CN1128215C - 气体循环培养红豆杉细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种气体循环培养红豆杉细胞的方法，其技术要点是将已经经过红豆杉细胞培养反应的气体导入红豆杉细胞培养中循环使用。本发明将红豆杉细胞培养中经反应器的气体全部或部分导入反应器中，并可适时、适量地补充所需气体，可根据需要维持或调节培养细胞的气相环境，改善、优化细胞的生长和次生产物的生产条件，促进细胞生长和目标产物的合成。
Description
技术领域
本发明属植物细胞工程范畴，涉及一种植物细胞培养技术中用反应器扩大培养植物细胞时，促进细胞生长及次生代谢产物合成的一种方法。
背景技术
植物细胞培养技术可用于生产植物细胞的初生产物(包括细胞本身)和次生代谢产物，可广泛用于农业、医药、食品、化妆品、香料等的生产，且有生产周期短、不受地理环境、气候、病虫害影响等优点，目前正受到人们的重视。
由于人们对于植物细胞培养的研究，特别是植物细胞扩大培养技术的研究尚不充分，各种植物细胞由于自身特性的不同，所需培养条件也有差异，使植物细胞培养技术变得更为复杂，应用进展较慢。目前，阻碍植物细胞培养产业化进程的关键问题是：随着反应器培养规模的扩大，次生代谢产物的产量明显下降。尽管人们严格控制培养条件，使扩大培养中的温度、PH值、营养成份、激素浓度等与小规模悬浮培养中保持不变，供气等条件尽量按比例扩大，但仍不能解决这个问题。
本申请人通过实践，认为出现上述问题与植物细胞培养中的气相成份有密切的关系。植物细胞在生长、代谢过程中需不断吸收氧气、放出二氧化碳以及一些极微量的气相成份如乙烯等，甚至还可能有一些人们尚不了解的、可能参与胞间信息传递的成份，这些植物细胞培养中释放的气体对细胞培养的影响，人们还了解得很少。
现有培养植物细胞反应器的气相运行图(见图1)，罐体2上的出气口3通过管道接有冷凝器4，罐体上的进气口1通过胶管接有灭菌过滤器7和气体流量计6，气体流量计6上有供气入口。现有的反应器培养植物细胞的方法都是在反应器进气口1加入新鲜气体，另一方面又在出气口3将尾气排出。这种气体运行方式主要考虑了植物细胞对氧的需求，而忽略了排出气体中带走的植物细胞培养中产生的各种气相成份对培养的影响。
应用本发明气体循环方式进行植物细胞培养时发现，气相中氧气的浓度有所下降，而二氧化碳的浓度有所上升，相信同二氧化碳一块释放的气体如乙烯，以及那些可能传递信息的气相的浓度也在积累上升，由此产生气体成份的组成与比例的变化，可对培养植物细胞次生产物的产量及细胞生长产生有利的影响。经改进的反应器中，氧浓度和二氧化碳浓度可按要求进行调控。
发明内容
本发明的目的就是提供一种将经过红豆杉细胞反应后的气体再次导入反应器中循环使用，从而促进红豆杉细胞生长和次生产物合成的方法。
本发明可由如下方式来实现：将已经经过红豆杉细胞培养反应的气体导入细胞培养中循环使用。可将经红豆杉细胞培养反应的气体全部导入反应器，或部分气体导入反应器。
本发明考虑了排出气体中带走的气体成份的作用，通过改进反应器的气相运作方式，克服了原培养方法中由于供给的补充气体在培养液中的溶解交换不充分、供给的氧气等气体绝大部分经排气口排入大气而未得充分利用、并带走了细胞培养中产生的气相成份的缺点。本发明将植物细胞培养中经反应器的气体全部或部分导入反应器中，并可适时、适量地补充所需气体，可根据需要维持或调节培养细胞的气相环境，改善、优化细胞的生长和次生产物的生产条件，促进细胞生长和目标产物的合成。
附图说明
下面结合附图，对本发明作进一步的描述。
图1为现有培养植物细胞反应器的气相运行示意图。
图2为本发明培养植物细胞反应器气相运行示意图。
图3为用两种反应器扩大培养对红豆杉细胞生长的影响。
图4为用两种反应器扩大培养对紫杉醇累积的影响。
在图中，1为进气口，2为罐体，3为出气口，4为冷凝器，5为循环气泵，6为气体流量计，7为灭菌过滤器。
具体实施方式
请阅图2，在现有培养植物细胞的反应器(罐体2的出气口3通过胶管接有冷凝器4，罐体2的进气口1通过胶管接有灭菌过滤器7和气体流量计6，气体流量计6上有供气入口)的基础上，冷凝器4与气体流量计6的供气口之间通过胶管接有循环气泵5。这样，把已经经过红豆杉细胞培养反应的气体导入红豆杉细胞培养中循环使用，利用细胞培养中产生的气相激素和CO2等气体提高细胞的生长和次生产物的产量，从而，实现本发明的目的。
另外，在冷凝器4之后可依次接入带有一定阻力的通大气的排空口和补入其它补充气体的气体混合室，在气体混合室的补气口可按需适时、适量地补入各种气体(氧气等)，而带阻力的排空口让与补充气体等量的循环气体自动排出，并让反应器保持一定的压力，从而，可控制反应器的出气口3排出的气体全部或部分通过胶管重新导入反应器中，形成气体循环，用于培养植物细胞。
下面介绍应用两种反应器培养红豆杉细胞实验的结果：
1、实验材料：供试材料是经20次继代培养的中国红豆杉悬浮培养细胞，采用B5基本培养基，添加5mg/L NAA、0.1mg/L 6-BA及4％蔗糖，培养基PH值调至5.8。
2、实验方法：在气相运行方式为本发明的循环式的反应器(自制，工作体积1升)中接种新鲜中国红豆杉细胞，接种量为8g/L(干重)，25℃黑暗中培养，每隔3天取样一次，测定各种指标。以同类型的气升式反应器(现有反应器，工作体积1升，通气方式为不循环，通气量0.3VVm，其它条件一样)中的培养结果作对照。
(1)、细胞干重的测定：取样后，将悬浮培养物用120目筛过滤，滤液用三角瓶盛好，待用；细胞用蒸馏水洗干净，滴干后置60℃烘干，称重。
(2)、紫杉醇的提取与检测：量取培养液，用二氯甲烷(体积比为1∶1)萃取三次，合并后回收二氯甲烷，残渣用少量甲醇溶解、定容。另外，称取0.25克干细胞样品(研细，过80目筛)，用30ml甲醇浸提过夜，并超声15分钟，静置后收集上层清液，重复3次。合并甲醇后回收，残渣用蒸馏水洗三次，洗液用相同体积的二氯甲烷萃取，其它操作同培养液的萃取。定容后的样品由本所化学室检测。样品检测采用Waters HPLC系统；流动相为甲醇—乙腈—水(29∶27∶44)；流速1.0ml/分钟；检测波长227nm。标准品购自SIGMA公司。
3、实验结果
(1)、两种反应器扩大培养对红豆杉细胞生长的影响。
从图3中可以看出对照组细胞的最终收获量为18g/L(干重)，试验组细胞的最终收获量为33g/L(干重)，说明反应器气相运行方式为循环式的更有利于红豆杉细胞的生长。
(2)、两种反应器扩大培养对紫杉醇累积的影响。
从图4中可以看出红豆杉细胞在用反应器扩大培养时，对照组的紫杉醇最高含量为8.68mg/L(其中培养液中4.9mg/L，干细胞内为0.021％)。试验组的紫杉醇最高含量为63.8mg/L(其中培养液中52.6mg/L，干细胞内为0.034％)。说明反应器气相运行方式为循环式的更有利于红豆杉细胞中紫杉醇的累积。
以上结果说明反应器气相运行方式为循环式的，有利于红豆杉细胞的生长和紫杉醇的累积，与现有反应器(气相运行方式为不循环)相比，细胞的收获量增加到1.8倍，目标产物紫杉醇的产量提高到7.4倍。
Claims (2)
1、一种气体循环培养红豆杉细胞的方法，其特征在于将已经经过红豆杉细胞培养反应的气体导入红豆杉细胞培养中循环使用。
2、依权利1所述的气体循环培养红豆杉细胞的方法，其特征在于将经红豆杉细胞培养反应的气体全部导入反应器，或部分导入反应器。
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