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CN112813020A - 具有特定hla配型的人胚干细胞 - Google Patents

具有特定hla配型的人胚干细胞 Download PDF

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CN112813020A
CN112813020A CN202010949011.XA CN202010949011A CN112813020A CN 112813020 A CN112813020 A CN 112813020A CN 202010949011 A CN202010949011 A CN 202010949011A CN 112813020 A CN112813020 A CN 112813020A
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stem cells
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Abstract

本申请涉及多种具有特定HLA配型的人胚干细胞，包含一种或多种所述人胚干细胞的细胞库，包含一种或多种所述人胚干细胞的组合物，以及，所述人胚干细胞的应用。本申请的人胚干细胞的HLA配型在中国汉族人群中具有高覆盖率，因此，对于后续的临床研究和应用是特别有利的。

Description

具有特定HLA配型的人胚干细胞
技术领域
本申请涉及生物技术领域。特别地，本申请涉及多种具有特定HLA配型的人胚干细胞，包含一种或多种所述人胚干细胞的细胞库，包含一种或多种所述人胚干细胞的组合物，以及，所述人胚干细胞的应用。本申请的人胚干细胞的HLA配型在中国人群中具有高覆盖率，因此，对于后续的临床研究和应用是特别有利的。
背景技术
干细胞具有无限分裂能力，并且其可以分化成特定组织，是细胞生物发育阶段较为原始的细胞。胚胎干细胞是干细胞的一种，其中，人胚干细胞(Human Embryonic StemCells，hESCs)可分离培养自受精后的早期胚胎直至囊胚时的内细胞团(Inner Cell Mass，ICM)。人胚干细胞具有自我增殖能力，可分化成各种细胞、组织。人胚干细胞具有比一般干细胞更强的分化潜能，在再生医学的应用上被寄予厚望。
再生医学利用细胞(包括已分化细胞及干细胞)所培育出的特定组织与细胞来修复器官或治疗疾病。许多疾病根源于细胞的损伤或身体组织的破坏，需要以组织或器官替换来进行修复。然而有此需求的病人远远高于可移植的捐赠器官数目，因此，利用胚胎干细胞所培育出的特定组织与细胞成为利用细胞来修复器官或治疗疾病的新来源。
目前，建立能广泛适用于临床的hESCs已经成为世界范围内关注的焦点。自从1998年Thomson等成功建立了人胚干细胞以来，hESCs一直是全球生命科学领域的研究热点之一。
HLA(human lymphocyte antigen，人类淋巴细胞抗原)是细胞表面上的一种蛋白质。HLA分子一般可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，其中Ⅰ、Ⅱ类HLA分子直接参与移植免疫反应，Ⅲ类HLA分子则起间接作用。HLA-Ⅰ类主要涉及HLA-A、B、C位点，HLA-Ⅱ类主要涉及HLA-DR、DP、DQ位点。HLA配型不和的移植，可能会产生移植物抗宿主病，因此，需要建立大量的胚胎干细胞系以满足配型需求。
发明内容
本申请的发明人经过大量工作得到了多株具有特定HLA配型信息的人胚干细胞，它们的HLA配型(特别是在HLA-A位点或者HLA-B位点上的HLA配型)在中国人群中具有高覆盖率，因此，对于后续的临床研究和应用是特别有利的。基于此，本申请提供了以下发明。
在一个方面，本申请提供了一种人胚干细胞，其在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为至少10％，例如至少15％，例如至少20％。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有选自下列的纯合的等位基因：纯合的等位基因HLA-A*11:01，纯合的等位基因HLA-A*24:02和纯合的等位基因HLA-A*02:01。
在某些实施方案中，除了HLA-A位点之外，所述人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*15:02或者纯合的等位基因HLA-B*51:01。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞选自保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，且具有保藏号CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCCNo.19669、CGMCC No.19670或者CGMCC No.19671的人胚干细胞。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*11:01。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为约21.14％。在某些进一步优选的实施方案中，除了HLA-A位点之外，所述人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*15:02。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为约3.54％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞为人胚干细胞CGMCC No.19666。在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*51:01。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为约5.63％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞为人胚干细胞CGMCC No.19667。
人胚干细胞CGMCC No.19666和CGMCC No.19667在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*11:01，其在中国人群中的覆盖率可达到21.14％。并且，人胚干细胞CGMCCNo.19666在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*15:02，其在中国人群中的覆盖率可达到3.54％。人胚干细胞CGMCC No.19667在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*51:01，其在中国人群中的覆盖率可达到5.63％。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*24:02。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为约15.56％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞选自：人胚干细胞CGMCC No.19668、CGMCC No.19669或者CGMCCNo.19670。
人胚干细胞CGMCC No.19668、CGMCC No.19669和CGMCC No.19670在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*24:02，其在中国人群中的覆盖率可达到15.56％。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*02:01。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为约12.28％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞为人胚干细胞CGMCC No.19671。
人胚干细胞CGMCC No.19671在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*02:01，其在中国人群中的覆盖率可达到12.28％。
在另一个方面，本申请提供了一种人胚干细胞，其在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有选自下列的纯合的等位基因：纯合的等位基因HLA-B*15:02，纯合的等位基因HLA-B*51:01和纯合的等位基因HLA-B*52:01。
在某些实施方案中，除了HLA-B位点之外，所述人胚干细胞在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为至少10％，例如至少15％，例如至少20％。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*11:01。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞选自保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，且具有保藏号CGMCC No.19666、CGMCC No.19667或者CGMCC No.19672的人胚干细胞。
在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*15:02。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为约3.54％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞为人胚干细胞CGMCC No.19666。在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*51:01。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为约5.63％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞为人胚干细胞CGMCCNo.19667。在某些实施方案中，所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*52:01。此类人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为约2.85％。在某些实施方案中，所述人胚干细胞为人胚干细胞CGMCC No.19672。
人胚干细胞CGMCC No.19672在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*52:01，其在中国人群中的覆盖率可达到2.85％。
本申请的人胚干细胞具有选自下列的一种或多种能力：(1)自我更新的能力；(2)分化成三个胚层的细胞(例如，外胚层细胞、中胚层细胞、和内胚层细胞)的能力；(3)表达选自下列的一种或多种标记物的能力：转录因子Oct4、碱性磷酸酶AP、阶段特异性胚胎抗原1(SSEA-1)、阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、转录因子NANOG、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)、SOX2、REX1，及其任何组合；和，(4)在免疫减弱的动物中产生畸胎瘤的能力。
本申请的人胚干细胞具有自我更新的能力。因此，在某些实施方案中，可将本申请的人胚干细胞培养于胚胎干细胞培养基中。在某些实施方案中，可将本申请的人胚干细胞与饲养层细胞一起培养。
此外，本申请的人胚干细胞具有分化成多种细胞(例如，外胚层细胞、中胚层细胞、和内胚层细胞)的能力。因此，在某些实施方案中，可以将本申请的人胚干细胞培养于分化培养基中，以获得期望的后代细胞。本申请的人胚干细胞的多能状态可通过多种方法来确认。例如，可通过检测蛋白质标志物来确认人胚干细胞的多能状态，所述蛋白质标志物包括但不限于，转录因子Oct4、碱性磷酸酶AP、阶段特异性胚胎抗原1(SSEA-1)、阶段特异性胚胎抗原3(SSEA-3)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、转录因子NANOG、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)、SOX2、REX1等。
因此，在另一个方面，本申请提供了一种细胞培养物，其包含一种或多种如上所述的人胚干细胞以及培养基。在某些实施方案中，所述人胚干细胞选自人胚干细胞CGMCCNo.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCCNo.19671、CGMCC No.19672，及其任何组合。在某些实施方案中，所述培养基为胚胎干细胞培养基。在某些实施方案中，所述培养物还包含饲养层细胞，例如来自哺乳动物(人或小鼠)的饲养层细胞。在某些实施方案中，所述培养基为分化培养基。
在另一个方面，本申请提供了一种分化的细胞，其是由一种或多种如上所述的人胚干细胞分化而产生的。在某些实施方案中，所述人胚干细胞选自人胚干细胞CGMCCNo.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCCNo.19671、CGMCC No.19672，及其任何组合。在某些实施方案中，所述分化的细胞选自外胚层细胞、中胚层细胞、内胚层细胞，及其任何组合。
在另一个方面，本申请提供了一种细胞库，其包含一种或多种如上所述的人胚干细胞。在某些实施方案中，所述人胚干细胞选自人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCCNo.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCCNo.19672，及其任何组合。
在某些实施方案，所述细胞库包括人胚干细胞CGMCC No.19666和CGMCCNo.19667。人胚干细胞CGMCC No.19666和CGMCC No.19667在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*11:01，其在中国人群中的覆盖率可达到21.14％。
在某些实施方案，所述细胞库包括人胚干细胞CGMCC No.19668、CGMCC No.19669和CGMCC No.19670。人胚干细胞CGMCC No.19668、CGMCC No.19669和CGMCC No.19670在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*24:02，其在中国人群中的覆盖率可达到15.56％。
在某些实施方案，所述细胞库包括人胚干细胞CGMCC No.19666和CGMCC No.19667中的一种或两种，CGMCC No.19668、CGMCC No.19669和CGMCC No.19670中的一种、两种或三种，以及CGMCC No.19671。此类细胞库中的人胚干细胞在HLA-A位点上至少可涉及纯合的等位基因HLA-A*11:01、纯合的等位基因HLA-A*24:02，纯合的等位基因HLA-A*02:01，由此，在HLA-A位点上在中国人群中的覆盖率可超过49％。
在某些实施方案，所述细胞库包括人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670和CGMCC No.19671。
在某些实施方案，所述细胞库包括人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667和CGMCC No.19672。此类细胞库中的人胚干细胞在HLA-B位点上至少可涉及纯合的等位基因HLA-B*15:02、纯合的等位基因HLA-B*51:01，纯合的等位基因HLA-B*52:01，由此，在HLA-B位点上在中国人群中的覆盖率可超过12％。
在某些实施方案，所述细胞库包括人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671和CGMCC No.19672。
在另一个方面，本申请提供了一种组合物，其包含一种或多种如上所述的人胚干细胞和/或如上所述的分化的细胞。在某些实施方案中，所述组合物包含人胚干细胞CGMCCNo.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCCNo.19671、CGMCC No.19672，或其任何组合。在某些实施方案中，所述组合物包含如上所述的分化的细胞。在某些实施方案中，所述组合物还包含培养基。在某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方案中，所述组合物包含有效量(例如治疗有效量)的人胚干细胞和/或分化的细胞。在某些实施方案中，所述组合物包含至少1*105个，至少1*106个，至少1*107个，至少1*108个，至少1*109个，至少1*1010个，至少1*1011个，至少1*1012个人胚干细胞和/或分化的细胞。
在另一个方面，本申请提供了一种生物支架，其包含一种或多种如上所述的人胚干细胞和/或如上所述的分化的细胞。在某些实施方案，所述生物支架包含人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCC No.19672，或其任何组合。在某些实施方案中，所述生物支架包含如上所述的分化的细胞。在某些实施方案中，所述人胚干细胞和/或分化的细胞附着于所述生物支架上。在某些实施方案中，所述人胚干细胞和/或分化的细胞以预定的模式附着于所述生物支架上。
在另一个方面，本申请提供了如上所述的人胚干细胞和/或如上所述的分化的细胞在制备药物组合物或生物支架中的用途，所述药物组合物或生物支架用于在由此需要的受试者中进行组织移植、器官移植或器官修复。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“干细胞”是指在合适的分化条件下能够分化为其他类型的细胞、并且在合适的培养条件下能够维持自我更新并基本保持未分化状态的细胞。示例性的人干细胞包括但不限于，可由骨髓组织获得的造血或间充质干细胞、可由胚胎组织获得的胚胎干细胞或可由胎儿生殖器组织获得的胚胎生殖细胞。
如本文中所使用的，术语“胚胎干细胞”是指未分化的多能细胞，其是从早期的胚胎(例如在囊胚期的内细胞团)中获得的，或者是通过人工手段(例如核移植)产生的，并且其能够产生胚胎或成体中的任何分化细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵子)。胚胎干细胞处于未分化状态，可以长期自我分化和自我更新，具有在一定条件下分化形成各种组织细胞的潜能。
如本文中所使用的，术语“人胚干细胞”(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)是指从受精14天以内的人囊胚获得的胚胎干细胞。人胚干细胞可以通过下列方法获得：用精子或DNA使卵细胞在体外受精、核移植、或孤雌生殖等方法。在本文中，人胚干细胞不包含从发育超过14天的囊胚或胚胎获得的干细胞，或者从胎儿分离获得的干细胞。
如本文中所使用的，术语“HLA”是指人淋巴细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。根据HLA的结构、功能及组织分布的差异，HLA分子可分为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类分子，其中Ⅰ类分子包括HLA-A、HLA-B、HLA-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面。人胚干细胞在再生医学中是宝贵的细胞资源，但临床中异源hESC衍生细胞的免疫排斥(特别是因HLA配型不合而导致的免疫排斥)是人胚干细胞及其衍生细胞应用的主要障碍。因此，HLA配型在人群中覆盖率越高的人胚干细胞，能够匹配患者的概率就越高，引起免疫排斥的可能性就越低，相应地，其在临床应用中就有更高的潜能和价值。
在本申请中，当提及具体的人胚干细胞时，可使用其命名或保藏编号来指代，二者具有相同的含义，并且可互相替换。
发明的有益效果
本申请的人胚干细胞具有特定的HLA配型，并且其HLA配型在中国人群中的覆盖率较高，因而，在临床应用中具有巨大的潜能和价值。特别地，本申请的包含多种人胚干细胞的细胞库在HLA-A位点上的基因型在中国人群中的覆盖率可超过49％，或者在HLA-B位点上的基因型在中国人群中的覆盖率可超过12％。
本申请所提供的具有特定HLA配型的人胚干细胞在遗传学和表观遗传学的特性具有重要意义。一方面，本申请的人胚干细胞具有正常人胚干细胞的所有特性；另一方面，本申请的细胞库在移植治疗时提供了更广泛的配型信息，这为解决HLA配型困难提供了更多的选择，对干细胞的临床应用具有重要意义。
关于生物材料保藏的说明
本申请涉及下列生物材料：人胚干细胞Q-CTS-hESC-32(保藏编号：CGMCCNo.19666)，Q-CTS-hESC-78(保藏编号：CGMCC No.19667)，Q-CTS-hESC-48(保藏编号：CGMCCNo.19668)，Q-CTS-hESC-53(保藏编号：CGMCC No.19669)，Q-CTS-hESC-66(保藏编号：CGMCCNo.19670)，Q-CTS-hESC-59(保藏编号：CGMCC No.19671)，和Q-CTS-hESC-55(保藏编号：CGMCC No.19672)；所述的生物材料已在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，且保藏时间为2020年4月10日。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了人胚干细胞的构建流程。
图2显示了培养数天后的内细胞团的形态。
图3显示了人胚干细胞相关的蛋白标志物(Tra-1-81、SSEA-4、Nanog和Oct3/4)在人胚干细胞CGMCC No.19668中的表达情况。
图4显示了人胚干细胞相关的蛋白标志物(Tra-1-81、SSEA-4、Nanog和Oct3/4)在人胚干细胞CGMCC No.19672中的表达情况。
图5显示了人胚干细胞相关的蛋白标志物(Tra-1-81、SSEA-4、Nanog和Oct3/4)在人胚干细胞CGMCC No.19671中的表达情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：胚胎的复苏
本申请所用的胚胎收集自合作医院生殖中心试管婴儿手术剩余的经供者知情同意捐赠的胚胎。这些用于建系的胚胎均是受精14天以内的囊胚。人胚干细胞建立的流程如图1所示，具体步骤如下：
1.1前期准备
1.1.1选择状态良好的饲养层细胞。提前准备胚胎培养体系：提前准备培养滴(购自Vitrolife，货号10131)，铺于培养皿中，再加入石蜡培养油(购自Vitrolife，货号10029)覆盖培养滴，放于二氧化碳培养箱平衡。
1.1.2按照胚胎复苏试剂盒(jie ying捷鹰)的说明书室温平衡解冻液。
1.1.3 IVF工作台酒精消毒擦拭干净。
1.1.4制作口控吸管玻璃针备用。
1.2胚胎复苏
1.2.1按照胚胎复苏试剂盒说明书解冻胚胎，简言之，从液氮储存罐中取出冷冻胚胎，迅速放入1号解冻液中，室温停留3min；用口吸管将胚胎转移到2号缓冲液中，室温停留3min；用口吸管将胚胎转移到3号缓冲液中，室温停留3min；用口吸管将胚胎转移到4号缓冲液中，室温停留3min。
1.2.2然后用口吸管将胚胎转移到胚胎培养滴中洗涤5次，最后移入新的培养滴中，于5％CO2、37℃的培养箱中进行培养。
实施例2：内细胞团(ICM)的分离
2.1准备适当的操作环境：打开IVF工作台，37℃预热。
2.2在显微镜下观察，选择适合进行内细胞分离的囊胚。
2.3核实饲养层细胞：显微镜下观察饲养层细胞，根据分离ICM胚胎数量，更换新鲜胚胎培养体系平衡。
2.4准备内细胞团分离操作的器械：口控吸管、玻璃针、胶管、酒精灯，操作区域做好消毒。
2.5在IVF工作台上，将待分离的囊胚转移到待接种的培养板中。
2.6分离囊胚内细胞团：用分离工具(例如注射器)分离内细胞团。在不破坏ICM的情况下将透明带和滋养层扎破，随后，将透明带和部分滋养层剥离，使ICM暴露出来固定。
2.7将培养板轻轻放回培养箱中培养。
实施例3：内细胞团的培养
3.1细胞团培养
3.1.1准备培养液：37℃培养箱预热平衡E8培养基。
3.1.2将上述培养液放在生物安全柜内，取出胚胎内细胞团培养板换液，弃掉500μL培养液，添加500μL新鲜的培养液。
3.1.4将换好液的胚胎内细胞团培养板放回二氧化碳培养箱继续培养。
3.1.5每2-3天观察。内细胞团培养数天后出现如图2所示的致密的细胞团(outgrowth)的形态。
3.2细胞团(outgrowth)的传代
3.2.1提前准备饲养层：显微镜下观察细胞团和复苏的饲养层细胞，确认无误后进行细胞团传代。
3.2.2在体视镜下，用机械法开始传代。
3.2.3将挑好的克隆块转移到已换好新鲜培养液的培养板上。
3.2.4将接种好的培养板放置在二氧化碳培养箱中培养。
3.2.5 24h后换液。
在本实施例中，共制备获得了7株人胚干细胞：人胚干细胞Q-CTS-hESC-32(保藏编号：CGMCC No.19666)，Q-CTS-hESC-78(保藏编号：CGMCC No.19667)，Q-CTS-hESC-48(保藏编号：CGMCC No.19668)，Q-CTS-hESC-53(保藏编号：CGMCC No.19669)，Q-CTS-hESC-66(保藏编号：CGMCC No.19670)，Q-CTS-hESC-59(保藏编号：CGMCC No.19671)，和Q-CTS-hESC-55(保藏编号：CGMCC No.19672)。
实施例4：人胚干细胞系的鉴定
将所获得的人胚干细胞扩大培养，并进行以下检测。
4.1流式细胞检测方法如下：
(1)消化人胚干细胞制备成单细胞悬液，用单细胞筛网过滤，1200rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞。
(2)加入4％PFA固定30分钟。
(3)弃去PFA，DPBS洗三遍。(Tra-1-81抗体染色直接进行第(5)步骤；SSEA-4、Nanog、Oct3/4抗体染色进行第(4)步)
(4)0.5％Triton室温通透10min，PBS洗三遍。
(5)稀释好的抗体，室温封闭0.5小时。
(6)PBS洗三遍，每次5min。
(7)Hoechst33342染色15min。
(8)流式上机操作，进行阳性细胞比例分析。
实验结果如图3-5所示。图3-5显示了，人胚干细胞相关的蛋白标志物(Tra-1-81、SSEA-4、Nanog和Oct3/4)在人胚干细胞CGMCC No.19668(图3)、CGMCC No.19672(图4)和CGMCC No.19671(图5)中的表达情况。结果显示，在实施例3获得的细胞群中，表达人胚干细胞相关蛋白标志物(Tra-1-81、SSEA-4、Nanog和Oct3/4)的细胞的比例都显著高于70％。
4.2 HLA配型
收集细胞样品，并委托北京博富瑞基因诊断技术有限公司检测所获得的胚胎干细胞的HLA配型信息。使用购自荷兰GenDX公司的试剂
Figure BDA0002676277870000131
(Amplificationprimers)进行检测。检测技术为下一代基因测序法(NGS)(信息见下表1)。
检测结果如表2和表3所示。结果显示，通过上述实验所建立的7株人胚干细胞系中，CGMCC No.19666和CGMCC No.19667在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*11:01，其在中国人群中的覆盖率可达到21.14％；CGMCC No.19668、CGMCC No.19669和CGMCCNo.19670在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*24:02，其在中国人群中的覆盖率可达到15.56％；CGMCC No.19671在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*02:01，其在中国人群中的覆盖率可达到12.28％；CGMCC No.19666在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*15:02，其在中国人群中的覆盖率可达到3.54％；CGMCC No.19667在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*51:01，其在中国人群中的覆盖率可达到5.63％；CGMCC No.19672在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*52:01，其在中国人群中的覆盖率可达到2.85％。
表1.NGS二代测序试剂信息
Figure BDA0002676277870000141
表2.HLA-A位点的覆盖率
Figure BDA0002676277870000142
表3.HLA-B位点的覆盖率
HLA-B 覆盖率 对应细胞保藏号
B*51:01/B*51:01 0.0563634 CGMCC No.19667
B*15:02/B*15:02 0.0354452 CGMCC No.19666
B*52:01/B*52:01 0.0285420 CGMCC No.19672
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种人胚干细胞，其在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为至少10％，例如至少15％，例如至少20％。
2.权利要求1的人胚干细胞，其中，所述人胚干细胞具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)所述人胚干细胞在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％；
(2)所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有选自下列的纯合的等位基因：纯合的等位基因HLA-A*11:01，纯合的等位基因HLA-A*24:02和纯合的等位基因HLA-A*02:01；
(3)所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有纯合的等位基因HLA-B*15:02或者纯合的等位基因HLA-B*51:01；和
(4)所述人胚干细胞选自保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，且具有保藏号CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCCNo.19670或者CGMCC No.19671的人胚干细胞。
3.一种人胚干细胞，其在中国人群中在HLA-B位点上的覆盖率为至少2％，例如至少3％，例如至少4％，例如至少5％。
4.权利要求3的人胚干细胞，其中，所述人胚干细胞具有选自下列的一个或多个技术特征：
(1)所述人胚干细胞在中国人群中在HLA-A位点上的覆盖率为至少10％，例如至少15％，例如至少20％；
(2)所述人胚干细胞在HLA-B位点上具有选自下列的纯合的等位基因：纯合的等位基因HLA-B*15:02，纯合的等位基因HLA-B*51:01和纯合的等位基因HLA-B*52:01；
(3)所述人胚干细胞在HLA-A位点上具有纯合的等位基因HLA-A*11:01；和
(4)所述人胚干细胞选自：保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，且具有保藏号CGMCC No.19666、CGMCC No.19667或者CGMCC No.19672的人胚干细胞。
5.一种细胞培养物，其包含一种或多种权利要求1-4任一项所述的人胚干细胞以及培养基；
优选地，所述人胚干细胞选自人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCCNo.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCC No.19672，及其任何组合；
优选地，所述培养基为胚胎干细胞培养基；优选地，所述培养物还包含饲养层细胞，例如来自哺乳动物(人或小鼠)的饲养层细胞；
优选地，所述培养基为分化培养基。
6.一种分化的细胞，其是由一种或多种权利要求1-4任一项所述的人胚干细胞分化而产生的；
优选地，所述人胚干细胞选自人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCCNo.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCC No.19672，及其任何组合；
优选地，所述分化的细胞选自外胚层细胞、中胚层细胞、内胚层细胞，及其任何组合。
7.一种细胞库，其包含一种或多种权利要求1-4任一项所述的人胚干细胞；
优选地，所述人胚干细胞选自人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCCNo.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCC No.19672，及其任何组合；
优选地，所述细胞库包括下列人胚干细胞：
(1)CGMCC No.19666和CGMCC No.19667；
(2)CGMCC No.19668、CGMCC No.19669和CGMCC No.19670；
(3)CGMCC No.19666和CGMCC No.19667中的一种或两种，CGMCC No.19668、CGMCCNo.19669和CGMCC No.19670中的一种、两种或三种，以及CGMCC No.19671；
(4)CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCCNo.19670和CGMCC No.19671；
(5)CGMCC No.19666、CGMCC No.19667和CGMCC No.19672；或者，
(6)CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCC No.19668、CGMCC No.19669、CGMCCNo.19670、CGMCC No.19671和CGMCC No.19672。
8.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1-4任一项所述的人胚干细胞和/或权利要求6所述的分化的细胞；
优选地，所述组合物包含人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCCNo.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCC No.19672，或其任何组合；
优选地，所述组合物包含权利要求6所述的分化的细胞；
优选地，所述组合物还包含培养基；
优选地，所述组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂；
优选地，所述组合物包含有效量(例如治疗有效量)的人胚干细胞和/或分化的细胞；
优选地，所述组合物包含至少1*105个，至少1*106个，至少1*107个，至少1*108个，至少1*109个，至少1*1010个，至少1*1011个，至少1*1012个人胚干细胞和/或分化的细胞。
9.一种生物支架，其包含一种或多种权利要求1-4任一项所述的人胚干细胞和/或权利要求6所述的分化的细胞；
优选地，所述生物支架包含人胚干细胞CGMCC No.19666、CGMCC No.19667、CGMCCNo.19668、CGMCC No.19669、CGMCC No.19670、CGMCC No.19671、CGMCC No.19672，或其任何组合；
优选地，所述生物支架包含权利要求6所述的分化的细胞；
优选地，所述人胚干细胞和/或分化的细胞附着于(例如以预定的模式附着于)所述生物支架上。
10.权利要求1-4任一项所述的人胚干细胞和/或权利要求6所述的分化的细胞在制备药物组合物或生物支架中的用途，所述药物组合物或生物支架用于在由此需要的受试者中进行组织移植、器官移植或器官修复。
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