CN1128167C

CN1128167C - 一种壳聚糖－聚丙烯酸复合物的纳米微球及其制法和用途

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Publication number: CN1128167C
Application number: CN01113580.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋锡群; 胡勇; 郭舰; 杨昌正
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2001-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2003-11-19
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: CN1314430A

Abstract

一种壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球，纳米微球的平均粒径为200-300nm，其中壳聚糖的分子量为10000-500000，脱乙酰度为50-100%，聚丙烯酸的分子量为20000-200000，聚丙烯酸的含量为20-50%。它可以作为药物载体，特别是磁共振成像显影增强剂的载体，本发明公开了它们的制法。

Description

一种壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球及其制法和用途

本发明涉及一种可生物降解高分子纳米微球，可作为药物及蛋白的载体，也可作为磁共振造影增强剂的载体。

采用生物相容高分子材料制备药物及基因载体用于它们的控制释放受到了愈来愈多的关注。可降解高分子纳米微球是七十年代末发展起来的具有缓控释放和体内靶向性的新型药物载体。可以根据粒子在体内分布的特异性，将药物输送到疾病部位后，缓慢释放，使药物在病灶部位的浓度显著增加，作用时间延长，药物的治疗效果显著提高；同时减轻药物对人体正常组织的毒副作用，从而使药物达到在体内病灶部位缓慢释放和靶向给药的目的，对临床应用具有重大的应用价值(J.Exp.Med.1988.(67).440-451)。

作为药物载体的纳米微球所用的材料一般采用可生物降解的高分子，主要有白蛋白、明胶、多糖及聚酯类化合物等。聚酯类化合物是最早被认可为安全使用于人体内的合成材料。如聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯及它们的共聚物(Contraception，1976，(13)，275-384)。最近，一种新型的嵌有亲水链段PEG的多嵌段聚合物受到了关注。(Colloids and surfaces B：Biointerfaces，2000，18：371-379)这些材料存在一些不足，如：药物包裹率太低，药物的控制释放难于控制，多肽及其它生物活性物质在包裹过程易于失活等。而本发明中采用的壳聚糖由于其良好的生物相容性、可生物降解性、低毒性及优异的亲水性，成为一种作为药物载体的优良材料。

磁共振成像MRI：Magnetic Resonance Imaging)技术是八十年代以来医学显像学中的最新成就之一。它是利用生物体内不同组织在外加磁场影响下产生不同的磁共振信号来成像的。磁共振信号的强弱取决于组织内分子中质子的弛豫时间。顺磁性金属离子(如Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺)的未成对电子自旋产生的局部磁场能够缩短邻近水分子中质子的弛豫时间，从而增大邻近区域的磁共振信号强度，提高影像的对比度。

为提高确诊部位的信号强度，必须使显影增强剂在该部位达到一定的浓度，才能提高诊断的灵敏度和准确性。而传统的磁共振显影增强剂(如：二乙三胺五乙酸钆DTPA-Gd)是组织间增强剂，细胞外分布，生物学分布没有专一性，不可能在特定部位富集，由此，必须加大增强剂的用量，才能获得较好的图像。因为DTPA-Gd具有一定的副作用，增大剂量，必定会影响它的实用安全性，由此，限制了磁共振成像技术在医学上进一步的应用。

采用纳米微球或纳米微粒来负载磁共振显影增强剂，是一个较新的领域，近年来得到了极大的发展。如何通过纳米高分子载体的靶向性的特点，将造影增强剂运送到感兴趣的部位，提高低浓度受体的信号，是磁共振成像造影增强剂研究的热点。通过具有良好生物相容性的高分子纳米控释体系，负载DTPA-Gd造影剂，可以使较低浓度的造影剂在局部富集，提高磁共振影像的对比度。同时，纳米粒子造影剂还具有体内循环时间长，靶向性的功能，(collods andsurfaces B：Biointerfaces 1999，(16)：305-319)在医用血池造影，肝、肺肿瘤诊断等领域具有极好的应用前景。

现有技术合成载药壳聚糖微球主要有沉淀法、反相法(W/O)及喷雾法等，这几种方法的制备工艺比较复杂，且所得壳聚糖微球的纯化步骤比较多且较繁琐。与本发明相近的壳聚糖纳米微球的制备方法(参见Polymer Bullitin，1999，(43)：67-73)是将聚氨基甲基丙磺酸酸滴加到壳聚糖的稀溶液中，搅拌条件下形成聚电解质复合物粒子。此类方法一方面是合成的粒子的粒径比较大，大于1微米。另一方面由于此种粒子是在极稀溶液中形成的，成品产出率比较低，且形成的微粒的粒径不均一。

而现有技术制备负载有磁共振显影增强剂微球的途径主要有：(1)用脂质体包埋显影增强剂DTPA-Gd；(collods and surfaces B：Biointerfaces 2000，(18)：293-299)，(2)在脂质体表面改性，接上一些多官能团的配体，再使Gd³⁺和此种改性后的脂质体配位，形成钆的高分子配合物等(collods and surfaces B：Biointerfaces 1999，(16)：305-319)。上述方法存在一些缺点。在第一种方法中，小分子的显影增强剂会从脂质体内渗透出来，渗透出来的显影增强剂会破坏脂质体薄膜。对于第二种方法，必须保证大部分金属原子和脂质体表面的官能团发生配位作用，才能确保金属原子和水分子的快速交换。此外，作为DTPA-Gd载体的脂质体是疏水性，这种性质限制了钆原子与水的交换，由此增强效果不是很理想。脂质体的表面改性的化学过程比较复杂，包埋过程也比较繁琐。

本发明的目的是：

1.提供一种可生物降解的亲水性的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球；

2.提供一种上述纳米微球的制备方法；

3.提供一种载有药物的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球，特别是载有磁共振成像显影增强剂的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

本发明的技术方案如下：

一种壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球，其中壳聚糖的分子量在10000-500000范围内，脱乙酰度为50-100％，聚丙烯酸的分子量范围为20000-200000，纳米微球的平均粒径为200-300nm，聚丙烯酸的含量为20-50％。

上述的纳米微球可以是用戊二醛交联剂交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。交联后的纳米微球更加稳定，耐碱性能较好。

一种制备上述壳聚糖-聚丙烯酸复合物纳米微球的方法，它是将壳聚糖溶解在酸性的(例如可以加乙酸使成酸性)蒸馏水中，搅拌下加入聚丙烯酸水溶液，形成微乳液，过滤即得壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

一种制备上述壳聚糖-聚丙烯酸复合物纳米微球的方法，它是在40-60℃搅拌下，在蒸馏水中加入壳聚糖和丙烯酸，溶解完全后，加入引发剂进行反应，引发剂可以是过硫酸钾，反应完成后形成微乳液，过滤即得壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

一种制备上述交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物纳米微球的方法，它是将壳聚糖溶解在酸性的(例如可以加乙酸使成酸性)蒸馏水中，搅拌下加入聚丙烯酸水溶液，形成微乳液，加入浓度为1％(m％)的戊二醛水溶液，升温至40℃，反应完成，过滤即得交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物纳米微球也可采用下法制备，在40-60℃，搅拌下，在蒸馏水中加入壳聚糖和丙烯酸，溶解完全后加入引发剂过硫酸钾，反应完成后，形成微乳液，然后加入交联剂戊二醛水溶液继续反应，反应完成后即得交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

交联剂戊二醛水溶液也可以提前和引发剂过硫酸钾同时加入，对交联反应没有影响。

本发明的壳聚糖-聚丙烯酸复合物纳米微球可以用作药物的载体，特别是可以作磁共振显影增强剂的载体。

作为药物的载体，它可以在本发明的壳聚糖-聚丙烯酸中加入要负载的药物或磁共振显影增强剂，经静置吸附，透析，即可得到包裹有药物或磁共振显影增强剂的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

作为药物的载体，它也可以在丙烯酸聚合前(即加入引发剂时)就加入需负载的药剂，如磁共振显影增强剂二乙三胺五乙酸钆(DTPA-Gd)或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N，N-四乙酸钆(DOTA-Gd)，然后加入引发剂，交联剂，反应完全后，过滤出纳米微球，用二次水透析，除去体系中无机盐小分子及未反应的单体，即可得到包裹有磁共振显影剂的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

本发明提供了一种平均粒径为200-300nm的壳聚糖-聚丙烯酸复合物纳米微球，它是亲水性的，在PH3-8缓冲溶液中有较好的稳定性，可生物降解，生物相容性好。本发明的制备方法采用了水相聚合的方法制备了壳聚糖的纳米微球。制备过程中不使用任何有机试剂和表面活性剂。很好的解决了壳聚糖微球的分离和纯化的问题。微球表面规则，具有一定的强度。DTPA-Gd或DOTA-Gd负载率高，化学性质稳定。上述特征表明：该微球作为一种载体，在性能上符合生物医学和生物化学工程领域的应用需要。

附图说明：

图1为负载有DTPA-Gd的本发明的纳米微球的模型图：1为聚合物网络；2为DTPA-Gd。

图2为本发明的交联纳米微球的电镜照片(放大倍数50000倍)。

图3为采用本发明方法制得的负载DTPA-Gd纳米微球的透射电镜照片，粒径小于300纳米(放大倍数50000倍)。

图4为各实施例所得的纳米微球的粒径分布统计图，其中图4-1～4-5分别是实施例1～5所得的纳米微球。

图5为负载阿霉素的纳米微球的体外药物释放曲线。

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为8万，脱乙酰度为90％的壳聚糖3克，再加入1克丙烯酸，搅拌条件下，升温至60℃。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入40毫克的引发剂—过硫酸钾，60℃条件下反应2小时，可得纳米微乳液。停止反应，过滤后将微乳液倒入透析袋中透析48小时，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体，即可得到复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量约为4克，聚丙烯酸的分子量为4万，透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为200nm左右，在pH3-7范围内能稳定保存。

实施例2：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为8万，脱乙酰度为85％的壳聚糖3克，再加入1克丙烯酸，搅拌条件下，升温至60℃。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入40毫克的引发剂—过硫酸钾，60℃条件下反应2小时，可得纳米微乳液。再加入10ml 1％交联剂戊二醛，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应，过滤后将微乳液倒入透析袋中透析48小时，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体，即可得到复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量约为4克，聚丙烯酸的分子量为4万。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为200nm左右，在pH3-8范围内能长时间保存。

实施例3：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为8万，脱乙酰度为70％的壳聚糖3克，再加入1克丙烯酸，搅拌条件下，升温至60℃。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入0.3克DTPA-Gd小分子化合物，再加入30毫克过硫酸钾作为引发剂。60℃条件下反应2小时，可得纳米微乳液。降温至40℃，加入10ml 1％交联剂戊二醛，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应后，过滤，将微乳液倒入透析袋中用二次水中透析1小时以上，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体。即可得到包裹有磁共振显影剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为4克，聚丙烯酸的分子量为4万，DTPA-Gd的包覆率大约为60％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为210nm左右，在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例4：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为8万，脱乙酰度为55％的壳聚糖1克，再加入1克丙烯酸，搅拌。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入15毫克过硫酸钾和5ml的戊二醛水溶液(1％，wt％)。50℃条件下反应4小时，可得纳米微乳液。再在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应后，过滤后将微乳液倒入透析袋中透析1小时以上，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体。向其中加入0.1克的DTPA-Gd化合物，静置48小时后，二次水中透析1小时以上，即可得到包裹有磁共振显影剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2克，聚丙烯酸的分子量为6万，DTPA-Gd的包覆率大约为60％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为200nm左右，在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例5：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为8万，脱乙酰度为60％的壳聚糖1克，再加入1克丙烯酸，搅拌。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入15毫克过硫酸钾，0.1克的DTPA-Gd化合物和5ml的戊二醛水溶液(1％，wt％)。50℃条件下反应4小时，可得纳米微乳液。再在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应后，过滤后将微乳液倒入透析袋中，二次水中透析1小时以上，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体。，即可得到包裹有磁共振显影剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2克，聚丙烯酸的分子量为4万，DTPA-Gd的包覆率大约为60％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为230nm左右，在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例6：

配置2％(wt％)分子量为8万，脱乙酰度为90％的壳聚糖的1％(wt％)的乙酸溶液100ml，再向其中加入0.2克的DTPA-Gd，溶解完全后，向其中加入1％(wt％)的分子量为10万的聚丙烯酸溶液50ml，形成一微乳液。过滤后，向该体系中加入1％(wt％)的戊二醛水溶液10ml，升温至40℃，搅拌条件下反应2小时，过滤，二次水中透析1小时以上。可得到负载有磁共振显影增强剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2克，DTPA-Gd的包覆率大约为60％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为290nm左右，粒度分布较宽。在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

表1说明了含DTPA-Gd纳米微球的不同DTPA-Gd浓度的弛豫时间(T1)。

实施例7：

配置2％(wt％)分子量为8万，脱乙酰度为90％的壳聚糖的1％(wt％)的乙酸溶液50ml，再向其中加入0.2克的DTPA-Gd，溶解完全后，将此溶液加入到1％(wt％)，分子量为10万的聚丙烯酸溶液100ml，形成一微乳液。过滤后，向该体系中加入1％(wt％)的戊二醛水溶液10ml，升温至40℃，搅拌条件下反应2小时，过滤，二次水中透析1小时以上。可得到负载有磁共振显影增强剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2克，DTPA-Gd的包覆率大约为60％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为280nm左右，粒度分布较宽。在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例8：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为2万，脱乙酰度为90％的壳聚糖2克，再加入1克丙烯酸，搅拌条件下，升温至60℃。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入0.2克DTPA-Gd小分子化合物，再加入20毫克过硫酸钾作为引发剂。60℃条件下反应2小时，可得纳米微乳液。降温至40℃，加入10ml 1％交联剂戊二醛，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应后，过滤，将微乳液倒入透析袋中用二次水中透析1小时以上，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体。即可得到包裹有磁共振显影剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2.5克，聚丙烯酸的分子量为1.5万，DTPA-Gd的包覆率大约为50％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为210nm左右，在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例9：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为20万，脱乙酰度为85％的壳聚糖2克，再加入1克丙烯酸，搅拌条件下，升温至60℃。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入0.2克DTPA-Gd小分子化合物，再加入20毫克过硫酸钾作为引发剂。60℃条件下反应2小时，可得纳米微乳液。降温至40℃，加入10ml 1％交联剂戊二醛，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应后，过滤，将微乳液倒入透析袋中用二次水中透析1小时以上，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体。即可得到包裹有磁共振显影剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2.0克，聚丙烯酸的分子量为8万，DTPA-Gd的包覆率大约为50％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为240nm左右，在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例10：

向盛有50ml蒸馏水的100ml搅拌式反应器中加入分子量为45万，脱乙酰度为85％的壳聚糖4克，再加入1.5克丙烯酸，搅拌条件下，升温至60℃。待壳聚糖溶解完全后，向其中加入0.2克DTPA-Gd小分子化合物，再加入20毫克过硫酸钾作为引发剂。60℃条件下反应2小时，可得纳米微乳液。降温至40℃，加入10ml 1％交联剂戊二醛，在40℃条件下反应2小时，以确保戊二醛反应完全。停反应后，过滤，将微乳液倒入透析袋中用二次水中透析1小时以上，以除去体系中的无机盐小分子及未反应的单体。即可得到包裹有磁共振显影剂的复合物纳米微球。

上述体系中纳米粒子的含量为2.5克，聚丙烯酸的分子量为8万，DTPA-Gd的包覆率大约为50％。透射电镜观察壳聚糖的纳米粒子为较为规则的球形结构，平均粒径为260nm左右，分布较宽，在pH3-8范围内能长时间保存。核磁共振实验结果表明：此纳米粒子具有较好的体外弛豫性能。

实施例11：磁共振增强剂DTPA-Gd包裹率的测定。

准确量取10ml所制备的纳米微乳液，置于50,000转每分钟的超速离心机中(Ultra ProTM 80，Du Pont)超速离心分离1小时后，收集上层清液。用原子吸收光谱法(ICP)测定清液中Gd离子的浓度，可计算出DTPA-Gd的包裹率。

实施例12：载药纳米微粒的体外药物释放曲线的测定

取实施例2制得的纳米微粒100mg，分散于生理盐水中，再向其中加入抗癌药盐酸阿霉素10mg，溶解后，静置24小时，超速离心分离后，取沉淀物在37℃条件下，生理盐水中测定其药物释放曲线。在此条件下，药物的包裹率为80％。

表1，不同DTPA-Gd含量纳米微球的弛豫时间(T1)

样品编号(实施例六)	浓度(mmol/mL)	T1，(ms)
样品编号(实施例六)	浓度(mmol/mL)	T1，(ms)	1	4.46	24.0
2	1.59	64.2	1	4.46	24.0
2	1.59	64.2	3	1.27	82.6
4	0.637	172.8	3	1.27	82.6
4	0.637	172.8	5	0.204	383.1

Claims

1.一种壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球，其特征是纳米微球的平均粒径为200-300nm，其中壳聚糖的分子量为10000-500000，脱乙酰度为50-100％，聚丙烯酸的分子量为20000-200000，聚丙烯酸的含量为20-50％。

2.根据权利要求1所述的纳米微球，其特征是经戊二醛交联剂交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

3.一种制备权利要求1所述的纳米微球的方法，其特征是将壳聚糖溶解在酸性蒸馏水中，搅拌下加入聚丙烯酸水溶液，形成微乳液，过滤即得壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

4.一种制备权利要求1所述的纳米微球的方法，其特征是在40-60℃搅拌下，在蒸馏水中加入壳聚糖和丙烯酸，溶解完全后，加入引发剂进行反应，形成微乳液，过滤即得壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

5.一种制备权利要求2所述的纳米微球的方法，其特征是将壳聚糖溶解在酸性蒸馏水中，搅拌下加入聚丙烯酸水溶液，形成微乳液，加入交联剂戊二醛水溶液，升温至40℃，反应完成，过滤即得交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

6.一种制备权利要求2所述的纳米微球的方法，其特征是在40-60℃，搅拌下，在蒸馏水中加入壳聚糖和丙烯酸，溶解完全后加入引发剂进行反应，形成微乳液，然后加入交联剂戊二醛水溶液，继续反应，反应完全后即得交联的壳聚糖-聚丙烯酸复合物的纳米微球。

7.根据权利要求6所述的纳米微球的方法，其特征是交联剂戊二醛水溶液在加入引发剂时，同时加入。

8.根据权利要求1或2所述的纳米微球的用途，其特征是作为药物或磁共振成像显影增强剂的载体。