CN112816700A - 一种检测尿液中hiv抗体的胶体金试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条，所述试纸条包括塑料底板、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸及金标垫，所述吸水纸、硝酸纤维膜、金标垫、样本垫均固定于塑料底板上，所述金标垫上固化有胶体金标记的SPA与HIV gp41融合抗原，硝酸纤维膜的两端分别与吸水纸的内端、金标垫的内端搭接，所述样本垫的内端与金标垫的外端搭接，所述硝酸纤维素膜上设有检测线以及质控线，所述检测线上混合包被HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原，所述质控线上包被有羊多抗。本发明用于艾滋病检测初步筛选，操作方便、快速，无创采样，检测灵敏度高，适用于普通人群自测。

Description

一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条

技术领域

本发明涉及一种试纸条，尤其是涉及一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条。

背景技术

人类免疫缺陷病毒又称艾滋病病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒。这 一病毒会攻击并逐渐破坏人类的免疫系统，致使宿主在被感染时得不到保护。大规模的HIV 检测对人力、物力、财力、时间都是一个严峻的挑战，特别是随着艾滋的全球蔓延、医护人 员被感染的风险事例对HIV检测技术的开发和创新提出了“精准、快速、无创”的要求。

目前关于艾滋诊断程序是初筛为阳性后再进行western blot确诊。初筛的主要检测方法 有两种：

1、血液检测：主要有化学发光法、时间分辨荧光法、免疫层析法(胶体金法或胶乳法)，这些 方法均是通过采集患者血样，体外定性或定量检测人血清、血浆和全血中的人类免疫缺陷病 毒(HIV-1/HIV-2)抗体来判断是否有艾滋病毒感染。

但是血液检测方法中的化学发光和时间分辨荧光均需要大型设备，只有县级及以上的 医院配备。且这两种方法耗时长，需要专门的技术操作人员。此外血液检测是一种创伤性检 测，而血液传播是艾滋传播的3大途径之一，血液检测方法的不足是：(1)医护人员在抽血 过程中被戳伤而感染的风险；(2)抽血后的各种相关医疗器械垃圾及处理存在感染的风险； (3)患者无法自行抽血检测从而保证个人隐私

2、口腔粘膜渗出液检测：主要方法有免疫层析法(胶体金法或胶乳法)。即用口腔拭子在牙 龈线不断擦拭后的渗出液，检测人口腔粘膜渗出液中的HIV-1/2型人类免疫缺陷病毒抗体。 该法相比血液传播的风险小很多，但仍存在传播风险如艾滋接触人群的高危人群。

尿液中存在HIV特异性抗体已经被大量研究和证实。无/极弱传染性的尿液检测方法 目前经CFDA批准的只有酶联免疫法，但该方法耗时长(3h)；同样可进行定性检测的胶体金法由于其操作简便、耗时短而备受亲睐，但由于尿液抗体含量很低而存在灵敏度低的问题， 故现有市场此类产品极少，且大多性能欠佳。此外有报道，尿液检测相比于血液，唾液存在 较高的假阳性问题。

此外传统的胶体金法检测尿液HIV抗体试纸条是单独采用双抗原夹心法，该方法检测 灵敏度不佳；也有双抗原夹心法与间接法结合检测尿液HIV抗体的方法，但该方法需要分开 标记两种蛋白，增加工作量和成本。

发明内容

本发明是为了解决现有技术的HIV初筛检测方法所存在的上述问题，提供了一种用于 艾滋病检测初步筛选，操作方便、快速，无创采样，检测灵敏度高，适用于普通人群自测的 检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试 纸条，所述试纸条包括塑料底板、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸及金标垫，所述吸水纸、硝酸纤维膜、金标垫、样本垫均固定于塑料底板上，所述金标垫上固化有胶体金标记的SPA与HIV gp41融合抗原，硝酸纤维膜的两端分别与吸水纸的内端、金标垫的内端搭接，所述样本垫的内端与金标垫的外端搭接，所述硝酸纤维素膜上设有检测线以及质控线，所述检测线上 混合包被HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原，所述质控线上包被有羊多抗。基于现有HIV 初筛检测方法所存在的上述技术问题，本发明通过构建一种将SPA优选表位和HIVgp41抗 原优选表位融合的重组抗原，设计得到了一种新的基于胶体金法检测尿液HIV抗体试纸条， 通过双抗原夹心和间接法结合检测，操作方便、快速，无创采样，能在减少胶体金标记次数 和喷金次数，降低工作量和成本的同时，提高灵敏度的效果，可用于艾滋病检测初步筛选， 适用于普通人群自测。

作为优选，所述吸水纸、样本垫及金标垫上设有保护膜。

作为优选，所述样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维薄裁成所需规格后，用处理液 喷涂均匀，烘干即可。烘干具体步骤是37℃烘箱烘12～16h。

作为优选，所述处理液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.2g Tris，1g碳酸钠， 0.5g Casien Na，1gPVP，0.5gHPMC，1gβ-环糊精，2g表面活性剂S9，0.05g防腐剂Proclin300， 搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.5，加超纯水定容至100ml。

作为优选，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将硝酸纤维素膜平整贴在塑料底板 上，用包被缓冲液分别将HIV gp41重组抗原稀释至浓度为2.0mg/ml，gp36重组抗原稀释至 浓度为1.0mg/ml，羊多抗稀释至浓度为0.5mg/ml，采用三维点膜喷金仪将稀释好的混合有 HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原的溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线 上，将稀释好的羊多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的质控线上，烘干。烘 干具体步骤是37℃烘箱烘12～16h。

作为优选，所述包被缓冲液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79gNa₂HPO₄·12H₂O，0.9gNacl，0.05g防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节 PH至8.0，加超纯水定容至100ml。

作为优选，所述金标垫通过以下方法制得：

(1)用移液枪量取需要标记量的粒径40～50nm胶体金溶液，以胶体金溶液体积计，加入1％ 0.1M、pH7.6的PBS溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调pH值至8.5，取SPA和 HIV gp41融合蛋白，按15ug/ml金水比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继 续快速搅拌30min后，加入封闭剂BSA，封闭剂终浓度为5mg/ml，继续搅拌20min后，10000r/min、10℃离心20min，去除上清，用金标复溶液重悬至原体积10％，涡旋混匀，即得胶体金-融合蛋白结合物；

(2)将上述胶体金-融合蛋白结合物，用三维点膜喷金仪以喷量8ul/cm均匀喷涂在金标垫上， 烘干。烘干具体步骤是37℃烘箱烘2～4h。

作为优选，所述金标复溶液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入0.6gTris，0.5gCasein Na，1gPVP，0.5gPEG20000，1g表面活性剂S9，20g蔗糖，0.05g防腐剂Proclin300，搅拌 至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。

作为优选，所述SPA和HIV gp41融合蛋白通过以下方法制得：

(a)分别以SPA蛋白和HIV gp41蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分别分析两种 抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择SPA蛋白一段优势序列和HIV gp41蛋白一段优势序 列，通过由4个甘氨酸构成的柔性片段将二者连接，得到如SEQ ID No：1所示的SPA和gp41 融合蛋白氨基酸序列；

(b)根据大肠杆菌偏爱密码子将SPA和gp41融合蛋白氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列， 得到的SPA和gp41融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，在对应的核苷酸序列上下游 分别添加酶切位点BamHI和EcoRI后合成目的基因，并将目的基因克隆于pMD19-T载体； (c)用限制性内切酶BamHI和EcoRI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体12h，酶切产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体，使用T4连接酶将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按7:1的比例于4℃连接 12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB平板， 37℃恒温培养12h之后，挑取单克隆菌株至含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB液体培养基， 37℃恒温摇床培养12h后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后 得到正确的重组表达载体；

(d)将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那青 霉素抗性的LB平板，于37℃过夜培养；第二日，挑取平板上单克隆菌株至含50μg/mL卡 那青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8h后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳 糖苷至终浓度为1.0mmol/L，诱导表达4个h后制备蛋白电泳样品，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳 结果表明SPA和HIV gp41融合蛋白成功表达，得到融合蛋白表达菌株；

(c)接种融合蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒 温摇床培养8h后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后， 分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳 糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4h，离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心 后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到SPA和HIV gp41融合蛋白。

因此，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明试纸条用于检测尿液样本，无创采样，避免因采血等使用方式造成的交叉感染。 并且本试纸条可以直接插入待测样本，使用人全程无需接触样本，操作简单，方便检测；

(2)本发明试纸条结合间接法和双抗原夹心法，提高了检测灵敏度，适合个人辅助检测，在 医学观察及医学检测时起到自检筛查的作用；

(3)通过制备SPA和HIV gp41融合抗原用于胶体金标记，相较于传统的SPA，HIV抗原分 开标记，减少了标记次数和喷金次数，降低了材料损耗和人力从而降低成本，且达到了间接 法和双抗原夹心法结合检测提高灵敏度的效果。

附图说明

图1是本发明的一种结构示意图。

图中：塑料底板1，样本垫2，硝酸纤维膜3，吸水纸4，金标垫5，检测线6，质控 线7，保护膜8。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。

如图1所示的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条，包括塑料底板1、样本垫2、硝酸纤维膜3、吸水纸4及金标垫5，吸水纸、硝酸纤维膜、金标垫、样本垫均固定于塑料底 板上，金标垫上固化有胶体金标记的SPA与HIV gp41融合抗原，硝酸纤维膜的两端分别与 吸水纸的内端、金标垫的内端搭接，样本垫的内端与金标垫的外端搭接，所述硝酸纤维素膜上设有检测线6以及质控线7，检测线上混合包被HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原，质 控线上包被有羊多抗。

上述检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条的制备方法为：取已贴好硝酸纤维素膜的塑 料底板，将金标垫贴在靠近检测线一侧的塑料底板上，将金标垫的内端与硝酸纤维素膜搭接 约0.5mm，将样本垫贴在上并与金标垫的外端0.5mm，将吸水纸6贴在靠近质控线一侧的塑 料底板上，并与硝酸纤维素膜搭接约0.5mm，将保护膜覆盖在金标垫和样本垫上，并与硝酸 纤维素膜5搭接约1mm，同时将保护膜覆盖在吸水纸上，并与硝酸纤维素膜搭接约1mm，将 组装完成的塑料底板2置于高精度自动切条机上切成3mm试纸条；

上述检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条中的样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维薄裁成 宽16mm，长30cm后置于网架上，每条玻纤用3.5ml处理液喷涂均匀，置于37℃烘箱烘12h， 样本垫处理液制备如下：80ml超纯水中加入1.2g Tris，1g碳酸钠，0.5g CasienNa，1g PVP， 0.5g HPMC，1gβ-环糊精，2g S9，0.05g防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸 调节PH至8.5，加超纯水定容至100ml即为样本垫处理液；

上述检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条中的硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将硝酸纤维 素膜平整贴在塑料底板上，用包被缓冲液分别将HIV gp41重组抗原稀释至浓度为2.0mg/ml， gp36重组抗原稀释至浓度为1.0mg/ml，羊多抗稀释至浓度为0.5mg/ml，采用三维点膜喷金仪 将稀释好的混合有HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原的溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝 酸纤维素膜的检测线上，将稀释好的羊多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的 质控线上，质控线与检测线的间距控制在0.5cm，于37℃烘箱中烘12h，包被缓冲液通过以 下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na₂HPO₄·12H₂O，0.9gNacl，0.05g防腐剂Proclin300， 搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml；

上述检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条中的金标垫通过以下方法制得：

(1)用移液枪量取需要标记量的粒径40～50nm胶体金溶液，以胶体金溶液体积计，加入1％ 0.1M、pH7.6的PBS溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调pH值至8.5，取SPA和 HIV gp41融合蛋白，按15ug/ml金水比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继 续快速搅拌30min后，加入封闭剂BSA，封闭剂终浓度为5mg/ml，继续搅拌20min后，10000r/min、10℃离心20min，去除上清，用金标复溶液重悬至原体积10％，涡旋混匀，即得胶体金-融合蛋白结合物；金标复溶液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入0.6g Tris，0.5g Casein Na，1g PVP，0.5g PEG20000，1g表面活性剂S9，20g蔗糖，0.05g防腐剂Proclin300， 搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml；其中，SPA和HIV gp41 融合蛋白通过以下方法制得：

(a)分别以SPA蛋白和HIV gp41蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分别分析两种 抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择SPA蛋白一段优势序列和HIV gp41蛋白一段优势序 列，通过由4个甘氨酸构成的柔性片段将二者连接，得到如SEQ ID No：1所示的SPA和gp41 融合蛋白氨基酸序列；

(b)根据大肠杆菌偏爱密码子将融合蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列得到的SPA 和gp41融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，在对应的核苷酸序列上下游分别添加酶 切位点BamHI和EcoRI后合成目的基因，并将目的基因克隆于pMD19-T载体；

(c)用限制性内切酶BamHI和EcoRI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和 pET-28a(+)载体12h，酶切产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因和pET-28a (+)载体，使用T4连接酶将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按7:1的比例于4℃连接12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB平板， 37℃恒温培养12h之后，挑取单克隆菌株至含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB液体培养基， 37℃恒温摇床培养12h后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后 得到正确的重组表达载体；

(d)将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那青 霉素抗性的LB平板，于37℃过夜培养；第二日，挑取平板上单克隆菌株至含50μg/mL卡 那青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8h后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳 糖苷至终浓度为1.0mmol/L，诱导表达4个h后制备蛋白电泳样品，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳 结果表明SPA和HIV gp41融合蛋白成功表达，得到融合蛋白表达菌株；

(c)接种融合蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒 温摇床培养8h后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后， 分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳 糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4h，离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心 后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到SPA和HIV gp41融合蛋白。

(2)将上述胶体金-融合蛋白结合物，用三维点膜喷金仪以喷量8ul/cm均匀喷涂在在 宽6mm、长30cm的金标垫上，置于烘箱中37℃烘4h。

检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条的使用方法为：将待测样本、检测试纸条及其他 检测用材料放置室温平衡；将试纸条的样本浸入端插入尿液标本容器中，待液体移行至膜上 时取出平放，15min读数。如果样本中含有HIV抗体，首先与胶体金标记的SPA和gp41融合抗原特异性结合，随后在毛细作用力下向上层析，与硝酸纤维素膜上包被的HIV gp41重组 抗原结合，形成固相抗原-HIV抗体-胶体金标记物三元复合物，从而在检测线(T)显现出一 条红色条带。如是阴性样本，则将无红色条带显现。在硝酸纤维素膜上还包被了羊多抗作为 质控线(C)，无论样本中是否存在HIV抗体，羊多抗都会与胶体金标记物结合，在质控线出 现一条红色条带，作为实验有效性的依据。

灵敏度、特异性试验：

采用本发明试纸条测试中国药品生物制品检定所HIV尿液抗体参考品(尿液快速试剂)，结 果如表1所示。

表1国家参考盘测试结果

注：“-”表示为阴性；“+”表示为阳性。

表1结果表明，使用本发明试纸条检测尿液HIV抗体的灵敏度≥99％，特异性≥99％， 符合中国药品生物制品检定所HIV抗体检测的标准。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限 制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州新脉生物科技有限公司

<120> 一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条

<130> 20201212

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> SPA和gp41融合蛋白氨基酸序列

<400> 1

Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp

20 25 30

Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn

35 40 45

Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn

50 55 60

Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly

65 70 75 80

Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu

85 90 95

Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn

100 105 110

Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu

115 120 125

Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys

130 135 140

Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu

145 150 155 160

Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys

180 185 190

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys

195 200 205

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys

210 215 220

Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ala Val Glu Arg Tyr Leu Gln Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly

245 250 255

Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ser Val Pro Trp Asn Thr Ser

260 265 270

Trp Ser Asn Arg Ser Gln Asp Gln Ile Trp Lys Asn Met Thr Trp Met

275 280 285

Gln Trp Glu Arg Glu Ile Glu Asn Tyr Thr Asn Glu Ile Tyr Thr Leu

290 295 300

Ile Glu Gln Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Leu Asp Leu Leu

305 310 315 320

Lys Leu Asp Glu Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile

325 330

<210> 2

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> SPA和gp41融合蛋白核苷酸序列

<400> 2

tttaacaaag atcagcagag cgccttttat gaaattctga acatgccgaa cctgaacgaa 60

gcccagcgca acggctttat tcagagcctg aaagatgatc cgagccagag caccaacgtg 120

ctgggcgaag ccaaaaaact gaacgaaagc caggccccga aagccgataa ctttaacaaa 180

gaacagcaga acgcctttta tgaaattctg ccgaacctga acgaagaaca gcgcaacggc 240

tttattcaga gcctgaaaga tgatccgagc cagagcgcca acctgctggc cgaagccaaa 300

aaactgaacg atgcccaggc cccgaaagcc gataacaaat ttaacaaaga acagcagaac 360

gccttttatg aaattctgca tctgccgaac ctgaccgaag aacagcgcaa cggctttatt 420

cagagcctga aagatgatcc gagcgtgagc aaagaaattc tggccgaagc caaaaaactg 480

aacgatgccc aggccccgaa agaagaagat aacaacaaac cgggcaaaga agataacaac 540

aaaccgggca aagaagataa caacaaaccg ggcaaagaag atggcaacaa accgggcaaa 600

gaagataaca aaaaaccggg caaagaagat ggcaacaaac cgggcaaaga agataacaaa 660

aaaccgggca aagaagatgg caacaaaccg ggcaaagaag atggcaacgg cggcggcggc 720

gccgtggaac gctatctgca ggatcagcag ctgctgggca tttggggctg cagcggcaaa 780

ctgatttgca ccaccagcgt gccgtggaac accagctgga gcaaccgcag ccaggatcag 840

atttggaaaa acatgacctg gatgcagtgg gaacgcgaaa ttgaaaacta taccaacgaa 900

atttataccc tgattgaaca gagccagaac cagcaggaaa aaaacgaact ggatctgctg 960

aaactggatg aatgggccag cctgtggaac tggtttaaca tt 1002

Claims (9)

1.一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条包括塑料底板(1)、样本垫(2)、硝酸纤维膜(3)、吸水纸(4)及金标垫(5)，所述吸水纸、硝酸纤维膜、金标垫、样本垫均固定于塑料底板上，所述金标垫上固化有胶体金标记的SPA与HIV gp41融合抗原，硝酸纤维膜的两端分别与吸水纸的内端、金标垫的内端搭接，所述样本垫的内端与金标垫的外端搭接，所述硝酸纤维素膜上设有检测线(6)以及质控线(7)，所述检测线上混合包被HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原，所述质控线上包被有羊多抗。

2.根据权利要求1所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条，其特征在于，所述吸水纸、样本垫及金标垫上设有保护膜(8)。

3.根据权利要求1所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述样本垫通过以下方法制得：将玻璃纤维薄裁成所需规格后，用处理液喷涂均匀，烘干即可。

4.根据权利要求3所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述处理液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.2g Tris，1g碳酸钠，0.5gCasien Na，1gPVP，0.5g HPMC，1gβ-环糊精，2g表面活性剂S9，0.05g防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.5，加超纯水定容至100ml。

5.根据权利要求1所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述硝酸纤维素膜通过以下方法制得：将硝酸纤维素膜平整贴在塑料底板上，用包被缓冲液分别将HIV gp41重组抗原稀释至浓度为2.0mg/ml，gp36重组抗原稀释至浓度为1.0mg/ml，羊多抗稀释至浓度为0.5mg/ml，采用三维点膜喷金仪将稀释好的混合有HIV gp41重组抗原和gp36重组抗原的溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的检测线上，将稀释好的羊多抗溶液以喷量1μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的质控线上，烘干。

6.根据权利要求5所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述包被缓冲液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入1.79g Na₂HPO₄·12H₂O，0.9gNacl，0.05g防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。

7.根据权利要求1所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述金标垫通过以下方法制得：

(1)用移液枪量取需要标记量的粒径40～50nm胶体金溶液，以胶体金溶液体积计，加入1％0.1M、pH7.6的PBS溶液，在磁力搅拌器上边搅拌边用1M NaOH调pH值至8.5，取SPA和HIVgp41融合蛋白，按15ug/ml金水比例标记胶体金，一次性快速加入至胶体金溶液中，继续快速搅拌30min后，加入封闭剂BSA，封闭剂终浓度为5mg/ml，继续搅拌20min后，10000r/min、10℃离心20min，去除上清，用金标复溶液重悬至原体积10％，涡旋混匀，即得胶体金-融合蛋白结合物；

(2)将上述胶体金-融合蛋白结合物，用三维点膜喷金仪以喷量8ul/cm均匀喷涂在金标垫上，烘干。

8.根据权利要求7所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述金标复溶液通过以下方法制得：80ml超纯水中加入0.6g Tris，0.5gCasein Na，1gPVP，0.5gPEG20000，1g表面活性剂S9，20g蔗糖，0.05g防腐剂Proclin300，搅拌至完全溶解，用1M盐酸调节PH至8.0，加超纯水定容至100ml。

9.根据权利要求7所述的一种检测尿液中HIV抗体的胶体金试纸条法，其特征在于，所述SPA和HIV gp41融合蛋白通过以下方法制得：

(a)分别以SPA蛋白和HIV gp41蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分别分析两种抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择SPA蛋白一段优势序列和HIV gp41蛋白一段优势序列，通过由4个甘氨酸构成的柔性片段将二者连接，得到如SEQ ID No：1所示的SPA和gp41融合蛋白氨基酸序列；

(b)根据大肠杆菌偏爱密码子将融合蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，得到的SPA和gp41融合蛋白核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，在对应的核苷酸序列上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI后合成目的基因，并将目的基因克隆于pMD19-T载体；

(c)用限制性内切酶BamHI和EcoRI于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体12h，酶切产物分别经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体，使用T4连接酶将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按7:1的比例于4℃连接12h后，连接产物转化DH5α感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB平板，37℃恒温培养12h之后，挑取单克隆菌株至含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12h后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体；

(d)将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB平板，于37℃过夜培养；第二日，挑取平板上单克隆菌株至含50μg/mL卡那青霉素抗性的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8h后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，诱导表达4个h后制备蛋白电泳样品，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明SPA和HIV gp41融合蛋白成功表达，得到融合蛋白表达菌株；

(c)接种融合蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8h后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4h，离心收集菌体后，低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到SPA和HIV gp41融合蛋白。

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