种特异性抗体是与磁性荧光编码微球配对的特异性抗体；所述溶血剂是含有具备溶解血液中红细胞的表面活性剂或盐类物质。
2.根据权利要求1所述的多指标联检的试剂盒，其特征在于，所述溶血剂是阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂或氯化铵中的一种。
3.根据权利要求2所述的多指标联检的试剂盒，其特征在于，所述溶血剂为含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液，所述表面活性剂选自tween 20、tween 80和曲拉通-100中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的多指标联检的试剂盒，其特征在于，所述溶血剂为含有曲拉通-100的缓冲液，曲拉通-100在缓冲液中的添加量为0.05%~0.15%。
5.根据权利要求4所述的多指标联检的试剂盒，其特征在于，曲拉通-100在缓冲液中的添加量为0.05%。
6.根据权利要求1所述的一种多指标联检的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中每种抗体包被的磁性荧光编码微球的含量为0.4~0.6 mg/mL。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种多指标联检的试剂盒，其特征在于，所述全血样本中配对抗体的靶标为2~14种。
8.根据权利要求7所述的一种多指标联检的试剂盒，其特征在于，所述靶标为和炎症相关的降钙素原（PCT）、白介素6(IL-6)、C反应蛋白（CRP）、血清淀粉样蛋白A（SAA）和肝素结合蛋白（HBP）这5种。
9.一种权利要求1-6任意一项所述的多指标联检的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据待检测指标，分别准备R1试剂和R2试剂；
取全血样本，加入所述溶血剂溶血，再加入R1试剂和R2试剂并进行反应，分离后弃液相，将固相进行检测；
或所述使用方法包括以下步骤：
根据待检测指标，分别准备R1试剂和R2试剂；
取全血样本，加入R1试剂和R2试剂并进行反应，然后加入所述溶血剂溶血，再分离后弃液相，将固相进行检测。
10.根据权利要求9所述的一种全血样本中多指标联检的试剂盒的使用方法，其特征在于，于全血样本中加入所述溶血剂后，使得所述溶血剂的添加量为添加溶血剂后溶液总体积的10%~90%。
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