CN113166972A - 新型免疫检查点抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)鉴定为癌症患者对免疫检查点抑制剂的反应性的预后生物标志物。更具体地，本发明涉及在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予特异性抑制纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)与淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，其中所述癌症为表达FGL1的癌症。此外，本发明涉及用于在癌症患者中评估对用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体的治疗的敏感性或预测对所述治疗的反应性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样本中的FGL1表达；并且涉及用于选择将从特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体中受益的癌症患者的试剂盒。特异性抑制FGL1与LAG3之间的相互作用的所述免疫检查点抑制性抗体可以是针对人FGL1的抗体或针对人LAG3的抗体，所述抗体任选地与其他免疫检查点抑制性抗体诸如抗PD1或抗PD‑L1抗体组合。

Description

新型免疫检查点抑制剂

技术领域

本发明涉及将纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)鉴定为治疗癌症患者的靶标以及预测这个癌症患者对免疫检查点抑制剂的反应性的预后生物标志物。更具体地，本发明涉及在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予特异性抑制纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)与淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)的相互作用的抗体，和/或特异性结合至FGL1的抗体，其中所述癌症优选为表达FGL1的癌症。此外，本发明涉及用于在癌症患者中评估对用免疫检查点抑制性抗体的治疗的敏感性或预测对其的反应性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样本中的FGL1表达。本发明还涉及用于选择将从免疫检查点抑制性抗体中受益的癌症患者的试剂盒。所述免疫检查点抑制性抗体可以是针对人FGL1的抗体或针对人LAG3的抗体，所述抗体任选地与其他免疫检查点抑制性抗体诸如抗PD1抗体或抗PD-L1抗体组合。

背景技术

对于平衡共刺激性受体活性和限制T细胞激活，从而预防自身免疫、自身炎症和组织损害而言，抑制性受体(IR)的表达上调至关重要。然而，肿瘤可以劫持这些所谓的免疫检查点机制，以防御CD4+和CD8+ T细胞引发的抗肿瘤免疫应答。最近的癌症免疫治疗方法旨在通过靶向抑制性受体来扭转这种消耗，以克服免疫耐受，从而允许重新激活针对肿瘤的细胞毒性T细胞应答。

许多免疫调节剂，主要是靶向诸如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)或程序性死亡因子1(PD-1)及其配体(PD-L1)等免疫系统检查点的抗体，已获得监管批准用于治疗多种癌症，所述癌症包括恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、和复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。然而，大部分用检查点抑制剂治疗的患者受益很小或没有受益，而且这些治疗费用高昂并且可能具有一些相关的毒性。因此，需要其他检查点抑制剂，需要检查点抑制剂的新组合，和/或需要用于预测对癌症疗法中的免疫检查点抑制性抗体的治疗反应的生物标志物，以优化患者选择。

另一个免疫检查点受体是淋巴细胞激活基因3(LAG3，CD223)。控制免疫系统的过度激活和防止自身免疫需要LAG3上调。由于其对T细胞的负调节作用，它是一种潜在的癌症免疫治疗靶标。LAG3是一种细胞表面T细胞抑制蛋白，并且被认为通过与主要组织相容性复合物II类(MHC-II)相互作用而起作用。现在有几种调节LAG3的免疫治疗剂处于临床和临床前开发的各个阶段，诸如LAG3-Fc融合蛋白IMP321和抗LAG3抗体BMS-986016。现有的抗LAG3疗法靶向与其唯一已知的配体II类MHC的相互作用。然而，在各种实验设置中，与MHC-II的相互作用似乎并非LAG3诱导的抑制功能所需，因此允许关于另外的潜在功能性LAG3配体进行推测。

发明内容

发明人将肝富集的具有肝细胞促有丝分裂活性和代谢功能的可溶性蛋白纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)鉴定为对癌症免疫疗法具有重要意义的LAG3结合伴侣。鉴于FGL1在抗PD1/PD-L1疗法的原发性抗性患者中的高表达，FGL1/LAG3途径可能是另一潜在的免疫逃逸机制。因此，FGL1及其与LAG3的相互作用是治疗剂的潜在靶标，并且FGL1的表达是用于预测对用免疫检查点抑制剂药剂(诸如抑制FGL1与LAG3之间的相互作用的抗体)的治疗的反应的有希望的预后生物标志物。由于FGL1/LAG3检查点抑制似乎至少补充了PD-1/PD-L1检查点抑制，因此FGL1也可以是用于其他免疫检查点抑制性抗体(诸如抗PD-1或抗PD-L1抗体)的阴性预后标志物。

在一方面，提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的特异性抑制纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)与淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)的相互作用的免疫检查点抑制性抗体。还提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的特异性结合至人FGL1的抗体。在特定实施方案中，癌症患者具有增加的FGL1表达，优选地，已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。更具体地，已确定来自所述患者的样本具有增加的FGL1表达，优选地，已确定来自所述患者的样本与对照相比具有增加的FGL1表达。所述方法可以包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达，并且向所述患者给予有效量的抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体。在一实施方案中，所述方法包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达是否增加，并且如果FGL1表达增加，向所述患者给予有效量的抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体。

还提供了一种特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体(由于其与免疫检查点途径相互作用，因此被认为是一种“免疫检查点抑制性抗体”)，其用于在人类患者中治疗癌症使用。进一步提供了特异性结合至人FGL1的抗体，其用于在人类患者中治疗癌症中使用。在特定实施方案中，癌症患者具有增加的FGL1表达，优选地，已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。更具体地，已确定来自所述患者的样本具有增加的FGL1表达，优选地，已确定从所述患者获得的样本与对照相比具有增加的FGL1表达。优选地，已经在体外确定来自所述患者的样本中具有增加的FGL1表达。供使用的抗体可以包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达，之后向患者给予抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体。在一实施方案中，所述使用包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达是否增加，并且如果FGL1表达增加，向所述患者给予抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体。

本发明进一步涉及在人类患者中治疗癌症的方法或供使用的抗体，其包括a)提供来自所述患者的样本，b)测量所述样本中的FGL1表达水平，c)将FGL1表达与对照进行比较，d)当已将FGL1表达水平测量为与所述对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗有反应，并且e)向所述患者给予有效量的所述抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述抗体。

本发明进一步涉及一种为癌症患者选择疗法的方法，所述疗法包括抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体，所述方法包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达水平，并且在FGL1表达水平增加时为所述患者选择所述疗法。

优选地，根据本发明的方法或供使用的抗体的FGL1表达与对照相比是增加的。所述对照可以是来自至少一位没有癌症的受试者或非癌性组织样本的基线表达的参考值或参考样本，其中所述非癌性组织样本优选源自与癌症相同的器官，并且更优选源自癌症患者。如在根据本发明的方法或用途中使用的来自患者的样本优选是肿瘤样本和/或血液样本。

在本发明的方法或疗法中使用的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体可以是抗FGL1抗体、抗LAG3抗体或其组合。特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述免疫检查点抑制性抗体可以单独使用，或者与选自抗PD-1抗体、抗PD-L1(抗B7-H1)抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体和抗OX40抗体中的至少一种另外的免疫检查点抑制性抗体组合使用。在特定实施方案中，所述至少一种另外的免疫检查点抑制性抗体是抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。在特定实施方案中，患者可以对至少一种免疫检查点抑制性抗体具有原发性或获得性抗性，所述至少一种免疫检查点抑制性抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体和抗OX40抗体。更具体地，所述患者可以对PD-1/PD-L1检查点抑制具有原发性或获得性抗性。

如上所述的癌症可以是但不限于脑癌、结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌或肺癌。优选地，所述癌症是肺癌或前列腺癌。更优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。所述治疗可以进一步伴有化学疗法或放射疗法。

在另一方面，提供了一种在人类癌症患者中检测增加的FGL1表达的方法，所述方法包括提供来自所述患者的样本；并且检测所述样本中的FGL1表达，其中优选地将在样本中检测到的FGL1表达与对照进行比较。所述方法可以任选地进一步包括：当已确定FGL1表达与对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体的治疗敏感。

本文还提供了一种在癌症患者中评估对用抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)任选地提供来自所述患者的样本，b)检测样本中的FGL1表达，c)将在步骤(b)中确定的FGL1表达与对照进行比较，其中样本中的FGL1表达与对照相比增加；并且任选地进一步包括：当已确定FGL1表达与对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗敏感。

还提供了一种对患者的肿瘤进行分类的方法，所述方法包括：(a)任选地提供来自所述患者的样本，(b)检测样本中的FGL1表达，并且(c)将所述肿瘤鉴定为用抗FGL1抗体或免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗的候选者。任选地，所述方法进一步包括将在步骤(b)中确定的FGL1表达与对照进行比较的步骤，其中样本中与对照相比增加的FGL1表达将肿瘤鉴定为用抗FGL1抗体或免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗的候选者。

还提供了一种预测人类癌症患者的反应性的方法，所述方法包括：(a)任选地提供来自所述患者的样本，(b)确定所述样本中的FGL1表达水平，(c)将FGL1表达与对照进行比较，并且(d)当将FGL1表达水平测量为与对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗有反应，或者当将FGL1表达测量为与对照相比没有增加时，将所述患者鉴定为不太可能有反应。

还提供了一种预测人类癌症患者的反应性的方法，所述方法包括：(a)任选地提供来自用或先前用至少一种免疫检查点抑制性抗体治疗的患者的样本，(b)确定所述样本中的FGL1表达水平，(c)将FGL1表达与对照进行比较，并且(d)当已确定FGL1表达水平与对照相比增加时，将所述患者鉴定为不太可能对用所述至少一种免疫检查点抑制性抗体的治疗有反应。

根据本发明的检测增加的FGL1表达的方法、评估敏感性的方法、分类的方法和预测反应性的方法通常并且优选地是体外方法。在特定实施方案中，提供样本的患者可以对至少一种检查点抑制性抗体具有原发性或获得性抗性，所述至少一种检查点抑制性抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体和抗OX40抗体。更具体地，所述患者可以对PD-1/PD-L1检查点抑制具有原发性或获得性抗性。这些方法可以进一步包括或随后进行向所述癌症患者给予抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的步骤。在任何一种所述方法中使用的样本优选是肿瘤或血液样本。可以通过以下方式在样本中检测FGL1表达：(a)使样本与抗FGL1抗体接触并检测FGL1(FGL1蛋白)和抗体之间的结合，或(b)检测样本中编码FGL1的mRNA的量。在特定实施方案中，所述对照是来自至少一位没有癌症的受试者或非癌性组织样本的基线表达的参考值或参考样本，其中所述非癌性组织样本优选源自与癌症相同的器官，并且更优选源自癌症患者。在特定实施方案中，抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述免疫检查点抑制性抗体是抗LAG3抗体或抗FGL1抗体。

还提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体，其中所述癌症患者具有使用本文所述的任何一种诊断方法确定的增加的FGL1表达。

在又一方面，提供了一种用于选择将从免疫检查点抑制性抗体、优选地抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体中受益的癌症患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于定量检测来自癌症患者的样本中的FGL1表达的手段，和对照。所述对照可以选自：(a)用于检测增强的FGL1表达的参考样本，(b)用于检测基线FGL1表达的参考样本，(c)包含FGL1表达的预定参考水平的说明，所述预定参考水平已与对免疫检查点抑制性抗体、优选地抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的敏感性相关联，(d)包含FGL1表达的预定参考水平的说明，所述预定参考水平已与对免疫检查点抑制性抗体、优选地抗FGL1抗体或特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体不敏感相关联，和/或(a)、(b)、(c)或(d)的组合。在一实施方案中，用于定量检测来自癌症患者的样本中的FGL1表达的所述手段是(a)对FGL1具有特异性的抗体，(b)对FGL1具有特异性的引物对和任选地杂交至扩增的产物的探针，和/或(c)杂交至FGL1序列的探针。

在又一方面，提供了一种筛选免疫检查点抑制性抗体的方法，所述方法包括

(a)提供FGL1蛋白，所述FGL1蛋白优选至少包含人FGL1的纤维蛋白原结构域；

(b)提供LAG3蛋白，所述LAG3蛋白优选至少包含人LAG3的结构域1和2；

(c)在存在待筛选抗体的情况下使所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白接触；

(d)确定所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合；并且

(e)如果与在不存在所述待筛选抗体的情况下所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合相比，所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合减少，将所述待筛选抗体鉴定为特异性抑制所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的相互作用的免疫检查点抑制性抗体。优选地，所述抗体是人或人源化抗体。

在又一方面，提供了一种筛选抑制(人)FGL1与(人)LAG3的结合的小分子的方法，所述方法包括

(a)提供FGL1蛋白，所述FGL1蛋白优选至少包含人FGL1的纤维蛋白原结构域；

(b)提供LAG3蛋白，所述LAG3蛋白优选至少包含人LAG3的结构域1和2；

(c)例如在高通量筛选的格式中，在存在例如来自化合物文库的小分子的情况下，使所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白接触，

(d)在存在和不存在所述小分子的情况下确定所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合；并且

(e)将特异性抑制所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的相互作用的小分子鉴定为FGL1-LAG3检查点抑制剂分子，其适合于开发用于治疗如上所提及的癌症疾病的药物。

本发明也应涵盖通过如上所阐述的方法被鉴定为(人)FGL1与(人)LAG3的结合的抑制剂的小分子，并且所述小分子因此可以用作药物，或者可以被开发为药物，所述药物作用于这种免疫检查点途径，并且因此可以用于如上文所提及的癌症疾病的(免疫)疗法中。

附图说明

图1.将FGL1鉴定为新型LAG3结合伴侣

(a)在以下步骤中进行基因组规模受体阵列筛选的示意图：(1)收集编码质膜基因和可溶性基因的cDNA文库。将选定的可溶性基因与人工跨膜结构域融合，以促进膜表达和阵列检测。(2)在1536孔板中基于机器人制备受体阵列。(3)通过基于超高速轨道摇床的程序反向转染受体阵列中的基因文库。使用293T.2A(一种过表达几种免疫相关衔接子的工程化293T细胞系)进行该测定。(4)对LAG3-Ig进行受体阵列筛选，收集并分析阵列结果。人Fc受体在每个板内用作筛选的融合蛋白的内部阳性对照。(b)FGL1-Ig与小鼠LAG3稳定感染的293T.2A(1)或模拟细胞(2)的结合的代表性流式细胞术点图。示出了对照Ig与小鼠LAG3表达细胞的结合(3)。所有样本均用抗LAG3染色。(c)小鼠FGL1与固定的小鼠LAG3融合蛋白的结合的代表性Octet传感图。(d-e)FGL1与LAG3之间的相互作用。293T.2A细胞用全长人或小鼠FGL1-TM(FIBCD1(1-57)融合至FGL1(23-312))(d)或LAG3(e)转染，如y轴所示。如x轴所示，将融合蛋白添加至培养物中，以通过细胞检测系统(CDS)评价与转染子的结合。显示了通过CDS分析软件捕获的各个孔的屏幕截图。(f)人FGL1-LAG3相互作用的Octet分析。如图所示，Octet蛋白A传感器加载人LAG3-Fc，然后测试与人FLAG-FGL1的结合动力学。通过Octet软件使用1:1的结合比计算Kd值。(g)通过FACS测试，在存在对照抗体(对照)或抗LAG3(C9B7W)的情况下，FGL1-Ig与小鼠LAG3转染的293T.2A细胞的结合。对照Fc融合蛋白结合用作阴性对照(阴影线)。

图2.FGL1-LAG3相互作用的表征

(a)通过细胞检测系统测量小鼠FGL1-Ig、具有卷曲螺旋结构域(CCD)的FGL1-Ig或具有纤维蛋白原结构域(FD)的FGL1-Ig与小鼠LAG3转染的293T.2A细胞的结合。(b)FGL1-Ig与用全长小鼠LAG3或具有不同细胞外结构域缺失的LAG3转染的293T.2A细胞的结合。LAG3全长蛋白由4个细胞外Ig结构域(D1至D4)、跨膜结构域(TM)和细胞内结构域(IC)组成。结合强度表示为“+++”(强)、“++”(中)、“+”(弱)和“-”(无结合)。(c)用全长小鼠LAG3转染293T.2A细胞。如图所示，将具有不同结构域缺失的FGL1-Ig或对照Fc融合蛋白添加到培养物中，并通过CDS测量其与转染子的结合。(d)通过CDS软件对FGL1与如(c)中的LAG3结构域缺失/突变形式的结合进行定量。

图3.FGL1显示了对T细胞的LAG3依赖性抑制性活性

(a)在存在可溶性FGL1-Ig或对照-Ig(5ug/ml)的情况下，通过次优浓度的固定的抗CD3抗体将来自WT或LAG3-KO小鼠的脾T细胞激活3天，之后添加³H-dTR。16小时后分析增殖的T细胞的胸苷掺入。(b)在存在HEL肽和不同浓度的重组FGL1(0、5、50ng/ml)的情况下，在CellGro无血清培养基中共培养3A9-LAG3小鼠T细胞杂交瘤细胞与LK35.2 B细胞系。显示在24小时时对上清液中IL-2水平的抑制的归一化的百分比(无FGL1作为0％抑制)。(c)通过CDS，在存在抗FGL1、抗LAG3或对照抗体的情况下，在变化的抗体:FGL1比率下，对小鼠FLAG-FGL1(100ng/ml)与小鼠LAG3转染的293T.2A细胞的结合进行定量。(d)在存在HEL肽和重组FGL1(50ng/ml)、抗FGL1和抗LAG3抗体(1ug/ml)的情况下，将3A9-LAG3小鼠T细胞杂交瘤细胞与如(c)中的LK35.2 B细胞系共培养。显示24小时时上清液中的IL-2水平。*，p<0.05；**，p<0.01；NS，无意义。

图4.抗FGL1加强了体内抗原特异性T细胞应答

(a)实验设计的示意图。将来自OT-1/Rag2KO小鼠的2x10e6个脾细胞静脉内转移到C57/BL6小鼠中，随后在一天后用卵清蛋白肽(ova peptide)进行处理(每只小鼠500ug)。在第1天和第2天进行对照、抗FGL1或抗LAG3抗体的注射。(b)在第4天通过CBA测量血浆细胞因子水平。*，p<0.05；NS，无意义。

图5.FGL1-KO小鼠赋予促炎表型

(a-b)不同小鼠组织和免疫细胞子集中的FGL1表达值，如在BioGPS微阵列数据库中所示。

图6.FGL1-KO小鼠血液中增强的免疫应答

(a)指示来自WT和FGL1 KO小鼠外周血的CD45区室的免疫谱系的频率。(b)WT(实心)和FGL1 KO(条纹的)小鼠外周血中所示免疫子集的定量。*，p<0.05。

图7.FGL1缺乏或阻断延缓肿瘤生长

(a-b)在第0天用MC38肿瘤细胞接种FGL1-KO、LAG3-KO或WT同窝仔(WT)(每只小鼠0.5x10e6个)。在肿瘤接种后监测这些小鼠在指定天数的平均肿瘤直径(a)和存活(b)。(c-f)在第0天用MC38肿瘤细胞接种C57/BL6小鼠(每只小鼠0.5x10e6个)，并从第6天到第18天每四天用抗FGL1、抗LAG3或对照mAb进行处理。描绘了肿瘤反应(c)和每mg肿瘤的CD45(左图)、CD8(中图)和CD4(右图)细胞的绝对数量(d)。而且，条形图(e)显示了来自FGL-1 KO和抗FGL1处理的小鼠的肿瘤中CD8 TIL的功能表型。(f)用MC38肿瘤细胞接种WT或FGL1-KO小鼠，并如(c)中用抗LAG3或对照抗体进行处理。显示了这些小鼠的平均肿瘤直径。(g)用MC38肿瘤细胞接种LAG3-KO小鼠，并如(c)中用抗FGL1或对照抗体进行处理。显示了这些小鼠的平均肿瘤直径。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.005；****，p<0.001；NS，无意义。

图8.FGL1表达在实体癌中得到上调

(a)不同人体组织中的FGL1表达值，如BioGPS微阵列数据库(mRNA)所示。(b)基于Oncomine数据库，通过R程序分析主要实体癌中，与相应的正常组织相比，癌灶中FGL1基因上调或下调(P值<0.05，倍数变化>3或<0.3作为截止值)的研究的频率。(c)通过使用TCGA癌症数据库分析与相应的正常组织(右手侧)相比，肺腺癌和其他实体癌(左手侧)的FGL1表达值(mRNA)。

图9.FGL1在人类癌症中上调并具有预后价值

(a)如在针对FGL1、DAPI核和细胞角蛋白染色的YTMA250 NSCLC癌组织阵列中通过定量免疫荧光(QIF)染色所示的FGL1表达分布。使用来自正常肺组织的中位表达值作为FGL1上调的截止值。(b)在YTMA250肺癌中通过定量免疫荧光定量的肿瘤FGL1表达与总体患者存活的关联。(c)通过ELISA测试NSCLC癌症患者和健康供体的西班牙群组中的血浆FGL1水平。(d-e)在抗PD1疗法后，对高FGL1或低FGL1的NSCLC(d)或黑色素瘤(e)患者的存活分析。

图10.FGL1靶向与抗PD疗法的协同效应

(a)在第0天用MC38肿瘤细胞接种C57/BL6小鼠(每只小鼠0.5x10e6个)，随后从第6天到第18天每四天用抗FGL1、抗LAG3或对照抗体进行处理。在一些组中，还在第6天用一次单剂量的抗B7-H1(10B5)对小鼠进行处理。显示了这些组中小鼠的存活。*，p<0.05；**，p<0.01。(b)在第0天用MC38肿瘤细胞接种C57/BL6小鼠(每只小鼠0.5x10e⁶个)，随后从第6天到第18天每四天用抗FGL1、抗LAG3或对照抗体进行处理。在一些组中，还在第6天用一次单剂量的抗B7-H1(10B5)对小鼠进行处理。显示了在第22天所示小鼠组中的平均肿瘤直径。

具体实施方式

一般实施方案“包含(comprising)”或“包含(comprised)”涵盖更具体的实施方案“由……组成”。此外，单数和复数形式不以限制性方式使用。如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”既表示单数也表示复数，除非明确指出仅表示单数。

如本文所用，术语“蛋白质”可与“氨基酸残基序列”或“多肽”互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、糖化或蛋白质加工。可以在多肽的结构中进行修饰和改变，例如融合至其他蛋白，氨基酸序列取代、缺失或插入，同时分子保持其生物学功能活性。例如，可以在多肽或其基础的核酸编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且可以获得具有相同特性的蛋白质。术语“多肽”通常是指具有多于10个氨基酸的序列，并且术语“肽”意指具有最多10个氨基酸的长度的序列。然而，这些术语可以互换使用。

如本文所用，术语“基因”是指可遗传的基因组序列的DNA基因座，其通过被表达为功能产物或通过调节基因表达来影响生物体的性状。基因和多核苷酸可包含内含子和外显子，如在基因组序列中，或仅包含编码序列，如在cDNA中，如开放阅读框(ORF)，其包含起始密码子(甲硫氨酸密码子)和翻译终止密码子。基因和多核苷酸还可以包含调节其表达的区域，诸如转录起始、翻译和转录终止。因此，还包含诸如启动子等调节元件。

术语“增强的”、“增加的”和“增加升高的”在本文可互换使用，并且是指与对照相比至少约10％，例如升高至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％、或至少约200％、或至少约300％，或者与对照相比在10-300％之间的任何整数减少。如本文所用，“对照”是来自至少一位没有癌症的受试者或非癌性组织样本的基线表达的参考值或参考样本，其中所述非癌性组织样本优选源自与癌症相同的器官，并且更优选源自癌症患者。

用于建立标志物如FGL1的截止值和用于测量从待分析的个体或患者获得的样本中的FGL1水平的方法和样本类型彼此匹配或相同。可以在对照组中获得截止值，即如下值：高于所述值则确认为增加的表达或过表达(例如与对照相比增加的FGL1表达)。选择截止值所基于的对照组以匹配所研究的个体/患者组。

“载体”是可用于将异源多核苷酸引入细胞中的核酸。一种类型的载体是“质粒”，它是指可以将另外的核酸区段连结在其中的线性或环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可以将另外的DNA或RNA区段引入到病毒基因组中。

术语“编码(encodes)”和“编码(codes for)”广义上是指借此使用聚合物大分子中的信息引导产生与第一分子不同的第二分子的任何过程。在其他方面，DNA分子可以编码RNA分子(例如通过使用DNA依赖性RNA聚合酶的转录过程)。而且，如在翻译过程中，RNA分子可以编码多肽。当用于描述翻译过程时，术语“编码”还扩展到编码氨基酸的三联密码子。在一些方面，RNA分子可以编码DNA分子，例如通过掺入RNA依赖性DNA聚合酶的逆转录过程。在另一方面，DNA分子可以编码多肽，其中应当理解，在这种情况下使用的“编码”掺入了转录和翻译两个过程。

术语“等位基因”是指基因、遗传靶区域或一般在单个基因座(即染色体位置)处的DNA序列的不同形式中的任何一种。这包含编码序列、非编码序列和调节序列。基因组内的不同等位基因在核苷酸序列上不一定相同。

术语“抗体”是指由一种或多种多肽组成的蛋白质，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。术语“抗体”在本文中以其最广义使用，并且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。术语“抗体”也涵盖抗体片段，如例如Fv、Fab、Fab'、F(ab)2或抗体的其他抗原结合子序列，即原始或“全长”抗体的抗原结合片段。术语“抗体”还涵盖工程化分子，如纳米抗体(R)，即源自骆驼科抗体的人源化VHH结构域，以及“结构域抗体”或“单结构域抗体”，即可以通过一个单一免疫球蛋白结构域(而不是通过两个成对的VH/VL结构域)结合其抗原的免疫球蛋白。术语“抗体”进一步涵盖抗体缀合物。经典4链全长“抗体”或“免疫球蛋白”一般是约150kDa的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链构成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链具有氨基端可变结构域(VH)和随后的三个羧基端恒定结构域(CH)。每条轻链具有N端可变结构域(VL)和单个C端恒定结构域(CL)。术语“抗体”进一步是指一类抗体，其包括多种具有相同特异性(可变结构域)并具有相同恒定结构域的单独抗体。

术语“免疫检查点抑制性抗体”是指结合至抑制性受体(IR)或更广泛地干扰抑制性受体与其配体之间的相互作用的如上定义的抗体，其中抑制性受体对平衡共刺激受体活性和限制T细胞激活而言至关重要。因此，这种抗体靶向免疫系统检查点，诸如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性死亡因子1(PD-1)或其配体(PD-L1)。适合在本发明中使用的免疫检查点抑制性抗体的例子是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体或抗LAG3抗体，但不限于此。此外，抗FGL1抗体可以被视为免疫检查点抑制剂。在大多数情况下，免疫检查点抑制性抗体是拮抗性或阻断性抗体，即，选自以下的阻断性抗体：抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗LAG3抗体、抗VISTA抗体、和抗BTLA抗体。然而，免疫检查点抑制性抗体也可以是激动性抗体，诸如抗GITR或抗OX40抗体。关于抗LAG3抗体，该抗体可以是选择性抑制LAG3与MHC II类分子的相互作用的抗体、或选择性抑制LAG3与FGL1的相互作用的抗体、或抑制LAG3与FGL1和MHC II类分子的相互作用的抗体。优选地，免疫检查点抑制性抗体是IgG抗体，更优选地是人或人源化IgG抗体，甚至更优选地是人或人源化IgG1或IgG4抗体。

“融合蛋白”定义为含有两个或更多个最初分开的天然的或经修饰的异源蛋白的完整序列或序列的任何部分的蛋白质，或者两个或更多个最初分开的天然的或经修饰的异源蛋白的完整序列或序列的任何部分的组合物。融合蛋白可以通过基因工程化方法通过融合两个或更多个基因或其部分来构建，所述基因或其部分最初编码两个或更多个最初分开的天然或异源蛋白或其部分。这产生了具有源自每个原始蛋白的功能特性的融合蛋白。融合蛋白包括但不限于Fc融合蛋白。如本文所用，融合蛋白也可以是Flag融合蛋白。融合蛋白如FGL1融合蛋白或LAG3融合蛋白也可以代替或与免疫抑制性抗体一起根据本发明用于治疗方法中或用于治疗癌症。优选地，融合蛋白是FGL1-Fc(FGL1-Ig)或LAG3-Fc(LAG3-Ig)蛋白。

术语“细胞因子”是指小蛋白，其由细胞释放并充当细胞间介体，例如影响分泌细胞周围的细胞的行为。细胞因子可由免疫细胞如T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞或其他细胞分泌。细胞因子可参与细胞间信号转导事件，诸如自分泌信号转导、旁分泌信号转导和内分泌信号转导。它们可以介导一系列生物学过程，所述生物学过程包括但不限于免疫、炎症和造血作用。细胞因子可以是趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。

如本文所用，术语“表达(expression)”或“表达(expressing)”是指宿主细胞内核酸序列的转录和/或翻译。癌症或癌症患者中目标基因产物的表达水平可以基于存在于所提供的样本中的对应mRNA的量、或由选定的基因特别是由编码FGL1的基因编码的蛋白的量来确定。例如，可以通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA的原位杂交或通过PCR(诸如qPCR)对从诸如FGL1基因等基因转录的RNA进行定量。由诸如FGL1基因等基因编码的蛋白质可以通过多种方法进行定量，例如通过ELISA、通过蛋白质印迹、通过放射免疫测定、通过免疫沉淀、通过免疫组织化学、通过测试蛋白质的生物学活性、通过蛋白的免疫染色和随后的FACS分析、或通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定。

如本文所用，术语“癌症患者具有增加的FGL1表达”是指如下患者：其患有表达FGL1的癌症，特别是具有增加的FGL1表达的癌症，更特别是与对照相比具有增加的FGL1表达的癌症。可以在癌症样本中，诸如在癌性组织的活检中，检测或确定FGL1表达。然而，也可以在癌症患者的血液样本，诸如血浆或血清样本中，检测或确定FGL1表达。FGL1可以以结合的和/或游离的(可溶的)的形式存在。因此，术语“癌症患者具有增加的FGL1表达”涵盖，所述患者患有具有增加的FGL1表达的癌症和/或所述患者的血液中具有增加的FGL1水平。因此，在一实施方案中，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，特别是与对照相比，所述对照如所述患者的相同组织的非癌性参考样本，或在至少一位参考受试者的相同组织的参考样本中，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的相同组织的参考样本，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。增强的表达可以检测为组织样本中升高的信号或升高的对FGL1呈阳性的细胞的百分比(肿瘤比例得分(TPS))。在另一实施方案中或除了先前的实施方案之外，患者在血液中如在血清和/或血浆中具有增加的FGL1表达，特别是增加的FGL1水平，更特别是增加的FGL1蛋白水平。优选地，FGL1表达与对照相比是增加的，所述对照如在非癌性参考血液样本中，如至少一位参考受试者的血清或血浆样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的参考血液样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。优选地，参考受试者没有进一步的肝损伤。在一实施方案中，患者患有表达FGL1的癌症，其中所述癌症不是肝癌。优选地，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌，更特别地是与对照相比具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌。

术语“基因产物”是指RNA多核苷酸和由基因或DNA多核苷酸编码的多肽。

如本文所用，术语“样本”是指组织样本或诸如血液样本等体液样本。组织样本是身体器官或组织的切片，它通常包括几种细胞类型，任选地具有将细胞保持在一起的细胞骨架结构。组织样本可以通过活检获得，所述活检例如包括切割、切片或穿孔。它涉及提取样本细胞或组织以进行检查。然而，术语“提供样本”、“来自患者的样本”或“从患者获得的样本”不包括提取组织或血液的有效步骤，而是指提供已经提取的样本，即提供来自患者的离体样本。此外，组织样本可以是肿瘤样本或相应对照样本，所述对照样本优选来自相同的组织。优选地，组织样本是作为福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的样本使用的。血液样本可以是血清或血浆样本，并且优选是血浆样本。然而，血液样本也可以包含细胞部分，例如用于全血细胞计数和血细胞检查，如外周血涂片。除血液外，其他体液样本包括粘液、精液、唾液、痰、支气管灌洗液、母乳、胆汁和尿液，但不限于此。样本还可以是骨髓活检或抽吸物或脑脊髓液。样本可以例如(但不限于此)通过以下方式来分析：细胞化学(诸如与在不同种类的细胞中或细胞上发现的某些物质反应的化学染色剂(染料))、流式细胞术和免疫组织化学(IHC)，诸如通过使用抗体染色、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)或ELISA。如本文所用，术语“从患者获得的样本”是指离体(即收集后)的样本，并且与“提供来自患者的样本”或“提供来自患者的离体样本”同义。

如本文所用，术语“检测FGL1表达”、“确定FGL1表达”是指通过本领域技术人员已知的任何手段或方法测量FGL1表达水平，其中可以在蛋白质或mRNA水平上确定FGL1表达。优选地，测量FGL1表达的手段或方法能够定量检测或确定FGL1表达，优选人FGL1表达。定量检测或确定FGL1表达包括检测或确定相对量或绝对量。适合于定量检测和确定FGL1表达的方法包括使样本与抗FGL1抗体接触，并诸如通过ELISA或通过IHC检测FGL1与抗体之间的结合，或诸如通过PCR检测样本中编码FGL1蛋白的mRNA的量。在一具体实施方案中，检测或确定FGL1表达或增加的FGL1表达涉及向患者给予抗FGL1抗体，并且进行体内成像，特别是如果所述抗体被标记，诸如通过放射、荧光或其他方式标记的情况。

缩写为FGL1的术语“纤维蛋白原样蛋白1”(同义词LFIRE-1、HFREPI、肝活素(Hepassocin)、HP-041)是指纤维蛋白原蛋白家族的蛋白质，它还包括纤维蛋白原样蛋白2和凝血因子V、VIII和XIII。然而，除非另有说明，否则术语“FGL1表达”涉及人体中的蛋白质和mRNA表达二者。FGL1由FGL1基因编码。FGL-1在其C端部分含有纤维蛋白原相关的结构域，其含有纤维蛋白原家族所有成员共有的四个保守半胱氨酸。然而，FGL-1缺乏血小板结合位点、交联区和凝血酶敏感位点，这些位点允许纤维蛋白原家族的其他成员协助纤维蛋白凝块的形成。FGL1在再生肝中上调，并在凝块形成后与纤维蛋白基质充分缔合。尽管大多数FGL1在血浆中被发现，但血液凝结后大约20％的FGL1保留在血清中。人FGL1前体具有如NCBI参考序列数据库以ID号NP_004458.3提供的氨基酸序列，其中氨基酸1至22对应于信号肽，并且氨基酸23至312对应于成熟蛋白。纤维蛋白原的C端球状结构域对应于氨基酸78至304。

如本文所用，缩写为LAG3的术语“淋巴细胞激活基因3蛋白”是指参与T细胞激活、增殖和内稳态的调节的抑制性分子。它也被称为CD223。LAG3是充当免疫检查点受体的CD4相关的激活诱导的细胞表面分子。LAG3在激活的T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)上表达。所述蛋白质以与CTLA-4和PD-1类似的方式对增殖、激活和内稳态进行负调节。据报道，其在Treg抑制功能中起作用，并有助于将CD8+ T细胞维持在致耐受性状态。LAG3在结构上与CD4相关，并以高亲和力结合至MHC II类分子。保守的“KIEELE”基序内的单个赖氨酸残基(K468)对于与下游信号转导分子的相互作用而言至关重要。它具有四个细胞外Ig样结构域，且在D1与D3结构域之间以及D2与D4结构域之间具有保守的结构基序。第一个结构域是Ig样V型结构域，并且接下来的三个结构域是Ig样C2型结构域。人LAG3与鼠LAG3具有约70％的同源性。LAG3的独特区别特征是D1结构域的C和C'β链之间的富含脯氨酸的30个aa的环。尽管人和鼠LAG-3二者都具有该环，但它们的同源性在该区域中最低。人LAG3具有由NCBI GenBank数据库以ID号AAH52589提供的氨基酸序列。

术语“特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体”是指结合至人FGL1或人LAG3从而阻断FGL1与LAG3的结合的如上所定义的抗体。抗体的这种阻断或拮抗活性可以是由于与FGL1对LAG3的或可替代地LAG3对FGL1的结合口袋(或结合界面)结合所致，或者由于与FGL1与LAG3的结合的任何其他空间相互作用所致，但不限于此。关于抗LAG3抗体，该抗体可以是选择性抑制LAG3与FGL1的相互作用的拮抗性抗体、或抑制LAG3与FGL1和MHC II的相互作用的拮抗性抗体。优选地，特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体为IgG抗体，更优选为人或人源化IgG抗体，甚至更优选为人或人源化IgG1抗体。

如本文所用，术语“程序性死亡因子1(PD-1)”涉及限制对抗原的过度免疫应答并防止自身免疫的免疫检查点。PD-1可以在多种免疫细胞上表达，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、激活的单核细胞和树突状细胞(DC)。它在激活的T细胞而不是静息T细胞的表面上表达，并具有两个已知的配体PD-L1和PD-L2。PD-L1在激活的T细胞、DC、单核细胞和髓样细胞上表达，并且在造血系统之外，PD-L1在肺、血管内皮、肝非实质细胞、胎盘合体细胞滋养层和角质形成细胞中表达。许多靶向PD-1或PD-L1相互作用的药剂正在进行各个阶段的临床开发。纳武单抗和派姆单抗是人源化的PD-1阻断性抗体，它们已被美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲医药管理局(EMA)批准用于不可切除或晚期恶性黑色素瘤(MM)、在铂类化学疗法时或之后进展的非小细胞肺癌(NSCLC)、以及在铂类化学疗法时或之后进展的复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。纳武单抗进一步被批准用于治疗在先前疗法后进展的晚期肾细胞癌(RCC)和在自体造血干细胞移植(HSCT)后复发或进展的经典型霍奇金淋巴瘤。派姆单抗已被进一步批准用于具有50％或更高PD-L1表达(TPS≥50％)的患者的一线治疗。阿特珠单抗是完全人源化的PD-L1阻断性抗体，它已被FDA和EMA批准用于在先前含铂化学疗法后患有局部晚期或转移性尿路上皮癌(UC)的患者或被认为不适合顺铂的患者，以及用于在先前化学疗法后患有局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。其他抗PD-L1抗体是德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗。

免疫检查点抑制性抗体的用途

在本发明中，提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，和/或抗FGL1抗体(在后一种情况下，与是否可以观察到FGL1与LAG3的相互作用的直接抑制无关)。

还提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体，和/或抗FGL1抗体，其中所述癌症患者具有增加的FGL1表达，优选地其中已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。在具体实施方案中，已确定从患者获得的样本具有增加的FGL1表达。所述增加的FGL1表达与对照相比通常是增加的。所述方法可以包括确定从所述患者获得的样本中的FGL1表达，并且向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，或抗FGL1抗体。所述方法可以进一步包括确定从所述患者获得的样本中的FGL1表达是否增加，并且如果FGL1表达增加，向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，或有效量的抗FGL1抗体。

还提供了一种特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、或抗FGL1抗体，其用于在人类患者中治疗癌症使用。在特定实施方案中，癌症患者具有增加的FGL1表达，优选地，已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。在具体实施方案中，已确定来自患者的样本具有增加的FGL1表达。所述增加的FGL1表达与对照相比通常是增加的。优选地，已经在体外确定来自所述患者的样本中具有增加的FGL1表达。供使用的抗体可以包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达，之后要向患者给予特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，或抗FGL1抗体。供使用的抗体可以进一步包括确定来自患者的样本中的FGL1表达是否增加，并且如果FGL1表达增加，向所述患者给予特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，或抗FGL1抗体。

在另一方面，提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的结合至人FGL1的抗体。还提供了一种结合至人FGL1的抗体，其用于在人类患者中治疗癌症中使用。在特定实施方案中，癌症患者具有增加的FGL1表达，优选地，已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。在具体实施方案中，已确定来自患者的样本具有增加的FGL1表达。所述增加的FGL1表达与对照相比通常是增加的。优选地，FGL1抗体抑制FGL1与LAG3的相互作用。

所述方法或所述供使用的抗体可以进一步包括a)鉴定需要治疗癌症的患者，b)确定所述患者具有增加的FGL1表达，并且c)向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，或抗FGL1抗体。所述方法或供使用的抗体可以进一步包括确定来自患者的样本中FGL1表达增加。所述方法或供使用的抗体可以进一步包括提供来自患者的样本以确定FGL1表达。

本发明进一步涉及在人类患者中治疗癌症的方法或供使用的抗体，其包括a)任选地提供来自所述患者的样本，b)测量所述样本中的FGL1表达水平，c)将FGL1表达与对照进行比较，d)当已将FGL1表达水平测量为与所述对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体或用抗FGL1抗体的治疗有反应，并且e)向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述免疫检查点抑制性抗体，或所述抗FGL1抗体。

本发明进一步涉及一种为癌症患者选择疗法的方法，所述疗法包括特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、或抗FGL1抗体，所述方法包括测量从所述患者获得的样本中的FGL1表达水平，并在FGL1表达水平增加时为患者选择所述疗法。

优选地，根据本发明的方法或供使用的抗体的FGL1表达与对照相比是增加的。所述对照可以是来自至少一位没有癌症的受试者或非癌性组织样本的基线表达的参考值或参考样本，其中所述非癌性组织样本优选源自与癌症相同的器官，并且更优选源自癌症患者。如在根据本发明的方法或用途中使用的来自患者的样本优选是组织样本和/或血液样本，优选是肿瘤或血液样本。因此，在一实施方案中，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，特别是与对照相比，所述对照如所述患者的相同组织的非癌性参考样本，或在至少一位参考受试者的相同组织的参考样本中，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的相同组织的参考样本，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。可以将增强的表达检测为升高的信号或升高的对FGL1呈阳性的细胞的百分比(肿瘤比例得分(TPS))。在另一实施方案中或除先前的实施方案之外，患者在诸如血清或血浆等血液中具有增加的FGL1表达，特别是增加的FGL1水平，更特别是增加的FGL1蛋白水平。优选地，FGL1表达与对照相比是增加的，所述对照如在参考血液样本中，如至少一位参考受试者的血清或血浆样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的参考血液样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。优选地，参考受试者没有进一步的肝损伤。在一实施方案中，患者患有表达FGL1的癌症，其中所述癌症不是肝癌。优选地，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌，更特别地是与对照相比具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌。组织或肿瘤样本可以作为福尔马林固定、石蜡包埋的样本使用，以用于FGL1检测。

特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体可以是抗LAG3抗体、或抗FGL1抗体、或其组合。在一具体实施方案中，免疫检查点抑制性抗体是抗LAG3抗体，其中所述抗LAG3抗体抑制FGL1与LAG3的相互作用。在另一具体实施方案中，免疫检查点抑制性抗体是抗FGL1抗体。在又一实施方案中，免疫检查点抑制性抗体是抗LAG3抗体和抗FGL1抗体。优选地，抗LAG3和抗FGL1抗体抑制FGL1与LAG3的相互作用。在特定实施方案中，抗FGL1抗体用于在人类患者中治疗癌症。

在根据本发明的方法或治疗中使用的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、和/或抗FGL1抗体也可以另外与至少一种其他的免疫检查点抑制性抗体(所述术语仍包括其抗原结合片段)一起使用，其中所述其他的免疫检查点抑制性抗体可以是分别除了特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、或抗FGL1抗体以外的任何检查点抑制性抗体。优选地，所述至少一个其他的免疫检查点抑制性抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗BTLA抗体、抗VISTA抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体和抗LAG3抗体。特别地，其中所述抗LAG3抗体选择性地抑制LAG3与MHC II类分子的相互作用。更优选地，所述至少一种免疫检查点抑制性抗体是抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、或抗PD-L1抗体，并且甚至更优选地，所述至少一种免疫检查点抑制性抗体是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

免疫检查点抑制性抗体和所述至少一种其他的免疫检查点抑制性抗体可以全身地(例如口服、肠胃外、皮下、静脉内、直肠、肌肉内、腹膜内、鼻内、经皮、或通过吸入或腔内装置)、局部地、或通过施加至粘膜(诸如鼻、咽喉和支气管)给予至患者。优选地，所述免疫检查点抑制性抗体和所述至少一种其他的免疫检查点抑制性抗体通过静脉内或皮下给予。在使用多于一种免疫检查点抑制性抗体的情况下，每种免疫检查点抑制性抗体可以通过适合的给予路径(优选通过静脉内或皮下的方式)独立给予。所述免疫检查点抑制性抗体和所述至少一种其他的免疫检查点抑制性抗体可以同时给予或彼此单独给予。通常，它们以单独的配制品或剂型提供，所述配制品或剂型可以在给予前组合或单独给予。

在某些实施方案中，用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、或用抗FGL1抗体治疗的癌症包括但不限于实体瘤、血液癌(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤)和转移性病变。在一实施方案中，所述癌症是实体瘤。实体瘤的例子包括恶性肿瘤，例如肉瘤和癌，例如各个器官系统的腺癌，诸如影响肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠道(例如结肠)、肛门、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮、膀胱细胞、前列腺)、咽、CNS(例如脑、神经或神经胶质细胞)、头颈、皮肤(例如黑色素瘤)和胰腺的那些，以及包括恶性肿瘤的腺癌，诸如结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。优选地，所述癌症是脑癌、结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌或肺癌。更优选地，所述癌症是肺癌或前列腺癌，甚至更优选地，所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。所述治疗可以进一步伴有化学疗法或放射疗法。所述癌症可以是早期、中期、晚期或转移性癌症。在一具体实施方案中，所述癌症不是肝癌(liver cancer)，如肝癌(hepatocarcinoma)，其具有或没有病毒感染，例如慢性病毒性肝炎。

在一实施方案中，所述癌症选自肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)(例如具有鳞状和/或非鳞状组织学的NSCLC，或NSCLC腺癌))、黑色素瘤(例如晚期黑色素瘤)、肾癌(例如肾细胞癌)、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、前列腺癌、乳腺癌(例如不表达雌激素受体、孕酮受体或Her2/neu中的一种、两种或全部的乳腺癌，例如三阴性乳腺癌)、结直肠癌、胰腺癌、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、肛门癌、胃食管癌、甲状腺癌、宫颈癌、淋巴增生性疾病(例如移植后淋巴增生性疾病)、脑癌或血液癌、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、或白血病(例如髓性白血病或淋巴样白血病)。

在另一实施方案中，所述癌症选自癌(例如晚期或转移性癌)、黑色素瘤或肺癌(例如非小细胞肺癌)。在一实施方案中，所述癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌，优选是非小细胞肺癌。在一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。在一实施方案中，所述癌症是对其他疗法无反应的晚期或不可切除的黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是前列腺癌，例如晚期前列腺癌。在又一实施方案中，所述癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。在又一实施方案中，所述癌症是肾癌，例如肾细胞癌(RCC)(例如转移性RCC或透明细胞肾细胞癌(CCRCC))。

在某些实施方案中，待治疗癌症的患者可以对至少一种免疫检查点抑制性抗体具有原发性或获得性抗性，所述至少一种免疫检查点抑制性抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗BTLA抗体、抗VISTA抗体、抗GITR抗体和抗OX40抗体。在一些实施方案中，所述患者对PD-1/PD-L1检查点抑制具有原发性或获得性抗性。对检查点抑制剂具有原发性(先天)抗性的患者也可以被称为无反应者。然而，在一些情况下观察到晚期复发，这表明对治疗具有获得性(继发性)抗性。

优选地，癌症患者具有或被鉴定为具有增加的FGL1表达。在某些实施方案中，癌症患者患有或被鉴定为患有具有增加的FGL1表达的肿瘤。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括基于具有增加的FGL1表达或患有具有增加的FGL1表达的肿瘤，鉴定适合用免疫检查点抑制性抗体治疗的癌症患者。在一些实施方案中，癌症患者具有或被鉴定为具有高百分比的对FGL1呈阳性的癌细胞。

在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括基于以下情况鉴定癌症患者：具有增加的FGL1表达；或具有高百分比的FGL1阳性癌细胞；以及患有肺癌(例如鳞状细胞肺癌或肺腺癌)、头颈癌；鳞状细胞宫颈癌；胃癌；食道癌；甲状腺癌；黑色素瘤、脑癌、结直肠癌、前列腺癌和/或鼻咽癌(NPC)，优选脑癌、结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌或肺癌。本文公开的方法和抗体可用于治疗具有增加的FGL1表达并与上述癌症相关联的转移性病变。

还提供了一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体，和/或抗FGL1抗体，其中所述癌症患者具有根据本文所述的任一种诊断方法确定的增加的FGL1表达。

如果本发明的抗体是结合至FGL1、优选结合至人FGL1的抗体，则所述抗体可能或可能不直接抑制FGL1与(人)LAG3的结合。所述抗体可能或可能不与人LAG3竞争结合至FGL1。尽管尚不完全清楚这种非竞争性抗体借之发挥其免疫调节作用的分子机制，但这种抗体可能具有与抗FGL1抗体(与LAG3竞争结合至FGL1)相同的治疗效果。

在又一方面，提供了结合至人LAG3的抗体(抗LAG3)，其中所述抗体抑制人LAG3与人FGL1的相互作用。

优选地，根据本发明的抗FGL1抗体和/或抗LAG3抗体是人或人源化的抗体，更优选是人或人源化的IgG1或IgG4抗体。

诊断方法

本文提供了一种在人类癌症患者中检测增加的FGL1表达的方法，所述方法包括提供来自所述患者的样本；并检测样本中的FGL1表达，其中所述样本中的定量检测的FGL1表达优选地与对照相比，其中所述方法可以任选地进一步包括：当已将FGL1表达确定为与对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体的治疗、或用抗FGL1抗体的治疗敏感。

本文还提供了一种在癌症患者中评估对用免疫检查点抑制性抗体的治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)提供来自所述患者的样本，b)检测样本中的FGL1表达，c)将在步骤(b)中确定的FGL1表达与对照进行比较，其中样本中的FGL1表达与对照相比增加；并且任选地进一步包括：当已将FGL1表达确定为与对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体或用抗FGL1抗体的治疗敏感。

还提供了一种对患者的肿瘤进行分类的方法，所述方法包括(a)提供来自所述患者的样本，(b)检测样本中的FGL1表达，以及(c)将肿瘤鉴定为用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、或用抗FGL1抗体治疗的候选者，其中所述方法任选地进一步包括将(b)中确定的FGL1表达与对照进行比较的步骤，其中与对照相比，在所述样本中的增加的FGL1表达将肿瘤鉴定为这种治疗的候选者。同时，样本中的增加的FGL1表达水平也可以表明肿瘤已逃脱用另一种免疫检查点抑制抗体的治疗，所述另一种免疫检查点抑制抗体诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗BTLA抗体、抗VISTA抗体、抗GITR抗体和抗OX40抗体。在这种情况下，这种其他免疫检查点抑制性抗体与特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体一起、或与抗FGL1抗体一起的组合使用可克服对这种其他免疫检查点抑制性抗体的原发性或获得性抗性，并因此可以克服与增加的FGL1表达相关联的不良预后。

还提供了一种预测人类癌症患者的反应性的方法，所述方法包括：(a)提供来自所述患者的样本，(b)测量所述样本中的FGL1表达水平，(c)将FGL1表达与对照进行比较，并且(d)当已确定FGL1表达水平与对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体、或用抗FGL1抗体的治疗有反应，或者当已确定FGL1表达与对照相比没有增加时，将所述患者鉴定为不太可能有反应。

还提供了一种预测人类癌症患者的反应性的方法，所述方法包括：(a)提供来自用或先前用至少一种免疫检查点抑制性抗体治疗的患者的样本，(b)确定所述样本中的FGL1表达水平，(c)将FGL1表达与对照进行比较，并且(d)当已确定FGL1表达水平与对照相比增加时，将所述患者鉴定为不太可能对用所述至少一种免疫检查点抑制性抗体的治疗有反应。其中所述至少一种免疫检查点抑制性抗体是除了特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体以外和除了抗FGL1抗体以外的免疫检查点抑制性抗体，但优选选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体和抗OX40抗体。更优选地，所述抗体选自抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、和抗PD-L1抗体，更优选地，所述抗体是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。与增加的FGL1表达相关联的不良预后可以通过用根据本发明的特异性抑制FGL1与LAG 3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体或抗FGL1抗体的添加疗法来克服。

考虑到免疫检查点途径之间的各种相互作用，增强的或增加的FGL1表达也可以表明用任何免疫检查点抑制剂治疗这个患者可以在癌症疾病的治疗中实现治疗效果，所述免疫检查点抑制剂包括(拮抗性)抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体或抗VISTA抗体。因此，根据本发明的另一方面，提供了治疗方法、预测人类癌症患者的反应性的方法、评估肿瘤或癌症疾病的敏感性的方法、对患者的肿瘤进行分类的方法等，其中增强的或增加的FGL1表达被用作指标，指示这个患者、肿瘤或癌症疾病可以通过如上所提及的免疫检查点抑制剂来治疗，所述免疫检查点抑制剂如例如(拮抗性)抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗VISTA抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体或抗VISTA抗体。

根据本发明的检测增加的FGL1表达的方法、评估敏感性的方法、分类的方法和预测反应性的方法优选地是体外方法。另外，检测FGL1表达的步骤特别涉及优选在来自患者的样本中定量检测FGL1表达或FGL1表达水平。所述方法可以进一步包括或随后进行向所述癌症患者给予特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的免疫检查点抑制性抗体或抗FGL1抗体的步骤。样本优选是组织和/或体液样本，优选是组织和/或血液样本，更优选是肿瘤和/或血液样本。举例来说，可以通过以下方式在样本中定量检测FGL1表达：(a)使样本与抗FGL1抗体接触并检测FGL1(FGL1蛋白)与抗体之间的结合，或(b)检测样本中编码FGL1的mRNA的量。另外，可以确定FGL1拷贝数的增加。在一实施方案中，所述对照是来自至少一位没有癌症的参考受试者或非癌组织样本的基线表达的参考值或参考样本，其中所述非癌组织样本优选源自与癌症相同的器官，并且更优选源自癌症患者。

如根据所述方法检测到的FGL1表达优选与对照相比增加。所述对照可以是来自至少一位没有癌症的参考受试者或非癌组织样本的基线表达的参考值或参考样本，其中所述非癌组织样本优选源自与癌症相同的器官，并且更优选源自癌症患者。如在根据本发明的方法中使用的来自患者的样本优选是组织样本和/或血液样本，优选是肿瘤和/或血液样本。

因此，在一实施方案中，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，特别是与对照相比，所述对照如所述患者的相同组织的非癌性参考样本，或在至少一位参考受试者的相同组织的参考样本中，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本，或参考值。参考值也可以被称为截止值。参考值可以基于至少一位参考受试者的相同组织的参考样本，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。可以将增强的表达检测为升高的信号或升高的对FGL1呈阳性的细胞的百分比(肿瘤比例得分(TPS))。

在另一实施方案中或除先前的实施方案之外，患者在诸如血清或血浆等血液中具有增加的FGL1表达，特别是增加的FGL1水平，更特别是增加的FGL1蛋白水平。优选地，FGL1表达与对照相比是增加的，所述对照如在参考血液样本中，如至少一位参考受试者的血清或血浆样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的参考血液样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。优选地，参考受试者没有进一步的肝损伤。

在一实施方案中，患者患有表达FGL1的癌症，其中所述癌症不是肝癌。优选地，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌，更特别地是与对照相比具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌。

在具体实施方案中，在来自对至少一种检测点抑制性抗体具有原发性或获得性抗性的患者、或来自对PD-1/PD-L1检查点抑制具有原发性或获得性抗性的患者的样本中检测FGL1表达，所述至少一种检查点抑制性抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体和抗OX40抗体。

具有增加的FGL1表达的癌症患者可以是患有表达FGL1的癌症、特别是具有增加的FGL1表达的癌症、更特别是与对照相比具有增加的FGL1表达的癌症的患者。可以在癌症样本中，诸如在癌性组织的活检中，检测或确定FGL1表达。然而，也可以在癌症患者的血液样本，诸如血浆或血清样本中，检测或确定FGL1表达。FGL1可以以结合的和/或游离的(可溶的)的形式存在。

在一实施方案中，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，特别是与对照相比，所述对照如患者的相同组织的非癌性参考样本，或在至少一位参考受试者的相同组织的参考样本中，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的相同组织的参考样本，优选多于一位参考受试者的相同组织的参考样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。可以将肿瘤样本中增强的表达检测为升高的信号(染色强度)和/或升高的对FGL1呈阳性的细胞的百分比(肿瘤比例得分(TPS))。通常，样本呈福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本的形式，例如作为组织微阵列(TMA)切片。用于评估患者TPS的具有FGL1染色的肿瘤细胞的百分比在0％和100％之间。TPS是显示部分或完全染色的活肿瘤细胞相对于样本中存在的所有活肿瘤细胞的百分比(阳性和阴性)。必须从评分中排除浸润的免疫细胞、正常细胞、坏死细胞和碎片。至少需要100个活肿瘤细胞来确定FGL1表达。试样的FGL1表达水平可解释为“无FGL1表达：TPS<1％”，“FGL1表达：TPS≥1％”，“高FGL1表达：TPS≥50％”。其他相关因素可以是表达水平(染色强度)。染色可以使用本领域已知的方法，使用原位杂交、优选荧光原位杂交(FISH)、或优选地免疫组织化学(IHC)来进行。对于IHC，通常需要对福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本的切片进行脱石蜡和再水化。抗原修复后，应在与抗FGL1抗体或LAG3融合蛋白反应之前，例如用过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶。其他相关因素也可以是基因拷贝数增加(基因组中的另外的基因拷贝)，如可以使用FISH进行鉴定(Inoue,Y.等人,Clinical significance of PD-L1and PD-L2 copy number gains in non-small-cell lung cancer,Oncotarget,7(22):32113-32128)。另外，可以定量检测来自血浆，如源自EDTA抗凝的外周全血的循环游离肿瘤DNA。除了原发性肿瘤样本外，也可以在转移性区域淋巴结样本中确定FGL1表达。也可以在患者患有淋巴瘤或白血病的情况下分析淋巴结。

核酸杂交仅涉及在探针与其互补靶标可以通过互补碱基配对形成稳定的杂合双链体的条件下，使探针(例如寡核苷酸或更大的多核苷酸)与靶核酸接触。如本文所用，杂交条件是指标准杂交条件，在所述条件下使用核酸分子鉴定相似的核酸分子。此类标准条件披露于例如以下文献中：Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Labs Press(通过引用以其整体并入，具体参见第9.31-9.62页)。另外，计算适当的杂交和洗涤条件以实现准许不同程度的核苷酸错配的杂交的公式披露于例如Meinkoth等人(1984)Anal.Biochem.138,267-284中。将没有形成杂合双链体的核酸从杂交核酸洗掉，然后可以检测杂交核酸，通常通过检测附着的可检测标记来检测。通过提高温度或降低含有核酸的缓冲液的盐浓度来使核酸变性。在低严格度条件(例如低温或高盐或二者)下，即使在复性的序列不完全互补的情况下，也会形成杂合双链体(例如DNA:DNA、RNA:RNA、或RNA:DNA)。因此，杂交的特异性在更低的严格度下降低。相反，在更高严格度(例如更高的温度或更低的盐)下，成功的杂交要求更少的错配。

在另一实施方案中或除了组织样本之外，患者在诸如血清和/或血浆等血液中具有增加的FGL1表达，特别是增加的FGL1水平，更特别是增加的FGL1蛋白水平。优选地，FGL1表达与对照相比是增加的，所述对照如在非癌性参考血液样本中，如至少一位参考受试者的血清或血浆样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本，或参考值。参考值可以基于至少一位参考受试者的参考血液样本，优选多于一位参考受试者的参考血液样本。所述至少一位参考受试者优选是未患有癌症的受试者。优选地，参考受试者没有进一步的肝损伤。血清和/或血浆中的FGL1表达可以例如以抗FGL1抗体或LAG3融合蛋白作为检测剂使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测，并且在本领域中是已知的。血清中FGL1的浓度在ng/ml范围内。

通过检测附着到样本核酸或抗体上的一种或多种标记来检测杂交的核酸或抗体。标记可通过本领域技术人员熟知的许多手段中的任一种来掺入。适用于本发明的可检测标记包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测的任何组合物。本发明中有用的标记包括荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、Alexa fluors、Spectrum染料等)、量子点、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、或³²P)和比色标记。检测此类标记的手段是本领域技术人员熟知的。因此，例如，可以使用照相底片或闪烁计数器来检测放射性标记，可以使用检测发射的光的光电检测器、荧光显微镜或流式细胞术来检测荧光标志物。仅通过使彩色标记可视化即可检测比色标记。优选地，通过荧光标记并且最优选地，在荧光原位杂交(FISH)测定的情况下，检测杂交核酸。FISH测定在本领域中是熟知的。抗体优选通过荧光标记或比色标记进行检测。

在一实施方案中，患者患有表达FGL1的癌症，其中所述癌症不是肝癌。优选地，患者患有具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌，更特别地是与对照相比具有增加的FGL1表达的癌症，其中所述癌症不是肝癌。适合于本发明的方法的癌症患者患有如针对免疫检查点抑制性抗体的治疗用途指定的癌症。

筛选方法

本文还提供了一种用于筛选免疫检查点抑制性抗体的方法，所述方法包括

(a)提供FGL1蛋白，所述FGL1蛋白优选至少包含人FGL1的纤维蛋白原结构域；

(b)提供LAG3蛋白，所述LAG3蛋白优选至少包含人LAG3的结构域1和2；

(c)在存在待筛选抗体的情况下使所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白接触；

(d)确定FGL1蛋白与LAG3蛋白的结合；并且

(e)如果与在不存在所述待筛选抗体的情况下所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合相比，所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合减少，将所述待筛选抗体鉴定为特异性抑制所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的相互作用的免疫检查点抑制性抗体。优选地，所述抗体是人或人源化抗体。

本文进一步提供了一种用于筛选抑制(人)FGL1与(人)LAG3的结合的小分子的方法，所述方法包括

(a)提供FGL1蛋白，所述FGL1蛋白优选至少包含人FGL1的纤维蛋白原结构域；

(b)提供LAG3蛋白，所述LAG3蛋白优选至少包含人LAG3的结构域1和2；

(c)例如在高通量筛选的格式中，在存在例如来自化合物文库的小分子的情况下，使所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白接触，

(d)在存在和不存在所述小分子的情况下确定所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合；并且

(e)将特异性抑制所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合的小分子鉴定为FGL1-LAG3检查点抑制剂分子，其适合于开发用于治疗如上所提及的癌症疾病的药物。

此外，本发明涵盖通过如上所阐述的方法被鉴定为(人)FGL1与(人)LAG3的结合的抑制剂的小分子，并且所述小分子因此可以用作药物，或者可以被开发为药物，所述药物作用于这种免疫检查点途径，并且因此可以用于如上文所提及的癌症疾病的(免疫)疗法中。

在特定实施方案中，测量FGL1(例如全长人FGL1或标记的FGL1，诸如3xFLAG标记的FGL1蛋白)与LAG3(例如人LAG3的融合蛋白，如LAG3-Fc融合蛋白)的可溶性蛋白的结合。可以例如使用生物传感器如Octet仪器来测量所述结合或相互作用。

在其他实施方案中，至少一种蛋白质包含跨膜结构域以促进膜表达，并且另一种结合伴侣是可溶性蛋白。人LAG3是跨膜蛋白，并因此含有跨膜结构域。FGL1是一种可溶性蛋白，其可以与诸如来自FIBCD1基因(ATM插入N端)或B7-H6基因(ATM插入C端)的人工跨膜结构域(ATM)融合，以促进膜表达。优选地，将与人工跨膜结构域融合的FGL1转染到过表达几种促进膜表达的免疫相关衔接子(诸如DAP10、DAP12、FcRγ和CD3ε)的细胞中，例如转染到293T.2A细胞中。可溶性蛋白可以是FGL1，任选地用可检测的标记(如标签(例如，3xFLAG标签)、Fc结构域或荧光标记)来标记，或者可以使用二抗检测。可替代地，可溶性蛋白可以是LAG3的可溶性融合蛋白，诸如LAG3-Fc融合蛋白，并且可以直接标记或用二抗或本领域已知的任何其他二级试剂来检测。在优选实施方案中，FGL1蛋白包含如NCBI参考序列数据库以ID号NP_004458.3提供的氨基酸序列的氨基酸78-304或氨基酸23-312。用于确定蛋白质间相互作用的方法是本领域已知的，并且可以包括使用细胞检测系统(CDS)、荧光显微镜检查和流式细胞术，但不限于此。

试剂盒

在又一方面，提供了一种用于选择将从免疫检查点抑制性抗体中受益的癌症患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于定量检测来自癌症患者的样本中的FGL1表达的手段，和对照。所述对照可以选自：(a)用于检测增强的FGL1表达的参考样本，(b)用于检测基线FGL1表达的参考样本，(c)包含FGL1表达的预定参考水平的说明，所述预定参考水平已与对免疫检查点抑制性抗体的敏感性相关联，(d)包含FGL1表达的预定参考水平的说明，所述预定参考水平已与对免疫检查点抑制性抗体不敏感相关联，和/或(a)、(b)、(c)或(d)的组合。在一实施方案中，用于定量检测来自癌症患者的样本中的FGL1表达的手段是(a)对FGL1具有特异性的抗体，(b)对FGL1具有特异性的引物对和任选地杂交至扩增的产物的探针，和/或杂交至FGL1靶序列、优选FGL1 mRNA靶序列的探针。

实施例

方法

动物

6至8周龄的C57BL/6(B6)小鼠购自Charles River(威明顿市，马萨诸塞州)。FGL1条件性敲除小鼠从欧洲突变小鼠资源库(EMMA)获得，并在基因工程化C57/BL6 ES细胞(Agouti JM8A)中对该小鼠品系进行了同源靶向。通过与CMV-Cre小鼠(Jackson Lab)杂交产生FGL1完全敲除(whole body knockout)小鼠(Fgl1-/-，在本文中称为FGL1-KO)。所有小鼠方案均符合NIH指南，并得到了耶鲁大学医学院动物保护和使用委员会的批准。

质粒、融合蛋白和抗体

编码约6500个全长质膜基因和约1300个可溶性基因的人cDNA文库是从Genecopeia(罗克维尔市，马里兰州)、Open Biosystems(亨茨维尔，阿拉巴马州)收集的，或者被单独克隆。将用于下述超高通量受体阵列的所有基因克隆到哺乳动物表达载体中。人和小鼠融合蛋白是通过用人Fc或3xFLAG标记编码细胞外结构域的相关基因产生的，在293T细胞中表达并通过亲和柱纯化。通过PCR或GeneArt合成(Thermo Fisher，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)产生FGL1和LAG3的结构域缺失质粒。流式细胞术和体外研究中使用的抗体购自BDBiosciences(圣何塞，加利福尼亚州)、BioLegend(圣地亚哥，加利福尼亚州)或ThermoFisher(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。用于抗LAG3单克隆抗体(C9B7W；针对小鼠LAG3)的杂交瘤来自Dario Vignali博士(匹兹堡大学)。通过用FGL1融合蛋白进行动物免疫，产生针对小鼠FGL1的大鼠mAb和针对人FGL1的小鼠mAb。

超高通量受体阵列技术

除质膜基因外，还基于表达谱、与已知免疫相关分子的同源性(使用BioGPS、Immgen、HPM、UCSC基因组浏览器和NCBI数据库进行生物信息学分析)选择可溶性基因，之后与来自FIBCD1基因(ATM插入N端)或B7-H6基因(ATM插入C端)的人工跨膜结构域(ATM)融合，以促进膜表达。为了构建每个受体阵列板，将cDNA文库质粒单独稀释于OptiMEM中(4ug/ml)，然后转移到384深孔板(VWR)中，每个孔中含200ul质粒溶液。通过机器人液体处理系统(PlateMate，Thermo Fisher)，将两微升(ul)质粒溶液从四个384板的每个孔转移到1536孔板(Greiner)中。整个人受体阵列包含五个1536板。除非指定，否则将这些1536板进一步贴箔并储存在-80℃下。对于受体阵列筛选，将阵列板从-80℃下取出并放置在孵育器中直至溶液完全融化。使阵列板旋转沉降(600g，2min)，并用Multidrop Combi机器人分配器(Thermo Fisher)以每孔2ul含lipofectamine 3000的OptiMEM(7ul lipofectamine/ml)进行分配，并通过超高速轨道摇床快速摇动1min。将所有板在室温下储存20，随后通过Multidrop Combi在每孔4ul DMEM培养基中添加2x10e3个293T.2A细胞(过表达几种促进膜表达的免疫相关衔接子(DAP10、DAP12、FcRγ和CD3ε)的293T细胞min)。使板进一步旋转沉降(1000g，4min)以处置每个孔内部的气泡，之后在37℃下孵育。转染后十八小时，将2ngLAG3-Fc融合蛋白(人或小鼠)和3ng抗Fc二抗添加到每个孔中。6-8小时后，使用AppliedBiosystems 8200细胞检测系统(CDS)读取这些板，并使用CDS 8200软件进行分析。人Fc受体在每个板内用作筛选的融合蛋白的内部阳性对照。

蛋白质间相互作用分析

在Octet Red仪器(PALL，纽约州)上测量并分析蛋白质相互作用，在室温下进行。将Octet蛋白A传感器浸入含有小鼠或人LAG3-Fc融合蛋白的溶液(10ug/ml)中，随后加载不同浓度的3xFLAG标记的FGL1蛋白(从10ug/ml开始进行2倍连续稀释)。通过Octet软件监测并分析蛋白缔合和解离。

体外T细胞功能测定

以指示的浓度将抗小鼠CD3 mAb(eBiosciences)预涂在96孔平板中。在存在5ug/ml的FGL1-Fc融合蛋白或同种型匹配的对照Fc的情况下，将来自C57/BL6小鼠或LAG3-KO小鼠的小鼠脾细胞以3x10e5/孔添加到每个孔中，并培养3天。在培养的最后16小时之前添加³H-TdR，并用MicroBeta Trilux液体闪烁计数器(PerkinElmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)对胸苷掺入进行计数。

对于抗原特异性T细胞实验，在存在HEL肽(1.5ug/ml)的情况下，将3A9 T细胞杂交瘤、或过表达小鼠LAG3全长基因的3A9与LK35.2细胞系一起孵育。还包括指示浓度的FGL1融合蛋白或对照用于测试体外功能。在一些组中，应用抗FGL1或抗LAG3抗体(5ug/ml)来监测拮抗效应。在细胞共培养后24小时，通过CBA试剂盒(BD Pharmingen)分析上清液中的IL-2水平。

体内肿瘤实验

使用8至10周龄的LAG3-KO、FGL1-KO小鼠或对照同窝仔进行体内肿瘤实验。在第0天，通过单次皮下注射MC38或Hepa1-6细胞接种肿瘤(对于MC38，5×10⁵个细胞并且对于Hepa1-6，1x10⁶个细胞)，并在第6、10、14和18天，用100ug抗FGL1或抗LAG3(C9B7W)抗体对小鼠进行腹膜内处理，以盐水或大鼠Ig作为对照。对于抗PD-L1(B7-H1)组合疗法，在第6天用针对PD-L1的仓鼠mAb(克隆10B5；100ug)对小鼠进行进一步处理。每周两次通过电子卡尺监测肿瘤生长，并使用平均肿瘤直径测量：(长度+宽度)/2。

生物信息学

从Oncomine(Thermo Fisher)收集有关实体癌病变和相应的正常组织的微阵列数据(共计254个数据集，覆盖14种类型的人类癌症)，通过R程序进一步分析每种癌症的数据集中的FGL1上调或下调频率(上调的倍数变化>3，或下调的倍数变化<0.3，并且P值<0.05作为截止值)。此外，通过利用TCGA癌症数据库，对几种癌症个体中的FGL1表达与相应的正常组织进行比较。通过癌症浏览器(https://genome-cancer.ucsc.edu/)对原始的微阵列数据进行归一化，然后通过R进行分析。

组织学和免疫组织化学

从幼稚小鼠或荷瘤小鼠中取出组织，包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片用于H&E或免疫组织化学染色。对于FGL1染色，在抗原修复之前对组织进行脱石蜡和再水化。然后用抗FGL1抗体(177R4)对组织切片进行染色，随后用扩增系统(DakoCytomation，格洛斯楚普自治市，丹麦)进行孵育。

统计分析

使用Student氏t检验和双因素anova进行统计分析，并且P值反映了对照样本内的比较。将小于0.05的P值视为具有统计学意义。图中的误差棒表示平均值的标准误差(SEM)。

实施例1

淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)是一种细胞表面T细胞抑制蛋白，并且被认为通过与主要组织相容性复合物II类(MHC-II)相互作用而起作用。然而，在各种实验设置中，LAG3诱导的抑制功能不需要这种相互作用，这表明存在其他功能性LAG3配体。使用基因组规模受体阵列系统，我们鉴定了纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)为LAG3结合伴侣，FGL1是一种具有肝细胞促有丝分裂活性和代谢功能的肝富集可溶性蛋白。

使用免疫球蛋白(Ig)Fc标记的LAG3细胞外结构域融合蛋白，采用基因组规模受体阵列平台(RAP)搜索新的LAG3结合蛋白(图1a)。RAP是一种半自动大规模基因表达系统，其中编码跨膜和可溶性蛋白的单独人cDNA可以在293T细胞的表面上短暂过表达(Yao,S.等人B7-h2 is a costimulatory ligand for CD28 in human.Immunity 34,729-740,(2011))。当前形式的RAP包含所有注释的基因的超过90％编码人跨膜(约6,500)和可溶性(约1,300)蛋白。为了促进膜表达，将几种免疫衔接子基因(DAP10、DAP12、FcRγ和CD3ε)工程化到293T细胞中，并将编码可溶性蛋白的基因融合到人工跨膜结构域上，使其可在细胞表面表达(图1a)。而且，为了提高效率，384孔板形式的原始平台也被修改成1,536孔板形式。在RAP筛选中，显示分泌蛋白FGL1是LAG3-Fc的主要结合蛋白。

实施例2

在人与小鼠的物种之间，所述相互作用似乎是保守的(图1d和图1e)。FGL1/LAG3相互作用可通过流式细胞术(图2b)并Octet生物层干涉测量术中以约1.5nM Kd(图1d)进行验证，从而表明高亲和力相互作用。在小鼠结合和人结合二者中的缓慢的解离速率表明这种相互作用的可能稳定性(图1c和图1f)。参与调节Treg功能的其他FGL1同源物(包括FGL2)以及几种血管生成素相关家族成员均未显示与LAG3的相互作用(数据未显示)，这表明FGL1/LAG3相互作用具有高度特异性。

我们努力确定FGL1与LAG3的结合结构域，以及这是否会影响MHC-II相互作用。FGL1由螺旋-螺旋结构域(CCD)和纤维蛋白原样结构域(FD)构成(Yamamoto,T.等人Molecular cloning and initial characterization of a novel fibrinogen-relatedgene,HFREP-1.Biochem Biophys Res Commun 193,681-687,(1993))。通过结构域缺失实验，我们证明了是FD而不是CCD负责LAG3结合(图2a和图2c)。LAG3蛋白由四个Ig样结构域(D1-D4)、跨膜结构域(TM)和细胞内结构域(IC)组成(Huard,B.等人Characterization ofthe major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3protein.Proc Natl Acad Sci U S A 94,5744-5749,(1997)；Triebel,F.等人LAG-3,anovel lymphocyte activation gene closely related to CD4.J Exp Med 171,1393-1405,(1990))(图2b)。LAG3中D3-D4结构域的缺失不影响FGL1结合，而单独的D1或D2部分降低了结合(图2b和图2d)，表明D1和D2二者均有助于FGL1/LAG3相互作用。先前的研究证明，小鼠LAG3的D1域的C'链中的单一点突变(Y73F)(对应于人LAG3中的Y77F)破坏了MHC II类结合(Huard,B.等人Characterization of the major histocompatibility complexclass II binding site on LAG-3protein.Proc Natl Acad Sci U S A 94,5744-5749,(1997)；Workman,C.J.,Dugger,K.J.&Vignali,D.A.Cutting edge:molecular analysisof the negative regulatory function of lymphocyte activation gene-3.J Immunol169,5392-5395,(2002))。有趣的是，我们发现FGL1-Fc与LAG3 Y73F突变体的结合与LAG3WT一样强(图2b和图2d)。此外，我们利用抗LAG3 mAb(C9B7W克隆)，据报道它可与小鼠LAG3的D2结构域结合，而不会破坏LAG3/MHC II类相互作用(Andrews,L.P.,Marciscano,A.E.,Drake,C.G.&Vignali,D.A.LAG3(CD223)as a cancer immunotherapy target.ImmunolRev276,80-96,(2017)；Workman,C.J.,Rice,D.S.,Dugger,K.J.,Kurschner,C.&Vignali,D.A.Phenotypic analysis of the murine CD4-related glycoprotein,CD223(LAG-3).Eur J Immunol 32,2255-2263,(2002)；Cemerski,S.,Zhao,S.,Chenard,M.,Laskey,J.,Cui,L.,Shukla,R.,Haines,B.,Hsieh,E.,Beaumont,M.,Mattson,J.,Blumenschein,W.,Hirsch,H.,Fayadat-Dilman,L.,Liang,L.,De Waal Malefyt,R.,T cell activation andanti-tumor efficacy of anti-LAG-3antibodies is independent of LAG-3–MHCIIblocking capacity.Journal for Immunotherapy of Cancer 3(Suppl 2),183,(2015))。在将293T LAG3⁺细胞与C9B7W一起预孵育后，我们发现FGL1/LAG3结合完全消失(图1g)。这些数据表明FGL1在涉及D1和D2二者的大区域中与LAG3相互作用。

为了直接测试FGL1和MHC II类是否竞争LAG3结合，我们将LAG3+细胞与MHC II类I-Ab融合蛋白与高浓度的FGL1(最多升高100倍)组合培养，未观察到显著的竞争(数据未显示)。这些数据表明，FGL1通过纤维蛋白原C端区域在涉及D1和D2二者的大区域中与LAG3相互作用，这对于MHC II类结合而言并非是冗余的。

实施例3

在竞争测定中，进一步确定了现有的单克隆抗LAG3抗体是否阻断了FGL1-LAG3相互作用。在存在或不存在抗LAG3抗体(10ug/ml抗LAG3-A488抗体；R&D Systems)的情况下，用荧光标记的FGL1(1ug/ml FGL-A647)对表达人LAG3的CHO细胞或用抗CD3抗体激活以诱导LAG3表达的原代T细胞进行染色，以确定它们是否与FGL1竞争结合至LAG3。在存在抗LAG3抗体的情况下，FGL1的结合并未减少(数据未显示)，因此似乎并未干扰FGL1:LAG3相互作用。

实施例4

接下来，我们分析了FGL1/LAG3相互作用在体外对T细胞的作用。激活后，LAG3在T细胞上高度表达。通过流式细胞术分析，FGL1-Fc融合蛋白结合来自WT小鼠而不是来自LAG3KO小鼠的激活的T细胞(数据未显示)。FGL1-Fc在抗CD3刺激后抑制了脾T细胞增殖，但所述抑制活性在LAG3-KO脾细胞中丧失(图3a)。同样，FGL1融合蛋白能够以剂量依赖性的方式抑制鼠3A9-LAG3+T细胞系的抗原特异性激活(图3b)。因此，FGL1在体外抑制T细胞增殖和功能。为了进一步证明FGL1/LAG3途径对T细胞抑制的依赖性，我们生成了特异性抗FGL1 mAb(克隆177R4)，它以与抗LAG3类似的方式阻断FGL1融合蛋白与表达LAG3的293T细胞的结合(图3c)。两种抗体都消除FGL1对3A9-LAG3细胞产生IL-2的抑制作用(图2d)，并在体内促进抗原特异性T细胞激活，如通过升高的IFN-γ和TNF-α的血浆水平所确定的(图4a和图4b)。我们的结果支持FGL1和LAG3作为负调节T细胞应答的受体/配体对起作用。

在激活的人原代T细胞中获得了相似的结果。当在24小时内用等于或高于1ug/ml的抗CD3抗体刺激时，CD4 T细胞和CD8 T细胞显示出增强的LAG3表达。用1或3ug/ml进行抗CD3刺激后，LAG3表达维持了至少72小时，如通过流式细胞术所分析的(数据未显示)。在用抗CD3/抗CD28包被的珠激活后第4天，激活的原代T细胞上的LAG3表达进一步可使用从人PBMC分离的T细胞通过FGL1-Fc染色(10μg/ml)来检测(数据未显示)。

为了评价FGL-1在调节免疫系统中的潜在作用，使用经野鼠色基因修饰的小鼠胚胎干细胞系(JM8)在C57BL/6背景中产生FGL1敲除(FGL1-KO)(Pettitt,S.J.等人AgoutiC57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.Nat Methods 6,493-495,(2009))。在野生型(WT)小鼠中，FGL1在肝脏中选择性表达，而不是由免疫系统表达(图5a)(Yan,J.等人Cloning and characterization of a mouse liver-specific genemfrep-1,up-regulated in liver regeneration.Cell Res 12,353-361,(2002)；Li,C.Y.等人Recombinant human hepassocin stimulates proliferation of hepatocytes invivo and improves survival in rats with fulminant hepatic failure.Gut 59,817-826,(2010)；Liu,Z.&Ukomadu,C.Fibrinogen-like protein 1,a hepatocyte derivedprotein is an acute phase reactant.Biochem Biophys Res Commun 365,729-734,(2008))。与WT同窝仔相比，在FGL1-KO小鼠中通过蛋白质印迹确认不存在肝FGL-1表达并且通过ELISA确认血浆FGL-1水平(数据未显示)。FGL1-KO小鼠具有整体正常的外观、器官大小和幼崽，表明FGL1不会整体影响小鼠的发育和生长。然而，FGL1-KO具有淋巴细胞明显的皮炎的高发病率。20只FGL1 KO小鼠(12至16个月龄)中有8只发生皮炎，而15只WT同窝仔中只有1只发生皮炎。八只12至16个月龄的雌性(而不是雄性)中有五只在血清中具有增加的抗双链DNA自身抗体(数据未显示)。通过大量细胞计数法进行的外周血单核细胞分析(Bendall,S.C.等人Single-cell mass cytometry of differential immune and drugresponses across a human hematopoietic continuum.Science 332,687-696,(2011))显示与FGL-1 WT相比，FGL1 KO小鼠中CD8 T细胞而不是CD4 T细胞或其他免疫子集的频率更高的趋势(图6a和图6b)。相比之下，诸如脾或肝等外周组织中的T细胞子集没有显著差异(数据未显示)。这些数据表明内在的FGL1不会影响发育和生长，但它可能参与调节生理免疫应答。

实施例5

鉴于LAG3作为靶标在癌症免疫疗法中的有希望的作用以及新鉴定的FGL1/LAG3途径在抑制T细胞免疫中的作用，我们测试了肿瘤免疫中的FGL1缺乏或阻断。使用免疫原性MC38小鼠结肠癌模型，我们发现与肿瘤所有野生型(WT)小鼠中的生长物相比，在第35天，在大多数KO小鼠中，缺乏FGL1或LAG3的小鼠对移植的肿瘤具有抗性(图7a)。当所有WT小鼠在60天内达到终点(平均肿瘤直径为15mm)时，约50％的FGL1-KO或LAG3-KO小鼠在150天后没有肿瘤(图7b)。抗FGL1和抗LAG3(克隆C9B7W)mAb也显著抑制同系C57BL/6小鼠中皮下植入的MC38鼠结肠癌(图7c)和Hepa1-6鼠肝癌(数据未显示)细胞系的生长。在MC38模型中，通过特异性mAb耗尽CD8+或CD4+ T细胞消除了FGL1和LAG3 mAb二者的抗肿瘤作用(数据未显示)，这表明所述抗肿瘤作用依赖于T细胞。通过大量细胞计数法进行的肿瘤浸润的白细胞(TIL)分析，我们观察到与对照组不同，在处理的(抗FGL1或抗LAG3)小鼠中每毫克肿瘤的白细胞(CD45+细胞)、CD8和CD4 T细胞的绝对数量显著升高(图7d)。而且，相比于对照小鼠，在处理的小鼠的肿瘤中观察到效应记忆T细胞群明显增加，但在肿瘤引流淋巴结和脾脏中则没有观察到(数据未显示)。在表征TIL中FGL1缺乏或FGL1阻断的功能变化时，观察到与对照组相比，在FGL-1 KO处理的小鼠和抗FGL1处理的小鼠二者中功能标志物(粒酶B、CD44、Ly6C、FAS)显著升高，且LAG-3减少(图7e)。

为了严格排除一种或多种其他LAG3配体的作用，我们测试了C9B7W在FGL1 KO小鼠中的抗肿瘤作用。尽管抗LAG3 mAb(C9B7W)明显减慢了WT小鼠的MC38肿瘤生长，但这种作用在FGL1 KO小鼠中被消除了(图7f)。因此，抗LAG3 mAb C9B7W的抗肿瘤作用是通过阻断FGL1而不是MHC II类或其他LAG3配体来介导的。另外，我们发现抗FGL1的作用也依赖于LAG3，因为该抗体不能为LAG3-KO小鼠赋予肿瘤抗性(图7g)。因此，我们的发现支持FGL1/LAG3作为功能性和相互依赖性对在抗肿瘤免疫的控制中的关键作用。

实施例6

鉴于FGL1/LAG3在小鼠癌症模型中的相关性，我们探索了FGL1作为新型抗肿瘤靶标在临床环境中的潜力。基于组织微阵列数据库(图8a)和最近报道的人蛋白组分析(Kim,M.S.等人A draft map of the human proteome.Nature 509,575-581,(2014))，在健康个体中FGL1表达在很大程度上限于肝。Oncomine数据库的综合分析揭示了FGL1 mRNA在几种实体瘤中的上调，在肺癌数据集中表达最高(8/23或35％)(图8b)。此外，证实在TCGA肺腺癌TCGA数据库中以及在除肝癌以外的许多其他癌症中，FGL1是上调最多的基因之一(图8c)。为了可靠地测量FGL1，我们使用以FGL1转染的293T细胞以及用于建立阈值表达割点的肿瘤和正常肺组织验证免疫荧光测定。然后，通过多重定量免疫荧光(QIF)在275例非小细胞肺癌(NSCLC)病例中分析FGL1表达，其中275例中有30例与正常肺组织配对。FGL1表达限于肿瘤细胞区室，在间质中的表达最少，并且在正常配对的肺组织中呈阴性染色(数据未显示)。在所有肺癌病例中，我们在约15％的试样中发现阳性染色(图9a)，并且在肿瘤活检中具有高FGL1表达的肿瘤与较差的预后相关联(图9b)。另外，我们还在两个独立群组(1号群组，来自纳瓦拉大学(图9c)，和2号群组，来自福建医科大学(数据未显示))中发现，NSCLC患者的血浆FGL1水平与健康供体相比更高，如通过ELISA所分析的。然而，在具有或没有肝损伤(ALT≥40U/L；ALT<40U/L)的患者中以及在具有或没有转移的患者中，血浆FGL1水平没有差异(数据未显示)。

实施例7

进一步测试了在肿瘤微环境中FGL1/LAG-3途径是否可以是独立起作用或与B7-H1(PD-L1)/PD-1途径协同起作用的替代的抑制途径。因此，我们分析了基线血浆FGL1水平与抗PD-1疗法在转移性NSCLC患者中的功效的相关性(1号群组)。在用抗PD-1 mAb治疗的患者中，较高的FGL1表达与较差的总体存活相关(图9d)。在用抗PD-1 mAb治疗的转移性黑色素瘤患者的独立群组(3号群组，来自耶鲁大学)中观察到了相似的结果(图9e)。

我们通过使用MC38肿瘤模型，进一步测试了抗FGL1/抗LAG3在抗B7-H1阻断情况下的作用。单药剂抗B7-H1 mAb减缓了肿瘤生长并改进了存活，死亡在90天内发生(图10a)。同样，单药剂抗FGL1或抗LAG3 mAb治疗未能延长存活超过3个月。令人惊讶的是，与单药剂疗法相比，抗B7-H1 mAb与抗FGL1或抗LAG3 mAb的组合显著改善了存活时间(图10a)和肿瘤负荷(图10b)。另外，超过30％的小鼠在超过150天的时间内没有肿瘤(图10a)。所有这些数据共同支持FGL1/LAG-3途径作为原发性抗性机制在用抗PD1/PDL1疗法治疗的癌症患者中的作用。所以，抗FGL1或抗LAG3阻断性抗体在几种小鼠模型中以受体-配体相互依赖性方式增强T细胞介导的肿瘤免疫并抑制肿瘤生长，并与B7-H1(PD-L1)/PD-1阻断疗法协同作用。

总结

已知的抗LAG3疗法靶向与其唯一已知的配体II类MHC的相互作用。发明人提出了涉及FGL1的替代的独立LAG3途径，其对癌症免疫疗法具有潜在的重要意义。FGL1抑制T细胞应答，并且(拮抗性)抗FGL1或抗LAG3阻断抗体削弱肿瘤生长。尽管FGL1在正常组织中的表达有限，但其在几种人实体癌(包括肺癌和黑色素瘤)中高度表达，并且具有重要的预后价值。鉴于FGL1在针对抗PD1/PD-L1疗法的原发性抗性患者中的高表达，FGL1/LAG3途径可能是潜在的免疫逃逸机制。此外，数据表明，FGL1表达作为用干扰FGL1/LAG3免疫检查点途径的药物成功治疗的生物标志物，以及作为预测抗PD-1反应、预测抗PD1/PD-L1疗法和潜在地其他检查点抑制性分子的不良预后的生物标志物，具有预后价值。

Claims (36)

1.一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的特异性抑制纤维蛋白原样蛋白1(FGL1)与淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG3)的相互作用的抗体。

2.根据权利要求1所述的用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述抗体，其中所述癌症患者具有增加的FGL1表达。

3.根据权利要求1所述的方法，其中已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。

4.根据权利要求3所述的方法，其中已确定来自所述患者的样本具有增加的FGL1表达。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括

a)确定来自所述患者的样本中的FGL1表达是否增加，并且

b)如果FGL1表达增加，向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述抗体。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括

a)鉴定需要治疗癌症的患者，并且

b)确定所述患者具有增加的FGL1表达，之后

c)向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述抗体。

7.一种为癌症患者选择疗法的方法，所述疗法包括特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体，所述方法包括确定来自所述患者的样本中的FGL1表达水平，并且在FGL1表达水平增加时为所述患者选择所述疗法。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述FGL1表达与对照相比是增加的。

9.一种在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括

a)提供来自所述患者的样本，

b)测量所述样本中的FGL1表达水平，

c)将FGL1表达与对照进行比较，

d)当已将FGL1表达水平测量为与所述对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用至少一种特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗有反应，并且

e)向所述患者给予有效量的特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述抗体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的所述抗体是抗FGL1抗体或抗LAG3抗体。

11.一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的结合至人FGL1的抗体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法包括给予选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体和抗OX40抗体中的至少一种另外的免疫检查点抑制性抗体。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述患者具有

(i)对至少一种免疫检查点抑制性抗体的原发性或获得性抗性，所述至少一种免疫检查点抑制性抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IDO抗体、抗CTLA-4抗体、抗Tim-3抗体、抗GITR抗体、抗VISTA抗体、抗BTLA抗体和抗OX40抗体，或者

(ii)其中所述患者对PD-1/PD-L1检查点抑制具有原发性或获得性抗性。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述癌症是脑癌、结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌或肺癌，优选是非小细胞肺癌(NSCLC)。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述治疗进一步伴有化学疗法或放射疗法。

16.一种评估癌症患者对用免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗的敏感性的方法，所述方法包括

(a)提供来自所述患者的样本，

(b)检测所述样本中的FGL1表达，并且

(c)将步骤(b)中确定的所述FGL1表达与对照进行比较，其中所述样本中的所述FGL1表达与所述对照相比是增加的。

17.一种对患者的肿瘤进行分类的方法，所述方法包括

(a)提供来自所述患者的样本，

(b)检测所述样本中的FGL1表达，并且

(c)将所述肿瘤鉴定为用免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗的候选者。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述方法是体外方法。

19.一种预测人类癌症患者的反应性的方法，所述方法包括

(a)提供来自所述患者的样本，

(b)确定所述样本中的FGL1表达水平，

(c)将FGL1表达与对照进行比较，

(d)当已确定FGL1表达水平与所述对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的治疗有反应，或者当已确定FGL1表达与所述对照相比没有增加时，将所述患者鉴定为不太可能有反应；并且任选地

(e)进一步包括向所述癌症患者给予免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的步骤。

20.一种在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者给予有效量的至少一种免疫检查点抑制性抗体，其中所述癌症患者具有增加的FGL1表达。

21.一种筛选免疫检查点抑制性抗体的方法，所述方法包括

(a)提供FGL1蛋白，所述FGL1蛋白优选至少包含人FGL1的纤维蛋白原结构域；

(b)提供LAG3蛋白，所述LAG3蛋白优选至少包含人LAG3的结构域1和2；

(c)在存在待筛选抗体的情况下使所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白接触；

(d)确定所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合；并且

(e)如果与在不存在所述待筛选抗体的情况下所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合相比，所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合减少，将所述待筛选抗体鉴定为特异性抑制所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的相互作用的抗体。

22.一种用于筛选抑制FGL1与LAG3的结合的小分子的方法，所述方法包括a)提供FGL1蛋白，所述FGL1蛋白优选至少包含人FGL1的纤维蛋白原结构域；

(b)提供LAG3蛋白，所述LAG3蛋白优选至少包含人LAG3的结构域1和2；

(c)在例如高通量筛选的格式中，在存在例如来自化合物文库的小分子的情况下，使所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白接触，

(d)在存在和不存在所述小分子的情况下确定所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合；并且

(e)将特异性抑制所述FGL1蛋白与所述LAG3蛋白的结合的小分子鉴定为FGL1-LAG3检查点抑制剂分子。

23.一种用于选择将从免疫检查点抑制性抗体、优选特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体中获益的癌症患者的试剂盒，其中所述试剂盒包含

(a)用于定量检测来自癌症患者的样本中的FGL1表达的手段，和

(b)对照。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述对照选自：

(a)用于检测增强的FGL1表达的参考样本，

(b)用于检测基线FGL1表达的参考样本，

(c)包含FGL1表达的预定参考水平的说明，所述预定参考水平已与对特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体的敏感性相关联，

(d)包含FGL1表达的预定参考水平的说明，所述预定参考水平已与对特异性抑制FGL1与LAG3的相互作用的抗体不敏感相关联，和/或

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的组合。

25.根据权利要求23所述的试剂盒，其中用于定量检测来自癌症患者的样本中的FGL1表达的所述手段是

(a)对FGL1具有特异性的抗体，

(b)对FGL1具有特异性的引物对和任选地杂交至扩增的产物的探针，和/或

(c)杂交至FGL1靶序列的探针。

26.一种结合至人FGL1的抗体，其中所述抗体抑制人FGL1与人LAG3的结合。

27.一种结合至人LAG3的抗体，其中所述抗体抑制人LAG3与人FGL1的结合。

28.根据权利要求27所述的抗体，其中所述抗体进一步抑制人LAG3与人MHC II类分子的相互作用。

29.一种在癌症的治疗中使用的抗FGL1抗体。

30.根据权利要求29所述的在癌症的治疗中使用的抗FGL1抗体，其中所述癌症疾病选自实体瘤、血液癌和转移性病变，更具体地选自白血病、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤)、肉瘤和癌，包括腺癌、结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、脑癌、结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、头颈癌、复发性或转移性头颈鳞状细胞癌、鳞状细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞宫颈癌、胃癌、食道癌和甲状腺癌。

31.根据权利要求29或权利要求30所述的抗FGL1抗体，其中所述抗体是人或人源化抗体。

32.根据权利要求29或权利要求30所述的抗FGL1抗体，其中待用所述抗FGL1抗体治疗的所述癌症患者具有增加的FGL1表达。

33.根据权利要求32所述的抗FGL1抗体，其中已确定所述癌症患者具有增加的FGL1表达。

34.根据权利要求33所述的抗FGL1抗体，其中已确定来自所述癌症患者的样本具有增加的FGL1表达。

35.根据权利要求34所述的抗FGL1抗体，其中所述治疗包括

(a)确定来自所述患者的样本中的FGL1表达是否增加，并且

(b)如果FGL1表达增加，向所述患者给予有效量的所述抗FGL1抗体。

36.一种在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括

a)提供来自所述患者的样本，

b)测量所述样本中的FGL1表达水平，

c)将FGL1表达与对照进行比较，

d)当已确定FGL1表达水平与所述对照相比增加时，将所述患者鉴定为可能对用抗FGL1抗体的治疗有反应，并且

e)向所述患者给予有效量的抗FGL1抗体。

Images