CN113164408B

CN113164408B - 肿瘤联合免疫治疗

Info

Publication number: CN113164408B
Application number: CN201980081117.8A
Authority: CN
Inventors: 李宗海; 孙蕊心
Original assignee: Clegg Medical Co ltd; Keji Biomedical Shanghai Co ltd; Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Clegg Medical Co ltd
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2025-07-22
Anticipated expiration: 2039-12-09
Also published as: WO2020114518A1; EP3892333A1; JP2022517301A; US20230158071A1; EP3892333A4; CN113164408A

Abstract

提供了一种治疗肿瘤的方法，包括对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和PARP抑制剂，所述免疫效应细胞表达有识别肿瘤抗原的受体。还提供了一种用于治疗肿瘤的试剂盒。

Description

肿瘤联合免疫治疗

技术领域

本申请属于细胞免疫治疗领域，具体涉及靶向肿瘤特异性抗原和PARP抑制剂联合抗肿瘤免疫治疗。

背景技术

近年来，免疫细胞治疗特别是CAR-T细胞治疗在B细胞肿瘤治疗中显示出惊人的治疗效果，目前已经超过200项CAR-T细胞用于血液肿瘤治疗的临床实验(Clinicaldevelopment of CAR T cells-challenges and opportunities in translatinginnovative treatment concepts,Jessica Hartmann et al.,EMBO Molecule Medicine,Published on line,August 1,2017)。

然而，由于生物体，特别是实体瘤的微环境的复杂性，在体外表现出优良效果的候选药物，在体内往往无法表现出相应的效果。换言之，候选药物的体外结果无法合理预示体内的效果。此外，同一个抗体对具有相同靶点的不同部位的肿瘤也有不同效果。例如，曲多珠单抗在应用于HER2阳性乳腺癌时具有较好的治疗作用，但应用于HER2阳性胃癌时，却没有效果(付强,胃癌HER2信号通路及去拖住单抗临床应用进展,药品评价，2012,9(27):8-12)。

尽管免疫效应细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但在实体瘤中应用中，CAR-T细胞面临着诸多问题，其中，将细胞归巢至肿瘤局部并且活化增殖是CAR-T细胞治疗起效的关键步骤。

近年来，PARP抑制剂在抗癌药物的研发中取得了突破性的进展。PARP抑制剂的抗癌机制主要包括：(1)阻滞DNA损伤修复，造成DNA损伤累积，最终杀死肿瘤细胞；(2)增加细胞对其他内外源DNA损伤因子的敏感性；(3)抑制血管生成；(4)增强正常细胞的免疫力，从而抵抗癌细胞的入侵。目前已有许多PARP抑制剂进入了临床试验。其中，奥拉帕尼Olaparib(AZD2281)是迄今为止临床研究最广泛的第3代PARP抑制剂，其是强有效的PARP-1抑制剂。但部分患者对该类药物仍不敏感。

因此，本研究旨在结合适当的小分子药物来增强肿瘤细胞的免疫原性，减少肿瘤免疫抑制因素，促进CART细胞的归巢和持续激活，从而提高CAR-T细胞本身的抗瘤活性。

发明内容

本申请的目的在于提供一种和小分子药物联用的肿瘤治疗方法，以提高免疫细胞治疗特别是CAR-T细胞治疗在实体瘤中抗肿瘤应用效果。

在本申请的一个方面，提供一种治疗肿瘤的方法，其包括：对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和PARP抑制剂，所述免疫效应细胞表达有识别肿瘤抗原的受体。

在本申请的一个方面，提供一种降低癌细胞生长、存活或活力或全部的方法，其包括：对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和PARP抑制剂，所述免疫效应细胞表达有识别肿瘤抗原的受体。

在至少一个具体的方面，所述PARP抑制剂选自：talazoparib、niraparib、olaparib、rucaparib、Niraparib、Pamiparib、Fluzoparib、Mefuparib、希明哌瑞中的任意。

在至少一个具体的方面，所示PARP抑制剂为olaparib。

在至少一个具体的方面，所述免疫效应细胞和PARP抑制剂的治疗效果大于所述免疫效应细胞和PARP抑制剂任一单独使用的效果。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法提高肿瘤组织CAR-T拷贝数。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法提高肿瘤组织中IFN-γ的表达水平。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法提高肿瘤组织中CD8+T细胞免疫细胞浸润。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法提高CD45+免疫细胞浸润。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法降低CD11b+Ly6G+的MDSCs细胞侵润。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法降低CD31+细胞浸润。

在至少一个具体的方面，上述本申请的方法不会引起PD1、LAG3、和/或TIM3的表达显著下降。

在至少一个具体的方面，在上述本申请的方法中，对患有肿瘤的个体给予免疫效应细胞和PARP抑制剂的方式选自以下中的任意：(1)先给予PARP抑制剂再给予免疫效应细胞，(2)同时给予免疫效应细胞和PARP抑制剂，以及(3)先给予免疫效应细胞再给予PARP抑制剂。

在至少一个具体的方面，在上述本申请的方法中，先给予PARP抑制剂再给予免疫效应细胞。

在至少一个具体的方面，在上述本申请的方法中，同时给予免疫效应细胞和PARP抑制剂。

在至少一个具体的方面，在上述本申请的方法中，先给予免疫效应细胞再给予PARP抑制剂。

在至少一个具体的方面，所述受体选自：嵌合抗原受体(Chimeric AntigenReceptor，CAR)、T细胞受体(T cell receptor，TCR)、T细胞融合蛋白(T cellfusionprotein，TFP)、T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)或其组合。

在至少一个具体的方面，所述肿瘤抗原选自EGFR或EGFRvIII。

在至少一个具体的方面，所述的嵌合抗原受体具有：(i)特异性识别肿瘤抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或(ii)特异性识别肿瘤抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信结构域和CD3ζ；或(iii)特异性识别肿瘤抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

在至少一个具体的方面，上述特异性识别肿瘤抗原的抗体为靶向EGFR或EGFRvIII的抗体，进一步优选所述抗体具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:29中的任一项。

在至少一个具体的方面，上述嵌合抗原受体具有如下氨基酸序列，所述氨基酸选自SEQ ID NO:30～SEQ ID NO:51、以及SEQ ID NO:55～SEQ ID NO:87中的任一项。

在至少一个具体的方面，上述肿瘤包括：乳腺癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，膀胱癌，输尿管癌，肾盂癌，脊椎肿瘤，脑胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

在至少一个具体的方面，上述免疫效应细胞选自：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合；优选地，所述免疫效应细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞或同种异体NK细胞，更优选地，所述T细胞为自体T细胞。

在至少一个具体的方面，上述的PARP抑制剂为口服给药、腹腔给药和/或注射给药。

在至少一个具体的方面，在上述方法中，对所述的个体不进行淋巴细胞清除。

在另外的方面，本申请提供表达有识别肿瘤抗原的受体的免疫效应细胞和PARP抑制剂在制备药物中的应用，其中，所述药物为治疗肿瘤的药物或降低癌细胞生长、存活或活力的药物。

在另外的方面，本申请提供表达有识别肿瘤抗原的受体的免疫效应细胞在制备药物中的应用，其中，所述药物含有所述细胞和PARP抑制剂，用于在人类患者中治疗肿瘤或降低癌细胞生长、存活或活力。

在至少一个具体的方面，所述PARP抑制剂包括：talazoparib、niraparib、olaparib、rucaparib、Niraparib、Pamiparib、Fluzoparib、Mefuparib和/或希明哌瑞。

在至少一个具体的方面，免疫效应细胞和PARP抑制剂给予时间不分先后、可以先给予PARP抑制剂再给予免疫效应细胞、也可以同时给药、还可以先给予免疫效应细胞再给予PARP抑制剂；优选地，PARP抑制剂为olaparib。

在至少一个具体的方面，所述的嵌合抗原受体具有：(i)特异性识别肿瘤抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或(ii)特异性识别肿瘤抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或(iii)特异性识别肿瘤抗原的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

在至少一个具体的方面，所述的免疫效应细胞包括：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合；优选地，所述免疫效应细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞或同种异体NK细胞，更优选地，所述T细胞为自体T细胞。

在至少一个具体的方面，在使用本申请的药物或试剂盒时，所述的PARP抑制剂为口服给药、腹腔给药和/或注射给药，优选地，PARP抑制剂为olaparib。

在至少一个具体的方面，在使用本申请的药物或试剂盒时，对所述的个体不进行淋巴细胞清除。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A为重组载体MSCV-806-mCD28z质粒图；图1B为CAR-T感染阳性率检测。

图2A为EGFRvIII阳性细胞检测；图2B检测了奥拉帕尼处理的细胞中的PARP1的表达；图2C显示了CCK8实验检测奥拉帕尼对乳腺癌细胞及CAR-T细胞的毒性作用。

图3A显示了细胞毒性实验检测奥拉帕尼预处理后加CAR-T治疗或奥拉帕尼和CART联合用药对肿瘤细胞的杀伤作用；图3B显示了ELISA实验检测奥拉帕尼对CAR-T细胞激活后细胞因子TNFα、IL-2、IFN-γ分泌的影响。

图4A显示实施例4中奥拉帕尼预处理组的CAR-T与靶细胞共同孵育后对细胞增殖的影响；图4B显示实施例4中奥拉帕尼预处理组的CAR-T与靶细胞共同孵育后，CAR-T细胞表面与耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达的变化。

图5显示了奥拉帕尼与CAR-T联合治疗小鼠原位乳腺癌移植瘤实验：图5A.实验流程图；图5B.肿瘤体积检测结果；图5C.小鼠体重变化检测；图5D.小鼠肿瘤重量检测；图5E.肿瘤组织CAR拷贝数检测；图5F.肿瘤组织CD4/CD8/CD31免疫组化检测；图5G.肿瘤组织MDSC细胞检测。

图6显示了奥拉帕尼与CAR-T联合治疗小鼠原位乳腺癌移植瘤实验：图6A.实验流程图；图6B.肿瘤体积检测结果；图6C.小鼠体重变化检测；图6D.小鼠肿瘤重量检测；图6E.肿瘤组织CAR拷贝数检测；图6F.肿瘤组织CD4/CD8/CD31免疫组化检测；图6G.肿瘤组织MDSC细胞检测。

具体实施方式

本申请涉及免疫效应细胞和PARP抑制剂联合应用于治疗肿瘤，应理解本发明并不限于所述的方法和实验条件。除非本文中专门定义，所使用的所有技术和科学术语具有在基因治疗、生物化学、遗传学、分子生物学、以及药物化学领域内的技术人员通常理解的相同含义。

类似或等效于本文中描述的那些的所有方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用，其中，合适的方法和材料在本文中都进行了描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义，为准。此外，除非另有规定，材料、方法和实施例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。

除非另有说明，本申请的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术，这都属于本领域的技术范围。这些技术充分解释于文献中。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.AUSUBEL，2000，Wileyand sonInc，Library of Congress，USA)；MolecularCloning:A Laboratory Manual，Third Edition，(Sambrooketal，2001，Cold SpringHarbor，NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harries & S.J.Higginseds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是Vols.154和155(Wuetal. eds.)和Vol.185，“Gene ExpressionTechnology”(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Hand book Of Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

本公开内容至少部分源于下述开创性认知：连续地、以任一次序地或基本上同时地包括给予低剂量奥拉帕尼和免疫效应细胞治疗的一个或多个周期和/或剂量的组合治疗方案在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和/或可以起始、使实现、增加、增强或延长免疫细胞的活性和/或数目，或通过肿瘤的医学有益应答。

术语“PARP(poly(ADP)-ribosepolymerase)”,是一种聚ADP核糖聚合酶，参与的细胞过程包括染色体重塑、调控细胞凋亡、细胞分裂。PARP在免疫应答中也发挥作用。目前为止已发现包括PARP1、PARP2、PARP3、Vault-PARP和Tankyrase1等17个家族成员，其中PARP1是在PARP蛋白家族中含量最丰富、发现最早、研究最深入广泛的一员，占细胞内PARP总活性的80％以上。PARP1的生物学功能为激活的PARP1形成同源二聚体，切割NAD+的碳氢键，生成烟酰胺和腺苷二磷酸核糖，进一步将后者转移并添加到特定核受体蛋白(包括自身)的特定氨基酸残基，并且不断添加形成直链或支链的PARP长链。PARP1对DNA损伤修复、基因转录和表达、基因组稳定性的维持、细胞周期调控及细胞调亡等生理过程发挥着重要作用。目前已有三种PARP抑制剂药物获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市。

Olaparib(奥拉帕尼)作为口服PARP1和PARP2的抑制剂，在2014年12月获得FDA加速批准以商品名Lynparza上市，是全球第一个上市的PARP抑制剂。它用于单药治疗经3种或3种及以上药物化疗的BRCA突变晚期卵巢癌。目前Olaparib用于对铂类化疗复发的晚期卵巢癌和BRAC缺陷的三阴性乳腺癌并处于Ⅲ期临床试验阶段，其与紫杉醇联合治疗胃癌也正在进行Ⅲ期临床。此外，对前列腺癌的治疗已经进入Ⅱ期临床阶段。但部分患者对该类药物仍不敏感。

在具体实施方式中，本申请采用的PARP抑制剂包括但不限于为talazoparib、niraparib、olaparib、rucaparib、veliparib、Niraparib、Pamiparib、Fluzoparib、Mefuparib和/或希明哌瑞，与CAR-T细胞联用治疗乳腺癌。

申请人发现在体外实验中：高于1μM浓度的奥拉帕尼能抑制肿瘤细胞的生长、高于2.5μM浓度的奥拉帕尼能抑制CAR-T细胞的生长；奥拉帕尼能够明显提高CAR-T细胞对E0771-EGFRvIII细胞和/或4T1-EGFRvIII细胞的杀伤作用，尤其是在5μM奥拉帕尼预处理组中，促进杀伤效果最为显著，比5μM奥拉帕尼联合治疗组的杀伤效果更好，提示较高浓度奥拉帕尼可能会对CAR-T的生长造成一定程度的抑制；奥拉帕尼预处理组、奥拉帕尼联合治疗组与CAR-T单独治疗组相比，细胞培养上清中IFN-γ的水平显著增加。

在本申请中，使用奥拉帕尼能够明显提高CAR-T细胞对E0771-EGFRvIII和4T1-EGFRvIII细胞的杀伤作用，尤其是在5μM奥拉帕尼预处理组(即先利用奥拉帕尼处理再提供CAR-T细胞进行处理中，促进杀伤效果最为显著，比5μM奥拉帕尼联合治疗组(即先利用奥拉帕尼处理，再同时使用奥拉帕尼和CAR-T细胞进行处理的杀伤效果更好，这表明较高浓度的奥拉帕尼可能会对CAR-T的生长造成一定程度的抑制。但与CAR-T单独治疗组相比较，5μM奥拉帕尼联合治疗组仍具有较高的协同致死效果。

在奥拉帕尼预处理组、奥拉帕尼联合治疗组与CAR-T单独治疗组相比，E0771-EGFRvIII细胞与CAR-细胞共培养上清中IFN-γ的水平显著增加，表明奥拉帕尼能够有效提高CAR-T细胞的对于肿瘤细胞的杀伤能力。奥拉帕尼预处理组的CAR-T与癌症细胞共同孵育后，CAR-T细胞的增殖并未受到明显影响；而奥拉帕尼联合治疗组由于共培养环境中存在奥拉帕，会对CAR-T细胞的增殖略有抑制，但并没有统计学意义。奥拉帕尼预处理组的CAR-T与癌症细胞共同孵育后，CAR-T细胞表面与耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达并未发生明显变化；奥拉帕尼联合治疗组中，CAR-T细胞表面与耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达也未发生明显变化。这提示奥拉帕尼处理并不会导致CAR-T的耗竭，从而不会影响效应T细胞的杀伤作用，显示奥拉帕尼与CAR-T细胞联合使用。

申请人在试验中发现利用本申请的方法或药物制剂或试剂盒能够有效地提高肿瘤组织CAR-T拷贝数、提高肿瘤组织中IFN-γ的表达水平、提高肿瘤组织中CD8+T细胞免疫细胞浸润、提高CD45+免疫细胞浸润，降低CD11b⁺Gr1⁺的MDSCs细胞侵润、降低CD31+细胞浸润。

进一步体内实验中发现，CAR-T细胞联合50mg/kg奥拉帕尼治疗能明显增加小鼠体内肿瘤组织中的CAR的拷贝数、改善肿瘤免疫抑制性环境，且不影响小鼠体重，但能明显抑制小鼠乳腺癌的肿瘤体积和肿瘤重量，说明奥拉帕尼可能通过将CAR-T细胞归巢至中肿瘤局部并且活化增殖来显著提高CAR-T细胞抑制肿瘤细胞生长作用。体外实验中，另一个PARP抑制剂veliparib在10μM及以上的浓度水平能够影响E0771ERVIII细胞的增殖水平，在20μM以上才能显著抑制E0771ERVIII细胞的增殖，但是在该浓度下对小鼠CAR-T细胞增殖造成显著的抑制作用；LDH细胞杀伤实验中发现10μM Veliparib不能够提高CART细胞的杀伤作用。另一种小分子药物JQ1，是一种BET bromodomain抑制剂，作用于BRD4，通过靶向抑制BRD4，可以诱发肿瘤细胞凋亡即增殖减缓，从而达到抗肿瘤作用。体外实验中，应用不同浓度的JQ1处理E0771ERVIII细胞细胞48h后，发现JQ1不能够抑制E0771ERVIII细胞的增殖，但是对小鼠T细胞和CAR-T细胞增殖造成显著的抑制作用，并且呈剂量依赖性。

申请人还发现，本申请不仅可以提高难治型癌症的抗癌效果，在使用CAR-T细胞时，还不需要进行淋巴细胞清除，从而大大减轻清淋造成的抗癌治疗效果低以及减轻对正常组织的损伤所造成的毒副作用，尤其是对骨髓的严重抑制。

在具体实施方式中，PARP抑制剂能以其本身安全的口服或非口服给药，或者以和药学上可接受的载体赋形剂及其他添加剂形成的化合物(如片剂、缓释制剂、胶囊剂、注射剂、溶液剂)安全的口服或非口服给药。当口服给药时，组合物可配制成片剂、糖衣剂或胶囊。为制备口服组合物可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为蹦解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗黏合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份蹦解添加剂组成混合物，该混合物与黏合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其他的蹦解剂，润滑剂和抗黏剂将此混合物压片。为增加溶解性可将杂环类衍生物游离后制成药学上可接受的有机酸，较好地为甲磺酸，富马酸等以有利于以注射剂形式给药，虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变。

在具体实施方式中，PARP抑制剂为用于治疗晚期乳腺癌、卵巢癌等的口服化疗药物奥拉帕尼(Olaparib、AZD2281)。

在某些实施方案中，患有肿瘤的个体每天口服奥拉帕尼的剂量约为700、650、600、550、500、450、400、350、300、290、280、270、260、250、240、 230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mg。

本申请中免疫效应细胞和PARP抑制剂给予时间不分先后；可以先给予PARP抑制剂再给予免疫效应细胞；也可以同时给药；还可以先给予免疫效应细胞再给予PARP抑制剂。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在PARP抑制剂给予之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在PARP抑制剂给予之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。

术语“免疫效应细胞”，是指参与免疫应答，产生免疫效应的细胞，如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。优选的，所述的免疫效应细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞。

在具体实施方式中，T细胞是自体T细胞、异种T细胞或同种异体T细胞。

在具体实施方式中，自然杀伤细胞是同种异体NK细胞。

术语“免疫效应细胞活性”是指免疫效应细胞接受抗原刺激而发生反应、增殖形成免疫效应物质并能进行特性免疫反应的能力。例如促进对靶细胞的杀伤或者抑制其生长或增殖。

术语“治疗有效量”、和“有效量”在本文中可互换地使用，是指有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量，例如但不限于足以促进T细胞应答的量或剂量。当指示“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“抑制肿瘤有效量”或“治疗有效量”时，本申请的免疫效应细胞、或治疗剂的精确给药数量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。有效量的免疫效应细胞是指但不限于能使免疫效应细胞抗肿瘤活性增加、增强或延长；抗肿瘤免疫效应细胞或活化免疫效应细胞数目的增加；促进IFN-γ分泌；肿瘤消退、肿瘤缩小、肿瘤坏死的免疫效应细胞的数量。

术语“不清淋”或“不进行淋巴细胞清除”，即不清除受试者体内的淋巴细胞。包括但不限于不给予淋巴细胞清除剂、全身辐射治疗或其组合或其他引起淋巴细胞数量清除的手段；但是，在给予了淋巴细胞清除剂、全身辐射治疗或其组合或其他引起淋巴细胞数量清除的手段后，当受试者体内淋巴细胞清除率低于60％，我们认为，虽然给予了清淋处理，但并没有达到淋巴细胞清除的效果，也将以等同落入本申请“不清淋”的范畴。

本文所用的“嵌合受体”，即用基因重组技术将不同来源的DNA片段或蛋白质相应的cDNA连接而成的融合分子，包括胞外域、跨膜域和胞内域。嵌合受体包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)、修饰的T细胞(抗原)受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)。

本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面， CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导。

本文所用的“跨膜结构域”，指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域，可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与嵌合受体的其它结构域中的一个有关的结构域，例如，在一种实施方式中，所述跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在某些情况下，跨膜结构域可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜结构域能够与表达嵌合受体的细胞表面上的另一个嵌合受体同型二聚化。跨膜结构域可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任何膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜结构域能够向胞内结构域传导信号，无论何时所述嵌合受体与靶结合。在本申请中特别使用的跨膜结构域可以包括至少以下的跨膜结构域:例如，T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在某些实施方式中，跨膜结构域可以包括至少下述跨膜区域:例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、 BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。

在某些情况下，跨膜结构域可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至CAR的胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质区之间形成键。甘氨酸-丝氨酸二联体提供一种特别合适的接头。

本文所用的“胞内结构域”与”细胞质结构域”具有相同含义,包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责其中已经引入嵌合受体的免疫细胞的正常免疫效应子功能中至少一个的活化。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。T免疫细胞的免疫效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导免疫效应子功能信号且引导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常可以应用全部胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导免疫效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以转导免疫效应功能信号的胞内信号传导结构域的截短部分。

具体来说，本申请使用的嵌合抗原受体具有：(i)特异性识别肿瘤抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或(ii)特异性识别肿瘤抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信结构域和CD3ζ；或(iii)特异性识别肿瘤抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

在具体的实施例中，采用了小鼠CD8α信号肽、鼠CD8α铰链区及跨膜区、鼠CD28胞内域，以及鼠CD3ζ胞内域。

在具体的实施例中，可采用人CD8α信号肽、人CD8α铰链区及跨膜区、人的CD28跨膜域、人CD28胞内域、人CD3ζ胞内域。

众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的:通过TCR引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。

术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的提供细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与MHC-抗原肽复合物的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别地用于本申请的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本申请的任一个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本申请的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是来自人或非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。

术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、 CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，以及特异性地结合CD83的配体。

共刺激性胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及特异性地结合CD83的配体等。

胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。

术语“4-1BB”是指具有如GenBank Accession No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Accession No.AAA62478.2的氨基酸残基214～255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为来自人或者来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。

术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')₂、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(如sdAb)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。

术语“抗体轻链”是指以其天然存在构型存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(l)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者都包括。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，能够编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本申请包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。

“肿瘤抗原”指的是过度增生性疾病发生、发展过程中新出现的或过度表达的的抗原。在某些方面，本申请的过度增生性病症是指肿瘤。本申请的肿瘤抗原为EGFR或EGFRvIII。EGFR在很多肿瘤中过量表达或变异。迄今为止，针对EGFR287-302表位的抗体被认为可以达到识别肿瘤表面过量表达EGFR、EGFRvIII、de4EGFR的目的。

在本申请至少一个具体实施方式中，特异性识别肿瘤抗原的抗体为靶向EGFR或EGFRvIII的抗体。在本申请至少一个具体实施方式中，特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQID NO:16所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:24所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，或者特异性识别肿瘤抗原的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。

在本申请至少一个具体实施方式中，本申请的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID NO:30所示，或如SEQ ID NO:31所示，或如SEQ ID NO:32所示，或如SEQ ID NO:33所示，或如SEQ ID NO:34所示，或如SEQ ID NO:35所示，或如SEQ ID NO:36所示，或如SEQ ID NO:37所示，或如SEQ ID NO:38所示，或如SEQ ID NO:39所示，或如SEQ ID NO:40所示，或如SEQID NO:41所示，或如SEQ ID NO:42所示，或如SEQ ID NO:43所示，或如SEQ ID NO:44所示，或如SEQ ID NO:45所示，或如SEQ ID NO:46所示，或如SEQ ID NO:47所示，或如SEQ ID NO:48所示，或如SEQ ID NO:49所示，或如SEQ ID NO:50所示，或如SEQ ID NO:51所示，或如SEQID NO:55所示，或如SEQ ID NO:56所示，或如SEQ ID NO:57所示，或如SEQ ID NO:58所示，或如SEQ ID NO:59所示，或如SEQ ID NO:60所示，或如SEQ ID NO:61所示，或如SEQ ID NO:62所示，或如SEQ ID NO:63所示，或如SEQ ID NO:64所示，或如SEQ ID NO:65所示，或如SEQID NO:66所示，或如SEQ ID NO:67所示，或如SEQ ID NO:68所示，或如SEQ ID NO:69所示，或如SEQ ID NO:70所示，或如SEQ ID NO:71所示，或如SEQ ID NO:72所示，或如SEQ ID NO:73所示，或如SEQ ID NO:74所示，或如SEQ ID NO:75所示，或如SEQ ID NO:76所示，或如SEQID NO:77所示，或如SEQ ID NO:78所示，或如SEQ ID NO:79所示，或如SEQ ID NO:80所示，或如SEQ ID NO:81所示，或如SEQ ID NO:82所示，或如SEQ ID NO:83所示，或如SEQ ID NO:84所示，或如SEQ ID NO:85所示，或如SEQ ID NO: 86所示，或如SEQ ID NO:87所示。

术语“癌症肿瘤”指特征在于在体外(例如经转化的细胞)或体内的过度增殖性细胞生长的广泛病症类别。可以通过本发明的方法治疗或预防的病况包括例如各种赘生物，包括良性或恶性肿瘤，各种增生等等。本申请的方法可以实现这样的病况中所牵涉的不希望有的过度增殖性细胞生长的抑制和/或逆转。癌症的具体例子包括包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌，白血病，淋巴瘤，鼻咽癌，血液癌症，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生血管癌，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。

术语“特异性地结合”是指识别并且结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其它分子。

术语“难治”指的是一种疾病，例如，肿瘤，其不应答治疗。在实施方案中，难治性肿瘤可以是对治疗开始前或开始时的治疗有抗性。在其他实施方案中，难治性肿瘤可以成为治疗期间抗性的。难治性肿瘤也称为抗性肿瘤。在本申请中，难治性肿瘤包括但不限于放疗不敏感、放疗后复发、化疗不敏感、化疗后复发、对CAR-T治疗不敏感或治疗后复发的肿瘤。难治性或复发性恶性肿瘤可以使用本文中描述的治疗方案。

如本文所用“复发的”是指在一段改进期，例如，在疗法，例如癌症疗法的先前治疗后，返回疾病(例如癌症)或疾病如癌症的体征和症状。

术语“个体”和“受试者”在本文中具有同等含义，可以是人和来自其他种属的动物。

术语“增强”指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如，增强的应答可以包含应答性中5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或更多的增加。如本文使用的，“增强”还可以指增加响应治疗例如免疫效应细胞疗法的受试者数目。例如，增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比，其中百分比是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％更多。

在一个方面，治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加，促进IFN-γ、TNFa分泌,或其组合决定。在另一个方面，临床结果是肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大，复发或扩散或其组合。在一个另外方面，治疗效应通过T细胞的存在、指示T细胞炎症的基因标记的存在，促进IFN-γ、TNFa分泌,或其组合预测。

如本文公开的免疫效应细胞可以通过各种途径施用于个体，包括例如经口或肠胃外，例如静脉内、肌内、皮下、眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、瘤内、鼻内(intravasally)、皮内或者分别使用例如皮肤贴片或透皮离子电渗疗法通过皮肤的被动或促进吸收。

在实践本申请的方法中待施用的试剂总量可以作为单一剂量以推注或通过在相对短时间段的输注，施用于受试者，或可以使用分级治疗方案进行施用，其中在延长时间段施用多个剂量。本领域技术人员将知道治疗受试者中的病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康、以及施用途径和待施用的治疗次数。考虑到这些因素，技术人员将根据需要调整具体剂量。一般而言，最初，使用I期和II期临床试验测定组合物的配制以及施用途径和频率。

范围：在整个公开中，本申请的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本申请的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、97～98 ％和98～99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。

根据本公开内容，本领域技术人员应了解在所公开的具体实施方案中可以作出许多变化或改变，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的精神和范围。本发明在范围上并不受限于本文描述的具体实施方案(其仅预期作为本发明的各方面的举例说明)，并且功能等同的方法和组分在本发明的范围内。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本申请的示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，参考例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、国际专利申请公开号WO2017186121A1、WO2018006882A1、WO2015172339A8、WO2018018958A1中公开的那些。

实施例1 CAR-T细胞的构建

本实施例采用靶向EGFRvIII的二代CAR，为了后期动物实验的需要，采用鼠的基因序列构建CAR的跨膜域和胞内域。

将小鼠CD8α信号肽的编码序列(SEQ ID NO：1)、抗EGFRvIII单抗抗体的编码序列(SEQ ID NO：2)、鼠CD8α铰链区及跨膜区的编码序列(SEQ ID NO：3)、鼠CD28胞内域的编码序列(SEQ ID NO：4)、鼠CD3ζ胞内域的编码序列(SEQ ID NO：5)依次连接，通过体外基因合成的方法获得806-mCD28z基因片段，并用Mlu Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点置换逆转录病毒载体MSCV-IRES-GFP(购自Addgene)中的IRES-GFP片段，获得重组载体MSCV-806-mCD28z(图1A)。在本实施例1中SEQ ID NO：2编码的抗体氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，实施例1构建的CAR细胞的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示。

用重组载体MSCV-806-mCD28z感染293T细胞(购自ATCC)，得到包装后的逆转录病毒。感染方法为本领域表达嵌合抗原受体的T细胞制备过程中常规的感染方法。

研磨C57BL/6小鼠的脾脏获取淋巴细胞，经过CD3+小鼠T细胞负性筛选试剂盒处理后，将获得的小鼠CD3+T淋巴细胞按1：1的体积比加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28磁珠活化刺激，放入细胞培养箱中，培养基为RPMI1640完全培养基(10％FBS+50μMβ-巯基乙醇+100U/mL的IL-2+1ng/mL IL-7)。

将活化24h的小鼠脾脏CD3+T淋巴细胞接种于Retronectin(5μg/mL)包被的24孔板中，加入逆转录病毒感染24h后，更换新鲜培养基，得到小鼠的806-mCD28z-CAR-T细胞。利用流式细胞术检测CAR-T细胞感染的阳性率，806-mCD28z-CAR-T细胞感染的阳性率为70.7％(图1B)。

实施例2 CCK8实验检测奥拉帕尼对乳腺癌细胞及CAR-T细胞的毒性

由于EGFR287-302表位仅在EGFRvIII或过表达EGFR的肿瘤中才暴露，而在正常组织中该表位隐匿(Gan HK et al.,Targeting of a conformationally exposed,tumor-specific epitope of EGFR as a strategy for cancer therapy.Cancer Res,2012,72(12):2924-2930.)。所以利用分子生物学常规手段建立过表达嵌合有人EGFR第287-302位氨基酸表位的小鼠EGFR的E0771、4T1小鼠乳腺癌细胞模型(E0771-EGFRvIII、4T1-EGFRvIII)。对细胞流式进行流式分选筛选EGFRvIII靶点阳性的细胞进行后续研究(图2A)。E0771、4T1细胞购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。

奥拉帕尼作为PARP1的有效抑制剂，能够抑制PARP1参与的DNA损伤修复过程。在小鼠乳腺癌细胞系和小鼠T细胞及CART细胞中，检测到均有不同程度PARP1的表达(图2B)，因此需要进行CCK8增殖实验，检测奥拉帕尼对肿瘤细胞和CART细胞增殖的作用。

取实施例1中的806-m28Z CAR-T细胞，将其铺于96孔板中，每孔1×10⁴个细胞，100μl培养基。取乳腺癌细胞E0771-EGFRvIII和4T1-EGFRvIII铺于96孔板中，每孔1×104个细胞，100μl培养基。分别取不同溶度的奥拉帕尼加入到细胞中，做成10个浓度梯度(即奥拉帕尼处理浓度分别为50μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0μg/ml)。不同组别的细胞经过48h药物处理后，每孔加入10μl CCK8底物显色试剂(Dojindo公司)，37℃孵育1h后，酶标仪测定450nm处吸光度，分别计算细胞活力。

计算细胞活力的公式如下所示：

细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]

结果如图2C所示，分别加入不同浓度的奥拉帕尼处理806-mCD28z-CAR-T细胞、4T1-EGFRvIII细胞及E0771-ERVIII细胞后，806-mCD28z-CAR-T细胞及E0771-EGFRVIII细胞的生长均有一定程度的抑制；其中，806-mCD28z-CAR-T细胞在2.5μM及更高浓度奥拉帕尼处理下，其增殖得到了一定程度的抑制，抑制率近80％；而E0771-EGFRVIII细胞系在1μM及更高浓度的奥拉帕尼浓度处理后，其增殖受到了抑制，抑制率为65％-90％；4T1-EGFRvIII细胞系在1μM及更高浓度的奥拉帕尼浓度处理后，其增殖受到了抑制，抑制率为30-40％(图2C)。这说明奥拉帕尼对806-mCD28z-CAR-T细胞和E0771-EGFRVIII、4T1-EGFRvIII细胞的生长作用浓度是不同的，同时提示应该选择合适的奥拉帕尼药物浓度开展后续的研究。由于在1μM奥拉帕尼处理下，E0771-EGFRVIII、4T1-EGFRvIII细胞的增殖受到抑制，但是806-mCD28z-CAR-T细胞的增殖并未受到影响；而在5μM奥拉帕尼处理下，E0771-EGFRVIII、4T1-EGFRvIII细胞和806-mCD28z-CAR-T细胞的增殖都受到了抑制，因此选取两种奥拉帕尼的浓度，以明确在不同浓度下和不同细胞反应状态下，奥拉帕尼与CAR-T联合治疗乳腺癌的效果。因此，在后续实验中，选择1μM和5μM奥拉帕尼进行研究。

实施例3细胞毒性实验检测奥拉帕尼预处理后加CAR-T治疗或奥拉帕尼和CAR-T联合用药对肿瘤的杀伤作用以及ELISA实验检测奥拉帕尼对细胞因子颗粒酶素B、IL-2、IFN-γ分泌的影响

与抗原靶点阴性的细胞共同孵育实验分组：分为UTD组和806-mCD28z-CAR-T组(或表示为806-28Z)。取实施例1中的未处理的小鼠T细胞、806-mCD28z-CAR T细胞分别与E0771或4T1细胞按1:3、1:1、3:1共孵育，16h后使用Cytox 96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay检测上清中LDH的分泌，并计算806-mCD28z CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性。如图3A所示，806-mCD28z-CAR T细胞对抗原阴性的靶细胞没有杀伤作用

与抗原靶点阳性的细胞共同孵育实验分组：分为UTD组、806-mCD28z-CAR-T组(或表示为806-28Z)、奥拉帕尼预处理组和奥拉帕尼联合治疗组；

其中，UTD组为未处理的小鼠T细胞；

奥拉帕尼预处理组包括：UTD+1μM奥拉帕尼预处理组(或表示为UTD+Olaparib 1μMpretreatment)、UTD+5μM奥拉帕尼预处理组(或表示为UTD+Olaparib 5μM pretreatment)、806-mCD28z-CAR-T+1μM奥拉帕尼预处理组(或表示为806-28Z+Olaparib 1μMpretreatment)、806-mCD28z-CAR-T+5μM奥拉帕尼预处理组(或表示为806-28Z+Olaparib 5μM pretreatment)；

奥拉帕尼联合治疗组：UTD+1μM奥拉帕尼联合治疗组(或表示为UTD+Olaparib 1μM)、UTD+5μM奥拉帕尼联合治疗组(或表示为UTD+Olaparib5μM)、806-mCD28z-CAR-T+1μM奥拉帕尼联合治疗组(或表示为806-28Z+Olaparib 1μM)、806-mCD28z-CAR-T+5μM奥拉帕尼联合治疗组(或表示为806-28Z+Olaparib5μM)。

奥拉帕尼预处理组：将E0771-EGFRVIII或4T1-EGFRvIII肿瘤细胞的培养基中分别加入不同浓度的奥拉帕尼(1μM、5μM)，37℃培养24h后，细胞经过胰酶消化处理，新鲜培养基重悬。取实施例1中的未处理的小鼠T细胞、806-mCD28z-CAR T细胞分别与不同浓度奥拉帕尼预处理后的E0771-EGFRvIII或4T1-EGFRvIII细胞按1:3、1:1、3:1共孵育，16h后使用Cytox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay检测上清中LDH的分泌，并计算806-mCD28z CAR T细胞对不同浓度奥拉帕尼预处理后的肿瘤细胞的杀伤毒性。具体检测步骤及计算方法见Promaga Cytox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay说明书(Promaga公司，REF:G1782)；同时利用ELISA试剂盒(联科生物CAT:1822)检测上清中细胞因子GranzymeB、IFN-γ、IL-2的分泌，具体实验步骤参考联科生物MouseGranzyme B、IFN-γ、IL-2ELISAkit说明书。

奥拉帕尼联合治疗组：将E0771-EGFRVIII或4T1-EGFRvIII肿瘤细胞的培养基中分别加入不同浓度的奥拉帕尼(1μM、5μM)，37℃培养24h后，细胞经过胰酶消化处理，新鲜培养基重悬。取实施例1中的未处理的小鼠T细胞、806-mCD28z-CAR-T细胞分别与不同浓度奥拉帕尼处理的E0771-EGFRvIII细胞或4T1-EGFRvIII按1:3、1:1、3:1共孵育，并在培养基中加入相应浓度的奥拉帕尼(1μM、5μM)继续处理16h后，使用Cytox 96 Non-RadioactiveCytotoxicity Assay检测上清中LDH的分泌并计算806-mCD28z CAR-T细胞对不同浓度奥拉帕尼预处理后的肿瘤细胞的杀伤毒性，具体检测步骤及计算方法见Promaga Cytox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay说明书(Promaga公司，REF:G1782)；同时利用ELISA试剂盒(联科生物CAT:1822)检测上清中细胞因子Granzyme B、IFN-γ、IL-2的分泌，具体实验步骤参考联科生物MouseGranzyme B、IFN-γ、IL-2ELISA kit说明书。

如图3A所示，使用奥拉帕尼能够明显提高CAR-T细胞对E0771-EGFRvIII和4T1-EGFRvIII细胞的杀作用，尤其是在5μM奥拉帕尼预处理组中，促进杀伤效果最为显著，比5μM奥拉帕尼联合治疗组的杀伤效果更好，这提示较高浓度奥拉帕尼可能会对CAR-T的生长造成一定程度的抑制。与CAR-T单独治疗组相比较，5μM奥拉帕尼联合治疗组仍具有较高的协同致死效果。

如图3B所示，奥拉帕尼预处理组、奥拉帕尼联合治疗组与CAR-T单独治疗组相比，E0771-EGFRvIII细胞与CART细胞共培养上清中IFN-γ的水平显著增加(Unpaired ttest，*表示p〈0.05,**表示p〈0.01,***表示p〈0.001，ns表示无统计学差异)；Granzyme B、IL-2的水平未见明显增加。本实验进一步证实奥拉帕尼能够明显提高CAR-T细胞的杀伤能力。4T1-EGFRvIII细胞与CAR-T细胞共培养上清中未见细胞因子水平的增加，说明，增强的杀伤效果来自奥拉帕尼和CAR-T细胞的联合作用。

实施例4奥拉帕尼对与小鼠乳腺癌细胞共培养的CAR-T增殖及耗竭相关蛋白表达的影响

实验分组：806-mCD28z-CAR-T组(或表示为806-28Z)、奥拉帕尼预处理组和奥拉帕尼联合治疗组；

奥拉帕尼预处理组包括：806-mCD28z-CAR-T+1μM奥拉帕尼预处理组(或表示为806-28Z+Olaparib 1μM pretreatment)、806-mCD28z-CAR-T+5μM奥拉帕尼预处理组(或表示为806-28Z+Olaparib 5μM pretreatment)；

奥拉帕尼联合治疗组：806-mCD28z-CAR-T+1μM奥拉帕尼联合治疗组(或表示为806-28Z+Olaparib 1μM)、806-mCD28z-CAR-T+5μM奥拉帕尼联合治疗组(或表示为806-28Z+Olaparib5μM)。

进行共同孵育实验前，806-mCD28z-CAR-T细胞需经过Cell Trace细胞染色。具体操作方法如下：每10⁶细胞在1mL 1640培养基中加入1μL的CellTrace染料，37℃避光处理20min；20min后，加入完全培养基处理5min后，离心弃上清。

奥拉帕尼预处理组：E0771-EGFRvIII或4T1-EGFRvIII肿瘤细胞的培养基中分别加入不同浓度的奥拉帕尼(1μM、5μM)，37℃培养24h后，细胞经过胰酶消化处理，新鲜培养基重悬。取实施例1中的806-mCD28z-CAR T细胞分别与不同浓度奥拉帕尼预处理后的E0771-EGFRvIII或4T1-EGFRvIII细胞按1:1共孵育，16h后应用流式检测CAR-T细胞增殖情况以及CAR-T细胞表面与T细胞耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达水平。

奥拉帕尼联合治疗组：将E0771-EGFRVIII或4T1-EGFRvIII肿瘤细胞的培养基中分别加入不同浓度的奥拉帕尼(1μM、5μM)，37℃培养24h后，细胞经过胰酶消化处理，新鲜培养基重悬。取实施例1中的806-mCD28z-CAR T细胞分别与不同浓度奥拉帕尼预处理后的E0771-EGFRvIII或4T1-EGFRvIII细胞按1:1共孵育，并在培养基中加入相应浓度的奥拉帕尼(1μM、5μM)16h后，应用流式检测CAR-T细胞增殖情况以及CAR-T细胞表面与T细胞耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达水平。

如图4A所示，奥拉帕尼预处理组的CART与靶细胞共同孵育后，CART细胞的增殖并未受到明显影响；而奥拉帕尼联合治疗组由于共培养环境中存在奥拉帕尼，会对CART细胞的增殖略有抑制，但并没有统计学意义。

如图4B所示，奥拉帕尼预处理组的CART与靶细胞共同孵育后，CART细胞表面与耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达并未发生明显变化；奥拉帕尼联合治疗组中，CART细胞表面与耗竭相关的蛋白PD1、LAG3和TIM3的表达并未发生明显变化，这提示奥拉帕尼处理并不会导致CART的耗竭，从而不会影响效应T细胞的杀伤作用。

实施例5奥拉帕尼与CAR-T联合治疗小鼠E0771-EGFRvIII原位乳腺癌移植瘤

(1)小鼠原位乳腺癌模型的建立及分组治疗：

收集处于对数生长期且生长良好的E0771-EGFRvIII细胞，接种5×10⁵靶细胞于C57BL/6小鼠(免疫系统正常的小鼠)的右侧第三对副乳位置，肿瘤细胞接种日记为第1天(即Day1)。

接种肿瘤后第10天(即Day10)，取小鼠T细胞并按本实施例步骤1所述构建806-mCD28z-CAR-T细胞系。

接种肿瘤后第14天(即Day14)，肿瘤体积约达到150mm³进行分组：

奥拉帕尼原液配方：奥拉帕尼依次加入4％DMSO+30％PEG300+66％ddH₂O，以5mg/mL作为储存液；

奥拉帕尼给药方式为腹腔给药，每只小鼠注射量为50mg/kg，小鼠体重约20g，因此每只注射200μL；对照组别中给予200μL溶剂处理(4％DMSO+30％PEG 300+66％ddH₂O)。

将小鼠分为6组，每组6只，具体体内实验流程如图5A所示：

UTD组：Day 14腹腔输注200μL溶剂/日，每日一次，连续5日，间隔2日再腹腔输注200μL溶剂/日，每日一次，连续5日；Day21尾静脉输注未经病毒感染5×10⁶的小鼠T细胞；

Olaparib(50mg/kg)组：Day 14腹腔输注50mg/kg奥拉帕尼/日每日一次，连续5日，间隔2日再腹腔输注50mg/kg奥拉帕尼/日，每日一次，连续5日；Day21尾静脉输注未经病毒感染5×10⁶的小鼠T细胞；

CAR-T(2×10⁶)组：Day 14腹腔输注200μL溶剂/日，每日一次，连续5日，间隔2日再腹腔输注200μL溶剂/日，每日一次，连续5日；Day21尾静脉输注2×10⁶的806-mCD28z-CAR-T细胞；

Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(2×10⁶)组：Day 14腹腔输注50mg/kg奥拉帕尼/日每日一次，连续5日，间隔2日再腹腔输注50mg/kg奥拉帕尼/日，每日一次，连续5日；Day21尾静脉输注2×10⁶的806-mCD28z-CAR-T细胞；

CAR-T(5×10⁶)组：Day 14腹腔输注200μL溶剂/日，每日一次，连续5日，间隔2日再腹腔输注200μL溶剂/日，每日一次，连续5日；Day21尾静脉输注5×10⁶的806-mCD28z-CAR-T细胞；

Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组：Day 14腹腔输注50mg/kg奥拉帕尼/日每日一次，连续5日，间隔2日再腹腔输注50mg/kg奥拉帕尼/日，每日一次，连续5日；Day21尾静脉输注5×10⁶的806-mCD28z-CAR-T细胞。

(2)瘤体积的检测。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化，每周记录三次。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²)/2。

小鼠肿瘤体积检测结果如图5B所示，结果表明：在肿瘤接种后的第35天，与CAR-T(2×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(2×10⁶)组小鼠的肿瘤体积明显减小；与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)小鼠的肿瘤体积明显减小。上述结果提示CAR-T细胞联合奥拉帕尼能够有效抑制小鼠乳腺癌的生长((Two-way ANOVA withBonferroni post-tests，*表示p〈0.05,**表示p〈0.01))。

同时，检测到各组小鼠体重变化不明显(如图5C所示)，提示奥拉帕尼联用并未对与CAR-T细胞联合治疗造成明显的毒性作用。

(3)抑瘤率和瘤重的测量。在肿瘤接种后的第35天，将小鼠实施安乐死，剥离小鼠乳腺原位肿瘤并称量瘤重，具体统计结果如图5D所示。与CAR-T(2×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(2×10⁶)组小鼠的抑瘤效率和肿瘤重量明显减小(***表示p〈0.001，Unpaired t test)；与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib (50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)小鼠的抑瘤效率和肿瘤重量明显减小(***表示p〈0.001，Unpaired t test)。

这提示奥拉帕尼的联用能提高CAR-T细胞抑制肿瘤生长作用，对小鼠乳腺癌的抗肿瘤效果更好。

(4)肿瘤组织CAR-T拷贝数检测。对各组小鼠肿瘤组织进行研磨抽提DNA，利用Taqman探针法检测逆转录病毒载体片段序列用来确定806-mCD28z-CAR的DNA拷贝数；

Taq探针法引物序列如下：

正向引物Forward：5’-GACGTTGGGTTACCTTCTG C-3’(SEQ ID No.52)

反向引物Reverse：5’-TTCCCAGGTCACGATGTAGG-3’(SEQ ID No.53)

探针引物序列：5’-(FAM)-ATGGCCGCGA GACGGCACCT-(BHQ1)-3’(SEQ ID No.54)

实验结果如图5E所示，与CAR-T(2×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(2×10⁶)组小鼠的肿瘤内CAR的拷贝数明显增加(Unpaired t test，*表示p〈0.05)；与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组小鼠的肿瘤内CAR的拷贝数明显增加(Unpaired t test，**表示p〈0.01)。上述结果说明奥拉帕尼联用提高CAR-T细胞在肿瘤组织中存活、扩增，起到提高抗肿瘤的作用。

(5)肿瘤组织CD4/CD8/CD31免疫组化检测。对各组小鼠肿瘤组织的石蜡切片进行免疫组化染色。CD4和CD8能够反映T细胞浸润组织情况，CD31能够反映肿瘤组织内血管新生水平。如图5F所示，各组小鼠肿瘤组织内CD4⁺T细胞浸润未见明显区别，没有统计学差异；但是与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组小鼠的肿瘤内CD8⁺T浸润明显增加(Unpaired t test，*表示p〈0.05)。此外，与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组小鼠肿瘤组织中CD31⁺细胞也较少，提示新生血管也受到抑制。上述结果，说明奥拉帕尼联用能够提高具有杀伤能力的CD8⁺T细胞在肿瘤组织中的侵润，从而发挥抗肿瘤的作用。

(6)肿瘤组织MDSC细胞(Myeloid-dereved suppressor cells,骨髓来源的抑制性细胞)检测。对各组小鼠肿瘤组织进行研磨，酶消化后，进行流式分析MDSC细胞比例的变化。如图5G所示，与CAR-T(2×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(2×10⁶)组小鼠的肿瘤组织中CD45⁺免疫细胞浸润明显增加，但是CD11b⁺Gr1⁺的MDSCs细胞侵润明显降低；与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib (50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)小鼠的肿瘤组织中CD45+免疫细胞浸润明显增加，但是CD11b⁺Gr1⁺的MDSCs细胞侵润明显降低。MDSCs细胞能够产生肿瘤免疫抑制性微环境，不利于CART发挥杀伤肿瘤的作用。因此，上述结果，说明奥拉帕尼联用能够改善肿瘤免疫抑制性环境，从而促进CAR-T发挥抗肿瘤的作用。

实施例6奥拉帕尼与CAR-T联合治疗小鼠4T1-EGFRvIII原位乳腺癌移植瘤

(1)小鼠原位乳腺癌模型的建立及分组治疗：

收集处于对数生长期且生长良好的4T1-EGFRvIII细胞，接种5×10⁵靶细胞于BABL/C小鼠(免疫系统正常的小鼠)的右侧第三对副乳位置，肿瘤细胞接种日记为第1天(即Day1)。

接种肿瘤后第14天(即Day14)，肿瘤体积约达到150mm³进行分组：

将小鼠分为4组，每组6只，具体体内实验流程如图6A所示：

小鼠肿瘤体积检测结果如图6B所示，结果表明：在肿瘤接种后的第35天，与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)小鼠的肿瘤体积明显减小。上述结果提示CAR-T细胞联合奥拉帕尼能够有效抑制小鼠乳腺癌的生长(Two-way ANOVA withBonferroni post-tests，*表示p〈0.05)。

同时，检测到各组小鼠体重变化不明显(如图6C所示)，提示奥拉帕尼联用并未对与CAR-T细胞联合治疗造成明显的毒性作用。

(3)抑瘤率和瘤重的测量。在肿瘤接种后的第35天，将小鼠实施安乐死，剥离小鼠乳腺原位肿瘤并称量瘤重，具体统计结果如图6D所示。与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)小鼠的抑瘤效率和肿瘤重量明显减小(*表示p〈0.05，Unpairedt test)。

Taq探针法引物序列如下：

正向引物Forward：5’-GACGTTGGGTTACCTTCTG C-3’(SEQ ID No.52)

反向引物Reverse：5’-TTCCCAGGTCACGATGTAGG-3’(SEQ ID No.53)

探针引物序列：5’-(FAM)-ATGGCCGCGA GACGGCACCT-(BHQ1)-3’(SEQ ID No.54)

实验结果如图6E所示，与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组小鼠的肿瘤内CAR的拷贝数明显增加(Unpaired t test，**表示p〈0.01)。上述结果说明奥拉帕尼联用提高CAR-T细胞在肿瘤组织中存活、扩增，起到提高抗肿瘤的作用。

(5)肿瘤组织CD4/CD8/CD31免疫组化检测。对各组小鼠肿瘤组织的石蜡切片进行免疫组化染色。CD4和CD8能够反映T细胞浸润组织情况，CD31能够反映肿瘤组织内血管新生水平。如图6F所示，各组小鼠肿瘤组织内CD4⁺T细胞浸润未见明显区别，没有统计学差异；但是与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组小鼠的肿瘤内CD8⁺T浸润明显增加(Unpaired t test，*表示p〈0.05)。此外，与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)组小鼠肿瘤组织中CD31⁺细胞也较少，提示新生血管也受到抑制。上述结果，说明奥拉帕尼联用能够提高具有杀伤能力的CD8⁺T细胞在肿瘤组织中的侵润，从而发挥抗肿瘤的作用。

(6)肿瘤组织MDSC细胞检测。对各组小鼠肿瘤组织进行研磨，酶消化后，进行流式分析MDSC细胞比例的变化。如图6G所示，与CAR-T(5×10⁶)组相比，Olaparib(50mg/kg)+CAR-T(5×10⁶)小鼠的肿瘤组织中CD45⁺免疫细胞浸润明显增加，但是CD11b⁺Gr1⁺的MDSCs细胞侵润明显降低。MDSCs细胞能够产生肿瘤免疫抑制性微环境，不利于CART发挥杀伤肿瘤的作用。因此，上述结果，说明奥拉帕尼联用能够改善肿瘤免疫抑制性环境，从而促进CART发挥抗肿瘤的作用。

在上述实施例中，仅仅是作为示例性的，采用了靶向EGFRvIII的鼠抗(SEQ ID NO：11)、鼠的跨膜域和胞内域等制备的CAR-T，当应用于人体治疗时，常用的可以选择人CD8α信号肽的编码序列(SEQ ID NO：6)、人CD8α铰链区及跨膜区的编码序列(SEQ ID NO：7)、人的CD28跨膜域的编码序列(SEQ ID NO：10)、人CD28胞内域的编码序列(SEQ ID NO：8)、人CD3ζ胞内域的编码序列(SEQ ID NO：9)进行制备。示例性的，所采用的靶向EFGRvIII的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：30-51或SEQ ID NO：55-87中的任一所示。

本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.表达有识别肿瘤抗原的受体的免疫效应细胞和PARP抑制剂在制备药物中的应用，其中，所述药物为治疗肿瘤的药物或降低癌细胞生长、存活或活力的药物；

其中，所述肿瘤抗原是EGFRvIII；

其中，所述PARP抑制剂为olaparib；

所述受体为嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor，CAR），所述免疫效应细胞为CAR-T细胞，所述CAR-T细胞特异性识别EGFRvIII；所述CAR-T细胞有抗肿瘤活性；所述肿瘤为乳腺癌；

所述嵌合抗原受体具有特异性识别EGFRvIII的抗体；所述特异性识别EGFRvIII的抗体是如下氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:11~ SEQ ID NO:29中的任一项。

2.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述的CAR-T细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞。

3.如权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述的CAR-T细胞为自体T细胞。

4. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有：

（i）特异性识别EGFRvIII的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

（ii）特异性识别EGFRvIII的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

（iii）特异性识别EGFRvIII的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的嵌合抗原受体是如下氨基酸序列，所述氨基酸选自SEQ ID NO:30~ SEQ ID NO:51、以及SEQ ID NO:55~SEQ ID NO:87中的任一项。

6. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，

所述应用提高肿瘤组织CAR-T拷贝数，和/或

所述应用提高肿瘤组织中IFN-γ的表达水平，和/或

所述应用提高肿瘤组织中CD8+T细胞免疫细胞浸润，和/或

所述应用提高CD45+免疫细胞浸润，和/或

所述应用降低CD11b+Ly6G+的MDSCs细胞侵润，和/或

所述应用降低CD31+细胞浸润。

7.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用不会引起PD1、LAG3、和/或TIM3的表达显著下降。

8.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，给予CAR-T细胞和olaparib的方式选自以下中的任意：

(1)先给予olaparib再给予CAR-T细胞，

(2)同时给予CAR-T细胞和olaparib，以及

(3)先给予CAR-T细胞再给予olaparib。

9.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的olaparib为口服给药、腹腔给药和/或注射给药。

10.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，对个体不进行淋巴细胞清除。

11.一种用于治疗肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

1)表达有识别肿瘤抗原的受体的免疫效应细胞；

2) olaparib；

3) 用于包含以上1)和2)所述物质的容器；和

4) 利用所述试剂盒治疗肿瘤的给药说明书；

其中，所述免疫效应细胞和olaparib的治疗效果大于所述免疫效应细胞和olaparib任一单独使用的效果；

其中，所述肿瘤抗原是EGFRvIII；

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的CAR-T细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞。

13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的CAR-T细胞为自体T细胞。

14. 如权利要求11-13中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有：

15. 如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述的嵌合抗原受体是如下氨基酸序列，所述氨基酸选自SEQ ID NO:30~ SEQ ID NO:51、以及SEQ ID NO:55~SEQ ID NO:87中的任一项。