CN112813037B

CN112813037B - 一种高效感染原代小胶质细胞的重组突变腺相关病毒及其相关生物材料

Info

Publication number: CN112813037B
Application number: CN202110021870.7A
Authority: CN
Inventors: 滕兆乾; 何炫程; 刘长梅; 杜洪震
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2041-01-08
Also published as: CN112813037A

Abstract

本发明公开了一种高效感染原代小胶质细胞的重组突变腺相关病毒及其相关生物材料。该重组腺相关病毒为表达AAV‑6X型衣壳蛋白的腺相关病毒，AAV‑6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。本发明将野生型AAV‑6型衣壳蛋白进行如下突变得到突变的AAV‑6型衣壳蛋白：在AAV‑6型衣壳蛋白的氨基酸序列的第588‑589位之间插入7个氨基酸残基。本发明的重组腺相关病毒rAAV‑6X(表达AAV‑6X型衣壳蛋白)体外感染小胶质细胞的效率是重组腺相关病毒rAAV‑6(表达野生型AAV‑6型衣壳蛋白)体外感染小胶质细胞的效率的8倍。本发明的重组腺相关病毒是高效转导小胶质细胞的rAAV载体。

Description

一种高效感染原代小胶质细胞的重组突变腺相关病毒及其相关生物材料

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高效感染原代小胶质细胞的重组突变腺相关病毒及其相关生物材料。

背景技术

近年来的研究表明，神经损伤程度似乎与固有免疫活动规模和活性程度相关。在中枢神经系统中，小胶质细胞(microglia)是主要免疫细胞，是最早响应神经损伤、感染或病理状态改变的一类细胞。除了具有免疫应答作用外，小胶质细胞在神经元的生理活动中起着支持、营养、保护等重要功能，还参与发育过程中对神经元连接性的定形和修整，参与神经元突触可塑性形成、神经生成以及学习等过程。越来越多的研究证据表明，小胶质细胞相关信号通路可能是神经退行性疾病的风险和发病机制的核心。大规模的全基因组关联研究(GWAS)已经确定了20多个与Alzheimer病(AD，老年性痴呆)相关的位点，其中许多表达或仅表达于小胶质细胞中。在AD中，β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的神经毒性作用被认为在AD病程进展中发挥着主要作用。小胶质细胞清除Aβ故障可能是导致神经炎症和神经退行性病变的关键所在。例如，如果在小胶质细胞中敲除TREM2基因，小胶质细胞则极少在Aβ斑块周围聚集，AD小鼠的神经炎症加剧、认知能力恶化。小胶质细胞在自闭症和发育障碍中的作用研究逐渐成为热点。自闭症患者的尸检结果发现，患者大脑中的小胶质细胞数量，形态和神经元相互作用发生了变化，特别是在控制执行功能的背外侧前额叶皮层等区域。此外，全转录组分析发现，许多小胶质细胞特异性基因在自闭症脑组织中的表达发生了显著改变，其中包括与炎症状态相关的标志物。虽然人类遗传学研究并没有发现小胶质细胞表达的基因与自闭症障碍直接相关，但是小胶质细胞可能通过对来自神经元或其他神经细胞损伤做出异常反应，进而导致自闭症患者发生神经环路功能障碍。

腺相关病毒(AAV)于1960年首次发现于实验用腺病毒(AdV)的培养基中，随后被人们开发为外源基因传导工具。在众多重组病毒中，重组腺相关病毒(rAAV)因其安全性高、稳定性强，已被广泛应用于多种疾病的基因治疗。在神经生物学领域，rAAV已被成功地应用于外源基因在星形胶质细胞和神经元中的功能研究。虽然rAAV基因治疗的临床成功令人鼓舞，但是rAAV表达系统在不少组织和特定细胞中依旧面临感染率不高、靶向特异性不强、外源基因大小受限等瓶颈问题。截止目前，针对靶向小胶质细胞的病毒载体系统的开发已有多种尝试，无论是慢病毒(lentivirus)还是AAV,都存在特异性和感染效率方面的巨大缺陷。现已证实AAV-1,2,3,4,5,7,8,9型在体内外几乎不感染任何的小胶质细胞，AAV-6型在体外感染小胶质细胞的效率低于10％，这极大的限制了AAV在小胶质细胞中的应用。

因此，基于小胶质细胞的重要生物学功能以及AAV的巨大应用潜力，亟待开发出一种高效感染小胶质的rAAV，继而推进小胶质细胞在疾病发生发展中的功能与调控机制方面的基础研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高腺相关病毒体外感染小胶质细胞的效率。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种重组腺相关病毒。

本发明所提供的重组腺相关病毒为表达AAV-6X型衣壳蛋白的腺相关病毒，所述AAV-6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。

所述重组腺相关病毒含有所述AAV-6X型衣壳蛋白的编码基因，所述AAV-6X型衣壳蛋白的编码基因的编码链的编码序列(CDS)是序列表中序列3的第2003-4234位核苷酸。

为了解决以上技术问题，本发明提供了重组腺相关病毒的构建方法。

本发明所提供的重组腺相关病毒的构建方法包括将AAV-6X型衣壳蛋白的编码基因导入包装细胞中，得到表达所述AAV-6X型衣壳蛋白的重组腺相关病毒；所述AAV-6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。

上述构建方法中，所述包装细胞可为AAV-293细胞系。

为了解决以上技术问题，本发明提供了下述任一种应用：

P1、所述重组腺相关病毒在制备外源基因传导工具中的应用，

P2、所述重组腺相关病毒在将目的DNA导入小胶质细胞中的应用，

P3、所述重组腺相关病毒在小胶质细胞分子层面改造中的应用，

P4、所述重组腺相关病毒在小胶质细胞功能研究中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种蛋白质。

本发明所提供的蛋白质为AAV-6X型衣壳蛋白，所述AAV-6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。

本发明还提供了与AAV-6X型衣壳蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述C1)至C7)中的任一种：

C1)编码AAV-6X型衣壳蛋白的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列表中序列3的第2003-4234位核苷酸的cDNA分子或DNA分子(即AAV-6X型衣壳蛋白基因)。

上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达AAV-6X型衣壳蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动AAV-6X型衣壳蛋白基因转录的启动子，还可包括终止AAV-6X型衣壳蛋白转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为病毒、酵母，细菌，藻和真菌。

为了解决以上技术问题，本发明提供了上述生物材料在制备重组腺相关病毒中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明提供了下述任一种应用：

P5、所述蛋白质在提高腺相关病毒对小胶质细胞感染效率中的应用(所述蛋白质在赋予腺相关病毒增强的小胶质细胞感染性中的应用)。

P6、所述生物材料在提高腺相关病毒对小胶质细胞感染效率中的应用。

上述应用中，所述蛋白质在提高腺相关病毒对小胶质细胞感染效率中的应用中，所述提高是与AAV-6型衣壳蛋白相比，所述AAV-6型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。所述生物材料在提高腺相关病毒对小胶质细胞感染效率中的应用中，所述提高是与所述AAV-6型衣壳蛋白相关的生物材料相比。

为了解决以上技术问题，本发明提供了用于感染小胶质细胞的组合物。

本发明所提供的用于感染小胶质细胞的组合物含有所述重组腺相关病毒。

上述用于感染原代小胶质细胞的组合物还可以含有感染原代小胶质细胞所需的其它试剂，如用于培养小胶质细胞的培养基。

上文中，所述外源基因传导工具可为载体。所述外源基因传导工具可为将目的DNA导入小胶质细胞的载体。所述应用的直接目的为非疾病诊断和/或治疗目的。

本发明将野生型AAV-6型衣壳蛋白进行如下突变得到突变的AAV-6型衣壳蛋白(即AAV-6X型衣壳蛋白)：在AAV-6型衣壳蛋白的氨基酸序列的第588-589位之间插入7个氨基酸残基。实验证明表达野生型AAV-6型衣壳蛋白的重组腺相关病毒rAAV-6体外感染小胶质细胞的效率为8.0％±1.9％，本发明的重组腺相关病毒rAAV-6X(表达AAV-6X型衣壳蛋白)体外感染小胶质细胞的效率为67.9％±4.6％；重组腺相关病毒rAAV-6X体外感染小胶质细胞的效率是重组腺相关病毒rAAV-6体外感染小胶质细胞的效率的8倍。本发明的重组腺相关病毒rAAV-6X是嗜小胶质细胞的。本发明的重组腺相关病毒rAAV-6X是高效转导小胶质细胞的rAAV载体。本发明的AAV-6X型衣壳蛋白及其基因与AAV-6型衣壳蛋白及其基因(野生型)相比，使重组腺相关病毒对小胶质细胞的感染效率提高了7倍，赋予腺相关病毒增强的小胶质细胞感染性。本发明的AAV-6X型衣壳蛋白及其基因可用于构建高效转导小胶质细胞的rAAV。

附图说明

图1为用于构建重组腺相关病毒的质粒图谱示意图。A为pAAV-6X的图谱，CAP表示AAV-6X型衣壳蛋白基因；B为pAAV-CAG-GFP的图谱；C为pAdDeltaF6的图谱；D为pAAV-RC6的图谱，CAP表示AAV-6型衣壳蛋白基因。

图2为AAV-6X型衣壳与AAV-6型衣壳示意图。CAP6表示AAV-6型衣壳蛋白，CAP6X表示AAV-6X型衣壳蛋白。

图3为rAAV-6X(图中表示为AAV-6X)与rAAV-6(图中表示为AAV-6)感染原代小胶质细胞效率比较示意图。****代表P<0.0001,是对实验三次重复进行one-way ANOVA单因素方差分析得到的。

图4为rAAV-6和rAAV-6X体外感染原代小胶质细胞后Iba1抗体免疫荧光染色结果比较。

A是rAAV-6体外感染原代小胶质细胞后Iba1抗体免疫荧光染色结果示意图。B是rAAV-6X体外感染原代小胶质细胞后Iba1抗体免疫荧光染色结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pAAV-RC6腺相关病毒包装质粒(以下简称pAAV-RC6)为ZOMANBIO的产品，其货号为#ZK2304。pAAV-RC6的核苷酸序列如序列表中序列1所示。pAAV-RC6为AAV-6型衣壳蛋白(以下简称野生型衣壳蛋白)基因的表达载体。序列表中序列1的第2003-4213位核苷酸是AAV-6型衣壳蛋白基因(简称AAV-6基因)的编码链的编码序列。该AAV-6型衣壳蛋白基因编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质(即AAV-6型衣壳蛋白)。

实施例1、重组腺相关病毒的构建及其感染原代小胶质细胞分析

一、重组腺相关病毒(AAV)的包装

1.重组质粒的制备(请参阅图1中A-D)：

1.1.重组衣壳包装质粒pAAV-6X的制备

以pAAV-RC6作为原始模板，将需插入的序列(R中带下划线的序列)设计在下游引物R上，以PCR的方式将外源序列插入到pAAV-RC6的衣壳序列当中。上游引物F(核苷酸序列是5′-ACAGCAGCTACGCGCACA-3′)和下游引物R(核苷酸序列是5′-AGGCTCCCATAACATGCACATCTCCGGTCGCAGGGTCTGTCAGACGCGTCGGACCAACCGGGCTGCTGCTCTGGAGATTGAC-3′)各1μl(工作液浓度10μM)，进行15个循环后，向PCR产物中加入1μl Dpn1酶消化掉原始的模板质粒pAAV-RC6。之后将PCR扩增产物转化大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布培养基37℃培养过夜。第二天，挑取单克隆菌株后进行一代测序验证。测序结果表明转化成功，所挑取的单克隆菌株含有突变(包含插入序列)的衣壳质粒，命名为pAAV-6X。pAAV-6X的核苷酸序列如序列表中序列3所示。pAAV-6X为突变型AAV-6型衣壳蛋白(以下简称AAV-6X型衣壳蛋白)基因的表达载体。序列表中序列3的第2003-4234位核苷酸是AAV-6X型衣壳蛋白基因(简称AAV-6X基因)的编码链的编码序列(CDS)。该AAV-6X基因编码氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质(即AAV-6X型衣壳蛋白)。pAAV-6X是AAV-6X基因表达载体。pAAV-6X与pAAV-RC6在核苷酸序列上的区别仅在于腺相关病毒的衣壳蛋白基因序列不同，pAAV-6X中，腺相关病毒的衣壳蛋白基因是AAV-6X基因；pAAV-RC6中，腺相关病毒的衣壳蛋白基因是AAV-6基因。AAV-6X基因与AAV-6基因在核苷酸序列上的区别仅在于AAV-6X基因是在AAV-6基因的1764-1765位核苷酸之间插入21个核苷酸。AAV-6X型衣壳蛋白与AAV-6型衣壳蛋白在氨基酸序列上的区别仅在于AAV-6X型衣壳蛋白是在AAV-6型衣壳蛋白的氨基酸序列的第588-589位之间插入7个氨基酸残基(图2)。

1.2.pAAV-CAG-GFP、pAdDeltaF6的准备

pAAV-CAG-GFP为腺相关病毒(AAV)载体转移质粒，其上含有荧光报告基因GFP，用于后续检测含有1.1中重组衣壳质粒的重组腺相关病毒的感染效率；pAdDeltaF6为腺相关病毒辅助包装质粒，用于重组腺相关病毒的包装。

pAAV-CAG-GFP(Addgene，#37825))质粒包含AAV-2的两个ITR序列和CAG启动子序列、GFP基因编码序列、SV40 polyA序列；pAdDeltaF6(Addgene，#112867)质粒包含腺病毒来源的E4,E2a和VA基因编码序列。

2、AAV-293细胞(Procell，#CL-0019)的复苏

2.1、设置温度为37～42℃的水浴。

2.2、从液氮罐中取出冻存的AAV-293细胞，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1-2min内使细胞溶液完全溶解。

2.3、将细胞溶液转移到15mL离心管中，并在其中加上1mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。

2.4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入10cm培养皿。

2.5、将培养皿平稳放入37℃、5％CO₂和95％相对湿度的培养箱中培养。

2.6、第二天观察细胞存活率。以后每天观察细胞生长情况。

3、AAV-293细胞的传代

3.1.当细胞生长到汇合率达到80％～90％时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

3.2.弃掉原培养基后使用0.01M PBS洗涤细胞2次，去掉0.01M PBS后加入1-2mL0.25％胰蛋白酶，放置于37℃培养箱中消化2min，待细胞脱落后加入含有胎牛血清的完全培养基终止消化。之后将细胞全部吹下，2000rpm离心2min。

3.3、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬，根据具体情况，将细胞分到15cm培养皿中培养。

4、重组腺相关病毒rAAV-6X包装和浓缩

4.1.质粒扩增

将含有构建好的AAV载体转移质粒(pAAV-CAG-GFP)、重组衣壳包装质粒(pAAV-6X)和辅助质粒(pAdDeltaF6)的大肠杆菌使用Tiangen无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取(具体操作参考说明书)，要求质粒浓度大于1μg/μl，A260/280在1.7-1.8间方可用以包装病毒。

4.2.大量扩增AAV-293细胞

将培养AAV-293细胞的15cm培养皿中的培养基吸净，使用0.01M PBS洗涤细胞2次，去掉PBS后加入1-2mL 0.25％胰酶溶液，使其均匀覆盖瓶底，置于37℃度培养箱中2min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，加入3mL 37℃水浴中预热的DMEM培养基(含10％FBS)，用10mL移液器进行吹打将细胞全部吹下，置于15mL离心管中。之后，2000rpm离心2min，根据具体情况，将细胞分到15cm培养皿中。转染当天观察细胞密度，密度达70-80％满即可进行转染。

4.3.质粒转染实现病毒包装

使用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)(1mg/mL)进行质粒转染AAV-293细胞，实现AAV病毒包装。质粒使用量按照每个15cm培养皿：载体转移质粒(pAAV-CAG-GFP)6μg，衣壳包装质粒(pAAV-6X)10μg，辅助质粒(pAdDeltaF6)12μg的用量进行转染。

4.4.重组腺相关病毒rAAV-6X收毒

病毒包装72h后开始收毒，病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。

1)准备一个干冰乙醇浴和37℃水浴

2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15mL的离心管中。收集细胞时，将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中；

3)1000rpm，离心3min，分离细胞和上清，细胞用3ml PBS重悬；

4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融3次。每次融解后稍加震荡。注意：每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。

5)10,000g离心去除细胞碎片，上清使用0.22μm滤膜过滤，之后将上清转移到一个新离心管中，即收集得到重组腺相关病毒rAAV-6X病毒颗粒。

4.5.重组腺相关病毒rAAV-6X的纯化

1)向超速离心管中依次添加15％，25％，40％，60％的碘克沙醇溶液，其中25％，60％层含有酚红溶液。将梯度溶液配制好后将步骤4.4中裂解的上清液缓慢加入到密度梯度离心介质中，配平后，使用超速离心机36,0000g，16℃，离心2h。

2)使用针头刺透40％-60％层交汇处，回收40％层溶液。接着使用Millpore 100kd超滤管进行浓缩，3500rpm离心30min，截留的病毒颗粒使用300-500μl PBS溶液反复吹打后吸至离心管中分装，即得到纯化后的重组腺相关病毒rAAV-6X，于-80℃冰箱保存。

4.6.rAAV物理滴度测定

1)使用DNAse I来消化没有包装到病毒衣壳中的DNA。准备DNAse I+DNAse消化缓冲液，将分装保存的病毒加入涡旋1-2秒混合，然后用吸管分别吸进3个管中。短暂的漩涡和旋转下来，在37℃水浴中孵化1h。之后将DNAse灭活，每管添加5μl EDTA，简短的涡旋混合，并在70℃干浴中孵育10分钟。

2)利用蛋白酶K来消化病毒衣壳并释放病毒基因组。准备蛋白酶K+蛋白酶K缓冲液，短暂的漩涡和旋转，50℃孵育2h。之后，95℃高温灭活蛋白酶K。

3)准备好qPCR mix，分别加入1μl 10¹⁰,10⁹,10⁸,10⁷,10⁶,10⁵拷贝/μl,6个拷贝数梯度的质粒标准品(pAAV-CAG-GFP)，另取制备好的病毒基因组DNA样品1μl加入mix中。设置阴性对照组，每组3个重复。之后通过建立标准曲线计算病毒的物理滴度。测得所得到的重组腺相关病毒rAAV-6X的物理滴度为5.45×10¹²VG/mL。

5、重组腺相关病毒rAAV-6包装和浓缩

重组腺相关病毒rAAV-6的制备方法与步骤4的区别仅在于将pAAV-6X替换为pAAV-RC6，其它操作完全相同。重组腺相关病毒rAAV-6的物理滴度为6.02×10¹²VG/mL。

二、重组腺相关病毒rAAV-6X和rAAV-6感染原代小胶质细胞效率比较

rAAV-6X和rAAV-6这两种重组腺相关病毒感染原代小胶质细胞过程如下，实验包含三个重复。

1.首先从新生小鼠体内分离小胶质细胞进行原代培养。

1.1组织取样

提前冰浴1×PBS缓冲液，并分装2ml加入15ml离心管中，做好标记。在生物安全柜中进行操作，将小鼠脑组织取出，去除海马与包被在组织外的血膜；将4只同亲本同性别小鼠的大脑皮层合并到一个15ml离心管中。

1.2单细胞悬液制备

(1)常温离心1000rpm，1min，将组织沉淀，弃上清；

(2)加入1ml胰酶，37℃消化8min，中间摇晃离心管2-3次；

(3)加入血清中和，停止消化，常温离心1000rpm 1min；

(4)加入2ml新鲜的胶质细胞培养基DMEM+10％FBS+1％P/S(向DMEM(GIBCO)中加入FBS(GIBCO)和P/S(Hyclone)得到的液体培养基，DMEM+10％FBS+1％P/S中，FBS的含量为10％，P/S的含量为1％)，使用1ml移液枪，吹打组织，使无肉眼可见组织碎块常温离心，2000rpm 3min；

(5)弃上清，重新加入2ml新鲜的胶质细胞培养基，吹打均匀常温离心，2000rpm3min；

(6)最后加入2ml新鲜的胶质细胞培养基，使用1ml移液枪将其吹成单细胞悬液。

1.3混合细胞培养过程

(1)将15ml离心管中的单细胞悬液转移到对应标记的T75培养瓶中，加入13ml培养基；

(2)混匀，静置在培养箱中5％CO₂,37℃，培养3天；

(3)3天后全换液，加17ml新鲜培养基，继续培养。

1.4小胶质细胞与星形胶质细胞的分离

(1)在光学显微镜下观察，可发现星形胶质细胞位于培养皿底部培养皿底部下层，小胶质细胞胶质细胞贴附于星形胶质细胞之上；

(2)待星形胶质细胞长满后，将T75培养瓶放置在摇床上，200rpm，

3h。

1.5小胶质细胞的培养

(1)对分离处理后的培养瓶进行处理，上清收取离心，获得小胶质细胞；

(2)用血球计数板计数，小胶质细胞铺在PDL提前包被(37℃，2h)的12或24孔板中，12孔板每孔40万细胞，24孔板每孔10万细胞；

(3)次日换液。

2.向原代培养的小胶质细胞中添加腺相关病毒进行感染。

1)按照MOI值1：500000分别将两种重组腺相关病毒加入到含有原代培养的小胶质细胞的培养基中，感染120h。

2)120h后用4％PFA进行固定15min，之后弃掉培养基，用PBS清洗3次。

3)加入含2％BSA的封闭液，封闭60min以上。

4)吸除大部分血清封闭液，加入封闭液稀释的一抗anti-Iba1多克隆抗体(Wako，019-19741)(1：1000)，4℃，16～18h或过夜。

5)PBS清洗3次，每次5分钟。加入稀释的Alexa Flour 594nm标记的二抗山羊抗兔IgG(1：1000)和DAPI(1：1000)，室温孵育2h。

6)PBS清洗3次，之后贴片进行拍照，进行活体成像观察EGFP表达的模式以及感染的细胞形态，用小胶质细胞特异性蛋白离子钙结合衔接分子1(Iba1)抗体对原代培养细胞进行染色，荧光显微镜下表明：Iba1抗体特异性染色结果能够与病毒转导表达的绿色荧光蛋白重合，通过统计Iba1抗体特异性染色与病毒转导表达的绿色荧光蛋白重合的小胶质细胞数量(a)，通过统计Iba1抗体特异性染色与细胞核染色确定小胶质细胞总数量(b)，进而通过公式：感染效率(％)＝a/b计算出rAAV感染原代小胶质细胞的效率，设3个重复。

表1.rAAV体外感染小胶质细胞的效率(％)

rAAV	重复1	重复2	重复3
				rAAV-6	7.2	6.7	10.2
rAAV-6X	63.1	72.3	68.3

结果如表1、图3和4所示：重组腺相关病毒rAAV-6体外感染小胶质细胞的效率为8.0％±1.9％，重组腺相关病毒rAAV-6X体外感染小胶质细胞的效率为67.9％±4.6％；重组腺相关病毒rAAV-6X体外感染小胶质细胞的效率是重组腺相关病毒rAAV-6体外感染小胶质细胞的效率的8倍。重组腺相关病毒rAAV-6X可高效感染原代小胶质细胞。AAV-6X型衣壳蛋白及其基因与AAV-6型衣壳蛋白及其基因相比，使重组腺相关病毒对小胶质细胞的感染效率提高了7倍，赋予腺相关病毒增强的小胶质细胞感染性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种高效感染原代小胶质细胞的重组突变腺相关病毒及其相关生物材料

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgttaacg ccccgcgccg gccgctctag aactagtgga tcccccggaa gatcagaagt 60

tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgatctg cgcagccgcc 120

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 180

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 240

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 300

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 360

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 420

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 480

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 540

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 600

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 660

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 720

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 780

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 840

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 900

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 960

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 1020

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 1080

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1140

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1200

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1260

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1320

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1380

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1440

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1500

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1560

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1620

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1680

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1740

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1800

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1860

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1920

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1980

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 2040

caacctctct gagggcattc gcgagtggtg ggacttgaaa cctggagccc cgaaacccaa 2100

agccaaccag caaaagcagg acgacggccg gggtctggtg cttcctggct acaagtacct 2160

cggacccttc aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggatg cagcggccct 2220

cgagcacgac aaggcctacg accagcagct caaagcgggt gacaatccgt acctgcggta 2280

taaccacgcc gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt ttgggggcaa 2340

cctcgggcga gcagtcttcc aggccaagaa gagggttctc gaacctcttg gtctggttga 2400

ggaaggtgct aagacggctc ctggaaagaa acgtccggta gagcagtcgc cacaagagcc 2460

agactcctcc tcgggcattg gcaagacagg ccagcagccc gctaaaaaga gactcaattt 2520

tggtcagact ggcgactcag agtcagtccc cgacccacaa cctctcggag aacctccagc 2580

aacccccgct gctgtgggac ctactacaat ggcttcaggc ggtggcgcac caatggcaga 2640

caataacgaa ggcgccgacg gagtgggtaa tgcctcagga aattggcatt gcgattccac 2700

atggctgggc gacagagtca tcaccaccag cacccgaaca tgggccttgc ccacctataa 2760

caaccacctc tacaagcaaa tctccagtgc ttcaacgggg gccagcaacg acaaccacta 2820

cttcggctac agcaccccct gggggtattt tgatttcaac agattccact gccatttctc 2880

accacgtgac tggcagcgac tcatcaacaa caattgggga ttccggccca agagactcaa 2940

cttcaagctc ttcaacatcc aagtcaagga ggtcacgacg aatgatggcg tcacgaccat 3000

cgctaataac cttaccagca cggttcaagt cttctcggac tcggagtacc agttgccgta 3060

cgtcctcggc tctgcgcacc agggctgcct ccctccgttc ccggcggacg tgttcatgat 3120

tccgcagtac ggctacctaa cgctcaacaa tggcagccag gcagtgggac ggtcatcctt 3180

ttactgcctg gaatatttcc catcgcagat gctgagaacg ggcaataact ttaccttcag 3240

ctacaccttc gaggacgtgc ctttccacag cagctacgcg cacagccaga gcctggaccg 3300

gctgatgaat cctctcatcg accagtacct gtattacctg aacagaactc agaatcagtc 3360

cggaagtgcc caaaacaagg acttgctgtt tagccggggg tctccagctg gcatgtctgt 3420

tcagcccaaa aactggctac ctggaccctg ttaccggcag cagcgcgttt ctaaaacaaa 3480

aacagacaac aacaacagca actttacctg gactggtgct tcaaaatata accttaatgg 3540

gcgtgaatct ataatcaacc ctggcactgc tatggcctca cacaaagacg acaaagacaa 3600

gttctttccc atgagcggtg tcatgatttt tggaaaggag agcgccggag cttcaaacac 3660

tgcattggac aatgtcatga tcacagacga agaggaaatc aaagccacta accccgtggc 3720

caccgaaaga tttgggactg tggcagtcaa tctccagagc agcagcacag accctgcgac 3780

cggagatgtg catgttatgg gagccttacc tggaatggtg tggcaagaca gagacgtata 3840

cctgcagggt cctatttggg ccaaaattcc tcacacggat ggacactttc acccgtctcc 3900

tctcatgggc ggctttggac ttaagcaccc gcctcctcag atcctcatca aaaacacgcc 3960

tgttcctgcg aatcctccgg cagagttttc ggctacaaag tttgcttcat tcatcaccca 4020

gtattccaca ggacaagtga gcgtggagat tgaatgggag ctgcagaaag aaaacagcaa 4080

acgctggaat cccgaagtgc agtatacatc taactatgca aaatctgcca acgttgattt 4140

cactgtggac aacaatggac tttatactga gcctcgcccc attggcaccc gttacctcac 4200

ccgtcccctg taattgtgtg ttaatcaata aaccggttaa ttcgtgtcag ttgaactttg 4260

gtctcatgtc gttattatct tatctggtca ccagatcccc gtagataagt agcatggcgg 4320

gttaatcatt aactacagcc cgggcgttta aacagcgggc ggaggggtgg agtcgtgacg 4380

tgaattacgt catagggtta gggaggtcct gtattagagg tcacgtgagt gttttgcgac 4440

attttgcgac accatgtggt ctcgctgggg gggggggccc gagtgagcac gcagggtctc 4500

cattttgaag cgggaggttt gaacgagcgc tggcgcgctc actggccgtc gttttacaac 4560

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 4620

tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 4680

gcctgaatgg cgaatggaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt 4740

ttgttaaatc agctcatttt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat 4800

caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat 4860

taagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 4920

acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 4980

gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 5040

aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 5100

gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcaggtgg 5160

cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 5220

tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 5280

gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 5340

tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 5400

tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 5460

ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 5520

atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 5580

cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 5640

attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 5700

gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 5760

ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 5820

gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 5880

agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 5940

gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 6000

gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 6060

ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 6120

tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 6180

tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 6240

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 6300

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 6360

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 6420

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 6480

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 6540

gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 6600

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 6660

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 6720

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 6780

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 6840

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 6900

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 6960

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 7020

agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 7080

ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 7140

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 7200

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 7260

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 7320

gcgcgccgat 7330

<210> 2

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His

260 265 270

Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe

275 280 285

His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn

290 295 300

Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln

305 310 315 320

Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn

325 330 335

Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro

340 345 350

Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala

355 360 365

Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly

370 375 380

Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe

405 410 415

Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp

420 425 430

Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg

435 440 445

Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg

565 570 575

Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala

580 585 590

Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu

705 710 715 720

Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

725 730 735

<210> 3

<211> 7351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgttaacg ccccgcgccg gccgctctag aactagtgga tcccccggaa gatcagaagt 60

tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgatctg cgcagccgcc 120

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 180

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 240

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 300

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 360

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 420

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 480

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 540

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 600

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 660

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 720

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 780

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 840

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 900

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 960

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 1020

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 1080

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1140

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1200

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1260

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1320

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1380

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1440

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1500

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1560

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1620

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1680

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1740

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1800

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1860

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1920

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1980

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 2040

caacctctct gagggcattc gcgagtggtg ggacttgaaa cctggagccc cgaaacccaa 2100

agccaaccag caaaagcagg acgacggccg gggtctggtg cttcctggct acaagtacct 2160

cggacccttc aacggactcg acaaggggga gcccgtcaac gcggcggatg cagcggccct 2220

cgagcacgac aaggcctacg accagcagct caaagcgggt gacaatccgt acctgcggta 2280

taaccacgcc gacgccgagt ttcaggagcg tctgcaagaa gatacgtctt ttgggggcaa 2340

cctcgggcga gcagtcttcc aggccaagaa gagggttctc gaacctcttg gtctggttga 2400

ggaaggtgct aagacggctc ctggaaagaa acgtccggta gagcagtcgc cacaagagcc 2460

agactcctcc tcgggcattg gcaagacagg ccagcagccc gctaaaaaga gactcaattt 2520

tggtcagact ggcgactcag agtcagtccc cgacccacaa cctctcggag aacctccagc 2580

aacccccgct gctgtgggac ctactacaat ggcttcaggc ggtggcgcac caatggcaga 2640

caataacgaa ggcgccgacg gagtgggtaa tgcctcagga aattggcatt gcgattccac 2700

atggctgggc gacagagtca tcaccaccag cacccgaaca tgggccttgc ccacctataa 2760

caaccacctc tacaagcaaa tctccagtgc ttcaacgggg gccagcaacg acaaccacta 2820

cttcggctac agcaccccct gggggtattt tgatttcaac agattccact gccatttctc 2880

accacgtgac tggcagcgac tcatcaacaa caattgggga ttccggccca agagactcaa 2940

cttcaagctc ttcaacatcc aagtcaagga ggtcacgacg aatgatggcg tcacgaccat 3000

cgctaataac cttaccagca cggttcaagt cttctcggac tcggagtacc agttgccgta 3060

cgtcctcggc tctgcgcacc agggctgcct ccctccgttc ccggcggacg tgttcatgat 3120

tccgcagtac ggctacctaa cgctcaacaa tggcagccag gcagtgggac ggtcatcctt 3180

ttactgcctg gaatatttcc catcgcagat gctgagaacg ggcaataact ttaccttcag 3240

ctacaccttc gaggacgtgc ctttccacag cagctacgcg cacagccaga gcctggaccg 3300

gctgatgaat cctctcatcg accagtacct gtattacctg aacagaactc agaatcagtc 3360

cggaagtgcc caaaacaagg acttgctgtt tagccggggg tctccagctg gcatgtctgt 3420

tcagcccaaa aactggctac ctggaccctg ttaccggcag cagcgcgttt ctaaaacaaa 3480

aacagacaac aacaacagca actttacctg gactggtgct tcaaaatata accttaatgg 3540

gcgtgaatct ataatcaacc ctggcactgc tatggcctca cacaaagacg acaaagacaa 3600

gttctttccc atgagcggtg tcatgatttt tggaaaggag agcgccggag cttcaaacac 3660

tgcattggac aatgtcatga tcacagacga agaggaaatc aaagccacta accccgtggc 3720

caccgaaaga tttgggactg tggcagtcaa tctccagagc agcagcccgg ttggtccgac 3780

gcgtctgaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg ggagccttac ctggaatggt 3840

gtggcaagac agagacgtat acctgcaggg tcctatttgg gccaaaattc ctcacacgga 3900

tggacacttt cacccgtctc ctctcatggg cggctttgga cttaagcacc cgcctcctca 3960

gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg gcagagtttt cggctacaaa 4020

gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg agcgtggaga ttgaatggga 4080

gctgcagaaa gaaaacagca aacgctggaa tcccgaagtg cagtatacat ctaactatgc 4140

aaaatctgcc aacgttgatt tcactgtgga caacaatgga ctttatactg agcctcgccc 4200

cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaattgtgt gttaatcaat aaaccggtta 4260

attcgtgtca gttgaacttt ggtctcatgt cgttattatc ttatctggtc accagatccc 4320

cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacagc ccgggcgttt aaacagcggg 4380

cggaggggtg gagtcgtgac gtgaattacg tcatagggtt agggaggtcc tgtattagag 4440

gtcacgtgag tgttttgcga cattttgcga caccatgtgg tctcgctggg ggggggggcc 4500

cgagtgagca cgcagggtct ccattttgaa gcgggaggtt tgaacgagcg ctggcgcgct 4560

cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 4620

gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 4680

gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggaa attgtaagcg ttaatatttt 4740

gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt ttttaaccaa taggccgaaa 4800

tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag 4860

tttggaacaa gagtccacta ttaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 4920

ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 4980

gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 5040

aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 5100

gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 5160

gctacagggc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 5220

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 5280

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 5340

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 5400

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 5460

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 5520

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 5580

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 5640

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 5700

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 5760

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 5820

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 5880

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 5940

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 6000

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 6060

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 6120

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 6180

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 6240

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 6300

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 6360

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 6420

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 6480

tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 6540

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 6600

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 6660

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 6720

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 6780

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 6840

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 6900

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 6960

cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 7020

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 7080

cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 7140

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 7200

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 7260

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 7320

ctatgaccat gattacgcca agcgcgccga t 7351

<210> 4

<211> 743

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His

260 265 270

Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe

275 280 285

His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn

290 295 300

Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln

305 310 315 320

Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn

325 330 335

Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro

340 345 350

Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala

355 360 365

Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly

370 375 380

Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe

405 410 415

Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp

420 425 430

Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg

435 440 445

Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser

450 455 460

Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg

565 570 575

Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Pro Val Gly Pro

580 585 590

Thr Arg Leu Thr Asp Pro Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala

595 600 605

Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro

610 615 620

Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro

625 630 635 640

Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile

645 650 655

Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr

660 665 670

Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val

675 680 685

Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro

690 695 700

Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe

705 710 715 720

Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr

725 730 735

Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

740

Claims

1.重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒为表达AAV-6X型衣壳蛋白的腺相关病毒，所述AAV-6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒，其特征在于：所述重组腺相关病毒含有所述AAV-6X型衣壳蛋白的编码基因，所述AAV-6X型衣壳蛋白的编码基因的编码链的编码序列是序列表中序列3的第2003-4234位核苷酸。

3.权利要求1或2所述的重组腺相关病毒的构建方法，所述构建方法包括将AAV-6X型衣壳蛋白的编码基因导入包装细胞中，得到表达所述AAV-6X型衣壳蛋白的重组腺相关病毒；所述AAV-6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。

4.权利要求1或2所述的重组腺相关病毒在制备外源基因传导工具中的应用。

5.权利要求1或2所述的重组腺相关病毒在将目的DNA导入小胶质细胞中的应用。

6.权利要求1或2所述的重组腺相关病毒在小胶质细胞分子层面改造中的应用。

7.权利要求1或2所述的重组腺相关病毒在小胶质细胞功能研究中的应用。

8.一种蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为AAV-6X型衣壳蛋白，所述AAV-6X型衣壳蛋白是氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白质。

9.与权利要求8所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述C1）至C7）中的任一种：

C1）编码权利要求8所述蛋白质的核酸分子；

C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；

C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；

C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物。

10.根据权利要求9所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为编码序列是序列表中序列3的第2003-4234位核苷酸的cDNA分子或DNA分子。

11.权利要求9或10所述的生物材料在制备重组腺相关病毒中的应用。

12.权利要求8所述蛋白质在提高腺相关病毒对小胶质细胞感染效率中的应用。

13.权利要求9或10所述生物材料在提高腺相关病毒对小胶质细胞感染效率中的应用。

14.用于感染小胶质细胞的组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求1或2所述的重组腺相关病毒。