CN113004347A - 一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分离工程技术领域，具体公开了一种分离和纯化2’‑岩藻糖基乳糖的方法，方法包括以下步骤：S1.过膜除菌体，得到膜清液；S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以盐类电解质为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，得溶质浓度为20～100g/L、电导率为400‑2000us/cm的电渗透除盐浓液；S3.过滤除蛋白、脱色、过滤，得滤液；S4.浓缩、结晶，得2’‑岩藻糖基乳糖。本发明的方法简单，不需要复杂反复的离子交换，也不需要使用有机超滤膜，节省了生产成本，并且得到的2’‑岩藻糖基乳糖的浓度可达99％，收率可达80％，可应用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及分离工程技术领域，尤其是涉及一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法。
背景技术
2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是母乳中最丰富的单岩藻糖基乳糖衍生物，2’-岩藻糖基乳糖是目前最具有潜力的一种岩藻糖基乳糖，已经被美国食品和药物管理局(FDA)批准为安全的食品添加剂。2’-岩藻糖基乳糖可通过α-1,2-岩藻糖基转移酶，以GDP-L-岩藻糖(GDP-L-Fuc)为供体、乳糖为底物催化合成。
目前，用于合成2’-FL的生产方法涉及微生物发酵过程，但是从发酵液中分离提纯高纯度2’-岩藻糖基乳糖是一个关键难题。现有技术中，分离提纯2’-FL的方法复杂，如使用多级有机膜超滤除去大分子杂质、利用模拟移动色谱床技术(AU2014331091A1，EP2857410A1)、反复利用离子交换技术(WO2019063757A1)等等，工艺复杂；结晶条件要求也苛刻，如WO2018164937A1专利中利用乙酸结晶，浓缩液中FL含量要求至少70～95％，温度至少40℃；且结晶提纯纯度不高，大约90％，而且还含有大量乳糖、岩藻糖、双岩藻糖基乳糖等杂质存在。如专利(WO2016095924A1)中含有大量DFL即双岩藻糖基乳糖。如专利EP2896628B1提纯中性HMOs过程，其中生物量的去除是采用能截留1万～10万道尔顿的超滤膜，利用离子交换进行脱盐，采用3K道尔顿的膜进行过滤，进行无菌和内毒素去除，然后浓缩喷雾干燥；总体工艺是错流过滤、阳离子和阴离子交换剂处理、浓缩、电渗析、浓缩、活性炭处理，3k道尔顿膜过滤，最后喷雾干燥。主要采用了超滤膜技术、离子交换技术、喷雾干燥技术等，反应条件较为繁琐，耗费成本大。
并且有专利WO2016095924A1公开关于2’-FL结晶的方法，限定了浓缩液中碳水化合物含量最好大于50％，2FL/DFL比例大于2:1，最后产品纯度是＞92％，DFL含量＜3％，乙酸含量＜3％。上述专利分离和纯化2’-FL的方法均较为繁琐，且产品纯度不高，因此，还有改善的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，本发明的方法简单，不需要复杂反复的离子交换，也不需要使用有机超滤膜，节省了生产成本，并且得到的2’-岩藻糖基乳糖的浓度可达99％，收率达到80％，可应用于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
S1.过膜除菌体：将微生物发酵获得发酵液经陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液；
S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以盐类电解质为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，得溶质浓度为20～100g/L、电导率为400-2000us/cm的电渗透除盐浓液；
S3.过滤除蛋白、脱色：将步骤S2中的电渗透除盐浓液浓缩、加热，得热处理液，然后将热处理液冷却，加入吸附剂搅拌，再过滤，得滤液；
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液浓缩、结晶，过滤、洗涤和烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
本发明人经过大量研究及试验发现，将发酵液直接经陶瓷膜过滤，截留菌体，除菌体后直接电渗析脱盐，提高分离和纯化效率。在电渗析脱盐过程中，淡室膜清液中阳离子通过阳膜向负极运动，阴离子通过阴膜向阳极运动。最终都进入浓室的去离子水中，使得膜清液中盐分含量越来越低，纯水中盐分不断富集，过程不断检测浓室、淡室两边电导率变化情况，最终得电导率为400-2000us/cm的电渗透除盐浓液。
并且将电渗透除盐浓液浓缩、加热使得电渗透除盐浓液中的蛋白质变性，然后使用吸附剂对热处理液脱色，吸附变性的变性的蛋白质，再将吸附剂过滤，提高了2’-岩藻糖基乳糖的纯度和收率；还利用浓缩、结晶，过滤、洗涤和烘干等步骤，最终得浓度可达99％，收率可达80％的2’-岩藻糖基乳糖。
其中盐类电解质在本发明中可以包括硫酸钠、硝酸钠等，不仅仅局限于本发明举例。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S1中的陶瓷膜的孔径为30-200nm。
在本发明的技术方案中，发酵液经孔径为30-200nm的陶瓷膜过滤，截留了微生物菌体，减少了反复离子交换等分离方式中复杂的操作步骤，大大提高分离效率，提高了2’-岩藻糖基乳糖的纯度和收率。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S3中加热温度为60-90℃，加热时间为0.1-1h，更优选地，加热温度为90℃，加热时间为30min。
在本发明的技术方案中，电渗透除盐浓液浓缩后加热至60-90℃，维持0.1-1h使电渗透除盐浓液中的蛋白质变性析出，有效避免了蛋白质残留在2’-岩藻糖基乳糖中，进一步提高了2’-岩藻糖基乳糖的纯度。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S3中热处理液冷却至20-40℃。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述吸附剂包括活性炭，所述活性炭在热处理液中的质量浓度为1-10％，更优选地，活性炭在热处理液中的质量浓度为1-2％。
在本发明的技术方案中，使用活性炭吸附析出变性的蛋白质，并且还具有脱色的效果，提高了2’-岩藻糖基乳糖的纯度和收率。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S3中过滤采用孔径为0.22-0.45um的单层滤膜。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S4中将步骤S3制备的滤液在温度为50-70℃下真空浓缩至2’-岩藻糖基乳糖含量为40-70％。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S4中滤液浓缩后，加入1-3倍重量浓缩后滤液的乙酸，加热至50-70℃，然后保温搅拌至出现晶体，结晶时间为2-12h。
作为本发明所述分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法的优选实施方式，所述步骤S4中洗涤过程先采用乙酸洗涤过滤后的滤液，再用质量浓度为70％～99％的乙醇再次洗涤过滤后的滤液。
本发明先用乙酸洗涤过滤后的滤液后用质量浓度为70％～99％乙醇可以提高后面的结晶纯度，比先用乙醇后用乙酸的结晶纯度要高。
本发明还提供了一种2’-岩藻糖基乳糖制品，由上述2’-岩藻糖基乳糖的方法所制得。
本发明采用上述2’-岩藻糖基乳糖的分离和纯化方法获得的2’-岩藻糖基乳糖制品，纯度高，并且经过高效液相法检测聚唾液酸的纯度可达99％，收率可达80％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，制备方法简单，分离效率高，采用本发明的方法可以更为高效的过滤了分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖过程中的蛋白、盐分和小分子杂质，为制备高纯度和高收率的2’-岩藻糖基乳糖提供保障；
2、本发明提供了一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，除菌体后直接进行电渗析脱盐，提高了2’-岩藻糖基乳糖的分离和纯化效率，减少了反复离子交换等分离方式中复杂的操作步骤；
3、本发明提供了一种2’-岩藻糖基乳糖制品，纯度高，收率高，经过高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度可达99％，收率可达80％。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法
一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
S1.过膜除菌体：将大肠杆菌菌种发酵获得发酵液(根据专利申请号为CN111808790A)，经孔径为30nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液；
S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以硫酸钠为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，淡室膜清液中阳离子通过阳膜向负极运动，阴离子通过阴膜向阳极运动。最终都进入浓室的去离子水中，使得膜清液中盐分含量越来越低，纯水中盐分不断富集，电渗析脱盐过程不断检测浓室、淡室两边电导率变化情况，最终得溶质浓度为60g/L、电导率为800us/cm的电渗透除盐浓液，加纯水洗膜合并；
S3.过滤除蛋白、脱色：将步骤S2中的电渗透除盐浓液倒入浓缩器中浓缩、加热至90℃后，维持30min，得热处理液，然后将热处理液冷却至35℃后，加入2％竹溪305活性炭，充分搅拌30min脱色、吸附蛋白，过0.22um单层滤膜过滤掉活性炭，得滤液；
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液转入浓缩罐，在60℃下真空浓缩至2’-岩藻糖基乳糖的含量为40-70％，得浓缩液，在浓缩液中加入2倍重量浓缩液的乙酸，加热至60℃保温搅拌至出现晶体，结晶时间10h，结晶后置于2℃冷藏12h，得冷藏液；
S5.过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后先用质量浓度为99.5％的乙酸洗涤后，再用质量浓度为90％的乙醇进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为99.0％，收率为80％。
实施例2、一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法
一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
S1.过膜除菌体：将微生物发酵获得发酵液经孔径为100nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液；
S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以硫酸钠为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，淡室膜清液中阳离子通过阳膜向负极运动，阴离子通过阴膜向阳极运动。最终都进入浓室的去离子水中，使得膜清液中盐分含量越来越低，纯水中盐分不断富集，电渗析脱盐过程不断检测浓室、淡室两边电导率变化情况，最终得溶质浓度为20g/L、电导率为2000us/cm的电渗透除盐浓液，加纯水洗膜合并；
S3.过滤除蛋白、脱色：将步骤S2中的电渗透除盐浓液倒入浓缩器中浓缩、加热至60℃后，维持30min，得热处理液，然后将热处理液冷却至20℃后，加入1％竹溪305活性炭，充分搅拌20min脱色、吸附蛋白，过0.3um单层滤膜过滤掉活性炭，得滤液；
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液转入浓缩罐，在50℃下真空浓缩至2’-岩藻糖基乳糖的含量为40-70％，得浓缩液，在浓缩液中加入1倍重量浓缩液的乙酸，加热至60℃保温搅拌至出现晶体，结晶时间12h，结晶后置于5℃冷藏24h，得冷藏液；
S5.过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后先用乙酸洗涤后，用质量浓度为80％的乙醇进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为97.5％，收率为75％。
实施例3、一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法
一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
S1.过膜除菌体：将微生物发酵获得发酵液经孔径为150nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液；
S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以硫酸钠为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，淡室膜清液中阳离子通过阳膜向负极运动，阴离子通过阴膜向阳极运动。最终都进入浓室的去离子水中，使得膜清液中盐分含量越来越低，纯水中盐分不断富集，电渗析脱盐过程不断检测浓室、淡室两边电导率变化情况，最终得溶质浓度为40g/L、电导率为1200us/cm的电渗透除盐浓液，加纯水洗膜合并；
S3.过滤除蛋白、脱色：将步骤S2中的电渗透除盐浓液倒入浓缩器中浓缩、加热至70℃后，维持20min，得热处理液，然后将热处理液冷却至40℃后，加入5％竹溪305活性炭，充分搅拌40min脱色、吸附蛋白，过0.4um单层滤膜过滤掉活性炭，得滤液；
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液转入浓缩罐，在60℃下真空浓缩至2’-岩藻糖基乳糖的含量为40-70％，得浓缩液，在浓缩液中加入2倍重量浓缩液的乙酸，加热至70℃保温搅拌至出现晶体，结晶时间10h，结晶后置于10℃冷藏24h，得冷藏液；
S5.过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后先用乙酸洗涤后，用质量浓度为85％的乙醇进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为98.0％，收率为70％。
实施例4、一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法
一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
S1.过膜除菌体：将微生物发酵获得发酵液经孔径为200nm的陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液；
S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以硫酸钠为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，淡室膜清液中阳离子通过阳膜向负极运动，阴离子通过阴膜向阳极运动。最终都进入浓室的去离子水中，使得膜清液中盐分含量越来越低，纯水中盐分不断富集，电渗析脱盐过程不断检测浓室、淡室两边电导率变化情况，最终得溶质浓度为100g/L、电导率为400us/cm的电渗透除盐浓液，加纯水洗膜合并；
S3.过滤除蛋白、脱色：将步骤S2中的电渗透除盐浓液倒入浓缩器中浓缩、加热至80℃后，维持1h，得热处理液，然后将热处理液冷却至30℃后，加入10％竹溪305活性炭，充分搅拌60min脱色、吸附蛋白，过0.45um单层滤膜过滤掉活性炭，得滤液；
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液转入浓缩罐，在70℃下真空浓缩至2’-岩藻糖基乳糖的含量为40-70％，得浓缩液，在浓缩液中加入3倍重量浓缩液的乙酸，加热至70℃保温搅拌至出现晶体，结晶时间12h，结晶后置于15℃冷-24h，得冷藏液；
S5.过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后先用乙酸洗涤后，用质量浓度为99％的乙醇进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为95.0％，收率为76％。
实施例5、一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法
与实施例1相似，实施例5的区别仅在于，步骤S5中：
S5.过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后先用质量浓度为99.5％的乙酸洗涤后，再用质量浓度为70％的乙醇进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为99.0％，收率为73％。
对比例1
与实施例1相似，对比例1的区别仅在于，不含有步骤S2，其余参数和方法与实施例1相同。
在本对比例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为80.0％，收率为80％。
对比例2
与实施例1相似，对比例2的区别仅在于，采用板框替换陶瓷膜，其余参数和方法与实施例1相同。
在本对比例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为95.0％，收率为76％。
对比例3
与实施例1相似，对比例3的区别仅在于，步骤S5中：
过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后先用质量浓度为90％的乙醇洗涤后，再用质量浓度为99.5％的乙酸进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本对比例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为89％，收率为79％。
对比例4
与实施例1相似，对比例4的区别仅在于，步骤S5中：
S5.过滤、洗涤和烘干：将步骤S4制备的冷藏液采用直径为15cm的定性滤纸进行过滤，过滤后用质量浓度为90％的乙醇进行洗涤；洗涤后进行60℃常压烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
在本实施例中，高效液相法检测2’-岩藻糖基乳糖的纯度为98.0％，收率为80％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.过膜除菌体：将微生物发酵获得发酵液经陶瓷膜过滤，截留菌体，得到含有2’-岩藻糖基乳糖的膜清液；
S2.电渗析脱盐：将步骤S1制备的膜清液经过电渗析脱盐，以盐类电解质为电解质，淡室装膜清液，浓室装去离子水，得溶质浓度为20～100g/L、电导率为400-2000us/cm的电渗透除盐浓液；
S3.过滤除蛋白、脱色：将步骤S2中的电渗透除盐浓液浓缩、加热，得热处理液，然后将热处理液冷却，加入吸附剂搅拌，再过滤，得滤液；
S4.浓缩、结晶：将步骤S3制备的滤液浓缩、结晶，过滤、洗涤和烘干，得2’-岩藻糖基乳糖。
2.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S1中的陶瓷膜的孔径为30-200nm。
3.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S3中加热温度为60-90℃，加热时间为0.1-1h。
4.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S3中热处理液冷却至20-40℃。
5.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述吸附剂包括活性炭，所述活性炭在热处理液中的质量浓度为1-10％。
6.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S3中过滤采用孔径为0.22-0.45um的单层滤膜。
7.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S4中将步骤S3制备的滤液在温度为50-70℃下真空浓缩至2’-岩藻糖基乳糖含量为40-70％。
8.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S4中滤液浓缩后，加入1-3倍重量浓缩后滤液的乙酸，加热至50-70℃，然后保温搅拌至出现晶体，结晶时间为2-12h。
9.如权利要求1所述的分离和纯化2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，所述步骤S4中洗涤过程先采用乙酸洗涤过滤后的滤液，再用质量浓度为70％～99％的乙醇再次洗涤过滤后的滤液。
10.一种2’-岩藻糖基乳糖制品，其特征在于，由权利要求1-9任一项所述的方法所制得。
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