CN113116878A - 15s-hepe用于增强t细胞介导的肿瘤免疫治疗的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂质衍生物15S‑HEPE作为T细胞介导的抗肿瘤免疫激活剂，用于治疗黑色素瘤的新用途。本发明发现，15S‑HEPE通过提高黑色素肿瘤中T细胞的浸润和活化水平，有效抑制黑色素肿瘤的生长。本发明所涉及的15S‑HEPE抗肿瘤活性可被用于制备抗黑色素肿瘤免疫治疗药物。

Description

15S-HEPE用于增强T细胞介导的肿瘤免疫治疗的新用途

技术领域

本发明属于医药与免疫治疗技术领域，具体涉及一种多不饱和脂肪酸EPA经15-脂氧合酶催化产生的脂肪酸衍生物15S-HEPE的新用途，即15S-HEPE作为T细胞介导的抗肿瘤免疫激活剂，用于肿瘤的免疫治疗。

技术背景

黑色素瘤是最为恶性的皮肤相关肿瘤，在过去的几十年中，黑色素瘤的发病率呈上升趋势。黑色素瘤导致的死亡占据了皮肤相关肿瘤导致的死亡的大部分。基于黑色素瘤不同的特点，如发生位置、遗传背景和突变类型等，已经发展了多种治疗黑色素瘤的方法包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，取得了一定的治疗效果。尽管如此，由于多种多样的抵抗机制，这些治疗方法难以达到理想效果。

肿瘤免疫疗法为黑色素瘤的治疗带来的重大的突破。针对CTLA-4、PD-1和PD-L1等免疫检查点的单克隆阻断抗体在黑色素瘤的治疗中显示了良好的效果。然而，临床研究表明，只有一部分病人对免疫检查点阻断抗体的治疗表现出良好的响应。T细胞在抗肿瘤免疫治疗中起着核心作用，免疫检查点阻断抗体阻断了T细胞的抑制性信号从而促进T细胞的活化和杀伤肿瘤功能。CTLA-4等免疫检查点阻断抗体的治疗效果与肿瘤中预先存在的T细胞，尤其是CD8⁺的肿瘤浸润T细胞的数量及活化水平密切相关。因此，提高肿瘤微环境中CD8⁺T细胞的数量和活化水平对黑色素瘤的免疫治疗非常重要。

15S-HEPE是源于多不饱和脂肪酸EPA经15-脂氧合酶催化产生的脂肪酸衍生物，其结构式如右图所示：

本发明发现15S-HEPE通过提高黑色素肿瘤中T细胞的浸润和活化水平，可有效抑制黑色素瘤的生长。

发明内容

本发明提供了多不饱和脂肪酸EPA经15-脂氧合酶催化产生的脂肪酸衍生物15S-HEPE的一种新用途。

15S-HEPE作为T细胞介导的抗肿瘤免疫激活剂用于肿瘤免疫治疗。

15S-HEPE能够提高肿瘤浸润T细胞的数量和活化水平。

优选的，肿瘤为黑色素瘤。

本发明研究发现，在体外培养和接种于裸鼠的黑色素瘤模型中，15S-HEPE处理不影响肿瘤的生长。而对接种于C57BL/6J小鼠的黑色素瘤，15S-HEPE处理显著抑制了肿瘤的生长，延长了小鼠的生存期。流式检测发现，15S-HEPE处理组肿瘤浸润T细胞的数量和活化水平显著提高。因此，15S-HEPE可提高黑色素肿瘤中T细胞的浸润、增强肿瘤中浸润T细胞的活化水平，抑制肿瘤的生长。本发明所涉及的15S-HEPE抗肿瘤活性可被用于制备抗肿瘤免疫治疗药物。

附图说明

图1为15S-HEPE对体外培养的B16-F1细胞生长影响的检测结果。

图2为15S-HEPE对接种于裸鼠体内的B16黑色素瘤生长作用的检测结果。其中A：裸鼠肿瘤生长曲线图；B：左图为裸鼠肿瘤实物图，右图为裸鼠肿瘤重量统计分析结果图。

图3为15S-HEPE显著抑制接种于C57BL/6J小鼠体内的B16黑色素瘤生长的结果。其中A：肿瘤生长曲线图；B：左图为肿瘤实物图，右图为肿瘤重量统计分析结果；C：对照组及实验组荷瘤小鼠分别接受空白溶剂和15S-HEPE治疗后的生存曲线。

图4为15S-HEPE显著提高接种于C57BL/6J小鼠体内的B16黑色素瘤中浸润T细胞数量和活化水平的结果。其中A：肿瘤浸润CD3e阳性T细胞流式细胞术检测结果；B：肿瘤浸润CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞CD44和CD62L表达水平的流式细胞术检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例来对本发明作进一步的说明，但这些实施例知识为了说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

15S-HEPE对体外培养的B16-F1细胞生长影响

1、实验材料

细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16-F1

试剂耗材：RPMI-1640培养液(Wiesent)，胰酶细胞消化液(碧云天)，胎牛血清(BI)， 96孔板(NEST)，MTT(碧云天)，DMSO(上海国药)

仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪

2、实验方法：

取对数生长期的B16细胞，0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液培养于96孔板中，2000个细胞每孔(100μL)，37℃ 5％CO₂培养，溶剂对照组(Vehicle)加入1μL含有0.1％乙醇的无菌生理盐水，实验组加入1μL含有相应浓度的15S-HEPE含0.1％乙醇的无菌生理盐水，15S-HEPE终浓度为1μM和10μM；在细胞培养的第0、1、2、3天加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h；吸去培养基，每孔加入 100μL DMSO充分溶解深紫色产物formazan，570nm波长检测吸光值。

3、实验结果

结果见图1，与对照组相比，用1μM和10μM 15S-HEPE处理体外单独培养的B16细胞，B16细胞的生长速率和细胞活力没有减弱。因而，1μM和10μM 15S-HEPE不会直接抑制B16细胞生长和活力。

实施例2

15S-HEPE对接种于裸鼠体内的B16黑色素瘤生长作用的检测

1、实验材料

细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16-F1

实验动物：SPF级裸鼠

试剂耗材：RPMI-1640培养液(Wiesent)，胰酶细胞消化液(碧云天)，胎牛血清(BI)， 10cm培养皿(NEST)，1mL一次性无菌注射器，100μL微量注射器，

仪器：细胞培养箱，超净工作台，SPF级动物设施

2、实验方法

B16细胞接种于10cm培养皿中，37℃ 5％CO₂培养24～36小时，使细胞处于对数生长期；胰酶细胞消化液消化细胞，收集细胞，细胞计数，配制3.33×10⁶个/ml浓度的单细胞悬液；每只裸鼠接种于右后腿外侧，皮内注射30μL单细胞悬液；从接种的次日起，腹腔注射15S-HEPE溶液(溶于含有2％乙醇的无菌生理盐水中)，剂量为4μg/kg小鼠体重，对照组为腹腔注射等体积的含有2％乙醇的无菌生理盐水，每日给药一次，直至实验结束；肿瘤生长期间，用游标卡尺测量肿瘤的短轴a和长轴b，计算肿瘤体积V(V＝0.5×a²×b)并绘制肿瘤生长曲线；实验结束时，处死小鼠，取出肿瘤，称量肿瘤重量，统计分析处理组和对照组肿瘤重量的差异。

3、实验结果

实验结果见图2。实验结果表明，与溶剂对照组相比，对于接种于裸鼠的黑色素瘤，腹腔注射15S-HEPE(4μg/kg每天)对肿瘤的生长和肿瘤最终的重量没有明显的抑制作用。

实施例3

15S-HEPE对接种于C57BL/6J小鼠体内的B16黑色素瘤生长作用的检测

1、实验材料

细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16-F1

实验动物：SPF级C57BL/6J小鼠

试剂耗材：RPMI-1640培养液(Wiesent)，胰酶细胞消化液(碧云天)，胎牛血清(BI)， 10cm培养皿(NEST)，1mL一次性无菌注射器，100μL微量注射器。

仪器：细胞培养箱，超净工作台，SPF级动物设施

2、实验方法

B16细胞接种于10cm培养皿中，37℃5％CO₂培养24～36小时，使细胞处于对数生长期；胰酶细胞消化液消化细胞，收集细胞，细胞计数，配制3.33×10⁶个/ml浓度的单细胞悬液；每只C57BL/6J小鼠接种于右后腿外侧，皮内注射30μL单细胞悬液；从接种的次日起，腹腔注射15S-HEPE溶液(溶于含有2％乙醇的无菌生理盐水中)，剂量为4μg/kg小鼠体重，对照组为腹腔注射等体积的含有2％乙醇的无菌生理盐水，每日给药一次，直至实验结束；肿瘤生长期间，用游标卡尺测量肿瘤的短轴a和长轴b，计算肿瘤体积V(V＝0.5×a²×b)并绘制肿瘤生长曲线；实验结束时，处死小鼠，取出肿瘤，称量肿瘤重量，统计分析处理组和对照组肿瘤重量的差异。小鼠生存率检测实验操作与测量肿瘤生长实验相同，不同之处在于实验一直进行直至小鼠全部死亡，记录每只小鼠的死亡时间，绘制小鼠生存曲线。

3、实验结果

实验结果见图3。实验结果表明，与溶剂对照组相比，对于接种于C57BL/6J小鼠的黑色素瘤，腹腔注射15S-HEPE(4μg/kg每天)明显抑制了肿瘤的生长，抑制率为52.8％。同时15S-HEPE(4μg/kg每天)处理也能显著延长小鼠的生存时间。因而，在免疫功能健全的C57BL/6J小鼠体内，15S-HEPE能够抑制黑色素瘤的生长。

实施例4

15S-HEPE提高接种于C57BL/6J小鼠体内的B16黑色素瘤中T细胞数量和活化水平

1、实验材料

细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16-F1

实验动物：SPF级C57BL/6J小鼠

试剂耗材：RPMI-1640培养液(Wiesent)，胰酶细胞消化液(碧云天)，胎牛血清(BI)， I型胶原酶(biosharp)，IV型胶原酶(biosharp)，DNase I(biosharp)，Hanks溶液：NaCl 8.175g， KCl 0.403g，Na₂PO₄ 0.114g，HEPES 5.958g，CaCl2 0.444g，MgSO₄ 0.197g，定容至1000mL；胶原酶消化液：100mL Hanks液+50mg I型胶原酶+50mg IV型胶原酶+7.5mgDNase I；FACS buffer：PBS+25mM HEPES+1mM EDTA；4％多聚甲醛(博士德)；10cm培养皿(NEST)，1mL 一次性无菌注射器，100μL微量注射器，100目不锈钢滤网，100μm孔径滤网，40μm孔径细胞滤网，15mL及50mL离心管，5mL一次性无菌注射器；Mouse Fc-receptor blockingreagent (Miltenyi Biotech)，小鼠流式抗体：CD3e-PE(BD，clone 145-2C11)，CD4-FITC(BD，clone GK1.5)，CD8a-PerCP-Cy5.5(eBioscience，clone 53-6.7)，CD44-APC(BD，cloneIM7)， CD62L-PE-Cy7(eBioscience，clone MEL-14)。

仪器：细胞培养箱，超净工作台，SPF级动物设施

2、实验方法

B16细胞接种于10cm培养皿中，37℃ 5％CO₂培养24～36小时，使细胞处于对数生长期；胰酶细胞消化液消化细胞，收集细胞，细胞计数，配制3.33×10⁶个/ml浓度的单细胞悬液；每只C57BL/6J小鼠接种于右后腿外侧，皮内注射30μL单细胞悬液；从接种的次日起，腹腔注射15S-HEPE溶液(溶于含有2％乙醇的无菌生理盐水中)，剂量为4μg/kg小鼠体重，对照组为腹腔注射等体积的含有2％乙醇的无菌生理盐水，每日给药一次，直至实验结束；实验结束时，处死小鼠，取出肿瘤，称量肿瘤重量。

取出肿瘤置于10cm培养皿中，用剪刀剪成1～2mm见方的小块；加入适量的胶原酶消化液，置于37℃摇床消化，转速为80rpm，每隔20～30min轻轻吹打混匀；消化1～1.5h后，将消化的细胞悬液过100μm孔径滤网，滤液置于50mL离心管中，4℃ 1000rpm离心5min，弃去上清；向细胞沉淀中加入PBS洗一次，4℃ 1000rpm离心5min，弃去上清；向细胞沉淀中加入适量预热的红细胞裂解液(2～5mL)，37℃孵育10min后，加入等体积的PBS，4℃ 1000rpm离心5min，弃去上清；向细胞沉淀中加入适量的PBS重悬细胞，用40um的滤网过滤细胞悬液制成单细胞悬液，4℃ 1000rpm离心5min，弃去上清；向细胞沉淀中加入适量的 FACS buffer，重悬细胞制成肿瘤组织单细胞悬液备用。

取制备的肿瘤组织单细胞悬液，用血球计数板或流式细胞仪检测细胞密度，取1～2× 10⁷cells，重悬于100μL FACS buffer；加入1μL mouse Fc receptor blockingreagent，4℃避光封闭15min；加入1uL相应的流式抗体，冰上避光反应1h，每20min用移液器轻轻吹打混匀一次；加入900μL FACS buffer重悬，4℃ 1000rpm离心5min，去除上清；加入1mL FACS buffer 重悬细胞，4℃ 1000rpm离心5min，去除上清；用200～400μL FACSbuffer重悬细胞，然后进行流式分析；

如样品不立即进行流式分析，可用4％多聚甲醛固定，步骤如下：待测细胞与流式抗体反应后用FACS buffer稀释清洗2遍，4℃ 1000rpm离心5min，去除上清；加入150μL 4％多聚甲醛重悬细胞，室温固定30min；直接加入450μL FACS buffer将多聚甲醛稀释到终浓度为1％，4℃避光保存，直至进行流式检测。

3、实验结果

实验结果见图4。对接种于C57BL/6J小鼠体内的B16黑色素瘤，15S-HEPE处理能够提高肿瘤浸润T细胞的数量，也提高了CD44阳性活化的T细胞亚群在CD8T细胞和CD4 T细胞中的比例。因此，15S-HEPE能够促进黑色素瘤中T细胞的浸润和激活。

Claims (5)

1.多不饱和脂肪酸EPA经15-脂氧合酶催化产生的脂肪酸衍生物15S-HEPE的抗肿瘤活性及在T细胞介导的肿瘤免疫治疗中的新用途。

2.根据权利要求1所述的15S-HEPE的抗肿瘤活性，其特征在于所述的15S-HEPE抗肿瘤活性为抗黑色素瘤活性。

3.根据权利要求1所述的15S-HEPE的抗肿瘤活性，其特征在于所述的15S-HEPE抗肿瘤活性为抑制黑色素瘤的生长。

4.根据权利要求1所述的新用途，其特征在于15S-HEPE在黑色素瘤免疫治疗中的新用途。

5.根据权利要求1，4所述的免疫治疗，其特征在于15S-HEPE提高肿瘤浸润T细胞的数量和活化水平。

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