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CN1131309C - 白细胞介素－6突变蛋白 - Google Patents

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CN1131309C
CN1131309C CN96180247A CN96180247A CN1131309C CN 1131309 C CN1131309 C CN 1131309C CN 96180247 A CN96180247 A CN 96180247A CN 96180247 A CN96180247 A CN 96180247A CN 1131309 C CN1131309 C CN 1131309C
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斯特凡·罗丝－约翰
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Abstract

本发明涉及一种新的IL-6突变蛋白，编码该突变蛋白的DNA序列、其在治疗中的用途以及包含该突变蛋白的药物组合物。这种新的IL-6突变蛋白是一种潜在的IL-6拮抗剂并且它可以有利地在治疗疾病中用作药物，在所说的疾病中IL-6具有病理遗传作用，这些疾病如浆细胞瘤/骨髓瘤、骨质疏松症和肿瘤以及自身免疫疾病。

Description

白细胞介素-6突变蛋白
发明领域
本发明涉及一种新的白细胞介素(IL)-6突变蛋白，编码该突变蛋白的DNA序列，其在药物学中的应用以及包含该突变蛋白的药物组合物。
发明背景
在受伤或感染的时候通过不同类型的细胞将IL-6释放入血浆中。IL-6涉及例如免疫防御、血细胞生成、巨核细胞成熟、血小板产生以及急性期反应(1)这样的活性谱。
除在宿主防御中起到重要的作用外，IL-6还与多种疾病的病理有关，例如浆细胞瘤、骨髓瘤、骨质疏松症和肿瘤以及自身免疫疾病(1)。
位于靶细胞上的IL-6受体复合物由两个不同的亚单位、即80-kDa的特异的配体结合亚单位(IL-6Ra)与130-kDa的信号转导蛋白(gp130)(2-4)组成。IL-6结合到IL-6Ra上，IL-6/IL-6Ra的复合物与gp130的二聚体有关，从而引发IL-6信号。IL-6自身对gp130不具有能测量到的亲和力(5，6)。
白介素-6的特征在于N-末端具有不均一性的蛋白质。已经报道(7)它有184种氨基酸(在本专利申请中将遵循该氨基酸编号)。二级结构预测和制作蛋白质模型表明IL-6为造血细胞因子家族的一个成员，其特点是具有四个反平行的a-螺旋(A，B，C和D)(8，9)。LIF(白血病抑制因子)、CNTF(睫状神经营养因子)、IL-11、CT-1(心脏营养因子(cardiotrophin)-1)与OSM(制瘤素M)也属于这一家族。这些物质在其受体复合物中都使用gp130蛋白，而这也可以解释它们具有重叠的生物活性(1，10，11)。
IL-6的缺失研究表明对该分子的生物活性而言，N-末端的28种氨基酸残基是不重要的。去除多于28种氨基酸将使上述蛋白质失活(12)。进一步的研究预示C-末端和A-B环的末端/B-螺旋的起点(区域2c，残基G77-E95)涉及与IL-6Rα的相互作用(9，13-16)。通过最近出版的人类IL-6模式(9)证实了上述结果，其中这两个区域是相邻的。
目前鉴定了IL-6与gp130的两个相互作用位点。
i.用中和mAbs的方法对IL-6蛋白进行的抗原决定基图形提供了残基Q152-T162(D-螺旋的起点)与gp130的相互作用有关的证据(17，18)。对嵌合的人类/小鼠IL-6蛋白的分析表明在IL-6的A-B环的起点处存在一个抗原决定基，该抗原决定基与接触和激活gp130有关(9，19)。最近通过用实验表明亮氨酸57与该相互作用有关而证实了这一结果(20)。该区域紧靠着螺旋D的起点，从而导致人们设想这两个区域一起形成了与一个gp130的共同相互作用的位点(9，19，21)。
ii.所确定的与gp130的第二个相互作用位点类似于GH(生长激素)/GHR2复合物的有关位点，其结构通过X-射线分析来确定(22)。据推测对与第二GHR的相互作用来说GH的重要部分同对与一个gp130的相互作用来说IL-6蛋白中的重要部分是一样的(23，24)。实际上，A-螺旋(Y31D/G35F)中两种氨基酸的取代以及C-螺旋(S118R/V121D)中两种氨基酸的取代也造成IL-6突变蛋白对IL-6Ra的亲和力基本正常，但却没有生物活性。这四种氨基酸对与第二gp130蛋白的相互作用似乎很重要(24，25)。
由于以前所讨论的IL-6与一些疾病的病理有关，因此开发IL-6活性的抑制剂便成为积极研究的主题。出于这一目的已经采用了不同的方法，其中包括使用抗IL-6、gp130或gp80的抗体；使用可溶的gp130；或者使用针对IL-6的突变蛋白或IL-6受体。
申请人已经研究了合成新的IL-6突变蛋白的可能性，这种突变蛋白可以起到IL-6受体拮抗剂的作用。出于这一目的，所遵循的一种科学方法为合成仍保留了结合IL-6Rα的能力、但却丧失了募集gp130的能力的突变蛋白。因此，最佳的分子应为一种不表现出IL-6活性、但比IL-6表现出更高的IL-6Rα结合能力，并且就IL-6而言含有尽可能少的突变以减少抗原性的风险的分子。
发明的内容
申请人现已发现通过结合在第54位的点突变和两个突变F170L/S176R(这两个突变增加了对IL-6Ra的亲和力)以及两个突变Q159E/T162P(这两个突变降低了依赖性IL-6Ra与gp130的相互作用)得到了人类IL-6突变蛋白，该突变蛋白保留了与受体的结合能力、但却不能激活gp130。具体地讲，本发明的主要目的是如图2和SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列及其片段的人类IL-6突变蛋白。该分子对人类依赖性IL-6的骨髓瘤细胞系XG-1显示出有效的IL-6拮抗剂及上述所有的优点。
本发明的另一个目的是DNA分子包括编码SEQ ID NO：1的多肽的DNA序列以及编码与SEQ ID NO：1具有相同活性的多肽，且由遗传编码的简并性或点突变生成的其变体的DNA分子。
本发明的再一个目的是含有本发明的核苷酸序列的质粒载体。
在另一方面，本发明提供了蛋白质作为药物的用途。具体地讲，涉及本发明的蛋白质在制备用于治疗疾病的药物中的用途，在疾病中IL-6具有病理遗传作用，这些疾病如浆细胞瘤、骨髓瘤、骨质疏松症和肿瘤以及自身免疫疾病。
药物优选以包括本发明的蛋白质以及一种或多种药物可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物的形式存在。这种药物组合物也构成了本发明的另一方面。
一种用于制备本发明的突变蛋白的方法，为使用在人们希望发生突变的碱基处含有失配的合成的寡核苷酸作引物的PCR技术。
在真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞中使用合适的表达载体都可以实现如本文所述的任意一种本发明的重组蛋白的表达。可以采用现有技术中已知的任意方法。
例如通过现有技术中众所周知的技术把编码本发明多肽的DNA分子插入构建得合适的表达载体中(参见Sambrook等人，1989)。通过均聚物谱尾或限制性连接把双链cDNA连接到质粒载体上，其中的限制性连接涉及使用合成的DNA接头或平头连接技术：使用DNA连接酶连接DNA分子并用碱性磷酸酶处理来避免不希望有的连接。
为了能够表达所需的蛋白质，表达载体还应当包括特异的核苷酸序列，该序列含有连接到编码所需蛋白质的DNA上的转录和翻译的调节信息，通过这种方式以便使基因表达并生产蛋白质。首先为了转录基因，位于前面的必须是可由RNA聚合酶识别的启动子，其中聚合酶可以结合到启动子上从而引发转录过程。可以使用的上述启动子有许多种，它们所发挥的效率有所不同(强和弱启动子)。
对真核宿主来说，取决于宿主的性质可以使用不同的转录和翻译的调节序列。这些序列可以来源于病毒，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猴病毒或类似的病毒，其中调节信号与能够高水平表达的具体基因有关。启动子的实例有疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选出便于阻抑和激活的转录起始调节信号，从而可以调制基因的表达。
把包括编码本发明多肽的核苷酸序列的DNA分子插入载体中，其中的DNA分子具有可操作连接的转录和翻译的调节信号，而这可以将所需的基因序列整合到宿主细胞中。同样通过引入一个或多个标记可以选出已由所引入的DNA稳定转化的细胞，其中的标记为选择含有表达载体的宿主细胞创造了条件。标记也可以给营养缺陷型的宿主提供光营养、对生物杀伤剂的抗性，所说的生物杀伤剂例如有抗生素或重金属如铜或类似物。选择性标记基因或者可以直接连接到将要进行表达的DNA基因序列上，或者可以通过共转染而引入同一细胞。对于最佳地合成本发明的蛋白质来说还需要其它要素。
在选择具体的质粒或病毒载体中重要的因素包括：从不含载体的受体细胞中识别和选择含有载体的受体细胞的难易程度；在具体的宿主中所需的载体的拷贝数；以及是否希望在不同种的宿主细胞之间能够“穿梭”载体。
一旦已经制备出含有构建体的用于表达的载体或DNA序列，就可以通过下列多种合适方式的任一种方式将所说的DNA构建体引入合适的宿主细胞中，其中所说的合适方式有：转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙-沉淀、直接微注射等。
宿主细胞可以是原核的或是真核的。其中优选真核宿主，例如哺乳动物细胞(如人类、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，这是因为它们对蛋白质分子进行了包括恰当的折叠或在适当的位点处进行糖基化的翻译后修饰。此外，酵母细胞也可以进行包括糖基化在内的翻译后的肽的修饰。现有许多的利用强启动子序列和高拷贝数的质粒的重组DNA策略，利用这些策略可以在酵母中生产所需的蛋白质。酵母可以识别在克隆的哺乳动物基因产物上的前导序列，并且分泌含有前导序列的肽(即前肽)。
在引入载体后，在选择含有载体的细胞生长的选择培养基上培养宿主细胞。克隆的基因序列的表达造成了所需蛋白质的生产。
通过任意一种已知的方法进行重组蛋白的纯化以实现纯化的目的，即包括提取、沉淀、层析、电泳或类似方法的任意的常规步骤。可用于更好地纯化本发明蛋白质的进一步的纯化步骤为使用单克隆抗体进行的亲和层析，其中的单克隆抗体可以结合靶蛋白并且被生产并固定在柱中所含的凝胶基质上。使含有重组蛋白的不纯的配制品通过该柱。通过特异的抗体把蛋白质结合到柱上，而杂质则通过该柱。在洗涤后，通过pH值或离子强度的改变从凝胶中洗脱出蛋白质。
现在将通过以下实施例来描述本发明，而这不应当以任何方式构成对本发明的限制。实施例将参照下文所解释的附图。
附图的简要描述
图1为人类IL-6蛋白的点突变体。如有阴影的方框所示的(A)代表具有预测的四个a-螺旋的人类IL-6蛋白。数字表示预测的a-螺旋的第一个和最后一个残基。该图显示出人类(顶部)和鼠(底部)的IL-6的区域2c和2a的氨基酸序列，其中区域2a又细分为区域2a1和2a2。该图显示了在区域2a中产生的点突变。(B)列出了区域2a中的IL-6的物种。(C)带状结构代表人类IL-6的模式。F78(底部)代表对IL-6Ra的结合来说很重要的部位，K54(顶部)代表对IL-6Ra的依赖性与gp130的相互作用来说很重要的部位。N-末端对应于人类IL-6的第17个残基(Ehlers等人1994)。
图2为本发明的人类IL-6突变蛋白的核苷酸序列。相对于人类IL-6而言，它在第54，159，162，170，176位上有五个点突变。本文以黑体报道了上述位置。
图3为人类IL-6的K54点突变体的结合和生物活性。(A)代表IL-6突变蛋白与可溶的人类IL-6Ra的结合。该图显示出两次实验的平均值。(B)代表鼠B9细胞的增殖，以及(C)代表响应IL-6突变体的人类XG-1细胞。该图显示出三次实验的一次代表值。(D)通过IL-6突变蛋白诱导亲血色蛋白在人肝癌细胞中的表达，将用于50％的亲血色蛋白表达所需的人类IL-6的量设为100％。该图显示出两次实验的平均值。
图4是与EP-LR结合的K54的点突变的结合和生物活性。(A)代表IL-6突变蛋白与可溶的人类IL-6Ra的结合。该图显示出两次实验的平均值。(B)代表鼠B9细胞的增殖，以及(C)代表响应IL-6突变体的人类XG-1细胞。该图显示出三次实验的一次代表值。(D)通过IL-6突变蛋白诱导亲血色蛋白在人肝癌细胞中的表达。该图显示出在有1μg/ml突变体存在的情况下亲血色蛋白的表达量。该图显示出两次实验的平均值。
图5是与EP-LR结合的K54的点突变对人类IL-6诱导的XG-1细胞增殖的拮抗作用。在有100pg/ml的人类IL-6存在下将所示浓度的IL-6突变体加入XG-1细胞中并测量其增殖。该图显示出四次实验的平均值。
实施例
材料与方法
化学药品
限制酶Accl，EcoNI，HindIII，Ncol，Nhel和Xbal是从AGS(Heidelberg，德国)获得的，多聚核苷酸激酶、牛小肠磷酸酶与T4DNA连接酶来自Boehringer Mannheim(Mannheim，德国)。限制酶BspEl和Vent DNA聚合酶是从NEN生物实验室(Schwalbach，德国)购买的，细胞培养基则来自Gibco(Eggenstein，德国)。Bolton-Hunter试剂(74TBq/mmol)和反式[35S]标记是从AmershamInternational(Amersham，英国)获得的。
寡核苷酸是从Pharmacia(Freiburg，德国)获得的。
山羊和兔多克隆血清抗-人亲血色蛋白是从Sigma(Deisenhofen，德国)购买的，碱性磷酸酶缀合的驴多克隆血清抗-兔IgG来自Pierce(Rockford，美国)。
人类IL-6 cDNA为Drs.T.Hirano与T.Kishimoto(Osaka，日本)的赠品。
Schopfer等人(26)描述了细菌表达质粒pRSET 5d和宿主细菌BL21(DE3)。在由翻译起始密码子取代信号序列后，利用限制位点Ncol和HindIII将编码人类IL-6的cDNA克隆进载体pRSET5d中(27)。
人骨髓瘤细胞系XG-1是由B.Klein博士(Nantes，法国)提供的。
在大肠杆菌中表达可溶的IL-6Ra蛋白，进行复性和纯化(28)。
通过把可溶的IL-6Ra蛋白胞外域的一部分注射到兔子体内来制备抗IL-6Ra的多克隆单特异性抗血清。
构建表达载体
为了把在第54位氨基酸的点突变引入人类IL-6中(pRSET5d-hulL-6-K54X)，将四个寡核苷酸进行融合并连接到经EcoNI-Nhel消化的pRSET 5d-突变体2a上(9)。所用的寡核苷酸为：5`AAC ATG TGT GAA AGC AGC  GAT GAG GCG 3`   有义(K54D)(SEQ ID NO：2)5`CTA GCG CCT C AT CGC TGC TTT CAC AC 3`    反义(K54D)(SEQ ID NO：3)5`AAC ATG TGT GAA AGC AGC  GAA GAG GCG 3`   有义(K54E)(SEQ ID NO：4)5`CTA GCG CCT C TT CGC TGC TTT CAC AC 3`    反义(K54E)(SEQ ID NO：5)5`AAC ATG TGT GAA AGC AGC  TTT GAG GCG 3`   有义(K54F)(SEQ ID NO：6)5`CTA GCG CCT C AA AGC TGC TTT CAC AC 3`    反义(K54F)(SEQ ID NO：7)5`AAC ATG TGT GAA AGC AGC  AAT GAG GCG 3`   有义(K54N)(SEQ ID NO：8)5`CTA GCG CCT C AT TGC TGC TTT CAC AC 3`    反义(K54N)(SEQ ID NO：9)5`AAC ATG TGT GAA AGC AGC  CCC GAG GCG 3`   有义(K54P)(SEQ ID NO：10)5`CTA GCG CCT C GG GGC TGC TTT CAC AC 3`    反义(K54P)(SEQ ID NO：11)5`GAA AGG AGA CAT GTA ACA AGA GT 3`          有义(SEQ ID NO：12)5`ATG TTA CTC TTG TTA CAT GTC TCC TTT 3`     反义(SEQ ID NO：13)
为了结合在第54位氨基酸的点突变与两个点突变F170L/S176R(简短命名为LR)和两个点突变Q159E/T162P(简短命名为EP)，通过把来自pRSET-5d-hulL-6-K54X的Ncol-Xbal cDNA片段连接到经Ncol-Xbal消化的载体pRSET 6d-hulL-6-Q159E/T162P-2a2-F170L/S176R(简短命名为pRSET 6d-hulL-6-EP-2a2-LR)中来构建载体pRSET 6d-hulL-6-EP-K54X-LR(19)。通过限制片段分析和DNA测序来证实所有构建体的完整性(29)。
制备蛋白质
用合适的pRSET表达载体转化BL21(DE3)细菌。如所述(27，30，31)来实现基因的表达和来自内含体的溶解的蛋白质的重折叠。将重折叠的蛋白质纯化至均一性＞90％。通过12.5％SDS-PAGE和银染色法来检测重组蛋白的纯度。
将IL-6结合到可溶的人类IL-6Ra上
在含有0.02％TWEEN 20/0.2％BSA的PBS中连续稀释纯化的IL-6突变蛋白并将其加入到1ng的人类125I-IL-6(60,000-90,000cpm/ng)和1.7ng的在大肠杆菌中表达的可溶的人类IL-6Ra(28)至最终体积为500μl。在4℃下培养过夜后，使用IL-6Ra抗血清和蛋白A Sepharose免疫沉淀IL-6/sIL-6Ra-复合物，并通过g-计数测定放射性活度。
生物学分析
为了分析鼠B9和人类XG-1的增殖，将IL-6突变蛋白连续稀释至附图所示的浓度。如所述(32，33)进行分析。一个B9单位大约对应于每毫升1pg的人类IL-6，而这导致B9细胞最大值一半的增殖。在用大约50pg/ml的人类IL-6刺激后，得到了人类XG-1细胞最大值一半的增殖。为了分析急性期蛋白的分泌，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养人肝癌细胞(Hep3B)，将上述细胞铺在96-孔的细胞培养平板上并使其达到汇合。用PBS洗涤细胞，在不含胎牛血清的DMEM中使细胞饥饿1小时，随后在100ml不含血清的DMEM中用含量增加的IL-6突变蛋白处理上述细胞20小时。通过酶联免疫吸附测定(34)检测在培养基中分泌的亲血色蛋白的量。
结果
IL-6的氨基酸K54涉及IL-6Ra的依赖性与gp130的相互作用
通过对人/鼠IL-6嵌合蛋白的研究已经表明IL-6蛋白的区域2a2(残基50-55)对IL-6Ra的依赖性与gp130的相互作用来说是很重要的(19)(图1A)。用相应的鼠的氨基酸更换这些残基会造成减少了与gp130的结合并使得对人类XG-1细胞的生物活性降低30倍。对10个IL-6物种的比较揭示出在2a2区域内，在8个物种中带正电的K54是保守的，但在鼠和大鼠的序列中却变为带负电的天冬氨酸(35，36)(图1B)。因此，我们把K54(图1C)换成图1A所示的氨基酸。克隆步骤也产生了IL-6的三个双重点突变：C44F/K54E、C50F/K54N与S52R/K54N，对这些点突变也进行了分析(图1A)。
为了分析K54点突变对IL-6Ra的依赖性与gp130的相互作用的影响，通过以点突变体的过剩量置换出结合到可溶形式的IL-6Ra蛋白上的人类125I-IL-6，我们首先分析了与IL-6Ra的结合。如图3A所示，当以10-20倍的摩尔过剩量使用未标记的人类野生型IL-6时，这种人类野生型IL-6置换出50％的结合的人类125I-IL-6。针对与IL-6Ra的亲和力而言，点突变体K54P和双重突变体S52R/K54N显示出比人类IL-6高10倍的亲和力，而突变体K54E具有比hulL-6低3倍的亲和力。其它进行分析的突变体显示出与人类IL-6具有类似的亲和力。此外，所说的突变体刺激鼠的IL-6的依赖性B9细胞增殖到与人类IL-6类似的程度，而这表明其结构是完整的(图3B)。
IL-6突变蛋白对人骨髓瘤XG-1细胞和人肝癌细胞具有的生物活性的形式为：K54P＞S52R/K54N＞hulL-6＝K54F＞K54D＞K54E＞C50F/K54N＞C44F/K54E。因此，突变体K54P和S52R/K54N对IL-6Ra具有最大的亲和力，这也表明它们对人类细胞具有最高的生物活性。带正电的赖氨酸54与相应带负电的天冬氨酸的更换仅仅造成对人类细胞的生物活性轻微的降低，而其与谷氨酸的更换却造成生物活性的大幅度降低(10倍)。
设计新的人类IL-6受体拮抗剂
最近，我们已经表明把鼠的残基50-55(区域2a2)和两个点突变F170L/S176R(简短地命名为LR)，该突变提高了与IL-6Ra的亲和力，引入双重突变体Q159E/T162P(简短地命名为IL-6-EP)，该突变显示出与gp130的相互作用的降低，将产生检测不到对人类细胞具有生物活性的IL-6突变蛋白(19)。这种IL-6突变体(IL-6-EP-2a2-LR)对人类IL-6Ra的亲和力类似于人类IL-6。就高度敏感的人类IL-6的依赖性人骨髓瘤细胞系XG-1而言，这种IL-6突变体是一种有效的IL-6受体拮抗剂。
我们把K54突变体引入突变体IL-6-EP-LR中。所得到的IL-6突变蛋白称作IL-6-EP-K54X-LR，其中X表示所有的在第54位引入的突变(图1A)。突变体IL-6-EP-C44F/K54E-LR和突变体IL-6-EP-K54E-LR显示出与人类IL-6Ra亲和力的下降，而所有其它的突变体都与人类IL-6具有的亲和力相同(图4A)。对突变体IL-6-EP-2a2-LR和IL-6-EP-S52R/K54N-LR来说，鼠B9细胞的增殖显著减少。所有其它突变体的活性比人类IL-6低大约5-10倍(图4B)。可是，对突变体IL-6-EP-LR、IL-6-EP-K54F-LR和IL-6-EP-S52R/K54N-LR来说，人类骨髓瘤XG-1细胞的增殖减少了大约3个数量级(图4C)。所有其它的突变体都显示出检测不到生物活性。对人类Hep3B细胞而言，仅有突变体IL-6-EP-LR和IL-6-EP-K54F-LR显示出剩余的活性(图4D)。
当把没有生物活性的突变体以增加的量加入到人类骨髓瘤细胞(XG-1)中时，其中的细胞由100pg/ml的人IL-6进行刺激，观察到对增殖的抑制作用。图5显示出突变体IL-6-EP-2a2-LR和IL-6-EP-K54P-LR的加入将导致在约100ng/ml下对增殖50％的抑制作用，而所有其它突变体的效果约低5-10倍。
讨论
氨基酸K54为gp130结合抗原决定基的一部分
所有的以不同的氨基酸残基替换K54的IL-6突变蛋白都能有效地结合到人类IL-6Ra上。令人感兴趣的是，P54和双重突变S52R/K54N的引入生成了与人类IL-6Ra具有更高亲和力的IL-6蛋白。由于包括残基54的2a2区域涉及与gp130的相互作用(19)，其最有可能为一个间接影响。我们推测P54或在第52位带电氨基酸精氨酸的存在引起螺旋A和螺旋B之间环的重新安置，从而改变了与IL-6Ra的相互作用直接有关的区域2C的位置。用在小鼠和大鼠中保守的精氨酸代替在8个物种中保守的赖氨酸54将引起生物活性轻微降低，而由谷氨酸代替将引起生物活性大量降低(10倍)。由于谷氨酸携带了一个比天冬氨酸长出一个亚甲基的侧链，那么带电基团和人类IL-6Ra之间的距离就可能是至关重要的。从这些数据可以假设K54接触了人gp130的带负电的残基并且在人类IL-6中的第54位引入带负电的氨基酸将造成gp130与IL-6/IL-6Ra复合物之间识别作用的降低。半胱氨酸44或50的突变生成了生物活性只轻微降低的IL-6突变蛋白，这就证实了Rock等人(34)近来得到的结果，Rock等人指出半胱氨酸44和50的取代不会生成失活的IL-6突变蛋白。
配体受体相互作用
现已解释了人类生长激素/生长激素受体复合物(GH/GHR2)的结构(22)。已经广泛地对生长激素及其受体之间的相互作用位点进行了突变(38-40)并已评价了单个氨基酸残基对结合能所作的贡献(41)。由于生长激素受体复合物是迄今为止在原子水平了解的造血细胞因子家族的唯一的受体-配体对，因此它起到了该家族其它成员的范例的作用。对于生长激素受体复合物来说已经表明在配体和受体侧的相互作用的抗原决定基由大约30个氨基酸残基组成(41)。但这些氨基酸残基所作的贡献是不一样的。大部分的结合能是由两个疏水相互作用提供的。该结合核心周围包围着不太重要的接触残基，这些残基通常是亲水性的并且部分被水化、它们对结合能仅作出了三分之一的贡献。已经假定上述结合位点的确定也可以应用于其它的配体-受体的相互作用(41)。
但是人们认为K54是中央的IL-6/gp130相互作用区域的周围残基之一，因而它对结合能作出小范围的贡献。在拮抗的IL-6突变蛋白中K54P取代造成的相当强的作用是因为AB-环中结构的改变。
IL-6受体拮抗剂
迄今为止已经鉴定出被认为是接触gp130的IL-6的两个主要区域：(i)2a2区域(残基50-55)和亮氨酸57，它们由IL-6的螺旋D的顶部来补充，和(ii)由螺旋A和螺旋C的部分形成的抗原决定基(9，18-21，23，24)。IL-6与IL-6Ra的结合需要A-B环的末端(残基78)以及该蛋白质的C-末端(9，13-16)。显而易见两个gp130分子是引发信号所必需的，并且非常可能在IL-6内的两个gp130相互作用位点的作用就是嵌入两个gp130蛋白。在两个gp130相互作用区域内的替换已使分子保留了其受体结合能力、但却不能引发信号。已经表明这样的分子可以用作IL-6受体拮抗剂(19，21，23，24)。同时改进IL-6突变蛋白的IL-6Ra的结合特性生成了所谓的超级拮抗剂(19，21，24)，这一事实暗示着有可能以某种独立的形式来改变与不同受体亚单位的结合性能。
在本专利申请中提出的新的IL-6受体拮抗剂含有在2a2区域内单个的K54P的取代，并且它与最近制成的在2a2区域中有5个氨基酸更换的IL-6突变蛋白效果相同(19)。
令人感兴趣的是，K54P突变蛋白显示出比人类IL-6更高的与IL-6Ra的结合能力，而与EP和LR的结合突变体则表现出正常的与IL-6Ra的结合能力。
就细胞因子受体拮抗剂的治疗潜力而言，显而易见氨基酸更换得越少、拮抗剂有抗原性的机会也越少。在这一方面，IL-6突变蛋白IL-6-EP-K54P-LR是迄今为止可以利用的改进的IL-6受体拮抗剂。
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                        序列表(1)一般信息：(i)申请人：
(A)姓名：应用研究系统ARS HOLDING N.V.
(B)街道：14 JOHN GORSIRAWEG
(C)城市：CURACAO
(E)国家：荷兰ANTILLES
(F)邮政编码(ZIP)：无(ii)发明名称：IL-6突变蛋白(iii)序列数：13(iv)计算机可读形式：
(A)存储媒体类型：软磁盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：Patentln Release#1.0，#1.30版(欧洲专利局)(2)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：
(A)长度：212个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(iii)假定：无(iv)反义：无(v)片段类型：N-末端(ix)特点：
(A)名称/要点：蛋白质
(B)定位：1..184(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
        -25                 -20                 -15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
    -10                 -5                  1Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr5                   10                  15                  20Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
            25                  30                  35Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
        40                  45                  50Ser Pro Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
    55                  60                  65Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
70                  75                  80Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr85                  90                  95                  100Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
            105                 110                 115Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
        120                 125                 130Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
    135                 140                 145Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Glu Asp Met Pro Thr His
150                 155                 160Leu Ile Leu Arg Ser Leu Lys Glu Phe Leu Gln Arg Ser Leu Arg Ala165                 170                 175                 180Leu Arg Gln Met(2)SEQ ID NO：2信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假定：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AACATGTGTG AAAGCAGCGA TGAGGCG(2)SEQ ID NO：3信息：(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
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(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假定：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CTAGCGCCTC ATCGCTGCTT TCACAC(2)SEQ ID NO：4信息：(i)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
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(A)长度：26个碱基对
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(A)长度：27个碱基对
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(A)长度：23个碱基对
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(A)长度：27个碱基对
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(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假定：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：ATGTTACTCT TGTTACATGT CTCCTTT

Claims (7)

1.一种包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽，就天然存在的人IL-6的氨基酸序列而言，所说的多肽包括下列突变：第54位的脯氨酸、第159位的谷氨酸、第162位的脯氨酸、第170位的亮氨酸以及第176位的精氨酸。
2.一种DNA分子，该DNA分子包括编码权利要求1的多肽的DNA序列以及编码与权利要求1的多肽具有相同的IL-6拮抗活性的多肽且由遗传编码的简并性或点突变生成的变体。
3.一种包括权利要求2的DNA序列的载体。
4.一种用权利要求2的DNA序列或权利要求3的载体转化的宿主细胞。
5.一种用于生产权利要求1的多肽的方法，该方法包括：
(1)在合适的培养基中培养权利要求4的宿主细胞；以及
(2)从所说的培养基中分离所说的多肽。
6.根据权利要求1的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗浆细胞瘤、骨髓瘤或骨质疏松症。
7.一种药物组合物，该组合物包括根据权利要求1的多肽以及一种或多种药物可接受的载体和/或赋形剂。
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